Efeitos da acupuntura no couro cabeludo em estilo de movimento na microestrutura da cápsula externa e na excitabilidade do reflexo espinhal em um modelo de rato de espasticidade pós-AVC

Resumo

Este protocolo descreve acupuntura do couro cabeludo em estilo de movimento em um modelo de rato de espasticidade pós-AVC e demonstra sua avaliação usando imagens comportamentais, de ressonância magnética, histológicas e eletrofisiológicas para investigar alterações na microestrutura da cápsula externa e na excitabilidade do reflexo espinhal.

Resumo

A espasticidade pós-AVC (PSS) prejudica gravemente a função motora e a qualidade de vida após o AVC. A ruptura da via cortico-reticuloespinhal e a inibição descendente supraespinhal prejudicada são considerados mecanismos patológicos importantes; no entanto, os mecanismos neurais e microestruturais subjacentes aos efeitos terapêuticos da acupuntura do couro cabeludo em movimento (MSSA) permanecem incompletamente compreendidos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos da MSSA na PSS utilizando uma avaliação multimodal que integra neuroimagem, eletrofisiologia e histologia em um modelo de rato de oclusão da artéria cerebral média. A imagem por ressonância magnética ponderada em T2 foi realizada para quantificar o volume do infarto cerebral, e a imagem por tensor de difusão foi usada para avaliar a integridade microestrutural da substância branca da cápsula externa. A coloração Luxol Fast Blue (LFB) avaliou a integridade da mielina dentro da cápsula externa, enquanto registros do reflexo H avaliaram a excitabilidade do reflexo espinhal. Análises de correlação foram realizadas para examinar as relações entre volume do infarto, microestrutura da substância branca, excitabilidade do reflexo espinhal e gravidade da espasticidade. A MSSA reduziu o volume do infarto cerebral, aliviou danos microestruturais da cápsula externa e atenuou a desmielinização. Além disso, a MSSA melhorou parâmetros anormais do reflexo H, normalizou a excitabilidade do reflexo espinhal e reduziu a espasticidade. Análises de correlação mostraram que infartos maiores estavam associados a maior lesão na cápsula externa, enquanto melhor preservação da integridade da substância branca estava associada a melhor regulação do reflexo espinhal e espasticidade menos severa. Esses achados sugerem que a MSSA pode aliviar a PSS reduzindo a lesão cerebral isquêmica, preservando a integridade microestrutural da cápsula externa e melhorando a função inibitória descendente associada à via cortico-reticuloespinhal, fornecendo evidências pré-clínicas que apoiam sua aplicação terapêutica.

Introdução

A espasticidade pós-AVC (PSS) é uma sequela prevalente e incapacitante do AVC isquêmico, definida clinicamente por aumentos dependentes da velocidade e do comprimento no tônus muscular. Essa condição frequentemente leva a postura anormal dos membros e padrões de movimento disfuncionais, comprometendo severamente a independência motora e a qualidade de vida dos pacientes, além de impor cargas econômicas e cuidadoras significativas em^{todo o mundo 1,2}. Como uma manifestação típica da síndrome do neurônio motor superior, a patogênese da PSS é atribuída principalmente à hiperexcitabilidade exagerada dos reflexos de estiramento da coha. Estudos neuroanatômicos e neurofisiológicos acumulados demonstraram que a perda da modulação inibitória descendente do sistema extrapiramidal para os circuitos reflexos espinhales é um mecanismo patológico chave subjacente à iniciação e progressão da PSS, com a via cortico-reticuloespinhal servindo como o circuito neural principal que media esse controle regulatório ^{descendente 3,4,5}.

A técnica de agulhamento é um determinante fundamental da eficácia da acupuntura e ocupa uma posição fundamental na prática clínica da acupuntura. A acupuntura do couro cabeludo no estilo de movimento (MSSA) é uma técnica de agulhamento distinta desenvolvida especificamente para intervenção PSS, que combina acupuntura do couro cabeludo com exercícios simultâneos de membros^{ativos ou passivos 3}. Numerosos ensaios clínicos mostraram que a MSSA produz resultados superiores em comparação apenas com acupuntura no couro cabeludo ou reabilitação de exercícios isolada na redução da gravidade da espasticidade, restauração da função locomotora e melhoria das atividades diárias em sobreviventes de ^AVC 6,7,8,9. Nossos estudos anteriores em animais demonstraram ainda que a MSSA exerce efeitos antiespásticos mais pronunciados do que a acupuntura convencional do couro cabeludo em modelos de PSS em ratos. Mecanisticamente, esses efeitos terapêuticos têm sido associados à melhora da perfusão cerebral na penumbra isquêmica, redução da excitabilidade do reflexo de estiramento da coluna e aumento da expressão do cotransportador de cloreto de potássio (KCC2) em motoneurônios do chifre anterior da espinha. Essa modulação molecular pode aumentar ainda mais a transmissão inibitória do ácido espinhal γ-aminobutírico (GABA)ergica, contribuindo assim para o alívio da espasticidade^10,11.

As investigações mecanicistas existentes sobre MSSA permanecem limitadas, sem estudos anteriores que examinem especificamente como a substância branca intracerebral em vias descendentes extrapiramidais contribui para a PSS. A cápsula externa forma um segmento crítico de substância branca da via cortico-retículo-espinhal; Ele contém fibras cortico-tegmentais que transmitem sinais corticais para a formação reticular do tronco encefálico, contribuindo assim para o controle inibitório supraespinhal dos circuitos do reflexo espinhal^12,13. Consistente com esse papel anatômico, múltiplos estudos de mapeamento de lesões e sintomas baseados em vóxeles mostraram que danos na cápsula externa estão associados à espasticidade dos membros superiores e inferiores após^AVC 12,13,14. Essas observações anatômicas e clínicas apoiam a seleção da cápsula externa como a principal região de interesse (ROI). Até o momento, nenhuma evidência in vivo demonstrou se a MSSA preserva a integridade microestrutural da cápsula externa ou se tais alterações estão associadas a alterações na excitabilidade do reflexo espinhal. Avaliações clínicas baseadas em avaliações comportamentais, ressonância magnética convencional (RM) e testes eletrofisiológicos permitem apenas análises correlacionais e podem ser influenciadas pela heterogeneidade do paciente, duração da doença e outros fatores clínicos de confusão. Em contraste, modelos padronizados de PSS em ratos permitem controle rigoroso das variáveis experimentais e protocolos uniformes de intervenção, fornecendo assim uma plataforma complementar para investigação mecanicista.

Focando na microestrutura da substância branca cerebral e na função neurofisiológica, este estudo integrou abordagens multimodais, incluindo imagem ponderada em T2 (T2WI), imagem por tensor de difusão (DTI), registro eletrofisiológico do H-reflexo, coloração direcionada por Luxol Fast Blue (LFB) da cápsula externa e avaliações comportamentais. Ao estabelecer uma estrutura integrada de correlação estrutura-função-comportamento, este estudo buscou investigar as relações entre infarto cerebral, microestrutura da cápsula externa, excitabilidade do reflexo espinhal e espasticidade após o tratamento com MSSA em um modelo de PSS em ratos. Os achados têm como objetivo fornecer evidências pré-clínicas que apoiem a associação entre a integridade preservada da cápsula externa e a redução da hiperexcitabilidade do reflexo espinhal após a MSSA, ao mesmo tempo em que fornecem uma base teórica para a aplicação translacional da MSSA na reabilitação de PSS.

Protocolo

Quarenta ratos adultos machos Sprague–Dawley (SD) Livre de Patógenos Específicos (SPF), pesando entre 240 e 280 g, foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology [Licença nº: SCXK (Jing) 2021-0011]. Todos os ratos eram alojados no Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim sob condições controladas, com temperatura ambiente de 23°C ± 1°C, umidade relativa de 50% ± 5%, e ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro, com acesso livre a comida e água. Os ratos foram aclimatados por 5 dias, durante os quais o treinamento de aclimatação em esteira foi realizado simultaneamente. Os animais passavam por aclimatação na esteira uma vez por dia, a uma velocidade de 10 m/min, durante 15 minutos por sessão, sem estimulação elétrica para reduzir o estresse do manuseio.

Com base em nosso estudo anterior, a taxa de sucesso da indução de PSS pelo método de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é de aproximadamente ^60%. Usando uma tabela de números aleatórios, 9 ratos foram selecionados aleatoriamente antecipadamente como o grupo operado por simulação; os 31 rats restantes foram usados para montagem de modelos. Após a modelagem bem-sucedida, esses ratos foram divididos aleatoriamente em grupo modelo e grupo MSSA. No total, nove ratos foram incluídos em cada grupo. Este experimento foi conduzido de acordo com os princípios 3R do bem-estar animal de laboratório e aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (BUCM 20250915-008).

Estabelecimento de Modelos

O modelo MCAO foi estabelecido em ratos usando uma técnica modificada de filamento intraluminal. Os ratos foram anestesiados com isoflurano a 3% para indução, e a anestesia foi mantida com 1,5% de isoflurano administrado em oxigênio a uma vazão constante de 1 L/min durante todo o procedimento cirúrgico. Foi feita uma incisão cervical na linha média, seguida de dissecação contusa para expor a artéria carótida comum direita (ACC), a artéria carótida externa (ECA) e a artéria carótida interna (ICA). Um ponto de monofilamento de náilon (diâmetro, 0,36 ± 0,02 mm) foi introduzido na ACI através da ECA e avançou aproximadamente 18–20 mm até a origem da artéria cerebral média (MCA) para alcançar a oclusão arterial. Os vasos foram ligados e a incisão foi fechada. Os ratos eram então colocados em uma bolsa térmica até a recuperação da anestesia. Ratos do grupo operado por simulação passaram por exposição cirúrgica idêntica ao CCA, ICA e ECA sem a inserção do filamento intraluminal.

Após a cirurgia, todos os ratos MCAO receberam cuidados pós-operatórios padronizados. Os animais foram mantidos em uma almofada térmica de 37°C nas primeiras 12 horas para evitar hipotermia. Incisões cirúrgicas foram limpas diariamente por três dias consecutivos, ampicilina (100 mg/kg) foi administrada por injeção intraperitoneal para profilaxia da infecção, e alimentos amolecidos foram fornecidos para manter uma nutrição adequada. Atividade geral, ingestão de alimentos, condição da ferida e função motora dos membros foram monitoradas diariamente dos dias pós-operatórios 1 a 10.

Déficits neurológicos foram avaliados por pesquisadores cegados à alocação de grupos usando o escore de déficit neurológico Zea Longa, e o tônus muscular foi avaliado usando a Escala de Ashworth Modificada (MAS). As avaliações foram realizadas 1 dia antes da cirurgia (dia −1), no dia da cirurgia antes do MCAO (dia 0) e nos dias pós-operatórios 1, 3, 5, 7 e 10. Ratos com Zea Longa e escores MAS ≥1 no terceiro dia pós-operatório foram considerados como tendo estabelecido um modelo PSS bem-sucedido.

Tratamento com MSSA

As intervenções começaram no terceiro dia pós-operatório. O local de estimulação da acupuntura no couro cabeludo foi a linha ipsilesional MS 6 (linha oblíqua parietotemporal anterior). De acordo com o Padrão Nacional para Manipulações Padronizadas da Acupuntura do Couro Cabeludo (GB/T 21709.2-2021), a linha MS 6 vai do GV 21 (Qianding) ao GB 6 (Xuanli).

Agulhas estéreis descartáveis de acupuntura (0,25 × 13 mm) foram inseridas sob a galea aponeurótica no GV 21 em um ângulo oblíquo de aproximadamente 15° em relação à superfície do couro cabeludo e avançaram em direção ao GB 6 ao longo da linha oblíqua parietotemporal anterior até uma profundidade de aproximadamente 10 mm. Manipulação rápida de giro (200 voltas/min) foi aplicada continuamente por 1 minuto. Após 15 minutos de retenção da agulha, a mesma manipulação de giro foi repetida uma vez, resultando em um tempo total de retenção da agulha de 30 minutos. Durante todo o período de retenção da agulha, os ratos passaram simultaneamente por exercícios na esteira a uma velocidade constante de 10 m/min.

Ratos dos grupos de operação simulada e modelo não receberam acupuntura nem exercícios na esteira. Para controlar o manuseio inespecífico e o estresse de contenção, foram manuseados com cuidado e contidos em suportes de meia não compressivos por 30 minutos ao dia, igualando a duração total diária da intervenção do grupo MSSA.

Avaliações Comportamentais

Pontuação Zea Longa para déficits neurológicos:

Déficits neurológicos em ratos foram avaliados usando o sistema de pontuação Zea^{Longa 16}. Os seguintes critérios foram aplicados: um escore de 0 indicou ausência de comprometimento neurológico e movimento normal e sem restrições; uma pontuação de 1 indicava extensão incompleta do membro anterior ou posterior contralateral ao lado afetado; uma pontuação de 2 indicava circulação em direção ao lado contralateral durante a locomoção; uma pontuação de 3 indicou queda para o lado contralateral enquanto caminhava; e uma pontuação de 4 indicou perda de consciência com ausência de ambulação espontânea.

MAS para Tônus Muscular:

O tônus muscular foi avaliado usando o MAS¹⁷. Os critérios foram definidos da seguinte forma: grau 0, ausência de aumento no tônus muscular; grau 1, leve aumento no tônus muscular, com uma trava transitória ou resistência mínima ao final da flexão e extensão passivas; grau 1+, aumento marcante do tônus muscular, com travamento transitório na média do movimento e resistência persistente durante a segunda metade do movimento; grau 2, aumento pronunciado do tônus muscular, com resistência evidente durante a maior parte do alcance do movimento, embora o membro permanecesse facilmente móvel; grau 3, aumento substancial no tônus muscular que dificultou a flexão e extensão passivas; e grau 4, movimento passivo limitado devido à rigidez das articulações. O Grau 1+ recebeu uma pontuação de 2 pontos, resultando em uma pontuação máxima de 5 pontos no MAS neste estudo¹⁰.

Neuroimagem T2WI para Quantificação do Volume do Infarto Cerebral

Todas as varreduras T2WI foram adquiridas usando um scanner de ressonância magnética PharmaScan operado com o software ParaVision 360 (versão 3.5). Uma sequência de pulsos de aquisição turbo rápida ponderada em T2 com aprimoramento de relaxamento (T2_TurboRARE, também chamada RARE/eco rápido de spin [FSE]) foi aplicada a ratos MCAO para quantificar o volume do infarto cerebral. Os parâmetros de imagem foram configurados da seguinte forma: tempo de repetição (TR) = 3000,0 ms, tempo de eco (TE) = 33,0 ms, campo de visão (FOV) = 35,00 × 35,00^{mm 2}, tamanho da matriz = 250 × 250, espessura da fatia = 0,80 mm, número de fatias = 35, número de excitações (NEX) = 3,0 e ângulo de inversão (FA) = 180,0°. As regiões do infarto cerebral foram delimitadas manualmente fatia a fatia no software ITK-SNAP (versão 4.4.0) por um único pesquisador cego para a atribuição em grupo, utilizando mudanças de intensidade do sinal e características morfológicas consistentes com infarto isquêmico. O volume do infarto cerebral era então calculado automaticamente pelo software.

DTI Neuroimaging para Avaliação da Integridade Microestrutural da Substância Branca

Os dados da ressonância magnética foram adquiridos usando um scanner de ressonância magnética 7.0 T PharmaScan. A anestesia foi induzida com 3% de isoflurano administrado em ar comprimido (0,4–0,6 L/min) e mantida com 1% de isoflurano durante toda a aquisição do DTI. A temperatura central do corpo foi mantida usando um banho-maria controlado termostaticamente durante todo o procedimento de imagem.

Durante a varredura por ressonância magnética, uma sequência de localização em três planos foi aplicada pela primeira vez para posicionar o cérebro do rato dentro do ímã. A DTI foi realizada usando uma sequência axial de imagem ecoplanar spin-echo de disparo único com os seguintes parâmetros: TR/TE = 3000/27 ms, matriz = 90 × 75, FOV = 20 × 15 mm², espessura do corte = 0,7 mm, 30 direções de gradiente de difusão e valores b de 0 e 1000 s/^{mm 2}. Para a análise DTI, regiões de interesse foram desenhadas na cápsula externa em fatias cerebrais 1,3 mm posteriores ao bregma. Mapas paramétricos de anisotropia fracionária (FA), difusividade média (DM), difusividade axial (DA) e difusividade radial (RD) foram reconstruídos usando o software ParaVision 360. Os dados são expressos como a razão entre o hemisfério afetado e o hemisfério saudável contralateral.

Coloração LFB para avaliação de lesão de mielina e remielinização

A coloração com LFB foi realizada para avaliar danos estruturais aos axônios mielinizados na cápsula externa. A lesão da mielina, caracterizada por rarefação e vacuolação da mielina, foi quantificada medindo a densidade óptica integrada (IOD) de fibras mielinizadas coradas com LFB dentro do ROI na cápsula externa usando o software ImageJ (versão 6.0; limiar em escala de cinza, 35–225). Com base no atlas estereotáxico cerebral^{de rato 18}, três seções coronais foram analisadas para cada animal com bregma +1,0 mm, −1,3 mm e −1,6 mm, correspondendo às porções anterior, média e média-posterior da cápsula externa. A média de IOD nas três seções foi calculada para representar cada animal (n = 4 por grupo). Os valores de IOD ipsilaterais foram normalizados para o lado contralateral e expressos como uma^{porcentagem 19}.

Registros eletrofisiológicos para avaliação da excitabilidade do reflexo espinhal

O reflexo H monossináptico espinhal foi registrado usando um sistema experimental de função biológica. Os ratos foram levemente anestesiados com α-cloralose (50 mg/kg, intraperitonealmente) para preservar a excitabilidade do reflexo espinhal durante os registros eletrofisiológicos. O nervo ciático esquerdo foi exposto por dissecação contundente e colocado sobre eletrodos bipolares para estimulação elétrica. Uma solução vitamínica oleosa foi aplicada intermitentemente no nervo exposto para manter a hidratação dos tecidos e a viabilidade neural. Um par de eletrodos de gravação em aço inoxidável foi inserido nos músculos interósseos da pata traseira esquerda, e um eletrodo de terra foi colocado na cauda. O H-reflexo foi evocado usando um estimulador de pulso monopolar-bipolar com duração de pulso de 100 μs. O limiar do reflexo H e o limiar motor (MT) foram determinados por estimulação elétrica incremental, com a corrente aumentada em passos de 0,05 mA até uma intensidade máxima de 3,0 mA para evitar lesão irreversível dos nervos periféricos.

Usando a mesma intensidade de estimulação que provocou o reflexo H máximo (H_máx), estímulos de pulso de frequências variadas (0,3, 5 e 10 Hz) foram aplicados para obter amplitudes do reflexo H em diferentes frequências de estimulação. Estimulação repetida de pulsos a 0,3 Hz foi aplicada para verificar que a amplitude da onda M permaneceu dentro de 95% de seu valor inicial; caso contrário, o conjunto de dados era descartado. A depressão dependente da frequência do reflexo H (DFD) foi calculada como a porcentagem da razão de amplitude H/M-onda (razão H/M) em 5 Hz e 10 Hz em relação àquela em 0,3 Hz, com a razão H/M em 0,3 Hz servindo como referência^{base 10}.

Análise de Dados

As análises estatísticas foram realizadas usando o software SPSS (versão 20.0). Os dados contínuos são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). A normalidade dos dados foi avaliada usando o teste de Shapiro–Wilk. A análise unidirecional da variância (ANOVA) foi usada para comparar os resultados convencionais de imagem e outras variáveis quantitativas entre os grupos. Quando a homogeneidade da variância era satisfeita, eram realizados testes post hoc de Bonferroni; caso contrário, o teste T3 de Dunnett foi aplicado. Os dados comportamentais foram analisados usando ANOVA bidirecional, com o grupo experimental e o período pós-operatório como fatores fixos. A análise de correlação de Spearman foi usada para avaliar associações entre variáveis do estudo. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

MSSA Melhora Déficits Funcionais Neurológicos

A ANOVA de medidas repetidas bidirecionais revelou efeitos principais significativos do tempo (F[2,613, 62,71] = 315,3, p < 0,001) e do grupo (F[2, 24] = 142,9, p < 0,001), bem como uma interação significativa do tempo × grupo (F[12, 144] = 99,94, p < 0,001) para os escores neurológicos da Zea Longa. Um dia antes da cirurgia, todos os ratos dos grupos operado simuladamente, modelo e MSSA apresentavam uma pontuação Zea Longa de 0, indicando função neurológica basal intacta sem déficits neurológicos. A partir do primeiro dia pós-operatório, os escores de Zea Longa aumentaram gradualmente tanto no grupo modelo quanto no MSSA. Não foi observada diferença significativa entre esses grupos do dia 1 ao dia 5 do pós-operatório (p > 0,05). Com a intervenção contínua, os escores de Zea Longa no grupo MSSA foram significativamente menores do que os do grupo modelo nos dias 7 e 10 pós-operatórios (p < 0,001), indicando melhora na função neurológica (Figura 1A).

Figura 1. A acupuntura do couro cabeludo em movimento melhora déficits neurológicos e reduz o tônus muscular em ratos com espasticidade pós-AVC. (A) Escores de déficit neurológico da Zea Longa medidos antes da oclusão da artéria cerebral média (MCAO; dia −1), imediatamente antes do MCAO (dia 0) e nos dias pós-operatórios 1, 3, 5, 7 e 10. (B) Pontuações modificadas da Escala de Ashworth medidas nos respectivos pontos de tempo. A linha vertical tracejada indica MCAO no dia 0. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). Barras de erro representam SD. ***p < 0,001 para as comparações indicadas entre parênteses. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

MSSA reduz o volume do infarto cerebral

Ratos operados por simulação apresentaram achados normais de T2WI, com intensidade homogênea do sinal parênquimico em todo o cérebro. Não foram observados hiperintensidade patológica, infarto cerebral, anormalidades morfológicas ou dilatação ventricular (Figura 2A). Em contraste, o grupo modelo apresentou hiperintensidade T2 proeminente no hemisfério cerebral ipsilateral, correspondente à região do infarto isquêmico, juntamente com evidente aumento ventricular (Figura 2A). A análise morfométrica quantitativa demonstrou que o volume do infarto cerebral foi significativamente reduzido no grupo MSSA em comparação com o grupo modelo (p < 0,001; Figura 2B). A intervenção MSSA está ilustrada na Figura 2C.

Figura 2. A acupuntura do couro cabeludo no estilo de movimento reduz o volume do infarto cerebral em ratos com espasticidade pós-AVC. (A) Imagens cerebrais representativas com imagem ponderada T2 (T2WI) dos grupos de acupuntura do couro cabeludo operada por simulação, modelo e de movimento (MSSA) em 1,00, 0,20, −0,92 e −1,88 mm em relação ao bregma. (B) Quantificação do volume do infarto cerebral a partir do T2WI. Símbolos individuais representam animais individuais. (C) Fotografia da intervenção MSSA realizada simultaneamente com o exercício na esteira. Os dados são apresentados como a média ± SD. As barras de erro representam SD. ***p < 0,001 em comparação com o grupo de modelos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

MSSA atenua a espasticidade muscular pós-AVC

Para as pontuações MAS, a ANOVA de medidas repetidas bidirecionais revelou efeitos principais significativos do tempo (F[2,158, 51,79] = 183,7, p < 0,001) e do grupo (F[2, 24] = 57,68, p < 0,001), juntamente com uma interação significativa no tempo × grupo (F[10, 120] = 58,70, p < 0,001). Todos os ratos apresentaram escore MAS de 0 um dia antes da cirurgia e no primeiro dia pós-operatório, refletindo tônus muscular basal normal sem espasticidade. A partir do terceiro dia pós-operatório, os escores de MAS aumentaram progressivamente nos grupos modelo e MSSA, indicando o desenvolvimento de espasticidade do membro pós-AVC, sem diferença significativa observada entre os dois grupos até esse momento. Do dia 5 ao dia 10 pós-operatório, os escores de MAS no grupo MSSA foram significativamente menores do que os do grupo modelo (p < 0,01 a p < 0,001), indicando que o MSSA aliviou o PSS (Figura 1B).

MSSA preserva a integridade microestrutural da substância branca na cápsula externa

Mapas representativos de parâmetros DTI são mostrados na Figura 3A. No dia 10 pós-operatório, em comparação com o grupo simulado, o grupo modelo apresentou uma redução significativa na razão de anisotropia fracionária (rFA) dentro da cápsula externa (p < 0,001; Figura 3B), acompanhados por aumentos significativos nas razões de difusividade média (rMD) e difusividade radial (rRD) (ambas p < 0,001; Figura 3C,D). Comparado ao grupo modelo, a MSSA aumentou significativamente a rFA (p < 0,001; Figura 3B) e diminuição significativa da rMD e da rRD (ambas p < 0,01; Figura 3C,D). Não foi observada diferença significativa na razão de difusividade axial (rDA) entre os grupos (p > 0,05; Figura 3E). A posição dos ratos durante a aquisição do DTI e a localização anatômica da cápsula externa ROI são mostradas na Figura 3F,G.

Figura 3. A acupuntura do couro cabeludo no estilo de movimento altera parâmetros de imagem do tensor de difusão em ratos com espasticidade pós-AVC. (A) Mapeamentos representativos de anisotropia fracionada (FA), difusividade média (DM), difusividade axial (DA) e difusividade radial (RD) dos grupos de acupuntura simulada, modelo e de acupuntura em estilo de movimento (MSSA) em −1,30 mm em relação ao bregma. (B–E) Quantificação das razões entre FA ipsilesional e contralateral (rFA), MD (rMD), RD (rRD) e AD (rAD), respectivamente. Símbolos individuais representam animais individuais. (F) Fotografia de um rato posicionado para imagem tensorial de difusão (DTI). (G) Imagem esquemática e correspondente de ressonância magnética mostrando as regiões de envolvimento da cápsula externa contralateral e ipsilesional. Os dados são apresentados como a média ± SD. Barras de erro representam SD. #p < 0,05 e ###p < 0,001 em comparação com o grupo operado por simulação; **p < 0,01 e ***p < 0,001 contra o grupo de modelos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

MSSA melhora a integridade da mielina na cápsula externa

A coloração com LFB foi realizada para avaliar a integridade da mielina na cápsula externa. Histologicamente, fibras mielinizadas apresentaram morfologia intacta e arranjo regular no grupo operado por simulação, enquanto perda evidente de mielina e desorganização estrutural foram observadas na cápsula externa de ratos modelo MCAO (Figura 4A). A análise quantitativa mostrou que o IOD relativo da coloração por LFB foi significativamente menor no grupo modelo do que no grupo operado por simulação (p < 0,001; Figura 4B). Comparado ao grupo modelo, o grupo MSSA apresentou valores relativos de IOD significativamente maiores (p < 0,001; Figura 4B), indicando melhora na integridade da mielina na cápsula externa após o tratamento com MSSA.

Figura 4. A acupuntura do couro cabeludo em estilo de movimento atenua a lesão da mielina da cápsula externa em ratos com espasticidade pós-AVC. (A) Seções cerebrais representativas coloridas com Luxol Fast Blue (LFB) panorâmica e vistas ampliadas das regiões de envolvimento (ROIs) da cápsula externa contralateral e ipsilesional dos grupos de acupuntura do couro cabeludo em simulação, modelo e em estilo movimento (MSSA). As caixas azuis e vermelhas nas imagens panorâmicas indicam, respectivamente, os ROIs contralateral e ipsilesional. Barras de escala nas imagens ampliadas = 50 μm. (B) Quantificação da densidade óptica integrada relativa (IOD) da coloração por LFB na cápsula externa ipsilesional normalizada para o lado contralateral. Símbolos individuais representam animais individuais; n = 4 por grupo. Os dados são apresentados como a média ± SD. As barras de erro representam SD. ###p < 0,001 versus o grupo operado por simulação; p < 0,001 contra o grupo de modelos; △p < 0,05 para a comparação indicada pelo colchete. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

MSSA inibe a hiperexcitabilidade do reflexo H espinhal

Gravações representativas de ondas M e H são mostradas na Figura 5A, e o sistema de gravação eletrofisiológica é mostrado na Figura 5B. No décimo dia pós-operatório, a avaliação eletrofisiológica demonstrou que, em comparação com o grupo simulado, o grupo modelo apresentou um aumento significativo do limiar motor (MT; p < 0,001) e razão máxima de onda H/amplitude máxima da onda M (H_máx/_{M máx}) (p < 0,001), um aumento modesto na latência da onda M (p < 0,05) e uma correspondente diminuição da latência do reflexo H (p < 0,05; Figura 5C–H). Comparado ao grupo modelo, o grupo MSSA apresentou MT significativamente menor (p < 0,001) e_{razão máxima}/M_máxima /M (p < 0,001), juntamente com um limiar do reflexo H significativamente maior (p < 0,001; Figura 5C–H). Não foi observada diferença significativa na intensidade de estimulação necessária para provocar o H_max expresso como múltiplo de MT entre os grupos modelo e MSSA (Figura 5H). Além disso, quando normalizado para a razão H/M em 0,3 Hz, a FDD do reflexo H diminuiu progressivamente com o aumento da frequência de estimulação nos três grupos (Figura 5I). Tanto em 5 Hz quanto em 10 Hz, a razão H/M foi significativamente menor no grupo MSSA do que no grupo modelo ( ambos p < 0,001), indicando uma restauração parcial da FDD do reflexo H em direção ao padrão fisiológico (Figura 5J; Tabela 1).

Figura 5. A acupuntura do couro cabeludo no estilo movimento reduz a hiperexcitabilidade do reflexo espinhal em ratos com espasticidade pós-AVC. (A) Traços representativos sobrepostos de ondas M e ondas H dos grupos de acupuntura do couro cabeludo (MSSA) operada por simulação, modelo e em estilo de movimento. (B) Fotografia do sistema de registro eletrofisiológico mostrando o local de estimulação do nervo ciático, eletrodos de registro e eletrodo de terra. (C–H) Quantificação do limiar motor (MT), razão máxima de onda H/amplitude máxima da onda M (H_máx/M_máx), latência da onda H, limiar do reflexo H, latência da onda M e a intensidade de estimulação que provoca o H_máximo expresso como múltiplo da MT, respectivamente. Símbolos individuais representam animais individuais. (I) Traços representativos do reflexo H obtidos em frequências de estimulação de 0,3 Hz, 5 Hz e 10 Hz em cada grupo. (J) Depressão dependente da frequência do reflexo H, expressa como a razão H/M em 5 Hz e 10 Hz normalizada para a razão H/M em 0,3 Hz. Regiões sombreadas representam a DS dos valores médios. Os dados são apresentados como a média ± SD. Barras de erro representam SD. #p < 0,05 e ###p < 0,001 versus o grupo operado por simulação; p < 0,001 contra o grupo de modelos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Grupo	MT (mA)	Mmax (mV)	Hmax (mV)	Latência M (ms)	Latência H (ms)	Limiar do reflexo H (×MT)	Hmax (×MT)	Relação H/M (0,3 Hz)	Relação H/M (5 Hz)	Razão H/M (10 Hz)
Sham (n = 9)	0,808 ± 0,218	11.119 ± 7.802	2.804 ± 2.896	4,567 ± 0,731	11.311 ± 0.849	1,296 ± 0,251	1,554 ± 0,264	0,452 ± 0,264	0,304 ± 0,155	0,176 ± 0,137
Modelo (n = 9)	1.855 ± 0.203###	3.282 ± 2.040##	2.307 ± 1.296	5.333 ± 0.893	10.456 ± 1.056	0,729 ± 0,299	1.517 ± 0.303	0,826 ± 0,120##	0,741 ± 0,129###	0,684 ± 0,131###
MSSA (n = 9)	0,663 ± 0,236	5.908 ± 2.751	1,497 ± 0,688	4.744 ± 0.590	10.978 ± 0.602	1.939 ± 0.819	1.832 ± 1.557	0,556 ± 0,238*	0,390 ± 0,193**	0,142 ± 0,134

Tabela 1: Parâmetros eletrofisiológicos do reflexo H em ratos com espasticidade pós-AVC. Medições eletrofisiológicas obtidas dos grupos de acupuntura simulada, modelo e acupuntura do couro cabeludo em estilo de movimento (MSSA), incluindo limiar motor (MT), amplitude máxima da onda M (M_max), amplitude máxima da onda H (H_máx), latência da onda M, latência da onda H, limiar do reflexo H expresso como múltiplo da MT (×MT), intensidade da estimulação provocando H_máximo expressos como múltiplos de MT (×MT) e razões H/M medidos em frequências de estimulação de 0,3, 5 e 10 Hz. Os dados são apresentados como médias ± SD. ##p < 0,01 e ###p < 0,001 contra o grupo operado por simulação; *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 contra o grupo de modelos.

Correlações entre o volume de infarto T2WI, métricas DTI da cápsula externa, índices eletrofisiológicos e escores de MAS

As correlações entre o volume do infarto cerebral medido por métricas de T2WI e DTI da cápsula externa foram examinadas primeiro. Na análise agrupada, o volume do infarto foi fortemente correlacionado negativamente com a rFA (ρ = −0,902, p < 0,001) e positivamente correlacionado com a rMD e a rRD (ρ = 0,511, p = 0,03; ρ = 0,661, p = 0,003; Figura 6A–D). Não foram observadas correlações significativas entre o volume do infarto e os parâmetros DTI nas análises de subgrupos. As relações entre métricas DTI da cápsula externa, índices eletrofisiológicos de excitabilidade do reflexo espinhal e tônus muscular avaliados pelo MAS foram então avaliadas. Na análise agrupada, menor rFA esteve associada a uma razão maior de H_máx/M_máximo (ρ = −0,895, p < 0,001), enquanto uma rRD maior esteve associada a um limiar menor do reflexo H (ρ = −0,504, p = 0,03; Figura 6E, F). Além disso, razões mais altas de H_max/M_max e limiares mais baixos do reflexo H estiveram associados a pontuações MAS mais altas (ρ = 0,760, p < 0,001; ρ = −0,479, p = 0,01; Figura 6G,H). Análises de subgrupos demonstraram uma correlação negativa significativa entre o limiar do reflexo H e a pontuação MAS apenas no grupo modelo (ρ = −0,736, p = 0,03), enquanto nenhuma correlação significativa foi observada nos grupos operados por simulação ou MSSA.

Figura 6. Associações entre o volume do infarto cerebral, parâmetros de imagem do tensor de difusão, índices do reflexo H e tônus muscular em ratos com espasticidade pós-AVC. (A–D) Associações do volume do infarto cerebral derivado da imagem ponderada em T2 (T2WI) com as razões ipsilesional/contralateral de anisotropia fracionada (rFA), difusividade média (rMD), difusividade radial (rRD) e difusividade axial (rDA), respectivamente. (E) Associação entre rFA e a razão máxima de amplitude de onda H/máxima onda M (H_máx/M_máx). (F) Associação entre o limiar de rRD e do reflexo H. (G) Associação entre H_max/_{M max} e pontuação da Escala de Ashworth Modificada (MAS). (H) Associação entre o limiar do reflexo H e a pontuação MAS. Círculos, quadrados e triângulos representam, respectivamente, os grupos de acupuntura do couro cabeludo em simulação, modelo e de acupuntura em movimento (MSSA). Linhas tracejadas correspondem à curva de ajuste de regressão linear gerada a partir dos dados medidos. Coeficientes de correlação de Spearman (ρ) globais e específicos de grupo e valores p correspondentes são exibidos em cada painel. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Disponibilidade de Dados:

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e no Material Suplementar. Os conjuntos de dados brutos que apoiam os resultados deste estudo são fornecidos na Tabela Suplementar 1.

Tabela Suplementar 1. Conjuntos de dados brutos que apoiam as análises quantitativas apresentadas neste estudo. O livro de exercícios contém os dados experimentais brutos usados para avaliações comportamentais, análise do volume de infartos ponderada por imagem T2 (T2WI), métricas de imagem por tensor de difusão (DTI), quantificação de coloração Luxol Fast Blue (LFB) e medições eletrofisiológicas do H-reflexo para todos os grupos experimentais. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Do ponto de vista da medicina tradicional chinesa, a PSS se enquadra na categoria de distúrbios músculo-tendões, com uma patogênese central descrita como lesão cerebral como causa raiz e espasticidade dos membros como manifestação^{superficial 20}. Portanto, as estratégias terapêuticas devem abordar tanto a lesão cerebral primária quanto as manifestações periféricas^{secundárias 21}. A justificativa subjacente à MSSA enfatiza a regulação holística do cérebro isquêmico até os membros espásticos, com os objetivos terapêuticos de promover a circulação sanguínea, desbloquear os meridianos, relaxar tendões e aliviar a espasticidade. A técnica de agulhamento é central para a eficácia da acupuntura, e escolher uma técnica adequada adaptada ao padrão da doença é fundamental para alcançar resultados clínicos favoráveis. MSSA é uma modalidade característica de acupuntura no couro cabeludo para PSS que combina acupuntura com movimento ativo ou passivo dos membros durante a retenção de^{agulhas 3}. Uma revisão sistemática recente e meta-análise demonstrou que a MSSA produz efeitos superiores na redução da espasticidade muscular, melhora a função motora e aprimora as atividades diárias em pacientes com PSS, em comparação com acupuntura ou reabilitação física convencional^{do couro cabeludo 9}. Notavelmente, a administração simultânea de acupuntura do couro cabeludo e reabilitação por exercício, conforme implementada na MSSA, produz melhores resultados do que a intervenção assíncrona, conforme respaldado por evidências clínicas de qualidade^{moderada 9}. A MS 6, conforme definida em GB/T 21709.2-2021, é uma linha de acupuntura parietotemporal oblíqua anterior do couro cabeludo selecionada por sua relevância anatômica e utilidade clínica^{estabelecida 9}. Ele se sobrepõe aos córtices motores primário e secundário, que são as principais fontes de projeções corticofugas descendentes que moldam a saída reticular do tronco encefálico e modulam a excitabilidade do reflexo espinhal. Clinicamente, a EM 6 é a linha de acupuntura do couro cabeludo mais comumente utilizada para PSS, conforme confirmado pela meta-análise mencionada, tornando-a um alvo ideal para modular vias motoras no presente estudo. Esses achados destacam as características procedimentais distintas e as potenciais vantagens clínicas da MSSA no manejo da PSS. Estudos pré-clínicos também mostraram que a MSSA melhora a perfusão cerebral na penumbra isquêmica e modula a excitabilidade dos motoneurônios do chifre anterior da espinha, fornecendo suporte mecanicista preliminar para sua aplicação^{terapêutica 10,11}.

Na teoria neurológica moderna, a patogênese da PSS é atribuída principalmente a três processos patológicos inter-relacionados: inibição descendente supraespinhal prejudicada, processamento anormal do sinal intraespinhal e alteração das propriedades intrínsecas dos músculos. Entre eles, os mecanismos pelos quais as vias descendentes supraespinais regulam a excitabilidade do reflexo espinhal permanecem incompletamente compreendidos². O trato retículo-espinal (TSR) desempenha um papel essencial na manutenção do equilíbrio do arco reflexo de estiramento. A TSR lateral recebe entrada excitatória do córtex pré-motor contralateral e da área motora suplementar através da via cortico-reticular, desce para dentro do funículo dorsolateral da medula espinhal e exerce controle inibitório sobre a atividade do reflexo de estiramento da coluna. Em contraste, a TSR medial não é regulada pelo córtex contralateral, desce dentro do funículo ventromedial e facilita a atividade reflexa de estiramento. O AVC cortical interrompe a via cortico-reticular, reduz a entrada excitatória para a formação reticular medular e resulta na predominância da atividade da TSR medial. Esse desequilíbrio contribui para o reflexo de estiramento da coha, hiperexcitabilidade e a manifestação clínica da espasticidade dos membros³. Estudos clínicos de neuroimagem relacionaram a PSS a lesões envolvendo o córtex pré-motor, putâmen, membro posterior da cápsula interna e cápsula externa^12,14,22. Entre eles, a cápsula externa representa um conduto chave da substância branca dentro da via cortico-retículo-espinhal, um importante trato extrapiramidal que integra entradas corticais, sinapses nos núcleos reticulares do tronco encefálico e projeta para a medula espinhal para exercer controle inibitório descendente sobre α-motoneurônios e interneurônios²³. Essa estrutura anatômica é apoiada por rastreamento neural e estudos DTI, que identificam consistentemente a cápsula externa como uma conexão principal entre o córtex cerebral, os gânglios da base e o tronco encefálico^23,24. Notavelmente, a espasticidade é cada vez mais reconhecida como um distúrbio em nível de rede resultante da perturbação do equilíbrio entre múltiplos sistemas motores descendentes, incluindo vias corticoespinais e extrapiramidais, em vez de disfunção de um único trato. Nesse contexto, a cápsula externa serve como uma estrutura representativa para sondar contribuições extrapiramidais para a PSS, já que seu envolvimento tem sido consistentemente associado a atividade exagerada do reflexo espinhal, enquanto lesões corticoespinais isoladas produzem mais frequentemente fraqueza sem espasticidade proporcional. Assim, selecionamos a cápsula externa como o principal ROI para investigar alterações microestruturais da substância branca associadas à gravidade da espasticidade. De acordo com esse enquadramento, o T2WI não revelou infarto cerebral evidente no grupo operado por simulação, enquanto lesões proeminentes do infarto foram observadas no grupo-modelo. O tratamento com MSSA melhorou significativamente a função neurológica, conforme avaliado pela escala Zea Longa, sugerindo um efeito neuroprotetor contra lesão cerebral isquêmica. O efeito de poupar infartos do MSSA pode envolver múltiplos mecanismos sinérgicos. Primeiro, foi demonstrado que a MSSA melhora a perfusão cerebral regional na penumbra isquêmica¹⁰, criando assim um microambiente mais favorável para a sobrevivência neuronal. Além disso, embora a evidência direta para MSSA seja atualmente limitada, estudos mecanicistas sobre acupuntura do couro cabeludo sugeriram várias outras vias que também podem contribuir, incluindo a promoção da angiogênese por meio da ativação da via de sinalização MATN2/WNT3a/β-catenina²⁵ e atenuação da neuroinflamação pós-isquêmica por meio da supressão da diferenciação Th17 mediada por RORγt e restauração do equilíbrio Th17/Treg²⁶. Esses achados levantam a possibilidade de que a MSSA possa envolver mecanismos neuroprotetores semelhantes além de seus efeitos hemodinâmicos. No entanto, a contribuição relativa de cada via ainda precisa ser determinada e merece investigação adicional.

A DTI permite uma avaliação quantitativa sensível da microestrutura da substância branca, com a FA refletindo a integridade da fibra, a RD servindo como marcador de desmielinização e a AD refletindo a integridade^{axonal 23}. No presente estudo, a cápsula externa foi selecionada como ROI para avaliar alterações microestruturais associadas à via cortico-reticuloespinhal na PSS. Comparados ao grupo operado por simulação, ratos-modelo apresentaram reduções significativas na AF relativa, juntamente com aumentos significativos na DM e RD relativas, indicativos de integridade da substância branca perturbada, edema cerebral e desmielinização na cápsula externa. A coloração com LFB demonstrou ainda mais perda evidente de mielina e desorganização dos feixes de substância branca, fornecendo suporte histológico para os achados do DTI. Coletivamente, os achados de neuroimagem e histologia indicam que a lesão isquêmica está associada a marcante comprometimento microestrutural da cápsula externa, que foi atenuado após o tratamento com MSSA. O H-reflexo é uma medida eletrofisiológica bem estabelecida para avaliar a excitabilidade do pool de α-motoneurônios espinhal e a regulação descendente^{supraespinhal 27}. A razão H_máx/_{M máximo} reflete a excitabilidade geral dos motoneurônios espinais, enquanto o limiar do reflexo H reflete a inibição pré-sináptica mediada por interneurônios espinais juntamente com entradas descendentes supraespinhais^{integradas 27}. A perturbação da via cortico-reticuloespinhal induzida por AVC enfraquece a regulação inibitória descendente, resultando em hiperexcitabilidade dos motoneurônios espinais caracterizada por um aumento da razão_Hmáx/M_máximo e um limiar reduzido do reflexo^H-27. Nossos experimentos preliminares exploraram os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos antiespásticos da MSSA, demonstrando que essa terapia pode aumentar a expressão espinhal de KCC2 e restaurar a função inibitória^{GABAérgica 10}. Com base nessas descobertas moleculares da coluna, o presente estudo elucida ainda mais os mecanismos supraespinais responsáveis pelos reflexos espinais exagerados, demonstrando que a lesão microestrutural da cápsula externa dentro da via cortico-retículo-espinhal está associada a um aumento marcado da excitabilidade da espinha. Em conjunto, esses achados sugerem que a MSSA pode promover a reconstrução das vias inibitórias descendentes supraespinais e reverter a hiperexcitabilidade do reflexo espinhal em ratos com PSS.

Dada a natureza transversal dos dados atuais, todas as análises de correlação devem ser interpretadas como exploratórias e geradoras de hipóteses, e não como evidências de relações causais. Análises de correlação foram realizadas para investigar as relações entre a carga do infarto, integridade microestrutural da cápsula externa, excitabilidade do reflexo espinhal e gravidade da espasticidade. Em todos os animais, volumes maiores de infartos foram associados a uma perturbação microestrutural derivada de DTI mais severa dentro da cápsula externa, sugerindo uma ligação entre lesão isquêmica primária e alterações secundárias da substância branca ao longo da via cortico-reticuloespinhal. Notavelmente, essas correlações gerais pareciam ser impulsionadas principalmente por diferenças entre grupos, e não pela variação individual dentro do grupo, já que nenhuma correlação significativa foi observada dentro de nenhum grupo individual. Maior FA relativa (rFA) esteve associada a uma menor razão H_máx/_{M máxima} , enquanto maior RD relativa (rRD) esteve associada a um limiar menor do reflexo H, consistente com a noção de que a preservação da integridade da cápsula externa está associada a uma regulação inibitória descendente mais eficaz. Além disso, razões mais altas de H_máx/M_máximo e limiares mais baixos do reflexo H estiveram associados a escores de MAS mais altos, apoiando uma associação entre alterações eletrofisiológicas e gravidade da espasticidade. Análises de subgrupos também revelaram que os padrões gerais de correlação eram predominantemente atribuíveis às diferenças entre grupos. Notavelmente, uma correlação negativa significativa entre o limiar do reflexo H e a pontuação MAS foi observada apenas no grupo modelo, sugerindo que a inibição pré-sináptica comprometida pode estar associada a maior espasticidade sob condições patológicas não tratadas.

Várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiro, a ausência de grupos controle apenas com acupuntura e apenas exercício impede a dissecação de suas contribuições independentes e sinérgicas. Estudos futuros que incorporem esses grupos de comparação ajudariam a esclarecer os mecanismos subjacentes à intervenção combinada. Segundo, o período de observação foi limitado à fase aguda (dias pós-operatórios 0–10), selecionada com base na janela de pico de espasticidade no modelo permanente MCAO. Se a MSSA confere benefícios terapêuticos sustentados além do estágio agudo ainda é desconhecido, e a validação em modelos crônicos de PSS será importante para determinar seu potencial translacional de longo prazo. Terceiro, embora o MAS seja amplamente usado para avaliar o tônus muscular, ele é inerentemente subjetivo e semi-quantitativo. Para complementar essa limitação, o H-reflexo foi simultaneamente avaliado como uma medida eletrofisiológica objetiva da excitabilidade do reflexo espinal. Quarto, o tamanho da amostra era modesto devido às demandas técnicas associadas às avaliações multimodais, e estudos com maior número de animais melhorariam o poder estatístico e a robustez dos achados. Por fim, todos os desfechos foram avaliados apenas no dia 10 pós-operatório. Estudos futuros que incorporem avaliações longitudinais em múltiplos pontos temporais proporcionariam uma compreensão mais abrangente da trajetória temporal das alterações neuroplásticas induzidas pela MSSA.

Estudos futuros podem investigar os mecanismos de neurogênese e remielinização após intervenção em MSSA. Como o DTI não pode visualizar diretamente a regeneração neuronal, abordagens complementares como rastreamento neural e imunohistoquímica podem caracterizar ainda mais a plasticidade neuronal e a remielinização. Do ponto de vista translacional, métricas DTI da cápsula externa, especialmente FA e RD, podem ajudar a estratificar pacientes com AVC de acordo com a gravidade da lesão da via cortico-reticuloespinhal e identificar aqueles que têm maior probabilidade de se beneficiar da MSSA. Essa abordagem orientada por biomarcadores poderia facilitar a seleção de pacientes e a estratificação de tratamentos em futuros ensaios clínicos, embora sua utilidade clínica ainda precise ser validada em coortes prospectivas de AVC. Em conclusão, este estudo investigou os mecanismos neurais associados ao tratamento com MSSA para PSS utilizando uma estrutura integrada que inclui avaliação de infarto baseada em T2WI, avaliação DTI da microestrutura da substância branca, eletrofisiologia do reflexo H e análise histológica de LFB. Os achados sugerem que a MSSA está associada à redução do volume do infarto cerebral, preservação da integridade microestrutural da cápsula externa e melhora na regulação inibitória descendente da via cortico-reticuloespinhal. Essas mudanças foram acompanhadas pela normalização da excitabilidade do reflexo espinhal e redução da espasticidade. Coletivamente, os achados fornecem insights mecanicistas e evidências pré-clínicas que apoiam a possível aplicação translacional da MSSA no manejo da PSS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
α-Chloralose	GoldBio	C-118-250	Anestésico para gravações de reflexo H
Absolute Ethanol	Beijing Tong Guang Fine Chemicals Co., Ltd.	VS104021-500 mL	Reagente histológico
Acupuncture Needles (0.25 × 13 mm)	Beijing Zhongyan Taihe Acupuncture Needle Co., Ltd.	NA	Agulhas estéreis descartáveis para acupuntura no couro cabeludo
Ampicillin	Beijing Rui Da Heng Hui Technology Development Co., Ltd.	HD-3018-500g	Antibiótico para profilaxia de infecções pós-operatórias
Biological Function Experiment System (BL420N)	Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd.	NA	Sistema de registro eletrofisiológico
Diffusion Tensor Imaging Analysis Software (ParaVision 360)	Bruker	NA	Aquisição de RM e reconstrução DTI
Eco-Friendly Dewaxing and Clearing Solution	Servicebio	G1128-500ML	Reagente histológico
Fully Automatic Rotary Microtome	Leica Microsystems	RM2255	Corte de tecido
Heating Pad	Suzhou Caiyang Electric Heating Technology Co., Ltd.	TT180×150-1XD	Manutenção de temperatura pós-operatória
ImageJ 6.0	National Institutes of Health	NA	Análise quantitativa de imagem
Isoflurane	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	I8000-25g	Anestésico inalatório
ITK-SNAP 4.4.0	University of Pennsylvania	NA	Segmentação de infarto cerebral
Luxol Fast Blue Solution	Servicebio	G1030-100ML	Corante de mielina
Monofilament Nylon Suture (0.36 ± 0.02 mm)	Beijing Cinontech Co., Ltd.	NA	Indução MCAO
Paraformaldehyde (4% in PBS)	Servicebio	TBAB0102	Fixação de tecido
PharmaScan 7.0 T Magnetic Resonance Scanner	Bruker	NA	Aquisição de RM
SPSS Statistics 20.0	IBM	NA	Análise estatística
Sprague–Dawley Rats (SPF, male)	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	NA	Animais experimentais
Thermostatically Controlled Water Bath System	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co., Ltd.	ZX-5A	Manutenção de temperatura durante a RM
Treadmill for Rodents	Clever	TreadScan	Treinamento de exercícios durante aclimatação e MSSA