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Artigo de investigação

Efeitos da acupuntura no couro cabeludo em estilo de movimento na microestrutura da cápsula externa e na excitabilidade do reflexo espinhal em um modelo de rato de espasticidade pós-AVC

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DOI:

10.3791/72225

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7 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Nursing, Beijing University of Chinese Medicine, 2Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve acupuntura do couro cabeludo em estilo de movimento em um modelo de rato de espasticidade pós-AVC e demonstra sua avaliação usando imagens comportamentais, de ressonância magnética, histológicas e eletrofisiológicas para investigar alterações na microestrutura da cápsula externa e na excitabilidade do reflexo espinhal.

Resumo

A espasticidade pós-AVC (PSS) prejudica gravemente a função motora e a qualidade de vida após o AVC. A ruptura da via cortico-reticuloespinhal e a inibição descendente supraespinhal prejudicada são considerados mecanismos patológicos importantes; no entanto, os mecanismos neurais e microestruturais subjacentes aos efeitos terapêuticos da acupuntura do couro cabeludo em movimento (MSSA) permanecem incompletamente compreendidos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos da MSSA na PSS utilizando uma avaliação multimodal que integra neuroimagem, eletrofisiologia e histologia em um modelo de rato de oclusão da artéria cerebral média. A imagem por ressonância magnética ponderada em T2 foi realizada para quantificar o volume do infarto cerebral, e a imagem por tensor de difusão foi usada para avaliar a integridade microestrutural da substância branca da cápsula externa. A coloração Luxol Fast Blue (LFB) avaliou a integridade da mielina dentro da cápsula externa, enquanto registros do reflexo H avaliaram a excitabilidade do reflexo espinhal. Análises de correlação foram realizadas para examinar as relações entre volume do infarto, microestrutura da substância branca, excitabilidade do reflexo espinhal e gravidade da espasticidade. A MSSA reduziu o volume do infarto cerebral, aliviou danos microestruturais da cápsula externa e atenuou a desmielinização. Além disso, a MSSA melhorou parâmetros anormais do reflexo H, normalizou a excitabilidade do reflexo espinhal e reduziu a espasticidade. Análises de correlação mostraram que infartos maiores estavam associados a maior lesão na cápsula externa, enquanto melhor preservação da integridade da substância branca estava associada a melhor regulação do reflexo espinhal e espasticidade menos severa. Esses achados sugerem que a MSSA pode aliviar a PSS reduzindo a lesão cerebral isquêmica, preservando a integridade microestrutural da cápsula externa e melhorando a função inibitória descendente associada à via cortico-reticuloespinhal, fornecendo evidências pré-clínicas que apoiam sua aplicação terapêutica.

Introdução

A espasticidade pós-AVC (PSS) é uma sequela prevalente e incapacitante do AVC isquêmico, definida clinicamente por aumentos dependentes da velocidade e do comprimento no tônus muscular. Essa condição frequentemente leva a postura anormal dos membros e padrões de movimento disfuncionais, comprometendo severamente a independência motora e a qualidade de vida dos pacientes, além de impor cargas econômicas e cuidadoras significativas emtodo o mundo 1,2. Como uma manifestação típica da síndrome do neurônio motor superior, a patogênese da PSS é atribuída principalmente à hiperexcitabilidade exagerada dos reflexos de estiramento da coha. Estudos neuroanatômicos e neurofisiológicos acumulados demonstraram que a perda da modulação inibitória descendente do sistema extrapiramidal para os circuitos reflexos espinhales é um mecanismo patológico chave subjacente à iniciação e progressão da PSS, com a via cortico-reticuloespinhal servindo como o circuito neural principal que media esse controle regulatório descendente 3,4,5.

A técnica de agulhamento é um determinante fundamental da eficácia da acupuntura e ocupa uma posição fundamental na prática clínica da acupuntura. A acupuntura do couro cabeludo no estilo de movimento (MSSA) é uma técnica de agulhamento distinta desenvolvida especificamente para intervenção PSS, que combina acupuntura do couro cabeludo com exercícios simultâneos de membrosativos ou passivos 3. Numerosos ensaios clínicos mostraram que a MSSA produz resultados superiores em comparação apenas com acupuntura no couro cabeludo ou reabilitação de exercícios isolada na redução da gravidade da espasticidade, restauração da função locomotora e melhoria das atividades diárias em sobreviventes de AVC 6,7,8,9. Nossos estudos anteriores em animais demonstraram ainda que a MSSA exerce efeitos antiespásticos mais pronunciados do que a acupuntura convencional do couro cabeludo em modelos de PSS em ratos. Mecanisticamente, esses efeitos terapêuticos têm sido associados à melhora da perfusão cerebral na penumbra isquêmica, redução da excitabilidade do reflexo de estiramento da coluna e aumento da expressão do cotransportador de cloreto de potássio (KCC2) em motoneurônios do chifre anterior da espinha. Essa modulação molecular pode aumentar ainda mais a transmissão inibitória do ácido espinhal γ-aminobutírico (GABA)ergica, contribuindo assim para o alívio da espasticidade10,11.

As investigações mecanicistas existentes sobre MSSA permanecem limitadas, sem estudos anteriores que examinem especificamente como a substância branca intracerebral em vias descendentes extrapiramidais contribui para a PSS. A cápsula externa forma um segmento crítico de substância branca da via cortico-retículo-espinhal; Ele contém fibras cortico-tegmentais que transmitem sinais corticais para a formação reticular do tronco encefálico, contribuindo assim para o controle inibitório supraespinhal dos circuitos do reflexo espinhal12,13. Consistente com esse papel anatômico, múltiplos estudos de mapeamento de lesões e sintomas baseados em vóxeles mostraram que danos na cápsula externa estão associados à espasticidade dos membros superiores e inferiores apósAVC 12,13,14. Essas observações anatômicas e clínicas apoiam a seleção da cápsula externa como a principal região de interesse (ROI). Até o momento, nenhuma evidência in vivo demonstrou se a MSSA preserva a integridade microestrutural da cápsula externa ou se tais alterações estão associadas a alterações na excitabilidade do reflexo espinhal. Avaliações clínicas baseadas em avaliações comportamentais, ressonância magnética convencional (RM) e testes eletrofisiológicos permitem apenas análises correlacionais e podem ser influenciadas pela heterogeneidade do paciente, duração da doença e outros fatores clínicos de confusão. Em contraste, modelos padronizados de PSS em ratos permitem controle rigoroso das variáveis experimentais e protocolos uniformes de intervenção, fornecendo assim uma plataforma complementar para investigação mecanicista.

Focando na microestrutura da substância branca cerebral e na função neurofisiológica, este estudo integrou abordagens multimodais, incluindo imagem ponderada em T2 (T2WI), imagem por tensor de difusão (DTI), registro eletrofisiológico do H-reflexo, coloração direcionada por Luxol Fast Blue (LFB) da cápsula externa e avaliações comportamentais. Ao estabelecer uma estrutura integrada de correlação estrutura-função-comportamento, este estudo buscou investigar as relações entre infarto cerebral, microestrutura da cápsula externa, excitabilidade do reflexo espinhal e espasticidade após o tratamento com MSSA em um modelo de PSS em ratos. Os achados têm como objetivo fornecer evidências pré-clínicas que apoiem a associação entre a integridade preservada da cápsula externa e a redução da hiperexcitabilidade do reflexo espinhal após a MSSA, ao mesmo tempo em que fornecem uma base teórica para a aplicação translacional da MSSA na reabilitação de PSS.

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Protocolo

Quarenta ratos adultos machos Sprague–Dawley (SD) Livre de Patógenos Específicos (SPF), pesando entre 240 e 280 g, foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology [Licença nº: SCXK (Jing) 2021-0011]. Todos os ratos eram alojados no Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim sob condições controladas, com temperatura ambiente de 23°C ± 1°C, umidade relativa de 50% ± 5%, e ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro, com acesso livre a comida e água. Os ratos foram aclimatados por 5 dias, durante os quais o treinamento de aclimatação em esteira foi realizado simultaneamente. Os animais passavam por aclimatação na esteira uma vez por dia, a uma velocidade de 10 m/min, durante 15 minutos por sessão, sem estimulação elétrica para reduzir o estresse do manuseio.

Com base em nosso estudo anterior, a taxa de sucesso da indução de PSS pelo método de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é de aproximadamente 60%. Usando uma tabela de números aleatórios, 9 ratos foram selecionados aleatoriamente antecipadamente como o grupo operado por simulação; os 31 rats restantes foram usados para montagem de modelos. Após a modelagem bem-sucedida, esses ratos foram divididos aleatoriamente em grupo modelo e grupo MSSA. No total, nove ratos foram incluídos em cada grupo. Este experimento foi conduzido de acordo com os princípios 3R do bem-estar animal de laboratório e aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (BUCM 20250915-008).

Estabelecimento de Modelos

O modelo MCAO foi estabelecido em ratos usando uma técnica modificada de filamento intraluminal. Os ratos foram anestesiados com isoflurano a 3% para indução, e a anestesia foi mantida com 1,5% de isoflurano administrado em oxigênio a uma vazão constante de 1 L/min durante todo o procedimento cirúrgico. Foi feita uma incisão cervical na linha média, seguida de dissecação contusa para expor a artéria carótida comum direita (ACC), a artéria carótida externa (ECA) e a artéria carótida interna (ICA). Um ponto de monofilamento de náilon (diâmetro, 0,36 ± 0,02 mm) foi introduzido na ACI através da ECA e avançou aproximadamente 18–20 mm até a origem da artéria cerebral média (MCA) para alcançar a oclusão arterial. Os vasos foram ligados e a incisão foi fechada. Os ratos eram então colocados em uma bolsa térmica até a recuperação da anestesia. Ratos do grupo operado por simulação passaram por exposição cirúrgica idêntica ao CCA, ICA e ECA sem a inserção do filamento intraluminal.

Após a cirurgia, todos os ratos MCAO receberam cuidados pós-operatórios padronizados. Os animais foram mantidos em uma almofada térmica de 37°C nas primeiras 12 horas para evitar hipotermia. Incisões cirúrgicas foram limpas diariamente por três dias consecutivos, ampicilina (100 mg/kg) foi administrada por injeção intraperitoneal para profilaxia da infecção, e alimentos amolecidos foram fornecidos para manter uma nutrição adequada. Atividade geral, ingestão de alimentos, condição da ferida e função motora dos membros foram monitoradas diariamente dos dias pós-operatórios 1 a 10.

Déficits neurológicos foram avaliados por pesquisadores cegados à alocação de grupos usando o escore de déficit neurológico Zea Longa, e o tônus muscular foi avaliado usando a Escala de Ashworth Modificada (MAS). As avaliações foram realizadas 1 dia antes da cirurgia (dia −1), no dia da cirurgia antes do MCAO (dia 0) e nos dias pós-operatórios 1, 3, 5, 7 e 10. Ratos com Zea Longa e escores MAS ≥1 no terceiro dia pós-operatório foram considerados como tendo estabelecido um modelo PSS bem-sucedido.

Tratamento com MSSA

As intervenções começaram no terceiro dia pós-operatório. O local de estimulação da acupuntura no couro cabeludo foi a linha ipsilesional MS 6 (linha oblíqua parietotemporal anterior). De acordo com o Padrão Nacional para Manipulações Padronizadas da Acupuntura do Couro Cabeludo (GB/T 21709.2-2021), a linha MS 6 vai do GV 21 (Qianding) ao GB 6 (Xuanli).

Agulhas estéreis descartáveis de acupuntura (0,25 × 13 mm) foram inseridas sob a galea aponeurótica no GV 21 em um ângulo oblíquo de aproximadamente 15° em relação à superfície do couro cabeludo e avançaram em direção ao GB 6 ao longo da linha oblíqua parietotemporal anterior até uma profundidade de aproximadamente 10 mm. Manipulação rápida de giro (200 voltas/min) foi aplicada continuamente por 1 minuto. Após 15 minutos de retenção da agulha, a mesma manipulação de giro foi repetida uma vez, resultando em um tempo total de retenção da agulha de 30 minutos. Durante todo o período de retenção da agulha, os ratos passaram simultaneamente por exercícios na esteira a uma velocidade constante de 10 m/min.

Ratos dos grupos de operação simulada e modelo não receberam acupuntura nem exercícios na esteira. Para controlar o manuseio inespecífico e o estresse de contenção, foram manuseados com cuidado e contidos em suportes de meia não compressivos por 30 minutos ao dia, igualando a duração total diária da intervenção do grupo MSSA.

Avaliações Comportamentais

Pontuação Zea Longa para déficits neurológicos:

Déficits neurológicos em ratos foram avaliados usando o sistema de pontuação ZeaLonga 16. Os seguintes critérios foram aplicados: um escore de 0 indicou ausência de comprometimento neurológico e movimento normal e sem restrições; uma pontuação de 1 indicava extensão incompleta do membro anterior ou posterior contralateral ao lado afetado; uma pontuação de 2 indicava circulação em direção ao lado contralateral durante a locomoção; uma pontuação de 3 indicou queda para o lado contralateral enquanto caminhava; e uma pontuação de 4 indicou perda de consciência com ausência de ambulação espontânea.

MAS para Tônus Muscular:

O tônus muscular foi avaliado usando o MAS17. Os critérios foram definidos da seguinte forma: grau 0, ausência de aumento no tônus muscular; grau 1, leve aumento no tônus muscular, com uma trava transitória ou resistência mínima ao final da flexão e extensão passivas; grau 1+, aumento marcante do tônus muscular, com travamento transitório na média do movimento e resistência persistente durante a segunda metade do movimento; grau 2, aumento pronunciado do tônus muscular, com resistência evidente durante a maior parte do alcance do movimento, embora o membro permanecesse facilmente móvel; grau 3, aumento substancial no tônus muscular que dificultou a flexão e extensão passivas; e grau 4, movimento passivo limitado devido à rigidez das articulações. O Grau 1+ recebeu uma pontuação de 2 pontos, resultando em uma pontuação máxima de 5 pontos no MAS neste estudo10.

Neuroimagem T2WI para Quantificação do Volume do Infarto Cerebral

Todas as varreduras T2WI foram adquiridas usando um scanner de ressonância magnética PharmaScan operado com o software ParaVision 360 (versão 3.5). Uma sequência de pulsos de aquisição turbo rápida ponderada em T2 com aprimoramento de relaxamento (T2_TurboRARE, também chamada RARE/eco rápido de spin [FSE]) foi aplicada a ratos MCAO para quantificar o volume do infarto cerebral. Os parâmetros de imagem foram configurados da seguinte forma: tempo de repetição (TR) = 3000,0 ms, tempo de eco (TE) = 33,0 ms, campo de visão (FOV) = 35,00 × 35,00mm 2, tamanho da matriz = 250 × 250, espessura da fatia = 0,80 mm, número de fatias = 35, número de excitações (NEX) = 3,0 e ângulo de inversão (FA) = 180,0°. As regiões do infarto cerebral foram delimitadas manualmente fatia a fatia no software ITK-SNAP (versão 4.4.0) por um único pesquisador cego para a atribuição em grupo, utilizando mudanças de intensidade do sinal e características morfológicas consistentes com infarto isquêmico. O volume do infarto cerebral era então calculado automaticamente pelo software.

DTI Neuroimaging para Avaliação da Integridade Microestrutural da Substância Branca

Os dados da ressonância magnética foram adquiridos usando um scanner de ressonância magnética 7.0 T PharmaScan. A anestesia foi induzida com 3% de isoflurano administrado em ar comprimido (0,4–0,6 L/min) e mantida com 1% de isoflurano durante toda a aquisição do DTI. A temperatura central do corpo foi mantida usando um banho-maria controlado termostaticamente durante todo o procedimento de imagem.

Durante a varredura por ressonância magnética, uma sequência de localização em três planos foi aplicada pela primeira vez para posicionar o cérebro do rato dentro do ímã. A DTI foi realizada usando uma sequência axial de imagem ecoplanar spin-echo de disparo único com os seguintes parâmetros: TR/TE = 3000/27 ms, matriz = 90 × 75, FOV = 20 × 15 mm2, espessura do corte = 0,7 mm, 30 direções de gradiente de difusão e valores b de 0 e 1000 s/mm 2. Para a análise DTI, regiões de interesse foram desenhadas na cápsula externa em fatias cerebrais 1,3 mm posteriores ao bregma. Mapas paramétricos de anisotropia fracionária (FA), difusividade média (DM), difusividade axial (DA) e difusividade radial (RD) foram reconstruídos usando o software ParaVision 360. Os dados são expressos como a razão entre o hemisfério afetado e o hemisfério saudável contralateral.

Coloração LFB para avaliação de lesão de mielina e remielinização

A coloração com LFB foi realizada para avaliar danos estruturais aos axônios mielinizados na cápsula externa. A lesão da mielina, caracterizada por rarefação e vacuolação da mielina, foi quantificada medindo a densidade óptica integrada (IOD) de fibras mielinizadas coradas com LFB dentro do ROI na cápsula externa usando o software ImageJ (versão 6.0; limiar em escala de cinza, 35–225). Com base no atlas estereotáxico cerebralde rato 18, três seções coronais foram analisadas para cada animal com bregma +1,0 mm, −1,3 mm e −1,6 mm, correspondendo às porções anterior, média e média-posterior da cápsula externa. A média de IOD nas três seções foi calculada para representar cada animal (n = 4 por grupo). Os valores de IOD ipsilaterais foram normalizados para o lado contralateral e expressos como umaporcentagem 19.

Registros eletrofisiológicos para avaliação da excitabilidade do reflexo espinhal

O reflexo H monossináptico espinhal foi registrado usando um sistema experimental de função biológica. Os ratos foram levemente anestesiados com α-cloralose (50 mg/kg, intraperitonealmente) para preservar a excitabilidade do reflexo espinhal durante os registros eletrofisiológicos. O nervo ciático esquerdo foi exposto por dissecação contundente e colocado sobre eletrodos bipolares para estimulação elétrica. Uma solução vitamínica oleosa foi aplicada intermitentemente no nervo exposto para manter a hidratação dos tecidos e a viabilidade neural. Um par de eletrodos de gravação em aço inoxidável foi inserido nos músculos interósseos da pata traseira esquerda, e um eletrodo de terra foi colocado na cauda. O H-reflexo foi evocado usando um estimulador de pulso monopolar-bipolar com duração de pulso de 100 μs. O limiar do reflexo H e o limiar motor (MT) foram determinados por estimulação elétrica incremental, com a corrente aumentada em passos de 0,05 mA até uma intensidade máxima de 3,0 mA para evitar lesão irreversível dos nervos periféricos.

Usando a mesma intensidade de estimulação que provocou o reflexo H máximo (Hmáx), estímulos de pulso de frequências variadas (0,3, 5 e 10 Hz) foram aplicados para obter amplitudes do reflexo H em diferentes frequências de estimulação. Estimulação repetida de pulsos a 0,3 Hz foi aplicada para verificar que a amplitude da onda M permaneceu dentro de 95% de seu valor inicial; caso contrário, o conjunto de dados era descartado. A depressão dependente da frequência do reflexo H (DFD) foi calculada como a porcentagem da razão de amplitude H/M-onda (razão H/M) em 5 Hz e 10 Hz em relação àquela em 0,3 Hz, com a razão H/M em 0,3 Hz servindo como referênciabase 10.

Análise de Dados

As análises estatísticas foram realizadas usando o software SPSS (versão 20.0). Os dados contínuos são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). A normalidade dos dados foi avaliada usando o teste de Shapiro–Wilk. A análise unidirecional da variância (ANOVA) foi usada para comparar os resultados convencionais de imagem e outras variáveis quantitativas entre os grupos. Quando a homogeneidade da variância era satisfeita, eram realizados testes post hoc de Bonferroni; caso contrário, o teste T3 de Dunnett foi aplicado. Os dados comportamentais foram analisados usando ANOVA bidirecional, com o grupo experimental e o período pós-operatório como fatores fixos. A análise de correlação de Spearman foi usada para avaliar associações entre variáveis do estudo. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

MSSA Melhora Déficits Funcionais Neurológicos

A ANOVA de medidas repetidas bidirecionais revelou efeitos principais significativos do tempo (F[2,613, 62,71] = 315,3, p < 0,001) e do grupo (F[2, 24] = 142,9, p < 0,001), bem como uma interação significativa do tempo × grupo (F[12, 144] = 99,94, p < 0,001) para os escores neurológicos da Zea Longa. Um dia antes da cirurgia, todos os ratos dos grupos operado simuladament...

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Discussão

Do ponto de vista da medicina tradicional chinesa, a PSS se enquadra na categoria de distúrbios músculo-tendões, com uma patogênese central descrita como lesão cerebral como causa raiz e espasticidade dos membros como manifestaçãosuperficial 20. Portanto, as estratégias terapêuticas devem abordar tanto a lesão cerebral primária quanto as manifestações periféricassecundárias 21. A justificativa subjacente à MSSA enfatiza a regulação holístic...

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Divulgações

Conflito de Interesses:

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Bolsa nº 82405579).

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Materiais

```html
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
α-ChloraloseGoldBioC-118-250Anestésico para gravações de reflexo H
Absolute EthanolBeijing Tong Guang Fine Chemicals Co., Ltd.VS104021-500 mLReagente histológico
Acupuncture Needles (0.25 × 13 mm)Beijing Zhongyan Taihe Acupuncture Needle Co., Ltd.NAAgulhas estéreis descartáveis para acupuntura no couro cabeludo
AmpicillinBeijing Rui Da Heng Hui Technology Development Co., Ltd.HD-3018-500gAntibiótico para profilaxia de infecções pós-operatórias
Biological Function Experiment System (BL420N)Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd.NASistema de registro eletrofisiológico
Diffusion Tensor Imaging Analysis Software (ParaVision 360)BrukerNAAquisição de RM e reconstrução DTI
Eco-Friendly Dewaxing and Clearing SolutionServicebioG1128-500MLReagente histológico
Fully Automatic Rotary MicrotomeLeica MicrosystemsRM2255Corte de tecido
Heating PadSuzhou Caiyang Electric Heating Technology Co., Ltd.TT180×150-1XDManutenção de temperatura pós-operatória
ImageJ 6.0National Institutes of HealthNAAnálise quantitativa de imagem
IsofluraneBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.I8000-25gAnestésico inalatório
ITK-SNAP 4.4.0University of PennsylvaniaNASegmentação de infarto cerebral
Luxol Fast Blue SolutionServicebioG1030-100MLCorante de mielina
Monofilament Nylon Suture (0.36 ± 0.02 mm)Beijing Cinontech Co., Ltd.NAIndução MCAO
Paraformaldehyde (4% in PBS)ServicebioTBAB0102Fixação de tecido
PharmaScan 7.0 T Magnetic Resonance ScannerBrukerNAAquisição de RM
SPSS Statistics 20.0IBMNAAnálise estatística
Sprague–Dawley Rats (SPF, male)Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.NAAnimais experimentais
Thermostatically Controlled Water Bath SystemShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co., Ltd.ZX-5AManutenção de temperatura durante a RM
Treadmill for RodentsCleverTreadScanTreinamento de exercícios durante aclimatação e MSSA
```

Referências

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Reimpressões e permissões

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NeurociênciaEdição 234Edição 234Valor VazioEdiçãooclusão da artéria cerebral médiainfarto cerebralcápsula externaintegridade da mielinavia cortico-reticuloespinalimagem por tensor de difusãoreflexo Htécnica de agulhamentoacupunturareabilitação após acidente vascular cerebral

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