Um Protocolo Otimizado para o Modelo de Estenose Valvar Aórtica Induzida por Guide-wire em Camundongos

Resumo

Este protocolo descreve um modelo otimizado de estenose da valva aórtica induzida por fio-guia em camundongos C57BL/6. Uma plataforma vascular de suporte personalizada, fabricada por impressão 3D, permite controle preciso da hemorragia, resultando em 95% de sobrevida nas primeiras 24 horas (19/20) e 90% de sucesso geral do modelo após 4 semanas (18/20).

Resumo

A estenose da valva aórtica (EVA) é uma doença cardiovascular importante com prevalência crescente em populações envelhecidas, porém a escassez de tecido valvar doente limita severamente estudos mecanicistas e o desenvolvimento de terapias. Este protocolo estabelece e otimiza um modelo reprodutível de EVA em camundongos, aperfeiçoando o método de lesão valvar induzida por fio-guia de Honda mediante o manejo controlado de hemorragia. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas são submetidos a lesão da valva aórtica induzida por fio-guia; o procedimento é refinado por meio de uma plataforma de suporte vascular personalizada, fabricada por impressão 3D, que permite controle preciso da hemorragia durante a inserção e retirada do fio-guia. As medidas de desfecho incluem sobrevida em 24 h, avaliação ecocardiográfica em 4 semanas e validação histopatológica. O protocolo otimizado alcança uma taxa de sobrevida de 95% em 24 h (19 de 20 animais); entre os sobreviventes, 94,7% (18 de 19) atendem ao critério pré-definido de sucesso hemodinâmico em 4 semanas, resultando em uma taxa geral de sucesso do modelo de 90% (18 de 20 animais), confirmada por ecocardiografia e análise histológica. Este modelo padronizado fornece uma plataforma confiável e reprodutível para investigar os mecanismos de degeneração valvar e avaliar intervenções terapêuticas candidatas.

Introdução

A doença valvular cardíaca continua sendo um peso substancial para os sistemas de saúde tanto em nações desenvolvidas quanto em desenvolvimento, com prevalência crescente paralelamente ao envelhecimento da população¹. Embora a implantação percutânea de válvula aórtica (TAVI) tenha transformado o tratamento da estenose aórtica grave^2,3, os mecanismos celulares e moleculares que levam à degeneração valvar ainda não são completamente compreendidos, e não existe terapia farmacológica aprovada para desacelerar ou reverter a progressão da doença^4,5. Um obstáculo central na pesquisa de doenças valvares é a disponibilidade limitada de tecido doente para investigação^6,7. Espécimes humanos de válvula aórtica são difíceis de obter em quantidade suficiente, e modelos animais que reproduzam de forma confiável as alterações valvares patológicas também têm sido escassos⁸. Essa lacuna tem impulsionado esforços contínuos para desenvolver modelos animais que reproduzam as características hemodinâmicas e histológicas da estenose valvar aórtica (AVS).

Abordagens dietéticas convencionais, como a alimentação prolongada com alto teor de gordura em camundongos ApoE⁻/⁻, exigem 20–24 semanas e apresentam baixas taxas de sucesso, com apenas uma minoria dos animais desenvolvendo um fenótipo estenótico definitivo^9,10,11,12. O modelo de lesão valvar induzida por fio-guia descrito por Honda et al. resolveu muitas dessas limitações ao provocar lesão mecânica nas cúspides valvares por meio de acesso à artéria carótida¹³. A técnica original envolve dissecação da artéria carótida, passagem retrógrada do fio-guia até a valva aórtica, arranhões repetidos nas cúspides e rotação do fio — produzindo alterações hemodinâmicas rápidas em poucos dias e um fenótipo estenótico estável em quatro semanas^13,14,15,16. Devido à sua relativa rapidez e direcionamento, o método de Honda tem sido amplamente adotado em pesquisas valvares recentes. No entanto, várias lacunas importantes permanecem. Detalhes completos do procedimento não foram plenamente documentados na literatura, a padronização entre laboratórios é insuficiente e o papel do controle de hemorragia — um determinante importante da morbidade perioperatória neste modelo — nunca foi sistematicamente abordado. Essas inconsistências reduzem a reprodutibilidade e limitam a transposição clínica.

Hipotetizou-se que a otimização sistemática do controle de hemorragia poderia melhorar significativamente a sobrevivência perioperatória e a confiabilidade do modelo. Este protocolo apresenta uma abordagem aprimorada e padronizada que se baseia no método de Honda, introduzindo uma plataforma de suporte vascular personalizada fabricada por impressão 3D. O dispositivo permite tensão longitudinal ajustável na artéria carótida, proporcionando hemostasia temporária completa durante a inserção e retirada do fio-guia, sem esmagar o vaso. Com esta abordagem, o protocolo otimizado alcança uma taxa de sobrevivência de 95% em 24 horas (19 de 20 animais); entre os sobreviventes, 94,7% (18 de 19) atendem ao critério pré-definido de sucesso hemodinâmico após 4 semanas, resultando em uma taxa geral de sucesso do modelo de 90% (18 de 20 animais). A documentação passo a passo do procedimento é fornecida para facilitar a reprodutibilidade entre laboratórios.

Protocolo

OBSERVAÇÃO: Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Hospital da China Ocidental (Número do Protocolo 20240311055). Foram utilizados camundongos machos C57BL/6 (8–10 semanas; aproximadamente 22–25 g) e camundongos fêmeas C57BL/6 (8–10 semanas; aproximadamente 18–20 g). Todos os materiais, reagentes, instrumentos, softwares e dispositivos personalizados utilizados neste protocolo, incluindo a plataforma personalizada de suporte vascular impressa em 3D, estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação pré-operatória e incisão cirúrgica

1. Anestesiar o camundongo usando isoflurano (3% para indução, 1,5–2% para manutenção) vaporizado em oxigênio a 100%. Confirmar a profundidade adequada da anestesia verificando a ausência de reflexos de retirada plantar (pinçamento do dedo do pé).
   CAUTION: O isoflurano é um anestésico volátil. Utilizá-lo com sistema ativo de captura ou em área bem ventilada, usar EPI apropriado e seguir os procedimentos de segurança institucionais.
2. Aplicar pomada oftálmica em ambos os olhos. Posicionar o camundongo em posição supina sobre uma plataforma cirúrgica regulada por temperatura mantida a 37 °C.
3. Preparar o campo cirúrgico depilando a região cervical anterior com creme depilatório químico.
4. Desinfetar a pele com três ciclos alternados de poviodine-iodo (ou clorexidina) e álcool a 70% (ou solução salina estéril aquecida), finalizando com o antisséptico.
5. Infiltrar lidocaína a 0,5% subcutaneamente ao longo da linha de incisão planejada para analgesia local preventiva.
6. Em seguida, fazer uma incisão longitudinal mediana na pele (aproximadamente 1,0–1,5 cm) na região anterior do pescoço, posicionada ligeiramente à direita da linha média da traqueia, utilizando tesoura microcirúrgica.
   CAUTION: Tesouras microcirúrgicas, agulhas, fios-guia e outros objetos cortantes podem causar lesões. Manipulá-los com cuidado e descartar objetos cortantes usados em recipientes aprovados para resíduos perfurocortantes.

2. Isolamento do vaso e colocação do sutura

1. Sob um estereomicroscópio cirúrgico, exponha a artéria carótida comum direita (ACCD) por dissecação romba através das camadas de fáscia e músculo subjacentes. Separe cuidadosamente a ACCD do nervo vago adjacente e dos tecidos conjuntivos circundantes, tomando cuidado para evitar irritação mecânica do nervo vago.
   NOTA: Mantenha as glândulas salivares e os tecidos expostos úmidos com solução salina estéril e aquecida durante todo o procedimento para prevenir dessecação.
2. Ligue permanentemente a extremidade distal da ACCD com um fio de seda 6-0 amarrado em um nó seguro que não deslize.
3. Coloque um laço corrediço frouxo de fio de seda 6-0 ao redor do segmento proximal da ACCD, deixando-o sem apertar para uso posterior durante a inserção do fio-guia.

3. Aplicação da plataforma e arteriotomia

OBSERVAÇÃO: Antes da cirurgia, esterilize a plataforma impressa em 3D utilizando gás óxido de etileno (EtO), seguido de aeragem adequada, e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos metálicos por autoclavação.

ATENÇÃO: O óxido de etileno é tóxico, inflamável e carcinogênico. Utilize a esterilização com EtO apenas em instalações aprovadas, permita uma aeragem adequada e siga os procedimentos institucionais de manuseio de resíduos.

1. Insira cuidadosamente a plataforma de suporte vascular impressa em 3D sob o segmento isolado da AACR, posicionando o ápice em forma de V invertida diretamente abaixo do vaso.
2. Ajuste lentamente a plataforma para aumentar a tensão longitudinal na AACR, encaixando os pontos previamente colocados em entalhes laterais progressivamente mais altos.
   NOTA: O ápice em forma de V invertida é projetado com um ângulo de 120° para se adaptar à curvatura do vaso sem esmagar a parede. Interrompa o aumento da tensão exatamente no ponto em que a pulsação arterial deixa de ser visualmente perceptível. Esse ponto final crítico garante hemostasia temporária sem lesão excessiva do vaso.
3. Realize uma arteriotomia transversal pequena (aproximadamente metade da circunferência do vaso) no segmento da AACR estabilizado, utilizando tesoura microcirúrgica. Deve ocorrer sangramento mínimo ou nenhum, caso a tensão tenha sido ajustada corretamente.

4. Inserção do fio guia e lesão da válvula

1. Sob visualização microscópica, insira o fio-guia (diâmetro de 0,014 polegada / 0,36 mm) na luz arterial através da arteriotomia transversa em direção retrógrada para a raiz aórtica.
   NOTA: Esse calibre é padrão em modelos publicados de lesão por fio-guia e aproxima-se do diâmetro luminal da artéria carótida comum direita murina (~0,4–0,5 mm), resultando em uma relação fio-guia/vaso de aproximadamente 0,7–0,9.
   CAUTELA: O fio-guia pode perfurar vasos ou tecidos adjacentes. Avance-o lentamente sob visualização e descarte os fios-guia usados como material perfurocortante ou resíduo cirúrgico contaminado.
2. Ape o nó corrediço pré-posicionado proximal ao redor do vaso e do fio-guia para obter hemostasia completa no local de inserção. Após fixar o nó corrediço, remova cuidadosamente a plataforma impressa em 3D de sob o vaso.
   NOTA: Se ocorrer sangramento inesperado durante a inserção, ou se o diâmetro do fio-guia causar atrito excessivo, reposicione temporariamente a plataforma para auxiliar na hemostasia ou reduza ligeiramente a tensão da plataforma para permitir a expansão da luz do vaso antes de tentar novamente a inserção.
3. Avance cuidadosamente o fio-guia em direção retrógrada através da RCCA, além do arco aórtico e em direção à válvula aórtica. Com orientação ecocardiográfica em tempo real, confirme que a ponta do fio-guia atravessou a válvula aórtica e entrou no ventrículo esquerdo.
4. Com o nó corrediço proximal totalmente apertado para manter a hemostasia, realize a lesão mecânica da válvula executando 100 movimentos de vai-e-vem (para frente e para trás) sobre a válvula aórtica, seguidos por 100 movimentos rotacionais do fio-guia contra as cúspides valvares.
   NOTA: Os 100 movimentos de vai-e-vem e 100 movimentos rotacionais foram estabelecidos por meio de extensa otimização interna como os valores que melhor equilibram o tempo do procedimento com a indução confiável de estenose hemodinamicamente significativa.

5. Retirada do fio-guia e fechamento da ferida

1. Após a conclusão da lesão valvar, retire lentamente o fio-guia do vaso.
2. Imediatamente converta o nó deslizante proximal em um nó permanente não-deslizante para ligar a artéria carótida comum proximal (RCCA) e prevenir qualquer sangramento pós-procedimento.
3. Fechamento da incisão cutânea com pontos separados de náilon 5-0 ou grampos cirúrgicos para feridas.
4. Não administrar drogas anti-inflamatórias não esteroides (NSAIDs) no pós-operatório. Não administrar antibióticos perioperatórios, pois o procedimento é realizado em condições assépticas.
5. Transfira o animal para uma gaiola de recuperação limpa e aquecida e monitore continuamente até que a deambulação completa seja restabelecida.

6. Avaliação ecocardiográfica da hemodinâmica transvalvar

1. Realize avaliações ecocardiográficas em todos os camundongos sobreviventes na quarta semana após a cirurgia para avaliar a gravidade da estenose da válvula aórtica.
2. Induza anestesia colocando o animal em uma câmara de indução com 3% de isoflurano em oxigênio a 100%. Confirme a profundidade anestésica verificando a ausência do reflexo de retirada dos membros. Depile a parede torácica anterior utilizando creme depilatório químico. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para prevenir a dessecação corneana.
3. Transfira o camundongo anestesiado para uma plataforma de imagem com controle de temperatura, posicionado em decúbito dorsal.
4. Fixe as patas aos eletrodos do eletrocardiograma (ECG) de superfície para monitoramento contínuo da frequência cardíaca. Titule a concentração de isoflurano (geralmente entre 1,0–1,5%) para manter uma frequência cardíaca fisiológica estável de 450–550 batimentos por min.
5. Limpe a parede torácica anterior e aplique uma camada generosa de gel acoplante pré-aquecido.
6. Aquisição de imagem em modo B
   1. Utilizando um sistema de ultrassom Vevo 3100 com transdutor MX550D (40 MHz), pressione o controle Modo B para iniciar a aquisição em tempo real de imagens bidimensionais.
   2. Posicione o transdutor na posição paraesternal esquerda para obter a vista longitudinal paraesternal do ventrículo esquerdo, válvula aórtica e aorta ascendente. Otimize profundidade, largura e ganho em 2D.
7. Aquisição em modo M e mensuração do ventrículo esquerdo
   1. A partir da vista longitudinal paraesternal, pressione o controle Modo M. Posicione a linha de amostragem atravessando o ventrículo esquerdo no nível dos músculos papilares.
   2. Pressione Iniciar para começar a aquisição. Quando for obtido um traçado estável abrangendo pelo menos três ciclos cardíacos, pressione Salvar.
   3. No Vevo LAB, utilize a ferramenta Traçado VE para delimitar o endocárdio na diástole final e na sístole final, e registre as dimensões internas do ventrículo esquerdo, as espessuras da parede anterior e posterior (LVAWd, LVPWd) e a massa do ventrículo esquerdo.
8. Reposicione e incline o transdutor para obter uma vista específica do arco aórtico.
   ​NOTA: Obter essa vista específica do arco aórtico é essencial para medições precisas da velocidade transvalvular, pois assegura o alinhamento ideal do feixe de ultrassom com a direção do fluxo sanguíneo através da válvula aórtica.
9. Avaliação com Doppler colorido
   1. A partir da vista do arco aórtico, pressione o controle Colorido. Posicione a caixa de cor sobre a válvula aórtica e a porção proximal da aorta ascendente.
   2. Ajuste a escala de cor e o ganho para que o jato sistólico seja claramente visualizado sem sobreposição (aliasing). Pressione Iniciar e depois Salvar.
10. Medição da velocidade com Doppler de onda pulsada
    1. Pressione o controle Doppler de Onda Pulsada (PW). Posicione a porta de volume amostral no ponto mais estreito do jato (vena contracta) e aplique correção angular (<60°).
    2. Pressione Iniciar para começar o traçado espectral; após registrar pelo menos três ciclos cardíacos, pressione Salvar. No Vevo LAB, meça a velocidade máxima transvalvular com a ferramenta Velocidade de Pico, fazendo a média de pelo menos três ciclos.

7. Processamento histológico e coloração da raiz aórtica

1. Após a avaliação ecocardiográfica, confirme a anestesia profunda verificando a ausência completa do reflexo de retirada do pedal. Realize a dislocação cervical como método secundário de eutanásia, de acordo com as Diretrizes da AVMA para a Eutanásia de Animais (edição 2020) e protocolos aprovados institucionalmente.
   CAUTION: Carcaças animais, tecidos excisados e materiais contaminados com sangue são resíduos biológicos/animais. Descarte-os de acordo com as regulamentações institucionais de biossegurança e das instalações animais.
2. Realize uma toracotomia usando microtesouras cirúrgicas para expor o coração.
3. Insira uma agulha de perfusão no ápice do ventrículo esquerdo e lave a circulação sistêmica com solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril e fria. A perfusão bem-sucedida é indicada pelo embranquecimento do fígado e dos pulmões.
4. Excise o coração intacto e imerja-o em paraformaldeído (PFA) a 4% à temperatura ambiente por um mínimo de 24 h para garantir fixação completa.
   CAUTION: O paraformaldeído é tóxico e irritante. Manipule o PFA a 4% em uma cabine de exaustão química com EPI apropriado e descarte os resíduos de PFA como resíduo químico perigoso.
5. Transfira o tecido fixado para um processador automático de tecidos para desidratação sequencial por meio de uma série graduada de etanol, seguida por clareamento com xilol e infiltração com parafina a 65 °C.
   CAUTION: O xilol é inflamável e tóxico, e a parafina quente pode causar queimaduras. Manipule o xilol em uma cabine de exaustão ou processador aprovado e descarte resíduos contendo xilol como resíduo químico perigoso.
6. Embeba os corações processados em blocos de parafina.
   NOTE: A orientação correta do coração no momento do embebimento é crítica. Posicione o coração para permitir o corte transversal pela raiz da aorta ao nível das três cúspides valvares.
7. Usando um micrótomo rotativo, corte seções transversais seriadas com espessura de 4–5 µm no plano da valva aórtica, garantindo que as três cúspides sejam capturadas. Monte as seções em lâminas de vidro e armazene-as à temperatura ambiente.
8. Realize coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) em lâminas selecionadas para avaliar a morfologia tecidual, o remodelamento estrutural e a espessura das cúspides valvares.
9. Realize coloração de Von Kossa em seções seriadas adjacentes para detectar e quantificar calcificação distrófica, identificável como depósitos minerais marrom-escuros a pretos dentro das cúspides valvares.

8. Procedimento cirúrgico simulado

OBSERVAÇÃO: Esta seção descreve o procedimento controle simulado. Camundongos simulados passam pela mesma anestesia, preparo da pele, exposição do vaso, arteriotomia e inserção retrógrada do fio-guia que o grupo com lesão por fio na aorta (AWI); o fio-guia é avançado até o nível supravalvular, mas não é passado através da válvula aórtica, e nenhuma lesão mecânica da válvula é realizada.

1. Anestesie o camundongo e prepare o campo cirúrgico conforme descrito nos passos 1.1 a 1.5.
2. Com visualização em microscópio estereoscópico, exponha a ACCD por dissecação romba conforme descrito no passo 2.1.
3. Ligue permanentemente a extremidade distal da ACCD com um fio de seda 6-0 e coloque um laço simples solto na extremidade proximal (como nos passos 2.2–2.3).
4. Realize a arteriotomia transversa e insira o fio-guia conforme descrito nos passos 3.1–4.2.
5. Avance o fio-guia em direção retrógrada até o nível supra-valvar da aorta ascendente com orientação ecocardiográfica, confirmando que a ponta do fio-guia NÃO atravessa a válvula aórtica.
   NOTA: NÃO realize os movimentos de empurrar-puxar ou de rotação para lesão valvar descritos no passo 4.4. Retire o fio-guia e imediatamente ligue a ACCD proximal conforme descrito nos passos 5.1–5.2.
6. Fechue a incisão cutânea com pontos separados de nylon 5-0 ou grampos para ferida.
   NOTA: Como no grupo AWI, a analgesia intraoperatória é fornecida por infiltração local de lidocaína (passo 1.5). Transfira o animal para uma gaiola aquecida de recuperação e monitore até que esteja totalmente ambulatório.
7. Submeta os camundongos Sham ao mesmo monitoramento pós-operatório, avaliação ecocardiográfica após 4 semanas e processamento histológico realizado no grupo AWI.

9. Análise estatística e desenho do estudo

1. Ao longo do estudo, 20 camundongos (10 machos, 10 fêmeas) foram submetidos ao procedimento AWI, e 6 camundongos C57BL/6 (3 machos, 3 fêmeas) foram submetidos ao procedimento Sham.
2. Meça a velocidade máxima transvalvular (o critério que define o sucesso do modelo) em todos os animais sobreviventes (19 AWI, 6 Sham).
3. Analise índices ecocardiográficos e histológicos detalhados em um subgrupo pré-especificado e balanceado por sexo de 6 camundongos AWI (3 machos, 3 fêmeas).
4. Garanta que todas as medições ecocardiográficas e histológicas sejam realizadas por pesquisadores cegos quanto à alocação dos grupos.
5. Avalie a normalidade dos dados com o teste de Shapiro-Wilk antes de realizar testes paramétricos. Compare dois grupos independentes (AWI versus Sham) utilizando o teste t de Student não pareado e bicaudal.
6. Analise e apresente os dados de sobrevida utilizando o método de Kaplan-Meier.
7. Realize todas as análises no GraphPad Prism. Apresente os dados como média ± erro padrão da média, considerando p < 0,05 estatisticamente significativo.

Resultados

Desenvolvimento de uma plataforma impressa em 3D para controle de hemorragia

Para abordar a hemorragia perioperatória—principal causa de morbidade e mortalidade no modelo convencional de AVS induzida por fio-guia—foi desenvolvida uma plataforma de suporte vascular impressa em 3D (Figura 1). A plataforma foi fabricada por impressão de estereolitografia (SLA) a partir de uma resina fotopolimerizável biocompatível (conforme classe USP VI / norma ISO 10993), com espessura estrutural de 1,07 mm. Após a impressão, as peças foram lavadas em álcool isopropílico para remover a resina não curada e submetidas à pós-curagem sob luz ultravioleta. O arquivo completo de design (.stp) é fornecido para que a plataforma possa ser reproduzida em sistemas SLA padrão. A plataforma apresenta uma superfície apical em forma de V invertido, com um ângulo de ápice de 120° (Figura 1A–B), que se ajusta à curvatura da artéria carótida comum direita isolada sem induzir compressão excessiva da parede. Múltiplas entalhes laterais em etapas sucessivas (Figura 1C–D) permite ao operador engatar os pontos previamente colocados e aplicar tensão longitudinal ajustável ao vaso. A tensão é aumentada progressivamente até que a pulsação arterial não seja mais visível — um ponto final visual que indica hemostasia temporária adequada. Esta abordagem proporciona um campo cirúrgico estável para a arteriotomia e a inserção do fio-guia, ao mesmo tempo que evita lesão por esmagamento excessiva na parede vascular.

Confirmação intraoperatória da posição do fio guia

A colocação correta do fio guia foi verificada em duas etapas durante o procedimento. Primeiro, mediante visualização direta ao microscópio estereoscópico, observou-se o fio guia entrando na luz da ACID através da arteriotomia transversa em direção retrógrada (Figura 2A). Em segundo lugar, a imagem ecocardiográfica em tempo real confirmou que a ponta do fio-guia havia atravessado a válvula aórtica e entrado no ventrículo esquerdo. A imagem em modo B identificou o fio-guia como um artefato linear hiperecogênico que atravessa o plano da válvula aórtica. (Figura 2B). A imagem Doppler colorida demonstrou fluxo turbulento localizado ao nível da válvula aórtica, fornecendo confirmação adicional do posicionamento do fio-guia através das cúspides valvares (Figura 2C; Vídeo Suplementar 1).

Sobrevivência perioperatória e taxa de sucesso do modelo

A integração da plataforma ajustável de tensão no fluxo cirúrgico resultou em alta sobrevida inicial. A análise de Kaplan-Meier demonstrou uma taxa de sobrevida de 95% após 24 h da cirurgia (19 de 20 camundongos; Figura 3A). O exame post-mortem do único animal não sobrevivente não revelou evidências de hemorragia grave, dano estrutural ou isquemia cardíaca, sugerindo que a morte foi atribuível a complicações relacionadas à anestesia e não ao trauma cirúrgico. O sucesso do modelo em 4 semanas foi avaliado usando um critério pré-definido: velocidade de fluxo transvalvular de pico superior a 2.000 mm/s, juntamente com achados histológicos complementares. Dos 19 animais sobreviventes, 18 (94,7%) atingiram esse limiar, resultando em uma taxa geral de sucesso do modelo de 90% em todo o grupo (18 de 20 camundongos; Figura 3B). Os resultados foram comparáveis entre os sexos: a sobrevida em 24 h foi de 9 de 10 em machos e 10 de 10 em fêmeas, e a taxa de sucesso do modelo em 4 semanas foi de 9 de 10 (90%) em ambos os sexos; a única morte perioperatória ocorreu em um macho (relacionada à anestesia) e a única falha do modelo ocorreu em uma fêmea sobrevivente.

Confirmação ecocardiográfica da estenose aórtica

A ecocardiografia transtorácica realizada 4 semanas após a cirurgia confirmou alterações hemodinâmicas compatíveis com estenose aórtica grave no grupo AWI. Os valores ecocardiográficos quantitativos são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM); os parâmetros funcionais e de remodelamento ventricular esquerdo foram analisados em 6 camundongos Sham e 6 camundongos AWI, enquanto a velocidade pico do jato transvalvar foi medida em todos os camundongos AWI sobreviventes e controles Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). A fração de ejeção do ventrículo esquerdo foi ligeiramente menor no grupo AWI do que nos controles Sham após 4 semanas (56,21 ± 1,15% vs. 61,57 ± 2,12%; p = 0,0503; Figura 3C), uma diferença que não atingiu significância estatística. Os registros de Doppler de onda pulsada demonstraram um aumento acentuado na velocidade do jato transvalvar no grupo AWI, atingindo 2740,89 ± 104,10 mm/s, comparado a 988,00 ± 126,24 mm/s no grupo controle Sham (Figura 3D). A análise quantitativa confirmou um aumento altamente significativo na velocidade pico do jato transvalvar no grupo AWI em relação aos controles Sham (p < 0,0001; Figura 3E). Consistente com uma fase inicial de adaptação à sobrecarga de pressão, o grupo AWI exibiu remodelamento concêntrico do ventrículo esquerdo: a espessura da parede anterior diastólica estava significativamente aumentada (LVAWd 1,14 ± 0,02 vs. 0,96 ± 0,03 mm; p = 0,0016; Figura 3F), enquanto a espessura da parede posterior diastólica e a massa do ventrículo esquerdo estavam elevadas, mas não atingiram significância estatística (LVPWd 1,01 ± 0,12 vs. 0,76 ± 0,02 mm, p = 0,0650, Figura 3G; massa do VE 124,51 ± 10,63 vs. 104,47 ± 2,45 mg, p = 0,0961, Figura 3H).

Validação histopatológica do remodelamento e calcificação valvular

O exame histológico das raízes aórticas corroborou os achados ecocardiográficos. Os valores histológicos quantitativos são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM) e foram analisados em 6 camundongos Sham e 6 camundongos AWI. A coloração com H&E no grupo AWI revelou espessamento acentuado das cúspides e desorganização estrutural, características ausentes nos controles Sham (Figura 3I). A morfometria quantitativa confirmou um aumento significativo na espessura média das cúspides valvares no grupo AWI em comparação com o grupo Sham (p < 0,0001; Figura 3J). A coloração de Von Kossa demonstrou calcificação distrófica extensa nas cúspides valvares espessadas do grupo AWI, identificada como depósitos minerais de cor marrom-escura a preta. Os controles Sham apresentaram deposição mineral desprezível (Figura 3K). A análise quantitativa de imagens revelou um aumento significativo na área total de calcificação (µm²) no grupo AWI em relação aos controles Sham (p < 0,0001; Figura 3L).

Figura 1: Projeto da plataforma de suporte vascular impressa em 3D mostrada em quatro vistas. (A) Vista oblíqua frontal-esquerda. (B) Vista oblíqua traseira-direita. (C) Vista de perfil lateral da geometria longitudinal geral da plataforma. (D) Vista angular destacando a região do ápice em forma de V invertido. Legendas dos componentes: 110, corpo da plataforma; 120, braços laterais; 121, entalhes laterais em degraus; 130, extremidade operacional; 140, ápice de inserção em forma de V invertido; 150, superfície de suporte em contato com o vaso; 160, declive de transição entre entalhes adjacentes; 190, artéria carótida comum direita (RCCA). A plataforma é fabricada a partir de resina fotopolimerizável biocompatível (espessura estrutural: 1,07 mm). O desenho estrutural 3D foi gerado pelos autores a partir do arquivo original de projeto CAD (.stp) da plataforma de suporte vascular utilizando o FreeCAD, um software gratuito e de código aberto para modelagem e visualização CAD. Nenhum desenho publicado por terceiros ou protegido por direitos autorais foi adaptado. O arquivo original de projeto CAD está disponível como arquivo suplementar. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2: Confirmação intraoperatória e ecocardiográfica do posicionamento do fio-guia. (A) Fotografia intraoperatória mostrando a inserção retrógrada do fio-guia (seta) através da arteriotomia transversa para dentro da luz da artéria carótida comum direita (RCCA), sob visualização estereomicroscópica direta. (B) Imagem ecocardiográfica em modo B mostrando o fio-guia (identificado como um artefato linear hiperécoico; seta) atravessando a válvula aórtica e entrando no ventrículo esquerdo. (C) Imagem ecocardiográfica com Doppler colorido demonstrando fluxo turbulento localizado ao nível da válvula aórtica, confirmando o posicionamento do fio-guia através das cúspides valvares. A visualização em tempo real do fluxo transvalvar com Doppler colorido durante o posicionamento do fio-guia é mostrada no Vídeo Suplementar 1. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3: Sobrevivência, resultados hemodinâmicos, remodelamento ventricular e histopatológicos do modelo otimizado de lesão aórtica com fio (AWI, sigla em inglês). (A) Curva de sobrevida de 24 h de Kaplan-Meier em camundongos AWI (n = 20). (B) Sucesso (vermelho) versus falha (preto) no grupo AWI após 4 semanas (n = 20); sucesso foi definido como velocidade transvalvular de pico > 2.000 mm/s. (C) Fração de ejeção (FE; p = 0,0503). (D) Representação de ecocardiogramas Doppler de onda pulsada (PW) de um camundongo Sham (esquerda) e AWI (direita). (E) Velocidade transvalvular de pico (n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0,0001). (F) Espessura diastólica da parede anterior do ventrículo esquerdo (LVAWd; p = 0,0016). (G) Espessura diastólica da parede posterior do ventrículo esquerdo (LVPWd; p = 0,0650). (H) Massa do ventrículo esquerdo (p = 0,0961). (I) Representação de cortes do seio aórtico corados com HE (Sham, esquerda; AWI, direita). (J) Espessura da cúspide da válvula aórtica (p < 0,0001). (K) Representação de cortes do seio aórtico corados com Von Kossa (Sham, esquerda; AWI, direita). (L) Área total de deposição de cálcio (µm²; p < 0,0001). Barras de escala = 500 µm. Em todos os gráficos de barras quantitativos, as barras representam valores médios e as barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). As comparações quantitativas entre os grupos Sham e AWI nos painéis C, E–H, J e L foram realizadas utilizando o teste t de Student não pareado bicaudal. Os dados quantitativos são provenientes dos grupos Sham e AWI (n = 6 por grupo), exceto para a velocidade transvalvular de pico no painel E, que foi medida em todos os camundongos AWI sobreviventes e controles Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Vídeo Suplementar 1: Visualização ecocardiográfica com Doppler colorido do fluxo sanguíneo transvalvular durante o posicionamento do fio-guia. O vídeo demonstra a aquisição em tempo real de imagens com Doppler colorido ao nível da valva aórtica durante o procedimento AWI, mostrando um fluxo turbulento localizado induzido pelo posicionamento do fio-guia através das cúspides valvares. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo fornece uma descrição detalhada de um modelo animal estável e seguro de estenose aórtica. Uma característica desta abordagem é uma plataforma auxiliar que facilita a inserção do fio-guia na artéria carótida comum. A plataforma é fabricada por impressão de estereolitografia (SLA) a partir de uma resina fotopolimérica biocompatível (espessura estrutural de 1,07 mm) e incorpora uma superfície apical em forma de V invertido com um ângulo de ápice de 120°; o arquivo completo do projeto está livremente disponível como um arquivo suplementar .stp. Este dispositivo garante uma entrada suave do fio-guia, controla objetivamente a perda sanguínea no período perioperatório e, assim, protege a sobrevivência dos camundongos modelo tanto no curto quanto no longo prazo. Desde a descrição original, o modelo induzido por fio-guia foi aprimorado e caracterizado ainda mais, incluindo variantes de gravidade graduada que ajustam a intensidade da lesão para produzir estenose de leve a grave¹⁷ e relatos recentes documentando suas complicações perioperatórias¹⁸; o presente protocolo se baseia nesse conjunto de trabalhos ao abordar sistematicamente a hemorragia perioperatória.

Várias etapas deste protocolo são críticas para a indução bem-sucedida do modelo e merecem atenção especial. Primeiro, o grau de tensão longitudinal aplicada por meio da plataforma impressa em 3D deve ser calibrado com precisão: a tensão deve ser aumentada apenas até que a pulsação arterial se torne visualmente imperceptível. Tensão insuficiente leva à hemorragia contínua durante a arteriotomia, enquanto tensão excessiva aumenta o risco de dano endotelial e ruptura do vaso. Segundo, o nó corrediço proximal deve ser firmemente apertado ao redor do vaso e do fio-guia antes da remoção da plataforma; a remoção prematura da plataforma com um nó corrediço inadequadamente fixado é a causa mais comum de hemorragia durante o procedimento. Terceiro, é essencial confirmar, com orientação ecocardiográfica, a entrada do fio-guia no ventrículo esquerdo. Sem essa etapa de verificação, o operador não pode ter certeza de que o fio-guia está corretamente posicionado na válvula aórtica, e uma lesão incompleta resultará em falha do modelo.

Várias complicações comuns podem ser antecipadas e gerenciadas. Se ocorrer sangramento durante a inserção do fio-guia, a plataforma deve ser reposicionada sob o vaso para restabelecer temporariamente a hemostasia antes de prosseguir. Em animais com artérias carótidas de menor calibre, a redução ligeira da tensão da plataforma pode expandir a luz do vaso para acomodar o fio-guia. Este modelo apresenta várias limitações que devem ser consideradas ao interpretar os resultados. A lesão mecânica por fio provoca uma lesão aguda mecânica e inflamatória da válvula, que difere do processo degenerativo crônico, impulsionado por lipídios, que caracteriza a estenose aórtica calcífica humana^17,19,20,21. Consequentemente, as características histológicas — embora reproduzam o espessamento das cúspides e a calcificação distrófica — podem não recapitular completamente todos os eventos moleculares da doença humana. O protocolo foi desenvolvido e validado em camundongos C57BL/6 de ambos os sexos com idade entre 8 e 10 semanas; no entanto, a aplicabilidade a outras linhagens ou animais idosos exige validação independente. Diferenças relacionadas ao sexo no diâmetro da artéria carótida e na anatomia cardíaca podem modular a dificuldade cirúrgica e os resultados hemodinâmicos; recomenda-se que os pesquisadores relatem o sexo como uma variável biológica nas análises subsequentes²². Além disso, a ligadura permanente da artéria carótida comum direita é inerente ao procedimento, embora o círculo de Willis forneça perfusão cerebral colateral em camundongos, e não tenham sido observados déficits neurológicos evidentes, efeitos cerebrovasculares ou cognitivos sutis não podem ser excluídos. A ecocardiografia basal (pré-procedimento) não foi realizada; o grupo simulado simultâneo serviu como controle para a função valvar normal, e recomenda-se a realização de um exame basal, quando viável, para permitir comparação intra-animal e para triagem de raras anormalidades espontâneas da válvula aórtica relatadas em camundongos C57BL/6 (~0,3% em linhagens não modificadas). A insuficiência aórtica não foi sistematicamente avaliada neste estudo; a frequência da insuficiência aórtica induzida por lesão e sua relação com a gravidade da estenose exigem avaliação específica e será abordada em trabalhos futuros.

Desvantagens potenciais da plataforma também devem ser consideradas. O dispositivo pode causar irritação mecânica em estruturas adjacentes, incluindo o nervo vago que acompanha a artéria carótida; esse risco é minimizado pelas bordas arredondadas e rombas da plataforma, seu ápice de 120° que se adapta ao vaso e seu tempo breve de aplicação, e nenhuma anormalidade respiratória ou outra complicação evidente atribuível ao dispositivo foi observada neste estudo. Em comparação com abordagens alternativas estabelecidas, este protocolo otimizado oferece várias vantagens práticas. Modelos dietéticos em camundongos ApoE⁻/⁻ exigem 20–24 semanas de alimentação com dieta rica em gordura e resultam em fenótipos estenóticos variáveis, com muitos animais não desenvolvendo doença hemodinamicamente significativa. O presente protocolo produz um fenótipo estenótico consistente em 4 semanas, com uma taxa de sucesso geral de 90% (18 de 20 animais). Em comparação com o método original de fio-guia Honda, o avanço principal deste protocolo é o controle sistemático da hemorragia perioperatória por meio da plataforma impressa em 3D.

O sangramento durante a inserção do fio-guia tem sido reconhecido como uma complicação da técnica original, mas foi pouco abordado. Na experiência retrospectiva do mesmo laboratório com o procedimento convencional (pré-plataforma) (mais de 400 casos), ocorreu sangramento intraoperatório grave em cerca de 40% dos casos, com mortalidade pós-sangramento de aproximadamente 60% e sobrevida de 24 horas de cerca de 75%, sendo o sangramento—principalmente no local de acesso carotídeo—responsável por praticamente todas as mortes perioperatórias. Isso está de acordo com Qian et al., que identificaram o sangramento no local da punção carotídea como a principal causa de morte perioperatória neste modelo. Ao controlar a perda sanguínea, a plataforma impressa em 3D aumentou a sobrevida em 24 horas para 95%, sem nenhuma morte atribuível a sangramento observada na presente coorte. Como o sangramento já não é a principal preocupação, a intensidade da lesão mecânica pode ser variada para produzir graus diferentes de estenose. Essa capacidade de ajuste tem relevância translacional direta: para terapêuticas candidatas com efeitos moderados, uma lesão basal mais grave pode ser necessária para revelar diferenças relacionadas ao tratamento que, de outra forma, seriam mascaradas em um modelo mais leve.

Este modelo é muito adequado para várias categorias de investigação subsequente. Como o fenótipo estenótico se desenvolve dentro de um período definido e reprodutível, pode servir como uma plataforma para avaliação pré-clínica de terapias farmacológicas candidatas destinadas a retardar a calcificação ou fibrose valvar²³. O modelo também é compatível com abordagens genéticas: o protocolo pode ser aplicado a camundongos transgênicos ou knockout na linhagem C57BL/6 para analisar a contribuição de vias de sinalização específicas para a progressão da doença valvar. Além disso, o ponto final de quatro semanas oferece uma janela prática para monitoramento ecocardiográfico seriado da evolução da doença ou da resposta ao tratamento. Os arquivos de design da plataforma impressa em 3D podem ser compartilhados livremente como um arquivo suplementar .stp, e espera-se que a padronização deste dispositivo entre laboratórios melhore ainda mais a reprodutibilidade entre diferentes locais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plataforma de suporte vascular impressa em 3D	Personalizado	N/A	Plataforma personalizada de suporte vascular impressa em 3D; arquivo CAD suplementar fornecido no formato .stp.
Paraformaldeído a 4%	Servicebio	G1101-3ML	Fixação tecidual
Sutura de náilon 5-0	Jinhuan Medical	F503	Fechamento da pele por suturas interrompidas
Sutura de seda 6-0	Jinhuan Medical	RC411	Ligadura permanente da RCCA distal e nó deslizante proximal
Gel acoplante acústico (pré-aquecido)	Keppler	KL-250	Ecocardiografia
Resina fotopolimerizável biocompatível	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Material para impressão SLA utilizado na fabricação da plataforma personalizada de suporte vascular impressa em 3D.
Camundongos C57BL/6 (8–10 semanas; machos 22–25 g, fêmeas 18–20 g)	GemPharmatech	C57BL/6	Utilizados ambos os sexos; mantidos em condições padrão
Gás óxido de etileno	Instalação institucional de esterilização	N/A	Esterilização da plataforma personalizada de suporte vascular impressa em 3D.
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	Visualização CAD e geração do desenho estrutural 3D a partir do arquivo .stp.
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	Análise estatística e geração de gráficos
Fio-guia, diâmetro de 0,014 polegadas	Boston Scientific	H749393071900	Lesão mecânica da válvula aórtica
Kit de coloração Hematoxilina e Eosina (H&E)	Beyotime	C0105S	Morfologia e espessura das cúspides
Isóflurano	RWD Life Science	R510-22-2	Indução com 3%; manutenção com 1,5–2% em O2 a 100%
Lidocaína	Shijiazhuang Pharmaceutical Group	H14024045	Infiltração local prévia no local da incisão (0,5%, passo 1,5)
Tesoura microcirúrgica rotativa	RWD Life Science	F11022-11	Incisão da pele, arteriotomia, toracotomia
Transdutor MX550D (40 MHz)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	Ecocardiografia
Creme depilatório Nair	Nair	255 g	Para depilação da região cervical anterior e parede torácica
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	Perfusão
Microtomo rotativo	Leica Biosystems	RM2125 RTS	Seccionamento seriado em 4–5 µm
Microsscópio estereoscópico (cirúrgico)	Olympus	SZX7	Isolamento vascular e microcirurgia
Sistema de ultrassom de alta resolução Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	Ecocardiografia
Kit de coloração de Von Kossa	Servicebio	G1043-20ML	Detecção de calcificação distrófica
Xilol	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.	C0430530209	Clareamento tecidual durante o processamento com parafina.