Microagulhas de dispersão Raman Superficialmente Responsivas a Redox para monitoramento das respostas de acupuntura em ratos com tolerância à glicose comprometida

Resumo

Este estudo exploratório com modelos de ratos apresenta uma microagulha ativa com dispersão Raman Superficial Aprimorada (SERS) sensível ao redox para intervenção simultânea de acupuntura e acompanhamento ratiométrico dos índices SERS relacionados à capacidade oxidativa local e potencial redox em ratos com tolerância à glicose comprometida.

Resumo

A tolerância à glicose comprometida (IGT) está associada a uma homeostase redox perturbada e aumento do estresse oxidativo, mas o acompanhamento dinâmico in vivo das alterações associadas ao redox durante a intervenção de acupuntura continua sendo tecnicamente desafiador. Este estudo desenvolveu um sistema de microagulhas ativas com dispersão Raman aprimorada na superfície (SERS) sensível à redox para intervenção simultânea de acupuntura e acompanhamento relativo de fatores SERS relacionados à capacidade oxidativa (CO) e potencial redox (RP) em ratos com IGT. Sondas SERS sensíveis a oxidativas e redox foram preparadas funcionalizando nanocascas de ouro (GNS) com p-fenilendiamina (p-PDA) para resposta ao CO e antracinona para resposta ao RP, respectivamente. As sondas foram carregadas em dois sulcos gravados em agulhas de acupuntura para construir microagulhas ativas para SERS. Ratos machos de Sprague–Dawley livres de patógenos específicos foram usados neste estudo exploratório. Três ratos atuaram como controles normais, e 20 ratos foram alimentados com dieta rica em gordura e receberam estreptozotocina (STZ) para induzir a IGT. Após a triagem, 18 ratos IGT elegíveis foram divididos em grupos de dieta rica em gordura e de dieta normal, com 9 ratos por grupo dietético. Cada grupo da dieta foi ainda dividido em subgrupos torção de pontos de acupuntura, torção sem local de acupuntura e inserção direta de pontos de acupuntura, com 3 ratos por subgrupo. O needling foi realizado duas vezes ao dia por 7 dias consecutivos, e foram registrados índices de glicose no sangue em jejum (FPG), glicose pós-prandial de 2 h (2hPG) e SERS relacionados a OC e RP. Os resultados mostraram que o agulhamento nos pontos de acupuntura com torção estava associado a valores mais baixos de FPG e 2hPG e alterou índices SERS relacionados a OC e RP neste modelo de rato IGT. Como curvas de calibração externas, ensaios bioquímicos independentes de estresse oxidativo, testes de lixiviação por sonda e ensaios de biocompatibilidade não foram incluídos, as razões SERS devem ser interpretadas como índices ópticos relativos associados ao redox, em vez de concentrações bioquímicas absolutas ou valores absolutos do potencial redox. Esses achados apoiam a viabilidade das microagulhas ativas no SERS como uma plataforma pré-clínica exploratória para combinar intervenção por acupuntura com rastreamento SERS racional local em ratos IGT.

Introdução

A tolerância à glicose comprometida (IGT), uma diminuição na capacidade do corpo de tolerar a glicose, representa uma etapa de transição entre a glicose no sangue normal e a glicose^{diabética 1}. A IGT é, portanto, um sinal chave de alerta precoce e uma etapa reversível no desenvolvimento do diabetes^{tipo 2} 2. Dados clínicos mostram que aproximadamente 30% da população com IGT progredirá para diabetes tipo 2 em 5–10 anos³; No entanto, com intervenção oportuna, essa porcentagem pode ser reduzida para menos de 10^%.

A IGT é um processo dinâmico e complexo, e um ambiente persistente de alta glicose é um gatilho chave para distúrbios do metabolismo^{oxidativo 5}. Quando o corpo está em um estado prolongado de hiperglicemia, a cadeia respiratória mitocondrial funciona de forma anormal, e a taxa de geração de espécies reativas de oxigênio aumenta em 30–50%, aumentando diretamente o poder oxidativo^{do corpo 6}; Simultaneamente, altos níveis de açúcar inibim a atividade de enzimas-chave, como a glutationa redutase, impedindo que o sistema antioxidante remova o excesso de espécies reativas de oxigênio em tempo hábil e prejudicando ainda mais o equilíbrio oxidação-redutor. Além disso, a IGT é acompanhada de alterações patológicas, incluindo resistência à insulina e comprometimento leve da função β-celular, resultando em uma variedade de respostas biológicas e^{bioquímicas 7,8}. Juntamente com a evolução do estado redox, essas mudanças agravam ainda mais a interrupção do metabolismo da glicose e aumentam o risco potencial de complicações do diabetes, incluindo retinopatia, nefropatia e doenças^{cardiovasculares 9,10}. Portanto, monitorar a capacidade oxidativa (CO) e o potencial redox (RP) em indivíduos ou modelos animais com GUI deve melhorar nossa compreensão dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento da IGT e orientar o desenho de estratégias terapêuticas direcionadas.

A acupuntura tem uma história de mais de 3.000 anos e demonstrou boa eficácia clínica no tratamento de muitas doenças¹¹. Além disso, inúmeros estudos experimentais em animais demonstraram que a acupuntura exerce efeitos benéficos na regulação dos estados de estresse oxidativo em modelos animais, aprimorando o sistema enzimático antioxidante e reduzindo a peroxidação^{lipídica 12}. Como prática médica tradicional chinesa, a acupuntura também demonstrou benefícios significativos no tratamento do diabetes e da IGT. Pontos de acupuntura Guanyuan (CV4) e Sanyinjiao (SP6) foram relatados como ativando a via SIRT1/PGC-1α no músculo esquelético, aliviando assim a resistência à insulina em camundongos com^{obesidade-diabetes 13}. Além disso, os pontos de acupuntura de Tianshu (ST25) modulam a atividade dos neurônios inibidores da glicose localizados na região hipotalâmica lateral e contribuem para a regulação do metabolismo dos^{glicolipídios 14}. No entanto, a maioria dos estudos sobre os mecanismos da acupuntura intravascular tem focado principalmente nos sistemas neuromodulador, imunomodulador e gastrointestinal, nos quais a acupuntura pode afetar o metabolismo da glicose por meio da modulação da função autonômica ou regular indiretamente os níveis de glicose no sangue ao melhorar o equilíbrio da flora intestinal^15,16. O mecanismo específico do efeito da acupuntura no tratamento com IGT e seus efeitos sobre o estresse oxidativo careceram de investigação aprofundada e suporte de dados experimentais.

O espalhamento Raman aprimorado na superfície (SERS) proporciona grande sensibilidade e especificidade, o que permite a detecção de uma grande variedade de analitos. Nanosondas SERS baseadas em nano-fibras ópticas¹⁷, membranas de quitosano¹⁸ e estudos anteriores demonstraram que agulhas^{de acupuntura 19} podem ser usadas para a detecção de biomarcadores, neurotransmissores e outros aspectos da bioquímica celular in vivo. Agulhas de acupuntura, em particular, representam ferramentas promissoras para testes de tecidos profundos, permitindo monitoramento in situ minimamente invasivo seguido de análise ex vivo. A acupuntura, como método terapêutico bem estabelecido, possui uma gama extremamente ampla de aplicações clínicas. Estudos recentes mostraram que fibras ópticas, curativos e dispositivos de microagulha habilitados para SERS podem suportar o rastreamento in situ ou minimamente invasivo de sinais associados ao redox em contextos biologicamente^{relevantes 20,21}. Paralelamente, agulhas de acupuntura ativas com SERS e sistemas relacionados de microagulhas emergiram como portadores promissores para integrar a capacidade de detecção com intervenção^{tecidual 19}, resultando em microagulhas ativas em SERS com resposta in vivo e capacidade de detecção in vitro de SERS.

O presente estudo se baseia na estratégia de microagulha ativa SERS-ativa, já relatada anteriormente, para detectar sinais relacionados à capacidade oxidativa e potencial redox em modelos de estresse induzido por glicose. No entanto, o presente trabalho difere do estudo anterior tanto no contexto biológico quanto no propósito experimental. Especificamente, este estudo aplica a plataforma de microagulhas SERS-ativa a um modelo de rato com tolerância à glicose comprometida e integra o acompanhamento local do SERS racionalizado com intervenção por acupuntura. O estudo atual compara ainda pontos de acupuntura com locais adjacentes não relacionados à acupuntura, avalia diferentes manipulações de agulhamento e monitora os índices SERS associados ao redox durante um período de intervenção de 7 dias. Comparado com fibras ópticas baseadas em SERS, curativos e microagulhas ativas em SERS, projetadas principalmente para detecção bioquímica em sítio único ou função única, a plataforma atual oferece dois avanços. Primeiro, as sondas responsivas a OC e RP são integradas em dois sulcos gravados independentes em uma única agulha de acupuntura, permitindo o monitoramento simultâneo dos parâmetros redox complementares. Segundo, a agulha de acupuntura funciona não apenas como portadora da sonda SERS, mas também como um dispositivo terapêutico, permitindo que o monitoramento redox seja realizado durante a intervenção de acupuntura, e não após o tratamento. Como mostrado na Figura 1, após a inserção das microagulhas nos tecidos, pequenas feridas são produzidas, e as sondas nas duas ranhuras reagem com os tecidos, permitindo que detectem níveis de CO e RP in vivo. O objetivo do estudo foi usar essas microagulhas ativas no SERS para examinar mudanças no CO e RP em ratos com IGT e determinar os efeitos da acupuntura associada a pontos de acupuntura nesses animais, obtendo assim valiosos insights sobre o mecanismo dos efeitos da acupuntura no tratamento da IGT e a relação entre redox e estados hiperglicêmicos anormais.

Protocolo

Animais e modelos da IGT

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Pesquisa da Universidade Sudeste de Suzhou (aprovação nº SEU-IACUC-20250318007) e foram realizadas de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Os ratos foram obtidos e alojados sob condições de livre de patógenos específicos (FPS) a 25 °C, com um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Para procedimentos que exigiam anestesia, os ratos eram anestesiados usando isoflurano administrado em oxigênio através de uma câmara de indução e mantidos usando um cone nasal. Isoflurano foi usado a 3% para indução e 1% para manutenção, com a concentração ajustada de acordo com a frequência respiratória e a resposta procedimental.

A profundidade anestésica adequada foi confirmada antes do needling ou injeção pela perda do reflexo de endireitamento e ausência de resposta ao aperto do dedo do pé. Durante a anestesia, o padrão respiratório, a posição do corpo e a recuperação eram monitorados, e os animais eram colocados em um almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. Os animais eram alojados com 2 pessoas por gaiola, com acesso livre a comida e água, a menos que fosse necessário jejum para o teste de glicose. Após a chegada, os ratos foram aclimatados por 1 semana antes da indução do modelo. O bem-estar animal era monitorado diariamente, incluindo atividade geral, tosa, ingestão de alimentos, peso corporal, condição do local de injeção e recuperação após anestesia. Ao final do estudo, os ratos foram eutanasiados de acordo com o protocolo animal aprovado. A eutanásia foi realizada por inalação gradual de CO₂ de preenchimento gradual, seguida pela confirmação da morte usando o método da luxação cervical. Animais que atenderam aos critérios de desfecho humano, incluindo perda de peso severa, imobilidade persistente, respiração anormal, incapacidade de comer ou beber, ou sofrimento severo, foram eutanasiados imediatamente, em vez de serem mantidos até o desfecho programado. Ratos machos de grau específico livre de patógenos de Sprague–Dawley, pesando 200 ± 20 g, foram usados neste estudo. Após 1 semana de aclimatação, os ratos foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: os três ratos do grupo normal foram alimentados com comida normal, enquanto os 20 ratos do grupo modelo foram alimentados com comida rica em gordura (50% comida basal + 10% banha + 25% sacarose + 15% gema em pó) por 3 semanas. Os animais do grupo modelo receberam injeção intraperitoneal de 20 mg/kg de solução STZ a 2% (solubilizada em 0,1 mol/L, tampão de citrato pH 4,4) por 12 horas, após 12 horas de jejum sem restrição de água. Os do grupo normal receberam uma injeção intraperitoneal da dose correspondente de solução tampão de citrato após serem alimentados com comida normal. Um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) foi realizado uma semana depois. Reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

A glicose no sangue em jejum (FPG) foi medida pela coleta de sangue na ponta da cauda de ratos de cada grupo após 12 horas de jejum sem restrição de água, e 2 horas de glicose pós-prandial (2hPG) foram registradas após injeção intraperitoneal de 20% de dextrose 2 g/kg. No grupo normal, a faixa de FPG era de 5,1–6,6 mmol/L, e a faixa de glicose de 2hPG era de 7,3–9,4 mmol/L, comparado a um FPG de ≤7,0 mmol/L e uma faixa de 2hPG de 10–16 mmol/L no grupo modelo. Entre os 20 ratos designados para indução modelo de IGT, 18 atenderam aos critérios pré-definidos de IGT após o IPGTT e foram incluídos no experimento de intervenção subsequente. Dois ratos foram excluídos porque seus valores de FPG ou 2hPG estavam fora da faixa pré-definida de IGT. Os 18 ratos elegíveis foram então aleatoriamente designados para um grupo com dieta rica em gordura e um grupo com dieta normal, com 9 ratos por grupo. Cada grupo da dieta foi ainda dividido em três subgrupos: torção de ponto de acupuntura, torção não de local de acupuntura e inserção direta de pontos de acupuntura, com três ratos por subgrupo. Este foi um estudo exploratório de desenvolvimento de métodos projetado para avaliar a viabilidade de combinar intervenção por acupuntura com rastreamento ratiométrico baseado em SERS em um modelo pré-clínico de ratos IGT. Nenhum cálculo formal de potência estatística foi realizado. O tamanho do subgrupo de três ratos foi selecionado com base na viabilidade, estudos preliminares de SERS-microagulhas e no princípio de redução animal. Ratos foram designados aleatoriamente pelo experimentador; não foram realizados ocultamentos formais de alocação e cegueira.

Os protocolos de tratamento com acupuntura foram avaliados com base em diretrizes de prática clínica baseadas em evidências para a medicina tradicional chinesa e na viabilidade de experimentos com^{animais 22}. Os pontos de acupuntura selecionados foram Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), Tianshu bilateral (ST25), bilateral Shuidao (ST28) e bilateral Zusanli (ST36). RN12, RN9 e RN7 estavam localizados na linha média anterior e tratados como pontos únicos da linha média, enquanto ST25, ST28 e ST36 foram tratados bilateralmente. Os pareamentos de pontos de acupuntura foram baseados nos usados para o tratamento clínico da IGT²³. A adaptação foi baseada na literatura^24,25, utilizando o método dicotômico. Para ratos, os pontos de acupuntura foram localizados de acordo com marcos anatômicos e conversão proporcional a partir das localizações padrão dos pontos de acupuntura humanos. Os pontos RN/CV abdominais foram identificados ao longo da linha média anterior usando o processo xifoide, umbílico e sínfise púbica como marcos anatômicos. ST25 foi marcado bilateralmente no nível umbilical, e ST28 foi marcado bilateralmente na região inferior do abdômen, na mesma distância lateral da linha média anterior. ST36 foi identificado no membro posterior anterolateral na região anterior do tibial, lateral ao tubérculo tibial. Locais de comparação adjacentes sem acupuntura foram marcados com 5 mm de lateral aos pontos de acupuntura correspondentes e fora da linha do meridiano reconhecido, evitando vasos visíveis, cicatrizes e locais de perfuração anteriores. Antes da agulhada, os ratos eram anestesiados com isoflurano conforme o protocolo animal aprovado e colocados em posição supina sobre uma almofada térmica. A pele abdominal e dos membros posteriores sobre cada local alvo foi raspada e desinfetada com etanol a 75%. Microagulhas ativas com SERS foram inseridas aproximadamente perpendicularmente à pele até uma profundidade de aproximadamente 10 mm. Para os grupos de torção dos pontos de acupuntura, microagulhas ativas no SERS foram inseridas nos pontos de acupuntura selecionados e giradas suavemente bidirecionalmente durante o período de retenção de 20 minutos. Para os grupos sem locais de acupuntura, o mesmo procedimento foi realizado nos locais de comparação de 5 mm adjacentes sem acupuntura. Para os grupos de inserção direta, microagulhas ativas com SERS foram inseridas nos pontos de acupuntura e mantidas por 20 minutos sem torção. Todos os procedimentos de agulhamento foram realizados pelo mesmo operador treinado para minimizar a variação entre operadores.

Agulhamento era realizado duas vezes ao dia, às 10h e 15h, por 7 dias consecutivos. Antes de cada procedimento diário, a FPG foi medida após 8 horas de jejum sem restrição de água. Após cada procedimento de agulhamento diário, as respostas de OC e RP foram registradas. No sétimo dia, após o tratamento de acupuntura, foi realizada a IPGTT, e foram registrados valores de 2hPG.

Advertências

A estreptozotocina é perigosa e deve ser tratada como um produto químico tóxico. Prepare a solução de estreptozotocina em um exaustor químico ou em um armário certificado de biossegurança, enquanto usa jaleco, luvas de nitrilo, óculos de proteção e máscara. Seringas, agulhas, lenços contaminados com estreptozotocina, camas de cama, gaiolas e resíduos relacionados a animais devem ser manuseados de acordo com procedimentos institucionais de resíduos biológicos e químicos perigosos. Agulhas e seringas usadas devem ser descartadas imediatamente em recipientes de perfis resistentes a perfuração, sem recobrir a tampo.

Fabricação de microagulhas ativas SERS para a detecção de CO e RP

Agulhas de acupuntura foram preparadas, conforme relatado^{anteriormente, 26}. Microagulhas ativas com SERS foram fabricadas utilizando o mesmo tipo de agulhas comerciais de aço inoxidável (0,25 mm × 26 mm) durante todo o estudo. As agulhas eram inseridas aproximadamente perpendicularmente à pele, com uma profundidade de 10 mm. Para grupos de torção, a rotação bidirecional manual foi aplicada suavemente e de forma consistente por 20 minutos durante o período de retenção pelo mesmo operador treinado. A manipulação não era controlada por instrumentos; portanto, a frequência e amplitude exatas da rotação não foram quantificadas. Essa limitação foi reconhecida na Discussão.

Inicialmente, as agulhas foram embebidas em uma solução de PMMA a 20% (p/v) em MMA, seguidas de secagem em temperatura ambiente (25 °C) por 1 dia. Em seguida, duas reentrâncias paralelas de tamanho uniforme e forma e profundidade semelhantes na camada protetora de PMMA (separadas por 5 mm) foram feitas usando uma pequena lâmina de faca artesanal que havia sido limpa com etanol; depois, as agulhas eram submersas em ácido sulfúrico de 0,5 M, servindo como eletrólito por 10 s para sofrer gravação eletroquímica a uma tensão de 12 V, gerando assim dois sulcos quase circulares nos locais de marca. Terceiro, após enxaguar em três ocasiões, as agulhas foram imersas em temperatura ambiente por 24 horas em uma solução de etanol contendo 0,1 mol L⁻¹ MPTES e 0,3 mol L⁻¹ APTES, conferindo assim funcionalidade sulfhidril às superfícies sulcadas. Quarto, o revestimento foi removido mergulhando a agulha no MMA. Microagulhas ativas SERS-responsivas ao potencial redox foram preparadas com base em um método²⁷ previamente relatado. O substrato SERS foi adsorvido em uma das ranhuras gravadas de cada agulha de acupuntura, após o que as microagulhas ativas para SERS resultantes eram submersas em uma solução aquosa de p-PDA a uma concentração de 1 × ^10-4 mol/L por 60 minutos a 37 °C, resultando em microagulhas SERS ativas responsivas à oxidação. Substratos SERS baseados em nanocascas de ouro foram sintetizados conforme descrito^{anteriormente, 28}. No presente trabalho, essas microagulhas foram pingadas na outra ranhura de cada agulha de acupuntura, que depois foram deixadas secar naturalmente. Isso gerou microagulhas ativas em SERS com resposta a CO e RP.

Avaliação ex vivo da resposta de CO e RP a microagulhas ativas no SERS

As respostas das sondas OC e RP foram avaliadas inserindo as microagulhas ativas no SERS no tecido ex vivo. Para verificar a resposta da sonda OC a mudanças oxidativas, espectros SERS do p-PDA foram registrados antes e depois da oxidação. Espectros das sondas redox SERS também foram adquiridos em uma solução fortemente redutora de_{NaBH 4} e em uma solução fortemente oxidante de HAuCl₄. A seletividade da sonda OC foi avaliada usando agentes redutores, incluindo 1 × ^10-4 M_{FeSO 4}, 1 × 10-4 M_{Na 2}SO₄ e 1 × ^10-4 M ácido ascórbico, e agentes oxidantes, incluindo 1 × ^10-4 M CuSO₄, 1 × ^10-4 M_{H 2O 2}, 1 × 10-4 M FeCl₃, e 1 × ^10-4 M HAuCl₄. Todas as soluções foram preparadas em 20 mM de PBS (pH 7,4), e as sondas foram incubadas com cada solução por 20 minutos a 37 °C. A robustez das microagulhas ativas no SERS foi avaliada registrando as respostas do CO antes e depois da reação com 1 × ^10-4 mol/L de_{FeCl 3} em temperatura ambiente. Esses testes ex vivo e baseados em solução foram usados para confirmar a resposta da sonda em condições controladas. No entanto, eles não reproduzem totalmente a complexidade do microambiente tecidular in vivo, onde variações locais de pH, adsorção de proteínas, componentes da matriz extracelular e outras substâncias biológicas podem afetar os sinais SERS. Portanto, as leituras in vivo de OC e RP foram interpretadas como índices SERS relativos associados ao redox, em vez de medições bioquímicas independentes da matriz.

Detecção de OC e RP em locais de acupuntura e não acupuntura

Para avaliar o desempenho das sondas OC e RP em pontos e pontos não acupunturas, as microagulhas ativas para SERS foram inseridas em ratos saudáveis nos pontos ST36 e RN12, e 5 mm adjacentes a cada um desses pontos, em uma profundidade aproximada de aproximadamente 10 mm, pelo mesmo período de tempo.

Efeitos da torção da agulha na detecção de OC e RP

Para avaliar a resposta das sondas OC e RP sob diferentes técnicas de agulhamento, microagulhas ativas com SERS foram inseridas nos pontos de acupuntura ST36 e RN12 e 5 mm adjacentes a esses pontos em ratos saudáveis, com uma profundidade de cerca de 10 mm. Em cada ponto de acupuntura, uma agulha era torcida, enquanto a agulha correspondente adjacente à ponta não era, e vice-versa (uma agulha adjacente ao ponto de acupuntura era torcida, enquanto sua contraparte no ponto de acupuntura não era). Os sinais SERS das sondas foram coletados no mesmo tempo de inserção para cada agulha.

Alterações no CO e RP em ratos com IGT em relação a pontos de acupuntura, torção da agulha e condições alimentares

Para avaliar os efeitos dos pontos de acupuntura, torção da agulha e condições alimentares sobre o CO e RP de ratos com IGT, ratos do grupo da dieta rica em gordura foram aleatoriamente distribuídos em três grupos (A1, A2 e A3; três ratos em cada grupo), assim como os do grupo da dieta normal (grupos B1, B2 e B3; três ratos em cada grupo). Para ratos dos grupos A1 e B1, microagulhas ativas com SERS foram inseridas nos pontos de acupuntura após a sedação e torcidas por 20 minutos; o mesmo procedimento foi realizado em ratos dos grupos A2 e B2, exceto que as microagulhas foram inseridas 5 mm adjacentes aos pontos de acupuntura. Para ratos em A3 e B3, as microagulhas ativas no SERS foram inseridas nos pontos de acupuntura do rato sem torcer; As agulhas ficaram no lugar por 20 minutos. O agulhamento era realizado duas vezes ao dia, às 10:00 e 15:00, por 7 dias. Antes de cada procedimento diário, um medidor de glicose era usado para registrar os valores de FPG para cada grupo de ratos (após jejum, mas sem restrição de água por 8 horas). Após cada dia de agulhagem, as respostas de OC e RP foram medidas e registradas. No sétimo dia, após a acupuntura, foi realizada a IPGTT em cada grupo de ratos, e os valores de 2hPG foram registrados.

Caracterização e medição

A morfologia das microagulhas ativas em SERS foi examinada com microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os espectros SERS foram adquiridos a 25 °C, usando um espectrômetro Raman configurado com um objetivo de 50× longa distância de trabalho (NA: 0,5) e um laser de 785 nm. Para todas as medições, o tempo de aquisição foi de 10 s, e o sistema Raman operava em uma potência nominal de laser de 600 μW sob a mesma configuração óptica. A potência real do laser entregue à superfície do tecido não foi medida diretamente neste estudo. Portanto, os espectros SERS foram usados para comparações relativas entre grupos sob configurações idênticas de aquisição, e nenhuma conclusão foi tirada sobre a segurança fototérmica absoluta do tecido. As razões de intensidade de duas sondas SERS foram calculadas usando a seguinte abordagem: a razão entre valores de intensidade em 1450 cm⁻¹ e 1500 ^cm−1 foi designada como indicador para OC (I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1), após subtrair a intensidade em 1700 cm⁻¹ (como fundo) de cada um dos dois picos, respectivamente, como em relatórios ^{anteriores, 17}; e usando I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ ^cm−1 como indicador de RP, a intensidade em 1700 cm⁻¹ (como fundo ) foi subtraída de cada um dos dois picos, respectivamente. Os valores calculados I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ e I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ foram analisados como índices relativos derivados do SERS das respostas associadas a OC e RP, respectivamente. Essas razões foram usadas para comparar mudanças entre grupos e pontos de tempo sob configurações idênticas de aquisição.

Nenhuma curva de calibração externa foi estabelecida no presente estudo para converter essas razões em concentrações absolutas de espécies oxidativas ou valores absolutos eletroquímicos de potencial redox. Cada espectro foi registrado duas vezes em cinco pontos diferentes da sonda SERS em três amostras replicadas. O Origin era usado para processar dados e produzir gráficos. Para minimizar a variabilidade relacionada à aquisição, o mesmo comprimento de onda do laser, objetivo, tempo de aquisição, ajuste de potência do laser e fluxo de trabalho de processamento espectral foram aplicados a todos os grupos. Os potenciais efeitos fototérmicos ou fotoquímicos causados pela irradiação a laser não foram quantificados de forma independente e são reconhecidos como uma limitação. Os dados estatísticos são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). O tamanho da amostra e o teste estatístico usado para cada experimento ou painel de figuras são especificados nas legendas correspondentes das figuras. Para experimentos de validação de sonda ex vivo , a sonda SERS ou microagulha preparada independentemente era usada como unidade de análise. Para análises in vivo de glicose no sangue e índice SERS, o rato foi usado como unidade de análise biológica. Espectros coletados em múltiplos pontos da mesma sonda foram tratados como medições técnicas e mediados antes da análise em nível de grupo. Análises estatísticas foram realizadas usando o software SPSS. Comparações entre grupos foram realizadas usando os testes estatísticos indicados nas legendas correspondentes das figuras. Medições seriadas de glicose no sangue em jejum e índice SERS durante o período de intervenção de 7 dias foram interpretadas como tendências longitudinais exploratórias devido ao pequeno tamanho do subgrupo, e nenhum modelo formal de medidas repetidas ou efeitos mistos foi aplicado. A significância estatística foi definida como p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultados

Fabricação de microagulhas ativas SERS para a detecção de CO e RP

Para identificar mudanças no CO e RP, microagulhas ativas em SERS contendo as sondas correspondentes foram fabricadas. Imagens representativas do SEM confirmaram a estrutura de dois sulcos das microagulhas ativas no SERS. A Figura 2A mostra o corpo da agulha de acupuntura com dois sulcos gravados, a Figura 2B mostra um sulco carregado com GNS, e a Figura 2C mostra uma visão ampliada do GNS distribuído dentro do sulco. Essas imagens confirmaram que os sulcos gravados poderiam servir como locais de carregamento localizados para as sondas SERS responsivas a OC e RP. A razão das intensidades de pico I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1 foi usada para representar o grau de oxidação da p-PDA. A Figura 3A mostra espectros SERS de p-PDA antes e depois da interação com 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃, enquanto a Figura 3B apresenta espectros para a sonda redox em 1 × 10⁻³ M NaBH4 e 1 × 10-4 M HAuCl₄ soluções aquosas. A resposta da sonda RP foi expressa como uma razão de intensidade máxima (I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1), que diminuiu com o aumento da RP.

Para avaliar a seletividade da sonda responsiva à capacidade oxidativa, a razão I₁₄₅₀ ^cm−1/I₁₅₀₀ cm⁻¹ foi medida após exposição a diferentes agentes redutores e oxidantes. Medições independentes com sonda foram realizadas com n = 3 por grupo, e a sonda SERS ou microagulha preparada independentemente foi usada como unidade de análise (Figura 3C). Comparado ao grupo CK (teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn), os agentes redutores_{FeSO 4} e Na₂SO₄ não alteraram significativamente a razão I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1 (p > 0,05). O ácido ascórbico (AA, p < 0,001) também produziu uma proporção aumentada sob a condição atual do ensaio, apesar de estar incluído como agente redutor. Portanto, a resposta AA foi interpretada cautelosamente como uma resposta espectral específica da sonda neste ensaio baseado em solução, e não como evidência de comportamento oxidante. Em contraste, reagentes oxidantes ou associados à oxidação aumentaram a razão em graus variados. A razão foi aumentada após exposição a CuSO₄ (p < 0,0001), H₂O₂ (p < 0,0001), FeCl₃ (p < 0,0001) e HAuCl₄ (p < 0,0001). Para avaliar a estabilidade da sonda OC em temperatura ambiente, espectros SERS foram adquiridos em intervalos horários ao longo de um período de 6 horas antes da reação da sonda com 1 × 10⁻⁴ M_{FeCl 3} (Figura 3D), e as correspondentes razões I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1 foram calculadas. Após a adsorção da sonda, o valor inicial permaneceu estável em aproximadamente 0,20 ± 0,02, assim como o da reação com_{FeCl 3} em torno de 0,9 ± 0,10, ao longo do período de 6 horas. Esses resultados sugerem que o p-PDA no GNS é estável no ar.

Respostas OC e RP em pontos de acupuntura e não acupuntura

Estudos anteriores²⁹ mostraram que a sonda OC atinge sua resposta máxima 10 minutos após a inserção. As Figuras 4A e B ilustram a resposta das microagulhas ativas com SERS em ratos saudáveis colocados nos pontos de acupuntura ST36 e RN12, assim como naqueles colocados 5 mm adjacentes aos pontos, por 10 minutos. Para esses experimentos, n = 3 ratos por grupo e espectros coletados de múltiplos pontos na mesma sonda foram tratados como réplicas técnicas e mediados antes da análise em nível de grupo. As microagulhas ativas no SERS responderam efetivamente às mudanças no CO e RP in vivo, sem diferença significativa no CC e RP no grupo dos pontos de acupuntura em relação ao grupo sem pontos de acupuntura (teste t de amostras independentes, p > 0,05).

Para determinar ainda mais os efeitos da torção da agulha no CO e RP locais in vivo, microagulhas ativas com SERS foram inseridas em ratos saudáveis nos pontos de acupuntura ST36 e RN12, e 5 mm além desses pontos, até uma profundidade de 10 mm. Durante a manobra de torção em cada ponto de acupuntura, a agulha adjacente ao ponto não foi torcida, e vice-versa, e mudanças nos valores de OC e RP no ponto da perfuração foram registradas (Figuras 4C–F). Não houve mudanças significativas no CO e RP de acordo com a torção realizada em pontos de acupuntura ou não em ratos saudáveis, nem houve efeito de torção em um ponto adjacente (p > 0,05).

Alterações no CO e RP em ratos com IGT associadas a acupuntura, torção de agulha e condições alimentares

Para confirmar o estabelecimento bem-sucedido de um modelo de rato para IGT, valores de FPG e 2hPG foram registrados usando um ensaio IPGTT em ratos modelo e controle, respectivamente. O grupo controle incluiu n = 3 ratos, e o grupo modelo incluiu n = 18 ratos que atenderam aos critérios pré-definidos para tolerância à glicose comprometida. Os ratos-modelo apresentaram glicose no sangue em jejum mais alta do que os ratos controle (6,92 mmol/L contra 5,54 mmol/L; teste U de Mann–Whitney, p < 0,01) e uma glicemia pós-prandial mais alta em 2 horas do que ratos controle (11,52 mmol/L contra 7,92 mmol/L; Teste U de Mann–Whitney, p < 0,001) (Figura 5), indicando indução bem-sucedida de IGT nos animais modelo.

Para verificar os efeitos da combinação de pontos de acupuntura, torção de agulha e condições alimentares em ratos IGT, foi selecionado um conjunto típico de pares de pontos de acupuntura. Os 18 ratos-modelo elegíveis foram então divididos em grupos de dieta rica em gordura e de dieta normal, com n = 9 ratos por grupo de dieta. Cada grupo dietético foi ainda dividido em três subgrupos de intervenção: torção de ponto de acupuntura, torção de local não de acupuntura e inserção direta de pontos de acupuntura, com n = 3 ratos por subgrupo. Os valores de FPG foram registrados antes de cada dia de agulhamento (Figuras 6A–C), e valores de 2hPG (Figura 6D) foram medidos após 7 dias de agulhamento por ensaio IPGTT em cada grupo. Neste conjunto de dados exploratório, nenhuma diferença clara em FPG ou 2hPG foi observada entre os grupos modelo de dieta rica em gordura e dieta normal após agulhamento nos pontos de acupuntura. Comparações entre agulhamento no ponto de acupuntura e não no local da acupuntura sugeriram que a torção do ponto de acupuntura estava associada a valores mais baixos de glicose no sangue sob as condições experimentais atuais (testes t de amostras independentes, p < 0,05). Como o tamanho do subgrupo era pequeno e a dieta, localização de pontos de acupuntura e manipulação de torção não podiam ser totalmente separadas estatisticamente, esses achados foram interpretados como observações preliminares de modelos animais.

Alterações nos índices SERS relacionados à capacidade oxidativa e ao potencial redox foram monitoradas durante 1 semana de intervenção por acupuntura em ratos IGT. Para essas análises, n = 3 ratos foram incluídos por subgrupo, e cada rato foi tratado como a unidade de análise biológica. Em ratos com dieta rica em gordura, o índice SERS relacionado à capacidade oxidativa diminuiu ao longo do tempo nos grupos de torção do ponto de acupuntura e de inserção direta no ponto de acupuntura, enquanto permaneceu relativamente mais alto no grupo de torção sem sítio de acupuntura (Figura 7A). O índice SERS relacionado ao potencial redox aumentou ao longo do tempo nos grupos de torção do ponto de acupuntura e inserção direta no ponto de acupuntura, enquanto o grupo de torção sem o local da acupuntura apresentou um aumento comparativamente mais fraco (Figura 7B). Tendências semelhantes foram observadas em ratos com dieta normal de IGT. O índice SERS relacionado à capacidade oxidativa diminuiu ao longo do tempo nos grupos de torção do ponto de acupuntura e de inserção direta no ponto de acupuntura, com uma mudança menor no grupo de torção não relacionado ao local da acupuntura (Figura 7C). O índice SERS relacionado ao potencial redox aumentou ao longo do tempo nos grupos de torção do ponto de acupuntura e inserção direta no ponto de acupuntura, enquanto o grupo de torção sem o local da acupuntura permaneceu comparativamente mais baixo (Figura 7D).

Para comparar ainda mais as condições alimentares sob a mesma manipulação de acupuntura, foram comparados os subgrupos de torção dos pontos de acupuntura dos grupos de dieta rica em gordura e da dieta normal. Nessa comparação, o índice SERS relacionado à capacidade oxidativa diminuiu ao longo do tempo em ambas as condições alimentares, com uma diminuição maior observada no subgrupo de torção de pontos de acupuntura da dieta normal até o dia 7 (Figura 7E). O índice SERS relacionado ao potencial redox aumentou ao longo do tempo em ambas as condições alimentares, com um valor mais alto no dia 7 no subgrupo de torção de pontos de acupuntura da dieta normal (Figura 7F). Esses achados sugerem que a torção dos pontos de acupuntura e a normalização alimentar estiveram associadas a mudanças nos índices locais de SERS associados ao redox em ratos IGT. Como cada subgrupo continha apenas três ratos e nenhum ensaio bioquímico independente de estresse oxidativo foi realizado, esses resultados devem ser interpretados como observações exploratórias de modelos animais, e não como evidências bioquímicas definitivas de melhora do estresse oxidativo.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Todos os dados numéricos brutos usados para geração de figuras e análise estatística, incluindo medições de glicose no sangue, valores de razão derivados do SERS e dados de origem para painéis quantitativos de figuras, foram organizados e carregados como Tabela Suplementar 1. Para experimentos de monitoramento contínuo da sonda gerados diretamente pelo instrumento analítico, os valores exportados e as saídas representativas geradas pelo instrumento usados para avaliar o desempenho da sonda estão incluídos no Arquivo Suplementar 1.

Figura 1: Fluxo de trabalho metodológico para intervenção com acupuntura e acompanhamento local de SERS ratiométrico usando uma microagulha SERS ativa de dois sulcos. O esquema ilustra a inserção da microagulha SERS-ativa de dois sulcos em um ponto de acupuntura ou local adjacente não acupuntura, seguida pela aquisição espectral Raman. Os autores criaram essa figura usando o software WPS, e não é necessária licença de direitos autorais. Abreviações: SERS = espalhamento Raman aprimorado pela superfície. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Imagens representativas de SEM de microagulhas ativas com SERS. (A) Corpo de agulha de acupuntura com dois sulcos; barra de escala = 200 μm; ampliação = 77×. (B) Um sulco integrado ao GNS; barra de escala = 20 μm; ampliação = 1.000×. (C) Uma imagem ampliada do sulco em B; barra de escala = 2 μm; ampliação = 30.000×. Abreviações: SEM = microscopia eletrônica de varredura; GNS = nanoconchas de ouro. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Caracterização de sondas SERS responsivas a OC e RP. (A) Espectros normalizados de p-PDA antes e após a interação com FeCl₃. (B) Espectros SERS normalizados de sondas RP em soluções de NaBH₄ e HAuCl₄, respectivamente. (C) I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ para sondas de OC em várias soluções oxidantes e redutoras. n=3 medições independentes de sonda por grupo. Teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste de múltiplas comparações de Dunn versus o grupo CK. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). (D) Avaliação de estabilidade em seis horas da sonda responsiva ao CO antes e depois da reação com FeCl₃. Abreviações: SERS = espalhamento Raman aprimorado pela superfície; CK = teste de controle; p-PDA = p-fenilediamina; AA = ácido ascórbico. p < 0,001, ****p < 0,0001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Índices SERS relacionados a OC e RP medidos com diferentes métodos de agulhamento em locais de acupuntura e não acupuntura em ratos saudáveis. (A) Índice SERS relacionado a OC após inserção direta em pontos de acupuntura e locais adjacentes não acupuntura. (B) Índice SERS relacionado à RP após inserção direta em pontos de acupuntura e locais adjacentes não acupunturas. (C) Índice SERS relacionado a OC após inserção direta em locais não acutúrgicos e torção da agulha nos pontos de acupuntura. (D) Índice SERS relacionado à RP após inserção direta em locais não acupunturas e torção da agulha nos pontos de acupuntura. (E) Índice SERS relacionado a OC após inserção direta nos pontos de acupuntura e torção da agulha em locais adjacentes não acupunturas. (F) Índice SERS relacionado à RP após inserção direta nos pontos de acupuntura e torção da agulha em locais adjacentes não acupunturas. OC foi calculado como_{I 1450} ^cm-1/I₁₅₀₀ ^cm-1, e RP foi calculado como_{I 1606} ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1. n=3 em cada grupo. Os dados são apresentados como média ± MEB. Não foram observadas diferenças significativas entre as comparações pareadas. Abreviações: OC = capacidade oxidativa; RP = potencial redox. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Valores FPG e 2hPG de acordo com o ensaio IPGTT em ratos modelo e controle (CK). FPG e 2hPG foram medidos para verificar o estabelecimento do modelo de ratos com tolerância à glicose comprometida. n = 3 ratos no grupo controle e n = 18 ratos no grupo modelo. A análise estatística foi realizada pelo teste Mann–Whitney U, e os resultados são apresentados como a média ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Valores de FPG e 2hPG para ratos IGT durante procedimentos de acupuntura. (A) Valores de FPG para o grupo que recebe acupuntura com torção de agulha nos pontos de acupuntura e inserção direta de agulha nos pontos de acupuntura (n = 3 por grupo). (B) Valores de FPG para grupos que recebem agulhamento com torção nos pontos de acupuntura e pontos não acupunturas (n = 3 por grupo). (C) Valores de FPG para os grupos de dieta rica em gordura e normal (n = 3 por grupo). (D) Dias 7 Valores de 2hPG em ratos com dieta rica em gordura e dieta normal sob as condições de torção de ponto de acupuntura, torção sem local de acupuntura e inserção direta em ponto de acupuntura. (n = 3 por grupo). Os resultados são apresentados como a média ± SEM. Comparações planejadas de pontos finais par a par no painel D foram analisadas usando um teste t de Student bidirecionado sem pareamento. *p < 0,05. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Mudanças no CO e RP de ratos em cada grupo durante 1 semana de acupuntura. (A) Mudanças no CO em ratos IGT com dieta rica em gordura. (B) Alterações na RP em ratos IGT com dieta rica em gordura. (C) Mudanças no CO em ratos com dieta normal de IGT. (D) Alterações na RP em ratos IGT de dieta normal. (E) Comparação do índice SERS relacionado ao CO entre as condições de dieta rica em gordura e normal dentro do subgrupo de torção de pontos de acupuntura; (F) Comparação do índice SERS relacionado à RP entre as condições de dieta rica em gordura e normal dentro do subgrupo de torção de pontos de acupuntura. n = 3 ratos por subgrupo. Os dados são apresentados como média ± SEM. Medições seriais foram interpretadas como tendências longitudinais exploratórias. Abreviações: OC = capacidade oxidativa; RP = potencial redox. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Saídas representativas geradas pelo instrumento para avaliação da sonda-resposta. Este arquivo contém resultados representativos de monitoramento contínuo gerados diretamente pelo instrumento analítico e usados para avaliar o desempenho da resposta da sonda. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Tabela de dados brutos para análises quantitativas. Este arquivo contém os dados numéricos de origem usados para geração de figuras e análise estatística, incluindo medições de glicose no sangue, valores de razão derivados do SERS e dados quantitativos de painéis de figuras. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A tolerância à glicose comprometida representa uma etapa de transição reversível antes do diabetes tipo 2 e está intimamente associada ao desequilíbrio metabólico, resistência à insulina e desregulação relacionada ao estresse oxidativo. A intervenção no estilo de vida e outras estratégias terapêuticas precoces podem reduzir o risco de progressão da tolerância à glicose prejudicada para o diabetes, mas as ferramentas para monitorar dinamicamente respostas bioquímicas locais durante a intervenção continuam^{limitadas 30}. A acupuntura tem sido relatada como afetando o metabolismo da glicose e vias relacionadas ao estresse oxidativo em estudos experimentais e clínicos. No entanto, a maioria dos estudos mecanicistas de acupuntura baseia-se em medições finais de sangue ou tecido, e relativamente poucos métodos permitem acompanhamento minimamente invasivo das respostas locais associadas à redox durante a intervenção com acupuntura. Ensaios clínicos anteriores de tratamentos para IGT confirmaram que o risco de diabetes pode ser amplamente reduzido por meio de intervenções no estilo de vida, incluindo modificações alimentares, redução da massa corporal e aumento da atividade^{física 31}. A acupuntura demonstrou ser eficaz na melhoria dos índices metabólicos da glicose e na redução do jejum e do 2hPG. Portanto, a elucidação da relação entre acupuntura, redox e IGT pode fornecer abordagens para reverter a IGT ou intervir em sua progressão, reduzindo assim a incidência de diabetes mellitus, além de fornecer insights sobre a patologia da IGT e os mecanismos subjacentes ao seu desenvolvimento.

O presente estudo propõe uma plataforma Raman ativa, com dispersão de microagulhas com dual-sulco redox sensível à superfície, para combinar intervenção de acupuntura com rastreamento SERS ratiométrico local em um modelo de rato com tolerância à glicose prejudicada. Nesse sistema, dois sulcos gravados em uma única agulha de acupuntura eram usados para transportar sondas responsivas à capacidade oxidativa e ao potencial redox. Esse design permitiu que a agulha de acupuntura funcionasse não apenas como ferramenta de intervenção, mas também como um portador de detecção para leituras ópticas relativas locais associadas ao redox. Os resultados mostraram que agulhamento em pontos de acupuntura com torção estava associado a valores mais baixos de glicose no sangue em jejum e 2hPG, além de alterações nos índices SERS relacionados à capacidade oxidativa e ao potencial redox em ratos com tolerância à glicose com deficiência de açúcar. Esses achados apoiam a viabilidade do uso de microagulhas ativas no SERS para explorar respostas locais associadas à redox durante a intervenção de acupuntura. No geral, os resultados sugerem que o agulhamento nos pontos de acupuntura com torção estava associado a valores mais baixos de FPG e 2hPG e a alterações nos índices SERS relacionados a OC e RP em ratos IGT. Esses achados apoiam a viabilidade do uso de microagulhas ativas no SERS para acompanhar respostas ópticas locais associadas ao redox durante a intervenção de acupuntura. No entanto, como ensaios bioquímicos padrão de estresse oxidativo, análise de lixiviação por sonda e testes de biocompatibilidade tecidual não foram realizados, as mudanças observadas no índice SERS não devem ser interpretadas como prova bioquímica definitiva de melhora do estresse oxidativo.

Várias abordagens alternativas poderiam ser usadas para investigar mais a fundo a mesma hipótese. Ensaios bioquímicos padrão de estresse oxidativo, incluindo medições de espécies reativas de oxigênio, malondialdeído, superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase e razões glutationa/dissulfeto glutationa, poderiam ser usados para validar se mudanças nos índices derivados do SERS correspondem aos biomarcadores convencionais de estresse^{oxidativo 32,33}. Sondas redox eletroquímicas, sensores redox baseados em fluorescência, ensaios de quimioluminescência, microdiálise seguida de análise bioquímica e validação imuno-histoquímica ou histológica baseada em tecidos também podem fornecer informações complementares. Combinar a detecção de microagulha ativa com SERS com essas abordagens independentes ajudaria a determinar se as alterações ópticas observadas refletem alterações bioquímicas redox específicas ou respostas locais mais amplas do tecido ao agulhamento e ao estado^{metabólico 34}.

As aplicações potenciais desse método vão além do modelo atual de tolerância à glicose com deficiência de açúcar. Como o desequilíbrio redox está envolvido em doenças metabólicas, lesão tecidual, inflamação e reparo de feridas, microagulhas ativas com SERS podem fornecer uma ferramenta pré-clínica útil para monitorar respostas locais associadas ao redox em modelos relacionados ao diabetes, estudos de cicatrização de feridas, modelos de doenças inflamatórias e outros contextos de intervenção minimamente^{invasivas 35}. Em pesquisas de acupuntura, a plataforma pode ser útil para comparar pontos de acupuntura, locais não relacionados com acupuntura, diferentes manipulações de agulhamento e diferentes agendas de intervenção. No entanto, essas aplicações permanecem exploratórias e exigem validação técnica e biológica adicional.

Várias limitações devem ser observadas. Primeiro, as leituras de OC e RP foram calculadas como índices ratiométricos derivados do SERS e não foram calibradas contra concentrações padrão de espécies oxidativas ou valores absolutos eletroquímicos de potencial redox. Portanto, os resultados atuais devem ser interpretados como respostas ópticas relativas associadas à redox sob condições idênticas de aquisição, em vez de medições bioquímicas absolutas. Segundo, o microambiente biológico do tecido pode introduzir fontes adicionais de variação do sinal, incluindo mudanças locais de pH, adsorção de proteínas, componentes da matriz extracelular e outros efeitos da matriz. Esses fatores não foram totalmente avaliados em meios contendo soro ou que imitam tecidos. Terceiro, a potência real do laser entregue à superfície do tecido e a mudança local de temperatura durante a aquisição do Raman não foram medidas diretamente; portanto, efeitos fototérmicos ou fotoquímicos potenciais não podem ser completamente descartados. Quarto, a reprodutibilidade em nível de lote da geometria do sulco e da carga da sonda não foi avaliada quantitativamente por imagem de SEM com múltiplas agulhas ou análise de eficiência de carga. Por fim, validação bioquímica independente, análise de lixiviação por sonda e testes locais de biocompatibilidade não foram realizados. Estudos futuros devem estabelecer curvas de calibração em matrizes biologicamente relevantes, correlacionar índices SERS com ensaios padrão de estresse oxidativo e redox, quantificar a lixiviação da sonda, avaliar a compatibilidade local dos tecidos após inserções repetidas e validar o dispositivo em coortes animais maiores. Microagulhas ativas com SERS podem fornecer uma plataforma útil para combinar intervenção de acupuntura com o acompanhamento relativo do SERS dos índices locais associados ao redox em um modelo pré-clínico de ratos com IGT. Calibrações adicionais, validação bioquímica, avaliação de lixiviação de sondas e estudos de biocompatibilidade são necessários antes que monitoramento quantitativo absoluto ou aplicação translacional possam ser reivindicados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Ácido ascórbico	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Medidor de glicose no sangue	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Testes de glicose no sangue	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Sulfato de cobre (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Álcool etílico (≥99,7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Sulfato ferroso (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Glicose (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Peróxido de hidrogênio (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
Cloreto de ferro (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Metacrilato de metila (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Espectrômetro micro-Raman	Renishaw	InVia Raman Microscope
p-Fenilenodiamina (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Polimetilmetacrilato (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Microscópio eletrônico de varredura	Zeiss	ULTRA Plus
Boridreto de sódio (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Sulfito de sódio (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Agulhas de acupuntura de aço inoxidável	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
Software de análise estatística	International Business Machines Corporation	Versão 2021
Estreptozotocina (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Ácido tetracloroáurico (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
Software SPSS	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	versão 26.0
ratos	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Masculino Sprague-Dawley específico livre de patógenos
ração basal	Anuokang Biotech.	SY10001
Banco	MCE	HY-W127601
Sacarose	MCE	HY-B1779
Pó de gema de ovo	MCE	HY-B2235B
Ácido cítrico monoidratado	Sigma-Aldrich	C1909
Citrato de sódio diidratado	Sigma-Aldrich	S4641
Tampão citrato	beyotime	P0086
Soro fisiológico tamponado com fosfato	beyotime	ST448-1L
Isoflurano	Bioss	D54468
Sistema de anestesia isoflurano para animais pequenos	RWD Life Science	R500
Câmara de indução e cone nasal	RWD Life Science	Acessórios compatíveis R500
Almofada térmica	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
Etanol 75%	Boyu Bio.	YB60401
Câmara de eutanásia CO2	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365