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Um Modelo de Laceração Hepática Murina Simplificando a Quantificação da Coagulopatia por Hemorragia Induzida por Trauma, Inflamação e Sobrevivência

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DOI:

10.3791/72215

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25 de setembro de 2026

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1Division of Hematology and Cellular Therapy, Department of Medicine, University of California San Diego

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um modelo reprodutível de laceração hepática em camundongo com hemorragia grave, que integra perda sanguínea, coagulopatia induzida pelo trauma e desfechos de sobrevida. O modelo permite a avaliação de intervenções hemostáticas, incluindo fator VIIa recombinante e ácido tranexâmico, juntamente com avaliações de coagulação, fibrinólise e mortalidade, fornecendo uma plataforma econômica e escalonável para pesquisas mecanicistas e translacionais sobre hemorragia.

Resumo

A hemorragia descontrolada continua sendo uma das principais causas de morte evitável em pacientes traumatizados, e a coagulopatia induzida pelo trauma (TIC) é um fator determinante importante na mortalidade precoce. Modelos experimentais que reproduzam de forma confiável a hemorragia e as respostas coagulopáticas associadas são essenciais para estudos mecanicistas e avaliação de intervenções direcionadas. Aqui, descrevemos um modelo murino padronizado de hemorragia profunda utilizando laceração hepática (LL) reprodutível que provoca hemorragia, a qual pode ser quantificada com precisão, ao mesmo tempo em que se acompanham simultaneamente a coagulopatia sistêmica, marcadores inflamatórios e mortalidade.

Os camundongos são submetidos a uma laparotomia mediana padronizada seguida de LL, e a perda sanguínea é quantificada por meio de esponjas impregnadas com sangue. Marcadores sistêmicos de coagulação, fibrinólise e marcadores inflamatórios são coletados por punção retro-orbital antes e em intervalos seriados pré-especificados após o procedimento. LL com perda sanguínea produz de forma confiável TIC (caracterizada pelo prolongamento do tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), aumento do complexo trombina-antitrombina (TAT), depleção seletiva dos fatores de coagulação (F) V e VIII e ativação da fibrinólise). Paralelamente, a ativação inflamatória é evidenciada pelo aumento da interleucina-6 (IL-6). Além disso, o modelo permite análises de sobrevida após o reparo da incisão mediana.

Como aplicação translacional, o rhFVIIa e o ácido tranexâmico (TXA) são utilizados para demonstrar que o modelo é sensível à correção de sangramento mediante modulação farmacológica dos parâmetros de coagulação e fibrinólise. Em comparação com modelos em animais de grande porte, este sistema murino oferece uma oportunidade econômica, versátil e facilmente escalonável para estudar intervenções inovadoras e direcionadas ao tratamento da hemorragia traumática.

Introdução

O trauma é uma das principais causas de morte e incapacidade em adultos jovens (idade < 45 anos)1,2, sendo a hemorragia incontrolada responsável por grande parte da mortalidade precoce3. Um fator crítico para os maus desfechos em pacientes gravemente feridos é o desenvolvimento da coagulopatia induzida por trauma (TIC)4,5. A TIC é uma desregulação complexa e multifatorial da hemostasia, caracterizada pelo esgotamento dos fatores de coagulação V e VIII6,7, fibrinólise desregulada7,8,9 e ativação inflamatória sistêmica10. A TIC contribui para sangramento contínuo e está associada a maior necessidade de transfusão11, falência de órgãos5 e mortalidade, apesar dos avanços na ressuscitação de controle de danos e nas intervenções terapêuticas5.

Portanto, modelos experimentais que reproduzam de forma confiável o choque hemorrágico com alterações coagulopáticas associadas são essenciais para investigações mecanicistas e avaliação de intervenções hemostáticas direcionadas. Modelos de hemorragia controlada utilizam retirada padronizada de sangue, o que pode não causar lesão tecidual, fator que contribui para a resposta coagulopática sistêmica observada no trauma clínico12. Assim, modelos de hemorragia que incluam lesão de órgãos sólidos devem oferecer maior relevância clínica, desde que o sangramento sustentado e as respostas sistêmicas possam ser avaliados quantitativamente13,14,15,16. Modelos mais complexos de CCI incorporam combinações de lesão cerebral traumática, fraturas de ossos longos ou membros, lesão de tecidos moles, laparotomia e choque hemorrágico controlado, a fim de reproduzir múltiplos componentes do trauma grave17,18. Embora essas abordagens forneçam uma representação mais abrangente do politrauma, seus múltiplos procedimentos de lesão e manipulações fisiológicas podem aumentar a complexidade técnica e a variabilidade experimental.

Apesar de décadas de investigação, os modelos experimentais clinicamente relevantes e reprodutíveis de CCI permanecem limitados e heterogêneos. Revisões têm enfatizado a necessidade de modelos robustos que reproduzam com maior precisão a sequência clínica de lesão tecidual e choque hemorrágico e que apoiem a avaliação de intervenções terapêuticas17,19. Modelos complexos que exigem instrumentação extensiva, incluindo cateterização cardíaca e monitoramento hemodinâmico contínuo, podem fornecer informações fisiológicas detalhadas, mas também requerem equipamentos especializados e manipulações procedimentais adicionais. Para eliminar barreiras à pesquisa em trauma, simplificar a abordagem experimental mantendo as características principais do CCI parece essencial. Aqui, descrevemos um modelo murino padronizado que resulta em choque hemorrágico não controlado14 utilizando LL reprodutível que induz sangramento acentuado e recapitula características-chave do CCI. Este modelo permite a avaliação das respostas de coagulação e inflamatórias, incluindo medidas gerais de coagulação (TTPa e geração de trombina), esgotamento seletivo de fatores de coagulação (FV e FVIII) como uma característica marcante do CCI, marcadores de fibrinólise e perfil de citocinas. Para demonstrar a sensibilidade e relevância deste modelo ao trauma humano, avaliamos os efeitos do rhFVIIa (agente pró-hemostático) e do ácido tranexâmico (agente antifibrinolítico), utilizados na reanimação por trauma, sobre a gravidade da hemorragia, a progressão da coagulopatia e os desfechos de sobrevida.

O modelo também permite a coleta serial e terminal de sangue, possibilitando a avaliação longitudinal das trajetórias de coagulação e inflamação em relação à gravidade da lesão e à intervenção terapêutica. Em conjunto, o modelo fornece um sistema murino reprodutível e escalonável para o estudo da CIT em situações de hemorragia acentuada e para a avaliação de intervenções hemostáticas e farmacológicas direcionadas, utilizando desfechos clinicamente relevantes, incluindo perda sanguínea, coagulopatia, fibrinólise, inflamação e sobrevida.

Em comparação com modelos prévios publicados de laceração hepática murina, incluindo o protocolo descrito por Dyer et al.13, este método introduz diversos avanços metodológicos fundamentais. Estes incluem a medição gravimétrica quantitativa da perda sanguínea, a padronização da gravidade da lesão mediante a normalização da massa hepática lacera em relação ao peso corporal e o perfilamento abrangente da coagulopatia induzida por trauma (TIC), fibrinólise e inflamação. Além disso, o modelo permite amostragem seriada, modulação farmacológica e análises de sobrevida que detalham técnicas de fechamento abdominal, possibilitando a recuperação física em vez da eutanásia. Todos os procedimentos podem ser realizados dentro de uma única abordagem experimental, fornecendo uma plataforma escalonável e translacional para o estudo de hemorragia e intervenções hemostáticas direcionadas.

Protocolo

O Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD) aprovou todos os protocolos com animais. Camundongos C57BL/6J foram criados e mantidos na instalação interna de criação da UCSD. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas, com idade entre 8 e 10 semanas, nos experimentos. Uma visão esquemática do fluxo de trabalho experimental e cronograma é apresentada na Figura Suplementar 1.

OBSERVAÇÃO: Os tamanhos das amostras foram determinados com base em experimentos preliminares, na variabilidade esperada dos pontos finais individuais e na experiência prévia com o modelo de laceração hepática em camundongos. Os tamanhos finais das amostras para os pontos finais experimentais individuais e para os grupos experimentais são fornecidos nas legendas das figuras correspondentes. Para as medições de peso hepático, os dados de múltiplos experimentos independentes foram agrupados para avaliar a consistência entre as coortes experimentais. Para ensaios de coagulação realizados em corridas experimentais separadas, amostras previamente analisadas foram incluídas em diferentes corridas para monitorar a consistência e reprodutibilidade entre ensaios.

1. Preparação pré-experimental

  1. Coleta da amostra basal (Dia -1)
    1. Coletar cerca de 200 µL de sangue por acesso retro-orbital de cada camundongo (8–10 semanas de idade) 24 h antes do experimento para estabelecer os parâmetros basais.
    2. Administrar cerca de 200 µL de solução salina estéril para injeção por via subcutânea após a coleta de sangue.
    3. Mantener os camundongos em gaiolas limpas sob condições laboratoriais padrão, com temperatura controlada de 20–24 °C, umidade relativa de 30%–70% e ciclo de 12 h de luz/12 h de escuro, com acesso ad libitum a alimento e água até o dia do experimento.
  2. Preparação da gaiola (Dia 0)
    1. Transferir o camundongo para uma gaiola limpa forrada com toalhas de papel novas no dia do experimento.
    2. Remover alimento e água 15 min antes do experimento e mantê-los suspensos até a remoção das esponjas de absorção após a cirurgia.

2. Preparação do instrumento e do campo cirúrgico

  1. Esterilização do instrumento
    1. Esterilize os instrumentos cirúrgicos, algodão, aplicadores e papéis de filtro por autoclavação.
    2. Desinfete a superfície cirúrgica utilizando etanol a 70%.
  2. Preparação da mesa cirúrgica
    1. Organize os instrumentos estéreis sobre um campo cirúrgico estéril.
    2. Prepare um recipiente de aço inoxidável com etanol a 70% e algodão estéril para a limpeza intermediária dos instrumentos.
    3. Ative um esterilizador de microesferas e aguarde até que atinja 150 °C para esterilização entre animais.

3. Preparação para manutenção da temperatura

  1. Preparação do tapete térmico isotérmico
    1. Ative o tapete de aquecimento isotérmico imediatamente antes da cirurgia, conforme as instruções do fabricante.
    2. Configure o tapete de aquecimento isotérmico para manter a temperatura corporal do camundongo dentro de uma faixa-alvo de 36–37 °C durante toda a anestesia e cirurgia.
    3. Confirme a distribuição uniforme de calor sobre a superfície do tapete.
    4. Coloque o tapete sobre a plataforma cirúrgica e cubra com um campo estéril.
    5. Conecte a mesa cirúrgica ao sistema de anestesia com isoflurano.

4. Anestesia e procedimentos pré-operatórios

  1. Indução da anestesia
    1. Induza a anestesia colocando o camundongo em uma câmara de indução com 2% de isoflurano em oxigênio a 2 L/min.
    2. Confirme anestesia adequada por meio do reflexo de pinçamento do dedo do pé.
    3. Registre o peso corporal antes da cirurgia.
  2. Administração de analgesia e tratamento
    1. Administre buprenorfina (3,25 mg/kg, via subcutânea) para analgesia.
    2. Prepare agentes hemostáticos conforme necessário.
    3. Para os grupos de tratamento, administre fator VII ativado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg) ou ácido tranexâmico (10 mg/kg) por injeção intravenosa retro-orbital 5 min antes da lesão.
    4. Administre volume equivalente (~100 µL) de solução salina estéril para injeção aos animais controle.

5. Preparação cirúrgica

  1. Preparação do local cirúrgico
    1. Transfira o camundongo anestesiado para a placa cirúrgica posicionada sobre o tapete isotérmico.
    2. Mantenha a anestesia por meio de cone nasal com 1,5%–2% de isoflurano em oxigênio a 2 L/min durante todo o procedimento cirúrgico.
    3. Posicione o camundongo em decúbito dorsal e fixe os quatro membros com fita adesiva.
    4. Depile a região abdominal.
    5. Realize a preparação asséptica utilizando povidona-iodo e etanol 70% em alternância (três ciclos).

6. Procedimento de laceração hepática

  1. Pré-pesagem de materiais
    1. Pré-pese dois tubos de 1,5 mL, incluindo um tubo contendo 0,5 mL de solução salina e um tubo vazio.
    2. Pré-pese três triângulos de absorção primários e dois triângulos de absorção secundários para cada animal e registre sua massa combinada.
    3. Pré-pese um barquinho de pesagem para cada animal para a pesagem subsequente do tecido hepático ressecado.
  2. Indução de lesão hepática
    1. Realize uma laparotomia mediana com aproximadamente 0,5 polegada (12,7 mm) de comprimento para expor o fígado.
    2. Posicione dois triângulos de absorção ao longo das paredes abdominais direita e esquerda, evitando contato com o fígado.
    3. Exteriorize o lobo hepático esquerdo e identifique as margens do lobo para padronizar a extensão da remoção do tecido. Evite lesão tecidual não intencional.
    4. Usando tesoura afiada, lacere aproximadamente 75% do lobo com um único movimento controlado para garantir consistência entre os animais.
    5. Transfira o tecido lacero ressecado para o tubo vazio previamente pesado para quantificação subsequente da gravidade da lesão.
    6. Insira um terceiro triângulo de absorção na cavidade abdominal para facilitar a coleta uniforme de sangue durante a fase de hemorragia.
  3. Fechamento abdominal rápido para manter a hemorragia interna (etapa crítica)
    1. Feche imediatamente a parede abdominal em aproximadamente 10–15 s usando dois clipes cirúrgicos autoclaváveis.
    2. Garanta o alinhamento preciso das bordas da incisão para obter fechamento completo sem lacunas. O fechamento incompleto pode resultar em vazamento externo de sangue e subestimação da perda sanguínea.
    3. Aplicar tensão constante, mas suave, durante o fechamento, evitando compressão do conteúdo abdominal, o que pode alterar a dinâmica da hemorragia.
    4. Reforce o fechamento com adesivo tecidual (2–3 gotas) para garantir um compartimento abdominal completamente selado.
  4. Monitoramento pós-lesão
    1. Pese o tecido hepático ressecado e normalize a medida em relação ao peso corporal para quantificar e confirmar a extensão da lesão hepática.
    2. Retorne o camundongo à gaiola colocada sobre o suporte isotérmico.
    3. Permita que a hemorragia prossiga por 60 min para o grupo de ponto final e o grupo de sobrevivência.

7. Coleta de sangue e quantificação da perda sanguínea

  1. Coleta e processamento da amostra de sangue
    1. Para o grupo de ponto final, reanestesiar o camundongo com isoflurano aos 60 min após a laceração hepática.
    2. Para o grupo de sobrevivência, reanestesiar o camundongo com isoflurano às 6 h e 7 dias após a laceração hepática para coleta de sangue.
    3. Coletar sangue por punção retro-orbital em tubos contendo solução de citrato de sódio (relação sangue-anticoagulante: 9:1) para preparação de plasma.
    4. Centrifugar as amostras a 2.000 × g por 10 min, seguido por uma segunda centrifugação a 12.000 × g por 5 min, para obter plasma pobre em plaquetas para ensaios de coagulação e fibrinólise posteriores.
  2. Medição da perda sanguínea
    1. Reabrir o abdômen aos 60 min após a laceração hepática, tanto para o grupo de ponto final quanto para o grupo de sobrevivência, e remover as esponjas absorventes contendo sangue.
    2. Transferir todas as esponjas impregnadas com sangue para o tubo previamente pesado contendo solução salina estéril.
    3. Utilizar esponjas absorventes adicionais previamente pesadas para coletar o sangue residual dentro da cavidade abdominal.
    4. Pesar o tubo de coleta após a coleta do sangue para obter o peso final do tubo.
    5. Calcular a perda sanguínea utilizando a seguinte equação gravimétrica:
      Perda sanguínea (µL/g) = [(peso final do tubo − peso inicial do tubo – peso da esponja absorvente) / peso corporal do camundongo] × 1000.
      NOTA: Todos os pesos são expressos em gramas. O fator 1.000 converte gramas de sangue em microlitros, assumindo uma densidade sanguínea de aproximadamente 1 g/mL.
  3. Grupo de sobrevivência e desfechos longitudinais
    1. Após a medição da perda sanguínea aos 60 min, fechar imediatamente a incisão utilizando grampos cirúrgicos e adesivo tecidual para garantir um compartimento abdominal completamente selado.
    2. Administrar 400 µL de solução salina estéril por via subcutânea antes da recuperação.
    3. Devolver o camundongo à sua acomodação padrão e monitorá-lo continuamente durante a recuperação da anestesia, avaliando-o aos 2 h, 6 h e 24 h após a cirurgia, seguido de monitoramento diário até o dia 7.

8. Cuidados pós-operatórios

  1. Monitoramento pós-operatório
    1. Monitore continuamente os animais durante a recuperação inicial da anestesia em busca de sinais de sofrimento ou morbidade.
    2. Registre o status de sobrevivência e observações clínicas em cada avaliação programada.
  2. Cuidados de suporte
    1. Administre 400 µL de solução salina estéril por via subcutânea diariamente durante 3 dias.
    2. Forneça analgesia (buprenorfina, 3,25 mg/kg, por via subcutânea) a cada 72 h de acordo com o protocolo aprovado de cuidados com animais.
    3. Mantenha os camundongos em alojamento padrão com acesso ad libitum a alimento e água.
  3. Extremos humanitários
    1. Monitore os animais em busca de extremos humanitários pré-definidos, incluindo letargia grave ou persistente, incapacidade de se locomover ou obter alimento ou água, dificuldade respiratória grave, ausência de resposta ou outros sinais de sofrimento severo conforme especificado no protocolo institucional aprovado de cuidados com animais.
    2. Eutanazie os animais que atingirem os extremos humanitários pré-definidos de acordo com as diretrizes institucionais.
    3. Continue o monitoramento de sobrevivência até o dia 7 ou até que um extremo humanitário seja atingido.

9. Procedimentos finais e coleta de tecidos

  1. Em pontos finais experimentais predeterminados, anestesiar os camundongos e coletar sangue por punção retro-orbital.
  2. Eutanasiar utilizando inalação de CO₂ de acordo com as diretrizes institucionais.
  3. Coletar órgãos e processar os tecidos para análise histológica de acordo com os procedimentos downstream especificados.

10. Ensaios de coagulação, fibrinólise e citocinas

OBSERVAÇÃO: Os reagentes, kits de ensaio e equipamentos utilizados para estes procedimentos estão listados na Tabela de Materiais.

  1. Medição do TTPa
    1. Registre todos os tempos de coagulação utilizando o coagulômetro listado na Tabela de Materiais.
    2. Misture 25 µL de plasma de camundongo com 25 µL do reagente de TTPa e incube por 3 min a 37 °C. Inicie a coagulação adicionando 25 µL de CaCl₂ (25 mM) preparado em HBS (20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7,4) e registre o tempo de coagulação.
  2. Medição da atividade de FV, FII e FX
    1. Misture 5 µL de plasma de camundongo com 20 µL do plasma deficiente no fator correspondente e 25 µL de HBS contendo 0,5% de albumina sérica bovina.
    2. Incube por 1 min a 37 °C e inicie a coagulação adicionando o reagente Innovin listado na Tabela de Materiais.
    3. Determine a atividade do fator em relação ao sistema de calibração/referência correspondente.
  3. Medição do FVIII
    1. Determine o FVIII utilizando um ensaio cromogênico de FVIII de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Medição de fibrinogênio
    1. Determine a concentração de fibrinogênio utilizando o método de Clauss. Adicione 10 µL de plasma de camundongo a 40 µL de solução salina tamponada com HEPES contendo 0,01% de albumina sérica bovina e incube por 3 min a 37 °C.
    2. Inicie a formação do coágulo adicionando 25 µL de trombina (25 U/mL) e determine a concentração de fibrinogênio utilizando a curva de calibração do ensaio.
  5. Medição de biomarcadores plasmáticos
    1. Meça os complexos TAT plasmáticos, complexos PAP e D-dímero utilizando os kits de ensaio comercialmente disponíveis listados na Tabela de Materiais. Realize cada ensaio de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Utilize padrões, calibradores e controles específicos para cada ensaio conforme especificado pelos fabricantes e calcule as concentrações dos analitos a partir das curvas-padrão correspondentes.
  6. Medição de IL-6 plasmática
    1. Meça as concentrações plasmáticas de IL-6 no momento basal e aos 60 min e 6 h após laceração hepática, utilizando o ensaio multiplex de citocinas listado na Tabela de Materiais.
    2. Realize o ensaio de acordo com as instruções do fabricante e analise os dados utilizando o software Q-View do fabricante.

Resultados

O modelo LL resulta em uma gravidade de lesão reprodutível e padronizada em camundongos. Figura 1A demonstra a consistência do peso do fígado lacero quando normalizado pelo peso corporal (%PC), com uma lesão mediana de 1,4% PC entre os grupos experimentais. Essa consistência confirma a indução cirúrgica confiável e permite a reprodutibilidade entre animais e em diferentes condições experimentais. A capacidade de padronizar a gravidade da lesão é essencial para avaliar as respostas fisiológicas subsequentes, independentemente da variabilidade no dano tecidual.

A validação da resposta hemorrágica e da modulação terapêutica dentro do modelo é demonstrada na Figura 1B. Os camundongos foram pré-tratados com solução salina, o agente pré-hemostático rhFVIIa ou o agente antifibrinolítico TXA, e a perda sanguínea foi quantificada e normalizada em relação ao peso corporal (µL/g). Camundongos tratados com solução salina exibiram hemorragia acentuada após LL, enquanto camundongos tratados com rhFVIIa ou TXA demonstraram redução na perda sanguínea. Esses achados demonstram a capacidade deste modelo de detectar modulação farmacológica da hemorragia e de avaliar intervenções hemostáticas em condições de sangramento incontrolável.

O modelo também reproduz características-chave da coagulopatia induzida por trauma. Conforme mostrado na Figura 1C, a LL resultou em prolongamento do TTPa, indicando coagulação prejudicada após a lesão. O tratamento com rhFVIIa ou TXA atenuou esse prolongamento, sugerindo restauração da função de coagulação. De forma semelhante, a geração de trombina, avaliada por complexos TAT, aumentou após a LL e reduziu com o tratamento com TXA, enquanto o rhFVIIa não reduz os níveis de TAT (Figura 1D), sugerindo modulação da ativação da coagulação.

A caracterização adicional da coagulopatia é mostrada na Figura 2. A LL resultou na depleção seletiva dos fatores de coagulação V e VIII, compatível com a CIT, e essas alterações foram revertidas com o tratamento com rhFVIIa ou TXA (Figura 2A,B). Em contraste, os fatores II e X não foram significativamente alterados (Figura 2C,D), indicando que essas mudanças ocorrem no contexto de fatores II e X preservados, o que sustenta um fenótipo predominantemente associado à CIT e não a um quadro semelhante à coagulação intravascular disseminada (CID).

O desenvolvimento da fibrinólise após LL é demonstrado na Figura 3. Os níveis de fibrinogênio foram reduzidos após a lesão, indicando consumo, e não foram totalmente restaurados com rhFVIIa ou TXA (Figura 3A). Em contraste, os marcadores fibrinolíticos, incluindo complexos de plasmina-antiplasmina (PAP) e dímero D, aumentaram após LL. O rhFVIIa reduziu os níveis de complexos PAP, mas não alterou significativamente os níveis de dímero D. A TXA reduziu os níveis de complexos PAP e de dímero D após LL (Figura 3B,C).

Por fim, a resposta inflamatória sistêmica e os desfechos de sobrevida são avaliados em Figura 4. Os níveis plasmáticos de interleucina-6 (IL-6) são medidos aos 60 min e 6 h após LL em todos os grupos de tratamento. Os níveis de IL-6 estão elevados nos pontos temporais iniciais em todos os grupos (Figura 4A). A sobrevida ao longo de um período de 7 dias é avaliada por meio de análise de Kaplan-Meier. A sobrevida em 7 dias é de 75% no grupo com soro fisiológico, 55% no grupo com rhFVIIa e 80% no grupo tratado com TXA. Nenhuma diferença significativa é observada entre os grupos com soro fisiológico e TXA, enquanto a sobrevida é significativamente reduzida no grupo com rhFVIIa em comparação com os grupos com soro fisiológico e TXA (Figura 4B).

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Figura 1: Validação do modelo de laceração hepática (LL): reprodutibilidade da gravidade da lesão, perda sanguínea quantitativa e indução de coagulopatia. Hemorragia interna grave é induzida por laparotomia mediana seguida de LL padronizada. Os camundongos são pré-tratados com solução salina (~100 µL) ou fator VII ativado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg) ou ácido tranexâmico (TXA; 10 mg/kg) antes da lesão, para avaliar a modulação farmacológica do sangramento e da coagulopatia. (A) A gravidade da lesão é quantificada como peso do fígado lacero normalizado pelo peso corporal (%PC), demonstrando indução reprodutível de lesão padronizada entre os animais. (B) A perda sanguínea é quantificada por método gravimétrico e normalizada pelo peso corporal (µL/g), demonstrando hemorragia mensurável que é reduzida com o tratamento com TXA. (C) O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e (D) os complexos de trombina–antitrombina (TAT) demonstram indução reprodutível de coagulopatia após LL, com modulação observada após tratamento com rhFVIIa ou TXA. Os dados são apresentados como valores individuais com mediana e intervalo interquartil; as comparações foram realizadas utilizando o teste não paramétrico de Mann–Whitney U (n = 5–21). ****P ≤ 0,0001. Adaptado com permissão de Joseph et al.16. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Validação da coagulopatia induzida por trauma (TIC) após laceração hepática (LL): depleção seletiva de fatores de coagulação. Hemorragia interna grave é induzida por laparotomia mediana seguida de LL padronizada. Os camundongos são pré-tratados com solução salina (~100 µL) ou fator VII ativado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg), ou ácido tranexâmico (TXA; 10 mg/kg) antes da lesão, para avaliar a modulação farmacológica da coagulopatia. Os parâmetros de coagulação são avaliados 60 minutos após a LL. (A) Os níveis do fator V e (B) do fator VIII demonstram depleção reprodutível após LL, compatível com TIC. (C) O fator II e (D) o fator X permanecem relativamente preservados, indicando depleção seletiva de fatores de coagulação em vez de consumo global. Os dados são apresentados como valores individuais com mediana e intervalo interquartil (n = 7–10). As comparações estatísticas foram realizadas utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney U. ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. Adaptado com permissão de Joseph et al.16. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Validação da ativação fibrinolítica após laceração hepática (LL). Hemorragia interna grave é induzida por laparotomia mediana seguida de LL padronizada. Os camundongos são pré-tratados com solução salina (~100 µL), fator VII ativado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg) ou ácido tranexâmico (TXA; 10 mg/kg) antes da lesão, para avaliar a modulação farmacológica da fibrinólise. Os parâmetros fibrinolíticos são avaliados 60 minutos após a LL. (A) Os níveis de fibrinogênio demonstram consumo após a lesão, compatível com ativação da fibrinólise e esgotamento de fatores de coagulação. (B) Os complexos plasmina–antiplasmina (PAP) e (C) os níveis de dímero D estão aumentados após a LL, indicando degradação ativa do fibrina e ativação sistêmica da fibrinólise. Os dados são apresentados como valores individuais com mediana e intervalo interquartil (n = 8–13). As comparações estatísticas foram realizadas utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney U. **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. Adaptado com permissão de Joseph et al.16. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Validação da resposta inflamatória sistêmica e avaliação da sobrevida após laceração hepática (LL). Hemorragia interna grave é induzida por laparotomia mediana seguida de LL padronizada. Os camundongos são pré-tratados com solução salina (100 µL), fator VII ativado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg) ou ácido tranexâmico (TXA; 10 mg/kg) antes da lesão. Após a lesão, a incisão abdominal é fechada com grampos cirúrgicos e adesivo tecidual, e os animais são devolvidos às suas gaiolas. O cuidado de suporte consiste na administração subcutânea diária de solução salina (400 µL) durante os três primeiros dias após a lesão. Amostras de plasma são coletadas aos 60 min e 6 h após a LL para avaliar a ativação inflamatória sistêmica. (A) Os níveis de interleucina-6 (IL-6) demonstram uma resposta inflamatória sistêmica sustentada após a lesão. Os dados são apresentados como valores individuais com mediana e intervalo interquartil. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando o teste não paramétrico de Mann–Whitney U (n = 9–13). (B) A sobrevida em sete dias é avaliada por análise de Kaplan-Meier, demonstrando a capacidade do modelo de suportar desfechos longitudinais baseados em resultados (n = 20). ****P ≤ 0,0001. Adaptado com permissão de Joseph et al.16. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Visão esquemática do modelo de laceração hepática e linha do tempo experimental. Esta figura resume o fluxo experimental para o modelo padronizado de laceração hepática (LL) em camundongos com hemorragia não controlada. Os camundongos são submetidos a laparotomia mediana, seguida por laceração hepática reprodutível de aproximadamente 75% do lobo hepático esquerdo. Antes da lesão, os animais recebem solução salina (~100 µL, controle veículo) ou fator VII ativado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg) ou ácido tranexâmico (TXA; 10 mg/kg), administrados por via intravenosa por injeção retro-orbital 5 min antes da laceração hepática. A quantificação da perda sanguínea é realizada utilizando esponjas abdominais previamente pesadas, colocadas na cavidade abdominal no momento da lesão, recolhidas 60 min após a laceração hepática e pesadas para determinar a hemorragia total. Em seguida, o abdômen é fechado com grampos cirúrgicos e adesivo tecidual. Amostras de sangue são coletadas por acesso retro-orbital aos 60 min na coorte de ponto final e aos 6 h e 7 d na coorte de sobrevida. O plasma é analisado quanto a parâmetros de coagulação, incluindo tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), atividade de fatores de coagulação, complexos de trombina-antitrombina (TAT), complexos de plasmina-α2-antiplasmina (PAP) e dímero D aos 60 min. O perfil de citocinas é avaliado aos 60 min e 6 h. A sobrevida é monitorada durante um período de 7 dias. Adaptado com permissão de Joseph et al.16. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste estudo, apresentamos um modelo murino reprodutível de hemorragia grave utilizando LL padronizado que integra avaliação quantitativa da perda sanguínea, caracterização da CIT e da inflamação, e análise de sobrevida dentro de um único experimento. O modelo produz gravidade da lesão consistente, demonstrada pelo peso do fígado lacero comparável, normalizado em relação ao peso corporal, ao mesmo tempo que permite avaliação reprodutível da hemorragia e das respostas hemostáticas sistêmicas entre grupos experimentais. O uso de um modelo de roedor pequeno com lesão padronizada e medidas quantitativas de desfecho permite avaliação eficiente de múltiplos pontos experimentais dentro de uma única estrutura experimental, apoiando investigação reprodutível e escalonável da CIT, sem necessidade de procedimentos tecnicamente complexos.

É importante destacar que este modelo reproduz características-chave da CCI, incluindo prolongamento dos parâmetros gerais de coagulação (TTPa), aumento da geração de trombina, conforme indicado pelos complexos TAT, depleção seletiva dos fatores de coagulação V e VIII e ativação da fibrinólise evidenciada por complexos PAP elevados e formação de dímero D. Essas alterações ocorrem no contexto de fatores II e X preservados, o que sustenta um fenótipo predominante de CCI em vez de coagulação intravascular disseminada. A capacidade de quantificar simultaneamente esses parâmetros fornece uma estrutura clinicamente relevante para avaliar a disfunção hemostática após lesão traumática.

Uma característica fundamental deste modelo é a incorporação da sobrevida como um desfecho em situações de hemorragia traumática. Para testar estratégias de resgate clinicamente relevantes, avaliamos tanto o rhFVIIa quanto o TXA, dois agentes utilizados ou investigados na reanimação de trauma em humanos. O TXA demonstrou efeitos consistentes na redução da perda sanguínea, normalização da coagulopatia e ativação fibrinolítica, resultando em resgate da sobrevida. Por outro lado, o rhFVIIa resultou em mortalidade significativa associada à supercorreção dos parâmetros hemostáticos e controle incompleto da fibrinólise16.

Essas descobertas destacam um aspecto importante do modelo: a sobrevivência é determinada por uma interação complexa entre a gravidade da hemorragia, coagulopatia e resposta sistêmica, e não pela correção isolada de vias hemostáticas individuais. Parece que este modelo de hemorragia é sensível à integração de parâmetros hemostáticos bioquímicos com a sobrevivência, sendo esta última um determinante crítico do desfecho na prática clínica. Embora a hemorragia traumática grave seja a lesão principal modelada neste sistema, lesões orgânicas secundárias também podem contribuir para o desfecho. Em nosso estudo anterior utilizando este modelo, microtrombos pulmonares e depósitos de fibrina foram observados em camundongos tratados com rhFVIIa e estiveram associados a maior mortalidade, sugerindo uma possível contribuição da lesão orgânica tromboinflamatória para o desfecho16.

Embora um grupo contemporâneo submetido a operação simulada não tenha sido incluído no presente estudo, demonstramos anteriormente que a laparotomia sem LL não resultou em TIC, demonstrando a necessidade de perda sanguínea rápida adicional (choque) para produzir as anormalidades características da coagulação observadas com o TIC14.

Várias considerações técnicas são importantes para a reprodutibilidade deste modelo. A extensão e localização da lesão hepática (LL) devem ser padronizadas, pois variações na quantidade de fígado removida podem afetar substancialmente a gravidade do sangramento e a resposta coagulopática resultante. Em nosso protocolo, cerca de 75% do lobo hepático esquerdo é removido, com o peso do fígado lacero normalizado em relação ao peso corporal, fornecendo uma medida objetiva da consistência da lesão. O fechamento abdominal rápido e seguro também é essencial para prevenir perda sanguínea externa e manter um ambiente de hemorragia intra-abdominal contida durante o período de observação. Para uma medição precisa da perda sanguínea, esponjas previamente pesadas devem ser recuperadas de forma consistente, utilizando o mesmo procedimento e cronograma de coleta em todos os grupos experimentais. Esses passos minimizam a variação dependente do operador e são particularmente importantes porque diferenças na perda sanguínea inicial podem influenciar a coagulopatia subsequente e a sobrevivência. Caso ocorra sangramento excessivo antes do fechamento ou haja perda sanguínea externa, o animal deve ser excluído.

Uma limitação deste modelo é que ele se concentra em lesão orgânica, o que não reflete a heterogeneidade do politrauma, que pode incluir fraturas de ossos longos, trauma por esmagamento de tecidos moles e outros estados complexos de choque. No entanto, essa lesão específica também é uma característica intencional do modelo, permitindo o estudo dos efeitos da hemorragia grave e da CID sem a complexidade e variabilidade adicionais introduzidas por múltiplas modalidades de lesão. Em conclusão, este modelo murino de LL fornece uma abordagem econômica (em comparação com estudos em animais grandes), robusta e escalável para investigar hemorragia traumática, CID e mortalidade. Ao combinar uma plataforma experimental simples com roedores pequenos, lesão padronizada, medição quantitativa da perda sanguínea, perfilagem hemostática abrangente e avaliação de sobrevida, o modelo oferece uma alternativa prática a modelos de trauma mais extensivamente instrumentados. Ele permite a avaliação integrada da perda de volume sanguíneo, coagulação (TTPa, FII, FV, FVIII, FX, TAT), fibrinólise (fibrinogênio, PAP, dímero D) e desfechos de sobrevida em um contexto clinicamente relevante, ideal para avaliar intervenções antifibrinolíticas e hemostáticas direcionadas.

Divulgações

A.v.D. recebeu honorários por participar em conselhos consultivos científicos, consultorias e apresentações de oratória da BioMarin, Regeneron, Pfizer, Bioverativ/Sanofi, CSL Behring, Novo Nordisk, Spark Therapeutics, Genentech e uniQure. A.v.D. é cofundador da Hematherix LLC, uma empresa de biotecnologia que está desenvolvendo a terapia com superFVa para complicações hemorrágicas. B.C.J., M.L.C. e R.M. não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos a Laurent Mosnier, PhD, pelo aconselhamento técnico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha 25 GBD Diagnostics305124
Agulha 30 GBD Diagnostics305106
Sistema de anestesiaPatterson Scientific78915712
Reagente de TTPA – STA-C.K. Prest. 5Stago597
AutoclipFine Science Tools12022-19
Aplicador de AutoclipFine Science Tools12020-09
Removedor de AutoclipFine Science Tools12023-00
Albumina sérica bovinaSigma Aldrich10735078001
Cloreto de cálcioFisher scientificC79-500
Tubo capilar – lisoFisher Scientific22-260943
Aplicador de algodãoMedique19-090-701
Bolas de algodãoFisher Scientific22-456-103
Kit ELISA de D-dímeroInvitrogenEEL094
Almofada isotérmica Delta PhaseBraintree Scientific50-195-4663
EtanolFisher scientificBP28184
EthiqaFidelisSKU 072117
Plasma deficiente em Fator IIAffinity BiologicalsFII-DP
Plasma deficiente em Fator VAffinity BiologicalsFV-DP
Plasma deficiente em Fator VIIIAffinity BiologicalsFVIII-DP
Plasma deficiente em Fator XAffinity BiologicalsFX-DP
Papel filtro, extra grosso, 7 cm × 8,4 cmFisher ScientificPI88605
Pinça GraefeFine Science Tools11049-10
Câmara de induçãoPatterson Scientific78933385
Soro fisiológico injetávelHospira0409-4888-02
InnovinSiemens Healthineers23-044-778
IsfluranoMed Vet International50-304-2993
K824086 Chromogenix Coatest SP Fator VIIIDiapharma K822585
Adesivo tissular rápido Liqui VetWorld Precision Instrument50-253-9340
Sterilizador de microesferasFisher scientific14-955-342
Tubos microcêntrifugos – 1,5 mLFisher ScientificAM12400
Kit multiplex de citocinas murinasQuansys Biosciences 111049MS-13P
Kit de ensaio do complexo PAPBiotechneNBP3-06903
Povidona-iodoMed Vet International50-283-2277
Fator VII ativado recombinante humanoNovo Nordisk0169-7001
Citrato de sódioFisher ScientificS279-500
Capa cirúrgicaStoelting10-000-695
Plataforma cirúrgica, manifold de anestesia para camundongo Equaflow 5Patterson Scientific78919268
Tesoura cirúrgicaFine Science Tools91405-11
Fita adesivaFisher scientific15-901-5R
Kit de ensaio do complexo TATSiemens Healthineers23-044-704
TrombinaInvitrogenPIRP43100
Ácido tranexâmicoAuromedics55150-0188-10
TrimmerStoelting10-000-792
Sistema de filtração com carvão ativado WAGPatterson Scientific78909457
Barquinho de pesagemFisher Scientific01-549-752

Referências

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Reimpressões e permissões

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Coagulopatia Induzida por TraumaQuantificação de HemorragiaMarcadores de InflamaçãoAnálise de SobrevivênciaMedição de Perda SanguíneaFatores de CoagulaçãoAtivação da FibrinóliseAtivação InflamatóriaModulação Farmacológica

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