Detecção de Antígenos de Células Imunes Intratumorais em um Modelo de Células Semelhantes a Células-Tronco de Glioblastoma Imunocompetente Utilizando Imuno-histoquímica Baseada em Substrato

Sourav Chakraborty; Connor Howard; Checo J. Rorie; Robert H. Newman; Samuel D. Rabkin; Dipongkor Saha

doi:10.3791/72193

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Artigo de método

Detecção de Antígenos de Células Imunes Intratumorais em um Modelo de Células Semelhantes a Células-Tronco de Glioblastoma Imunocompetente Utilizando Imuno-histoquímica Baseada em Substrato

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DOI:

10.3791/72193

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21 de agosto de 2026

Sourav Chakraborty¹ , Connor Howard¹ , Checo J. Rorie¹ , Robert H. Newman¹ , Samuel D. Rabkin² , Dipongkor Saha¹

¹Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, ²Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

O estudo fornece um fluxo de trabalho detalhado e reprodutível baseado em substrato para imuno-histoquímica, permitindo a detecção consistente de antígenos únicos e duplos em cortes de tecido tumoral derivados de células-tronco de glioblastoma, fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE). O protocolo auxilia na identificação de diversos marcadores imunes e tumorais, ao mesmo tempo que aborda desafios técnicos, com possível aplicação em outros modelos de tumor.

Resumo

O glioblastoma (GBM) é a neoplasia cerebral primária mais comum e letal, não possuindo terapias eficazes. Caracteriza-se por um microambiente tumoral profundamente imunossupressor, impulsionado em parte por células semelhantes a células-tronco do GBM (GSCs), resistentes ao tratamento. Aqui, descrevemos protocolos reprodutíveis baseados em substrato para imuno-histoquímica (IHC) de uma e duas cores, destinados à detecção de antígenos de superfície e intracelulares associados a células imunes infiltrantes em tumores cerebrais fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE). Os tumores cerebrais foram obtidos a partir de GSCs murinos, implantados ortotopicamente em camundongos imunocompetentes. O protocolo de IHC de uma cor utiliza um sistema de detecção cromogênico baseado na peroxidase do rabanete (HRP) para visualização de antígenos individuais de células imunes, enquanto o protocolo de IHC de duas cores emprega uma estratégia sequencial de coloração baseada na fosfatase alcalina (AP) para detecção simultânea de dois antígenos de células imunes na mesma seção tecidual, incluindo fluxos de trabalho que utilizam anticorpos primários de mesma origem de hospedeiro. Esses métodos fornecem uma estrutura prática e reprodutível para análise cromogênica de antígenos associados a células imunes infiltrantes em tecidos de GBM e podem ser adaptáveis a outros modelos pré-clínicos de tumor e potencialmente a espécimes humanos FFPE.

Introdução

O glioblastoma (GBM) é um tumor cerebral primário maligno agressivo, altamente invasivo e heterogêneo, associado à baixa sobrevida dos pacientes, apesar das terapias padrão atuais¹. Uma característica definidora do GBM é seu microambiente tumoral (TME) profundamente imunossupressor, que contribui para a resistência às estratégias imunoterápicas²^,³. Múltiplos mecanismos impulsionam a imunossupressão no GBM, incluindo a reduzida infiltração de linfócitos T efetores e a indução da disfunção e exaustão dos linfócitos T⁴. Além disso, células semelhantes a células-tronco do glioblastoma (GSCs), uma subpopulação de células do GBM, promovem ainda mais a evasão imunológica ao manter um TME imunologicamente “frio”, caracterizado por atividade imune citotóxica limitada⁵. Essas características destacam a importância de caracterizar com precisão as populações de células imunes infiltradas no tumor e seus estados funcionais no TME do GBM.

A imuno-histoquímica (IHC) continua sendo um dos métodos mais amplamente utilizados para avaliar a infiltração de células imunes em tecidos tumorais, pois preserva a arquitetura tecidual ao mesmo tempo em que permite a visualização, localização e avaliação semi-quantitativa de marcadores celulares in situ⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Estudos imuno-histoquímicos e de imunoprofilagem anteriores avançaram substancialmente nosso entendimento sobre o panorama imunológico do GBM e identificaram populações de células imunes associadas à progressão tumoral e à resposta terapêutica¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. A IHC cromogênica de cor única é particularmente útil para detectar marcadores imunes individuais em cortes de tecido fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE)¹²^,¹³^,¹⁵^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Em contraste, a IHC cromogênica de dupla cor permite a visualização simultânea de dois marcadores no mesmo corte tecidual, facilitando a avaliação do fenótipo celular, proliferação ou estado de ativação¹²^,¹⁹^,²¹.

Apesar desses avanços, protocolos cromogênicos baseados em substrato padronizados e práticos aplicáveis a modelos de GBM derivados de GSC imunocompetentes ainda são limitados. Além disso, a IHC cromogênica permanece mais desafiadora no GBM do que em muitos outros tumores sólidos devido à infiltração escassa e heterogênea de células imunes, à extensa heterogeneidade intratumoral e ao microambiente tumoral altamente imunossupressor e complexo, o que complica a visualização e interpretação precisas de múltiplas populações celulares dentro da mesma seção tecidual²^,³^,⁴. A IHC cromogênica dupla apresenta desafios técnicos adicionais, particularmente quando ambos os anticorpos primários são produzidos na mesma espécie hospedeira, exigindo uma otimização cuidadosa da compatibilidade dos anticorpos, uma estratégia de coloração sequencial para detecção simultânea de dois antígenos na mesma seção tecidual e a seleção de um substrato cromogênico para garantir a clara discriminação dos marcadores por microscopia de luz.

Aqui, descrevemos protocolos reprodutíveis baseados em substrato para IHC de uma e duas cores que detectam com sucesso antígenos superficiais e intracelulares representativos associados a células imunes infiltrantes em um modelo ortotópico imunocompetente de GBM derivado de 005 GSC²²^,²³^,²⁴. Esses protocolos cromogênicos de IHC baseados em substrato também podem ser adaptados a outros modelos pré-clínicos e potencialmente a espécimes tumorais humanos em FFPE. Os tecidos cerebrais de camundongo coletados foram fixados em formalina tamponada neutra a 10% durante a noite (~12 h) antes do processamento rotineiro de tecidos e inclusão em parafina, conforme descrito anteriormente¹⁹. Blocos FFPE foram cortados (espessura de 5 µm¹⁹) em lâminas de vidro microscópicas positivamente carregadas e armazenados à temperatura ambiente até o uso. A IHC de uma cor utiliza um sistema de detecção cromogênico baseado em peroxidase de rábano (HRP) com 3,3′-diaminobenzidina (DAB) como substrato para gerar um sinal marrom, visualizável por microscopia de luz. Este fluxo de trabalho é adequado para detectar antígenos associados à membrana e antígenos intracelulares em cortes de tecido FFPE.

A IHC de dupla cor permite a detecção simultânea de dois antígenos na mesma seção de tecido, mas exige otimização adicional para garantir a compatibilidade dos anticorpos e a clara separação dos sinais cromogênicos. A coloração IHC de dupla cor é relativamente simples quando os anticorpos primários são produzidos em espécies hospedeiras diferentes, permitindo o uso de anticorpos secundários específicos para cada espécie. No entanto, a detecção simultânea torna-se mais desafiadora tecnicamente quando ambos os anticorpos primários são originários da mesma espécie hospedeira. Para superar esse desafio, o protocolo de IHC de dupla cor descrito aqui emprega uma estratégia sequencial de coloração cromogênica baseada em fosfatase alcalina (AP), utilizando substratos distintos para permitir a clara discriminação visual entre os sinais de dois antígenos ao microscópio óptico.

Ambos os fluxos de trabalho incluem desparafinização do tecido, reidratação, recuperação de antígenos, bloqueio, coloração, desidratação, clareamento e montagem. A preparação dos reagentes é crucial para a qualidade e reprodutibilidade da coloração (consulte o Arquivo Suplementar 1). Da mesma forma, diluições apropriadas dos anticorpos primários também são fundamentais para um protocolo de coloração bem-sucedido, sendo realizadas imediatamente antes do uso em soro de cavalo ou cabra normal a 2,5%, dependendo da espécie do anticorpo secundário correspondente (consulte a Tabela 1). Uma lista de anticorpos secundários específicos para espécies utilizados em coloração simples e dupla também é apresentada na Tabela 2. A IHC de cor única utiliza reagentes de clareamento e montagem à base de xilol, enquanto a IHC de dupla cor exige alternativas livres de xilol (por exemplo, Histo-Clear), pois o substrato é parcialmente solúvel em xilol (consulte a lista de substratos na Tabela 3).

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Protocolo

Este protocolo foi conduzido de acordo com todas as diretrizes regulamentares e institucionais relevantes, incluindo o Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) (números de protocolo IACUC: 2004N000067 e LA24-0045).

OBSERVAÇÃO: Várias etapas nos protocolos de IHC de uma e duas cores envolvem reagentes inflamáveis, incluindo etanol e agentes de clareamento tecidual. Assim, procedimentos que envolvem produtos químicos inflamáveis, incluindo desparafinização, reidratação, desidratação, clareamento e montagem, devem ser realizados em capela de exaustão química certificada, utilizando práticas apropriadas de segurança laboratorial. Os reagentes inflamáveis devem ser preparados e armazenados em recipientes de vidro com tampa rosqueável, devidamente rotulados, dentro de armários designados para armazenamento de substâncias inflamáveis, conforme as diretrizes institucionais de segurança. Os materiais e volumes de reagentes são configurados para processamento em lote de até 48 lâminas de microscópio (duas grades de coloração, 24 lâminas por grade), embora o fluxo de trabalho possa ser facilmente ajustado de acordo com as necessidades experimentais.

1. IHC de uma única cor para seções de tumor cerebral em FFPE

OBSERVAÇÃO: O seguinte protocolo descreve a IHC de cor única baseada em substrato para a detecção de antígenos superficiais e intracelulares representativos em cortes de tumor cerebral em parafina (FFPE) derivados do modelo ortotópico de CSG 005.

Desparafinização (20 min):
1. Coloque as lâminas em uma grade de lâminas de polioximetileno (POM) e imerja a grade em recipientes de coloração, primeiro em Xilol I e depois em Xilol II, por 10 min cada, em uma cabine de exaustão. Certifique-se de que os cortes teciduais permaneçam completamente submersos em xilol durante a desparafinização.
  CAUTELA: Realize este passo sob uma cabine de exaustão química com equipamento de proteção individual (EPI) apropriado, incluindo jaleco de laboratório, óculos de proteção, máscara facial e luvas. Não permita que os cortes sequem nesta etapa ou em qualquer etapa subsequente, pois isso pode causar danos ao tecido e perda de cortes. Armazene as soluções de xilol em recipientes de vidro herméticos e reutilize-as se estiverem limpas.
Reidratação gradual (15 min):
1. Reidrate os cortes sequencialmente em etanol a 100%, 90% e 70%, por 5 min cada. Para isso, imerja as lâminas em etanol a 100% no recipiente de coloração por 5 min (em seguida, devolva o etanol a 100% ao frasco de vidro para reutilização), seguido por etanol a 90% por 5 min (devolva ao frasco), e finalmente em etanol a 70% por 5 min (devolva ao frasco).
  CAUTELA: Realize este passo sob uma cabine de exaustão química e use EPI conforme no passo 1.1. Essas soluções de etanol podem ser reutilizadas entre experimentos se armazenadas em recipientes de vidro herméticos, desde que estejam limpas.
Enxágue com água (5 min):
1. Coloque as lâminas em água destilada por 5 min, completando assim o processo de reidratação.
  NOTA: Enquanto realiza este passo, prepare 600 mL (para 1 grade de lâminas) a 800 mL (para 2 grades de lâminas) de solução tampão de recuperação de antígeno 1× (tampão de citrato de sódio 10 mM) em um béquer de vidro microondável de 2 L, conforme as instruções listadas no Arquivo Suplementar 1.
Recuperação de antígeno (~20 min):
1. Cubra o béquer de 2 L contendo o tampão recém-preparado de recuperação de antígeno (citrato de sódio 10 mM) com filme plástico para evitar evaporação excessiva durante o pré-aquecimento e o aquecimento prolongado no micro-ondas.
2. Faça alguns furos no filme plástico para evitar que o tampão seja expulso devido à pressão excessiva gerada durante a fervura dos cortes teciduais.
  NOTA: Use EPI conforme no passo 1.1.
3. Pré-aqueça a solução recém-preparada de tampão de recuperação de antígeno (citrato de sódio 10 mM) por 3 min. Coloque a grade de lâminas com os cortes teciduais reidratados na solução de recuperação de antígeno pré-aquecida.
4. Em seguida, aqueça os cortes teciduais no micro-ondas por 15 min na potência máxima (por exemplo, P10), monitorando cuidadosamente o béquer para garantir que os cortes permaneçam submersos e não sequem devido à evaporação.
  NOTA: Alternativamente, realize a recuperação de antígeno em um recipiente plástico de coloração colocado dentro de uma panela de vapor por aproximadamente 15 min, o que fornece um método de aquecimento mais suave com menos necessidade de monitoramento. O tampão de citrato de sódio (10 mM, pH 6,0) foi validado com sucesso e utilizado como tampão de recuperação de antígeno para todos os anticorpos primários listados na Tabela 1. Dependendo do anticorpo primário e das recomendações do fabricante, outros tampões, como EDTA ou Tris-EDTA, podem ser necessários para anticorpos não avaliados neste estudo.
Resfriamento (10–20 min):
1. Retire o béquer do micro-ondas, coloque-o na bancada de trabalho e deixe esfriar até a temperatura ambiente por 20 min. Para acelerar o resfriamento, coloque o béquer em água da torneira gelada por ~10 min.
  CAUTELA: O béquer estará extremamente quente; use luvas resistentes ao calor ou pinças para manuseá-lo. Use EPI conforme no passo 1.1.
Enxágue com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) (~10 min):
1. Retire a grade de lâminas do béquer e imerja as lâminas em solução de DPBS 1× no recipiente de coloração.
2. Enxágue os cortes duas vezes em DPBS 1× por 5 min cada, usando lavagens suaves e estáticas para evitar a soltura do tecido.
Barreira hidrofóbica (<1 min/lâmina):
1. Durante o enxágue com DPBS (passo 1.6), remova cuidadosamente cada lâmina individualmente, limpe suavemente ao redor do corte tecidual com lenços sem fiapos (por exemplo, Kim Wipes), evitando contato com o tecido em si.
2. Use uma barreira hidrofóbica, como uma caneta peroxidase-anti-peroxidase (PAP), para desenhar uma barreira repelente a líquidos ao redor de cada corte tecidual, depois devolva a lâmina à solução de enxágue com DPBS no recipiente de coloração. Repita esses passos para todas as lâminas.
  NOTA: Uma barreira hidrofóbica ao redor do tecido evita o transbordamento de reagentes entre cortes e ajuda a manter os anticorpos sobre o tecido.
Bloqueio de peroxidase endógena (5 min):
1. Descarte o DPBS 1× do recipiente de coloração e adicione solução de H₂O₂ a 3%, garantindo que as lâminas ou cortes teciduais fiquem completamente imersos por 5 min.
  NOTA: Incubação prolongada em H₂O₂ a 3% pode danificar o tecido. O bloqueio da atividade de peroxidase endógena é um passo crucial para prevenir fundo causado pela peroxidase endógena durante o desenvolvimento da coloração. Use EPI conforme no passo 1.1.
Enxágue com DPBS (~12 min):
1. Descarte a solução de H₂O₂ a 3% e enxágue novamente as lâminas em DPBS 1× duas vezes, por 5 min cada.
2. Após o segundo enxágue, retire as lâminas da grade, coloque-as planas na câmara umidificada e adicione água destilada às bordas da câmara umidificada.
3. Não deixe os cortes secarem; prossiga imediatamente para o bloqueio no passo 1.10.
  NOTA: Cada câmara umidificada listada na Tabela de Materiais possui espaço para acomodar 30 lâminas.
Bloqueio com soro (~70 min):
1. Adicione 50 µL de solução de albumina sérica bovina (BSA) a 5% por corte e incube por 30 min à temperatura ambiente, mantendo a tampa da câmara umidificada fechada para evitar evaporação do tampão de bloqueio dos cortes teciduais.
2. Após 30 min, bata suavemente nas lâminas sobre lenços sem fiapos colocados na bancada para descartar o BSA.
3. Em seguida, adicione soro normal de cavalo ou cabra a 2,5% (uma gota por corte), compatível com a espécie de origem do anticorpo secundário, e incube os cortes por mais 30 min à temperatura ambiente com a tampa da câmara umidificada fechada. Bata suavemente nas lâminas em papel absorvente ou lenços sem fiapos para remover o soro e prossiga imediatamente para o passo 1.11.
  NOTA: Não deixe os cortes secarem. Prepare os anticorpos primários diluídos no tampão de bloqueio apropriado (veja Tabela 1) próximo ao final do passo de bloqueio, para que estejam prontos para uso no passo 1.11 assim que o bloqueio for concluído.
Incubação com anticorpo primário (~16 h):
1. Aplicar ~50 µL de anticorpos primários, diluídos idealmente no tampão de bloqueio apropriado (veja Tabela 1), sobre os cortes teciduais e incubar durante a noite (~16 h) a 4 °C em câmara umidificada.
  NOTA: Certifique-se de que as áreas designadas da câmara umidificada estejam preenchidas com água destilada para manter a umidade durante a noite. Além disso, tome cuidado para que as áreas/câmaras designadas para as lâminas com tecido não sejam preenchidas com água destilada, pois isso pode causar alagamento dos cortes.
Enxágue com DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Coloque uma grade de lâminas em um recipiente de coloração e preencha com tampão de lavagem (DPBS 1×, 0,1% Tween 20).
2. Após a incubação noturna, retire as lâminas da câmara umidificada, descarte os anticorpos primários batendo suavemente nas lâminas sobre papel absorvente, coloque as lâminas em uma grade imersa no tampão de lavagem (DPBS 1×, 0,1% Tween 20) no recipiente de coloração e descarte o tampão de lavagem.
3. Em seguida, lave os cortes em DPBS 1× (0,1% Tween 20) três vezes, por 5 min cada, retire as lâminas da grade, coloque-as planas na câmara umidificada e prossiga imediatamente para o passo 1.13.
  NOTA: Cada tempo de lavagem pode ser estendido para 10–15 min se a coloração de fundo parecer elevada após o desenvolvimento da cor no passo 1.15. As lavagens devem ser suaves e estáticas (sem agitação ou movimento) para evitar a soltura do tecido das lâminas.
Incubação com anticorpo secundário (~32–35 min):
1. Adicione uma gota por corte do anticorpo secundário conjugado com HRP apropriado (anti-coelho ou anti-rato IgG, conforme necessário; veja Tabela 2) e incube os cortes teciduais por 30 min à temperatura ambiente com a tampa da câmara umidificada fechada.
  NOTA: O anticorpo secundário pode ser diluído 1:1 em PBS para reduzir o fundo no passo 1.15.
Enxágue com DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Após a incubação com o anticorpo secundário, retire as lâminas da câmara umidificada e bata suavemente nas lâminas sobre papel absorvente para descartar os anticorpos secundários.
2. Em seguida, coloque as lâminas em uma grade imersa no tampão de lavagem (DPBS 1× com 0,1% Tween 20) dentro de um recipiente de coloração para uma lavagem breve e descarte o tampão de lavagem.
3. Em seguida, lave os cortes teciduais três vezes com DPBS 1× (0,1% Tween 20) por 5 min cada.
  1. Antes de iniciar o passo de desenvolvimento do cromógeno (ou seja, passo 1.15), coloque uma grade separada em um recipiente de coloração preenchido com água destilada, um passo preparatório para o passo 1.16, para interromper a reação cromogênica.
  2. Durante a lavagem final, prepare imediatamente a solução de trabalho de DAB (1 gota de cromógeno por 1 mL de substrato; veja Arquivo Suplementar 1).
Desenvolvimento do cromógeno (30 s–5 min):
1. Após a terceira lavagem no passo 1.14, retire as lâminas da grade e coloque-as planas na bancada com fundo branco.
2. Aplicar 50 µL da solução de trabalho de DAB em cada corte e monitorar visualmente o desenvolvimento da coloração marrom em fundo branco ou sob microscópio de luz.
  NOTA: Use EPI conforme no passo 1.1. O uso de papel absorvente branco ajuda a visualizar o desenvolvimento da coloração marrom durante a etapa do cromógeno DAB. O desenvolvimento da cor pode levar de 20 a 60 s para alguns marcadores e de 2 a 5 min para outros (veja detalhes no passo 1.16).
Interromper a reação (1–2 min):
1. Assim que o sinal de cor marrom desejado aparecer no passo 1.15, interrompa imediatamente a reação mergulhando a lâmina em um recipiente com água destilada preparado no passo 1.14.3.1.
2. Mantenha as lâminas enxaguadas em água destilada por 1 min. Descarte a água destilada e prossiga para o passo 1.17 (contra-coloração).
  NOTA: As lâminas podem permanecer em água destilada por até 1 h sem afetar a coloração. O tempo necessário para o desenvolvimento da cor determina quando iniciar o passo de interrupção da reação. Além disso, se houver 2–3 marcadores (como CD3, CD4, CD8 ou outros) na mesma lâmina (como é o caso neste estudo), os tempos de reação podem variar; por exemplo, no sistema descrito aqui, o desenvolvimento da cor geralmente leva cerca de 30 s para células CD8⁺, 1–3 min para células CD3⁺ ou CD4⁺, ou mais tempo (3–5 min) para células Granzima B⁺ e Ki67⁺. Devido às diferenças nos tempos de desenvolvimento da cor, toda a lâmina não pode ser imersa em água destilada para interromper a reação. Em vez disso, interrompa cada reação individualmente para cada corte adicionando 200–300 µL de água destilada diretamente sobre cada corte.
Contra-coloração (<1 min):
1. Para realçar o contraste com a coloração marrom, adicione hematoxilina diluída (1:3 em água destilada) ao recipiente de coloração, garantindo que as lâminas permaneçam imersas em hematoxilina diluída por ~10–20 s.
  NOTA: Se o fundo do DAB for forte, contra-colora por mais tempo (até 1 min) ou use hematoxilina não diluída brevemente.
Enxágue com água da torneira (6 min):
1. Descarte a hematoxilina do recipiente de coloração e devolva-a ao frasco de vidro para reutilização.
2. Enxágue as lâminas em água da torneira por 1 min, depois enxágue em água da torneira corrente lenta por 5 min, mantendo os cortes voltados para longe do fluxo direto da água. Descarte a água da torneira e prossiga para o passo 1.19.
  NOTA: Os passos restantes até o montagem são realizados em uma cabine de exaustão.
Desidratação gradual (15–17 min):
1. Imersa as lâminas em etanol a 70% no recipiente de coloração por 5 min (em seguida, devolva o etanol a 70% ao frasco de vidro para reutilização), seguido por etanol a 90% por 5 min (devolva ao frasco), e finalmente em etanol a 100% por 5 min (devolva ao frasco).
2. Prossiga para o passo 1.20.
  NOTA: Realize este passo em uma cabine de exaustão química. As mesmas soluções de etanol do passo 1.2 são usadas nesta etapa de desidratação e podem ser reutilizadas várias vezes se estiverem limpas.
Limpeza:
1. Use as mesmas soluções de Xilol I e II utilizadas na desparafinização (passo 1.1) para limpar os cortes teciduais/lâminas.
2. Primeiro, imerja as lâminas em solução de Xilol I no recipiente de coloração por 10 min (em seguida, devolva o Xilol I ao frasco de vidro para reutilização) e depois em solução de Xilol II por mais 10 min.
3. Mantenha as lâminas em Xilol II até a conclusão da montagem (ou seja, passo 1.21).
  NOTA: Nunca deixe os cortes secarem nesta etapa, pois cortes secos tornam-se frágeis; assim, se necessário, os cortes podem permanecer em Xilol II por mais tempo para a montagem.
Montagem:
1. Retire as lâminas uma a uma do Xilol II e coloque-as planas em uma cabine de exaustão química. Coloque uma gota de meio de montagem à base de xilol em uma lamínula de tamanho apropriado, depois coloque a lamínula sobre a lâmina, com o meio de montagem voltado para os cortes teciduais.
2. Pressione suavemente a lamínula com o polegar para espalhar o meio de montagem uniformemente sobre os três cortes e remover bolhas de ar.
  NOTA: É necessária uma lamínula de 24 × 50 mm para cobrir três cortes em uma lâmina; 24 × 40 mm para dois cortes; e 24 × 24 mm para um corte. É importante concluir a montagem em até 30 s por lâmina, pois o meio de montagem pode secar rapidamente devido ao fluxo constante de ar na cabine de exaustão, fazendo com que o Xilol II evapore rapidamente da lâmina e torne os cortes frágeis.
Secagem ao ar e microscopia de luz:
1. Seque as lâminas ao ar na cabine de exaustão por pelo menos 2 h antes da avaliação e da obtenção de imagens usando microscópio de luz. Após a secagem, armazene as lâminas montadas em caixas de lâminas à temperatura ambiente por anos.

2. IHC de dupla coloração para seções de tumor cerebral em FFPE

OBSERVAÇÃO: O protocolo a seguir descreve um fluxo de trabalho de IHC cromogênica de dupla cor baseado em substrato para detecção simultânea de dois antígenos na mesma seção de tumor cerebral em FFPE. Em comparação com a IHC de cor única, o fluxo de trabalho de dupla cor é mais demorado, pois exige ciclos de coloração sequenciais com incubações independentes de anticorpos primários, incluindo etapas de incubação prolongadas por toda a noite em cada rodada de coloração. No entanto, esse fluxo de trabalho prolongado permite a detecção confiável de antígenos simultâneos na mesma seção de tecido, preservando a morfologia tecidual e mantendo uma clara separação dos sinais cromogênicos sob microscopia de luz.

Desparafinização (20 min):
1. Siga o mesmo processo de desparafinização descrito acima para IHC monocromática na etapa 1.1 em uma capela química, mas use agentes de clareamento sem xilol (por exemplo, Histo-Clear I e Histo-Clear II em vez de xilol).
  ATENÇÃO: Use EPI conforme na etapa 1.1 e realize este passo sob capela química. Recomenda-se o uso do Histo-Clear porque o cromógeno é parcialmente solúvel em xilol, e o processamento sem xilol ajuda a preservar a intensidade da coloração durante a IHC bicromática. Não deixe as seções secarem. Essas soluções de clareamento podem ser reutilizadas se armazenadas em recipientes de vidro herméticos e estiverem aparentemente limpas.
Reidratação gradual (15 min):
1. Idêntico à IHC monocromática conforme descrito na etapa 1.2. Rehidrate as seções sequencialmente com diminuição gradual da concentração de etanol (100%, 90% e 70%) por 5 min em cada etapa.
  NOTA: Um conjunto separado de etanol graduado sem xilol é usado aqui, pois o etanol graduado utilizado na IHC monocromática na etapa 1.2 provavelmente está contaminado com Xilol II.
Lavagem com água (5 min):
1. Idêntico à IHC monocromática na etapa 1.3; coloque as lâminas em água destilada por 5 min para completar o processo de reidratação.
  NOTA: Idêntico à etapa 1.3; prepare a solução de recuperação de antígeno durante este período de 5 min.
Recuperação de antígeno (~20 min): Siga o mesmo procedimento de recuperação de antígeno descrito para IHC monocromática na etapa 1.4.
Resfriamento (10–20 min): Siga o mesmo processo de resfriamento descrito para IHC monocromática na etapa 1.5.
Lavagem com DPBS (10 min): Siga o processo de lavagem da solução de recuperação de antígeno descrito para IHC monocromática na etapa 1.6.
Barreira hidrofóbica (<1 min/lâmina):
1. Durante a lavagem com DPBS na etapa 2.6, crie uma barreira hidrofóbica ao redor das seções teciduais seguindo o mesmo processo/protocolo da etapa 1.7.
2. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar uma barreira repelente de líquido ao redor de cada seção tecidual, depois devolva a lâmina à solução de lavagem com DPBS no recipiente de coloração. Repita esses passos para todas as lâminas.
Bloqueio da fosfatase alcalina (5 min):
1. Após completar as barreiras hidrofóbicas em todas as seções teciduais, remova as lâminas do recipiente de coloração, coloque-as planas na câmara umidificada, adicione uma gota de solução bloqueadora de fosfatase alcalina endógena (por exemplo, BLOXALL) por seção e incube as seções por 5 min. Prossiga imediatamente para a etapa 2.9.
  NOTA: Como anticorpos secundários conjugados à fosfatase alcalina (AP) são usados no protocolo de IHC bicromática, é essencial bloquear a atividade de fosfatase alcalina endógena para reduzir o sinal de fundo durante o desenvolvimento da cor vermelha ou azul. A solução bloqueadora BLOXALL é usada aqui para inibir a fosfatase alcalina endógena. Ela também inibe a peroxidase endógena, portanto, essa solução bloqueadora pode ser usada também no protocolo de IHC monocromática para bloquear a atividade de peroxidase endógena, em vez da solução de H₂O₂ a 3%.
Lavagem com DPBS (10 min):
1. Lave as lâminas em solução DPBS 1× no recipiente de coloração duas vezes, por 5 min cada.
2. Após a segunda lavagem, remova as lâminas do recipiente de coloração, coloque-as planas na câmara umidificada e adicione água destilada às bordas da câmara umidificada.
  NOTA: Não deixe as seções secarem; prossiga imediatamente para o bloqueio da ligação antígeno-anticorpo não específica na etapa 2.10.
Bloqueio com soro (~70 min):
1. Siga o mesmo processo de bloqueio com soro descrito no protocolo de IHC monocromática na etapa 1.10.
  1. Primeiro, bloquee com o tampão bloqueador universal (BSA 5%; 50 µL/seção) por 30 min à temperatura ambiente e depois com soro normal de cavalo a 2,5% (uma gota/seção), compatível com a espécie hospedeira do anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado à AP, por mais 30 min à temperatura ambiente com a tampa da câmara umidificada fechada.
  2. Após esse período, bata suavemente nas lâminas em papel absorvente para descartar o soro e prossiga para a etapa 2.11.
    NOTA: Prepare o anticorpo primário I (ver Tabela 1) durante o minuto final da etapa de bloqueio, conforme descrito na etapa 1.10.
Incubação com anticorpo primário I (~16 h):
1. Siga o mesmo processo de incubação com o anticorpo primário descrito na etapa 1.11. Por exemplo, adicione cerca de 50 µL de anticorpo anti-CD3 de coelho, diluído 1:100 em soro normal de cavalo a 2,5% (ver Tabela 1), a cada seção tecidual.
2. Incube durante a noite (~16 h) a 4 °C em câmara umidificada.
Lavagem com DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Siga o mesmo procedimento de lavagem (3 etapas, 5 min cada) descrito para o protocolo de IHC monocromática na etapa 1.12.
2. Após a terceira lavagem, coloque as lâminas planas dentro da câmara umidificada. Prossiga imediatamente para a etapa 2.13.
  NOTA: Mesmas observações da etapa 1.12, por exemplo, cada tempo de lavagem pode ser estendido para 10–15 min, e a lavagem deve ser suave e estática. Não deixe as seções secarem.
Incubação com anticorpo secundário I (~32–35 min):
1. Adicione uma gota por seção do anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado à AP (ver Tabela 2) e incube as seções teciduais por 30 min à temperatura ambiente com a tampa da câmara umidificada fechada.
  NOTA: O anticorpo secundário pode ser diluído 1:1 em PBS para reduzir o sinal de fundo na etapa 2.15.
Lavagem com DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Siga o mesmo procedimento de lavagem com DPBS 1×/0,1% Tween 20, conforme na etapa 1.14.
2. NOTA: Durante a etapa final de lavagem, prepare frescamente a solução de trabalho do substrato (5 mL, conforme recomendado; ver Tabela 3) de acordo com as instruções do fabricante (ver preparação de reagentes no Arquivo Suplementar 1).
Desenvolvimento da cor vermelha (12–15 min):
1. Após completar a etapa 2.14, coloque as lâminas planas sobre a bancada com fundo branco, como papel absorvente branco, conforme descrito na etapa 1.15.
2. Misture bem a solução de trabalho do substrato vermelho recém-preparada, depois adicione 50 µL a cada seção tecidual (descarte qualquer solução restante).
3. Incube as seções teciduais à temperatura ambiente até que a cor vermelha apareça, verificando periodicamente a cada 2–3 min contra um fundo branco ou sob microscopia de luz.
  NOTA: O tempo necessário para o desenvolvimento da cor vermelha varia entre marcadores e pode levar 20–30 min. No entanto, para coloração de células CD3⁺ em seções de tumor cerebral 005 com o sistema de detecção AP, o desenvolvimento da cor vermelha geralmente ocorre em 12–15 min.
Lavagem com tampão (5 min):
1. Assim que o sinal vermelho desejado aparecer na etapa 2.15, lave as seções em DPBS 1×/0,1% Tween 20 por 5 min em um recipiente de coloração.
2. Durante este tempo de lavagem, prepare frescamente o anticorpo primário II em um tampão de bloqueio apropriado (por exemplo, anticorpo anti-Ki67 de coelho diluído 1:100 em soro normal de cavalo a 2,5%; ver Tabela 1).
  NOTA: Diferentemente da lavagem com água destilada usada na IHC monocromática (etapa 1.16), o DPBS/0,1% Tween 20 é usado aqui não apenas para interromper a reação, mas também para remover rigorosamente o cromógeno em excesso e preparar para o segundo ciclo de coloração.
Incubação com anticorpo primário II (~16 h):
1. Leve as lâminas para uma câmara umidificada e adicione cerca de 50 µL do anticorpo anti-Ki67 de coelho recém-preparado a cada seção tecidual. Incube durante a noite (~16 h) a 4 °C.
Lavagem com DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Siga o mesmo procedimento da etapa 1.12.
2. Após a terceira lavagem, remova as lâminas do recipiente de coloração e coloque-as planas na câmara umidificada. Prossiga imediatamente para a etapa 2.19.
Incubação com anticorpo secundário II (~32–35 min):
1. Siga o mesmo procedimento da etapa 2.13. Adicione uma gota por seção do anti-IgG de coelho conjugado à AP (ver Tabela 2) e incube as seções teciduais por 30 min à temperatura ambiente com a tampa da câmara umidificada fechada.
Lavagem com DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Siga o mesmo procedimento de lavagem com DPBS 1×/0,1% Tween 20, conforme na etapa 1.14.
  NOTA: Durante a etapa final de lavagem, prepare frescamente a solução de trabalho do substrato (5 mL, conforme recomendado; ver Tabela 3) de acordo com as instruções do fabricante (ver preparação de reagentes no Arquivo Suplementar 1).
Desenvolvimento da cor azul (10–12 min):
1. Após completar a etapa 2.20, coloque as lâminas planas sobre a bancada com fundo branco.
2. Misture bem a solução de trabalho do substrato azul recém-preparada, depois adicione 50 µL a cada seção tecidual (descarte qualquer solução restante).
3. Incube as seções teciduais à temperatura ambiente até que a cor azul apareça, verificando periodicamente a cada 2–3 min contra um fundo branco ou sob microscopia de luz.
  NOTA: Assim como o desenvolvimento da cor vermelha na etapa 2.15, o tempo necessário para o desenvolvimento da cor azul pode levar 20–30 min. No entanto, para coloração de células Ki67⁺ em seções de tumor cerebral 005 com o sistema de detecção AP, a cor azul se desenvolve em 10–12 min.
Lavagem com tampão (5 min):
1. Assim que o sinal azul desejado aparecer na etapa 2.21, imerja as seções em DPBS 1×/0,1% Tween 20 por 5 min em um recipiente de coloração. Descarte a solução de lavagem.
Lavagem com água (1 min): Lave as seções em água destilada por 1 min. Descarte a água destilada após a lavagem.
Desidratação gradual (15–17 min):
1. Imersão das lâminas em etanol a 70% no recipiente de coloração por 5 min (depois devolva o etanol a 70% ao frasco de vidro para reutilização), seguido por etanol a 90% por 5 min (depois devolva ao frasco) e, finalmente, em etanol a 100% por 5 min (depois devolva ao frasco).
2. Repita cada etapa em capela. Prossiga para a etapa 2.25.
  NOTA: As mesmas soluções de etanol (sem xilol) da etapa 2.2 são usadas nesta etapa de desidratação e podem ser reutilizadas várias vezes se estiverem aparentemente limpas.
Clareamento sem xilol:
1. Use as mesmas soluções sem xilol (ou seja, Histo-Clear) usadas na etapa 2.1 para limpar as seções teciduais/lâminas.
  1. Primeiro, imerja as lâminas na solução sem xilol I no recipiente de coloração por 10 min (depois devolva a solução sem xilol I ao frasco de vidro para reutilização) e depois na solução sem xilol II por mais 10 min.
  2. Mantenha as lâminas na solução sem xilol II até a montagem (ou seja, etapa 2.26) estar completa.
    NOTA: As seções podem permanecer na solução sem xilol II por mais tempo, se necessário, para a montagem.
    ATENÇÃO: Use EPI conforme na etapa 1.1 e realize este passo sob capela química.
Montagem sem xilol:
1. Remova as lâminas uma a uma da solução sem xilol II e coloque-as planas em uma capela. Coloque uma gota de meio de montagem sem xilol em uma lamínula de tamanho apropriado, depois coloque a lamínula sobre a lâmina, com o meio de montagem voltado para as seções teciduais.
2. Pressione suavemente a lamínula com o polegar para espalhar o meio de montagem uniformemente sobre as três seções e remover bolhas de ar.
  NOTA: Complete a montagem em até 30 s por lâmina, pois o meio de montagem pode secar rapidamente. Use EPI conforme na etapa 1.1 e realize este passo sob capela química.
Secagem ao ar e microscopia de luz: Deixe as lâminas secarem ao ar na capela por pelo menos 2 h antes da avaliação e da obtenção de imagens usando microscopia de luz. Uma vez secas, as lâminas montadas podem ser armazenadas em caixas de lâminas à temperatura ambiente por anos.

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Resultados

A IHC de uma única cor utilizando o sistema de detecção cromogênico baseado em HRP produziu marcação clara e reprodutível em seções de tumor cerebral FFPE 005. Imagens representativas da marcação de antígenos de superfície são mostradas na Figura 1, demonstrando a detecção bem-sucedida de marcadores de linfócitos T (CD3, CD4, CD8), marcadores de macrófagos associados ao tumor (TAM) (CD68, F4/80) e a molécula do ponto de controle imune ligante da morte programada 1 (PD-L1). Em todos os casos,...

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Discussão

Este estudo descreve um fluxo de trabalho cromogênico de IHC baseado em substrato detalhado e reprodutível para detecção simples e dupla de antígenos superficiais e intracelulares em tecidos de tumores cerebrais em parafina (FFPE) derivados de um modelo ortotópico de CSG. O objetivo principal deste estudo foi metodológico, visando estabelecer um protocolo prático, passo a passo, para detecção confiável de antígenos por métodos cromogênicos em tecidos de GMB imunocompetentes.

A IHQ cromogênica ...

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Divulgações

S.D.R. é co-inventor de patentes relacionadas a vírus do herpes simples oncolíticos, detidas e administradas pela Georgetown University e pelo Massachusetts General Hospital, que receberam royalties da Amgen e da Acti\Vec Inc., e atuou como consultor e recebeu honorários da Replimune, Cellinta e Greenfire Bio, além de honorários e participação acionária da EG 427. Os demais autores declaram que este manuscrito foi preparado na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um possível conflito de interesse.

Agradecimentos

D.S. recebeu apoio parcial de um fundo do College of Science and Technology da North Carolina Agricultural and Technical State University (NCA&T), da Bolsa de Pós-Graduação para Docentes (GRADS-4C) na NCA&T e de uma concessão do NIH (1R16NS147983-01). Da mesma forma, S.D.R. foi apoiado em parte pela Cátedra Thomas A. Pappas em Neurociências, enquanto R.H.N. foi apoiado em parte por uma concessão do NIH (1R35GM153737). Agradecemos ao Dr. Inder Verma e ao Dr. Yasushi Soda pelos GSCs 005.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Garrafas de vidro de 2 L	Corning	CORN1395-2L	Utilizadas para preparação e armazenamento de DPBS 10×, DPBS 1×, água destilada e tampão de citrato de sódio
Béquer de vidro Pyrex de 2 L	Corning	1000-2L	Utilizado para recuperação de antígeno mediada por micro-ondas no tampão de citrato de sódio (volume de trabalho de 600–800 mL)
Soro normal de cavalo 2,5% ou soro normal de cabra			Estes são fornecidos prontos junto com os anticorpos secundários da Vector Laboratories. Utilizados para bloqueio específico da espécie e diluição de anticorpos, dependendo da espécie de origem do anticorpo secundário (IgG anti-coelho ou anti-rato), a fim de minimizar a ligação inespecífica e a coloração de fundo
Peróxido de hidrogênio a 30% (H₂O₂)	Fisher Scientific	BP2633500
Garrafas de vidro de 500 mL	VWR International	VWRU10754-818	Utilizadas para preparação e armazenamento de reagentes inflamáveis para IHC de cor única e reagentes livres de xilol para IHC de dupla cor
Papel absorvente para bancada com Kimwipes			Utilizado durante os procedimentos de coloração para remover excesso de anticorpo ou solução de lavagem das seções de tecido antes das incubações subsequentes, minimizando o arraste de reagentes e a contaminação cruzada
Anti-CD3e	Abcam	ab5690
Anti-CD4	eBioscience	14-9766-80
Anti-CD68	Abcam	ab125212
Anti-CD8a	eBioscience	14-0808-80
Anti-Cleaved caspase-3	CST	9661
Anti-F4/80	Abcam	ab111101
Anti-FoxP3	Abcam	ab54501
Anti-GFP	Abcam	ab183734
Anti-Granzyme B	Abcam	ab4059
Anti-Ki67	Abcam	ab16667
Anti-NeuN	CST	24307
Anti-PD-L1	Abcam	ab205921
Anti-pSTAT1	CST	9167
Anti-T-bet	Abcam	ab91109
AP anti-IgG de coelho	Vector Laboratories	MP-5401
AP anti-IgG de rato	Vector Laboratories	MP-5404-15
Solução bloqueadora BLOXALL	Vector Laboratories	SP-6000-100	Utilizada principalmente em IHC de dupla cor para inibir a atividade de peroxidase e fosfatase alcalina endógenas
Albumina sérica bovina (BSA)	Bioworld	22070007-2	Utilizada para preparar tampão bloqueador universal a 5% para reduzir a ligação inespecífica
Meio de montagem permanente Cytoseal 60	Electron Microscopy Sciences	18006	Meio de montagem compatível com xilol, utilizado para IHC de cor única
Substrato e cromógeno DAB	DAKO	K346811-2	Utilizado para detecção cromogênica de cor única baseada em HRP. Preparar imediatamente antes do uso, adicionando 1 gota de cromógeno a 1 mL de substrato DAB, conforme instruções do fabricante’s. A solução de trabalho não utilizada deve ser descartada após a preparação. O DAB é um potencial carcinógeno e deve ser manipulado de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança e segurança química
Água destilada			Utilizada para preparação de reagentes, lavagens e preparação de tampões. Água ultrapura ou Milli-Q também pode ser utilizada
DPBS (salina tamponada com fosfato de Dulbecco’s)	Corning	55-031-PC
Etanol, prova 200	Decon Labs	2701
Lâminas microscópicas Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Lâminas de vidro microscópicas com carga positiva para seções de tecido
Cobrelâminas de vidro	Corning ou Milipore Sigma		Os tamanhos apropriados devem ser selecionados com base no número de seções de tecido por lâmina. Tamanhos comuns incluem: 24 mm × 24 mm (uma seção de tecido), 24 mm × 40 mm (duas seções de tecido), 24 mm × 50 mm (três seções de tecido)
Hematoxilina	Fisher Scientific	220-102
Histo-Clear (1 L)	Electron Microscopy Sciences	64111-01	Agente de clareamento livre de xilol utilizado para IHC de dupla cor. Preparar duas garrafas de 500 mL rotuladas como Histo-Clear I e Histo-Clear II
HRP anti-IgG de camundongo	Vector Laboratories	MP-7402-15
HRP anti-IgG de coelho	Vector Laboratories	MP-7401
HRP anti-IgG de rato	Vector Laboratories	MP-7444-15
Câmaras umidificadas	Stellar Scientific	HS-120879	Para incubação de seções de tecido com anticorpos primários e secundários
Caneta de barreira hidrofóbica (caneta PAP)	Vector Laboratories	H-4000	Utilizada para criar uma barreira repelente à água ao redor das seções de tecido, retendo anticorpos e reagentes durante a incubação e prevenindo contaminação cruzada entre múltiplas seções de tecido na mesma lâmina
Kimwipes	Kimtech Science	34155	Utilizados para remoção suave de reagentes residuais e tampão de lavagem das seções de tecido
Agitador magnético	IKA	I-10001529	Para preparação de soluções estoque de citrato de sódio e DPBS
Forno de micro-ondas	Panasonic (Modelo: NN-L931BF)	SN: 6H61050036	Capacidade de 2,2 pés cúbicos. Necessário para recuperação de antígeno mediada por calor usando um béquer de vidro de 2 L
Microscópio de luz Nikon	Nikon	SN: 707798	Nikon Eclipse Ci-L sn: 707798, Sola light engine 5M5-LCR-VA sn: 11787, Software: NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Câmeras: Nikon DS-Fi3 sn: 110865 (colorida) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (P&B)
Medidor de pH	VWR International	77619-152	Para ajuste do pH do tampão de recuperação de antígeno
Papel plástico	Fisher Scientific	01810	Utilizado para cobrir parcialmente o tampão de recuperação de antígeno durante o aquecimento em micro-ondas, minimizando a evaporação e prevenindo o ressecamento do tecido
Gradilhas de polioximetileno (POM) para lâminas	Mopec	SP234	Compatíveis com os recipientes de coloração acima; cada gradilha comporta até 24 lâminas microscópicas
Balança de precisão	Mettler Toledo	30697420	Para pesagem de citrato de sódio e pó de DPBS
Refrigerador	Thermo Scientific	TSG3005CA	Para armazenamento de reagentes e anticorpos sensíveis à temperatura
Caixas de armazenamento de lâminas	Fisher Scientific	22-267294
Recipientes/descartáveis para coloração	Mopec	SP233	Cada recipiente acomoda uma gradilha de coloração com 24 lâminas
Barra de agitação	Fisher Scientific	14-512-128	Para preparação de soluções estoque de citrato de sódio e DPBS
Dihidrato de citrato de trissódio	Thermo Scientific Chemicals	AA3643936
Tween 20	Thermo Scientific	AAJ20605AP
Meio de montagem permanente VectaMount PT	Vector Laboratories	H-5600-60	Meio de montagem permanente livre de xilol utilizado para IHC de dupla cor
Kit de substrato de fosfatase alcalina Vector Blue	Vector Laboratories	SK-5300	Utilizado para desenvolvimento de sinal cromogênico azul durante IHC de dupla cor baseada em AP. Como o Vector Blue é parcialmente solúvel em xilol, agentes de clareamento e meios de montagem livres de xilol devem ser utilizados em protocolos de coloração de dupla cor
Kit de substrato de fosfatase alcalina Vector Red	Vector Laboratories	SK-5100	Utilizado para desenvolvimento de sinal cromogênico vermelho durante IHC de dupla cor baseada em AP
Xilol (1 L)	StatLab	8400-1	Utilizado como agente de desparafinização e clareamento para IHC de cor única. Preparar duas garrafas de 500 mL rotuladas como Xilol I e Xilol II

Referências

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Reimpressões e permissões

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