Este estudo avalia os efeitos da pílula Zuogui na osteoporose pós-menopausa em ratas ovariectomizadas, utilizando um delineamento fatorial três por três. Os resultados apoiam efeitos sinérgicos dos componentes Yin e Yang no metabolismo ósseo e nos marcadores associados da via EphB4/ephrinB2, embora as evidências mecanicistas permaneçam associativas e não causais.
Artigo de investigação
Pílula Zuogui Modula o Acoplamento Osteoblasto-Osteoclasto em Ratas Ovariectomizadas: Um Estudo Fatorial Três por Três
21 visualizações
⸱
11 de setembro de 2026
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A osteoporose pós-menopausa é causada pelo desacoplamento da formação e reabsorção óssea associado à deficiência de estrogênio. Este estudo quantificou os efeitos independentes e interativos das subformulações Yin-nutritivas do Zuogui Pill em um modelo de rato ovariectomizado e examinou as associações com a via EphB4/ephrinB2/RhoA/fosfatase alcalina. De acordo com o ARRIVE 2.0, 130 ratas fêmeas Sprague-Dawley livres de patógenos específicos foram randomizadas em 13 grupos (n=10/grupo), incluindo nove grupos em um delineamento fatorial três por três. Os desfechos incluíram P1NP, CTX-1, densidade mineral óssea do fêmur medida por absorciometria de dupla energia com raios X (DXA), histologia trabecular e expressão de ácido ribonucleico mensageiro e proteína medida por reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa e Western blotting. A fórmula completa (I2A2) foi associada a níveis mais elevados de P1NP, níveis mais baixos de CTX-1 e maior DMO em comparação com o grupo modelo. A análise fatorial identificou uma interação Yin-Yang entre P1NP e DMO, apoiando a sinergia farmacológica. As alterações moleculares foram associadas ao aumento da expressão de EphB4/ephrinB2/ALP e à redução da expressão de RhoA. Esses achados sustentam uma associação entre o tratamento com Zuogui Pill, melhora dos fenótipos ósseos e modulação de marcadores da via; a dependência causal da via requer validação com inibidores, silenciamento gênico e culturas em co-cultura.
Introdução
A osteoporose pós-menopausa (OPM) afeta uma grande população de mulheres e é caracterizada pela desregulação do equilíbrio entre formação e reabsorção óssea associada à deficiência de estrogênio1,2. O sistema receptor-ligante EphB4/ephrinB2 media a comunicação entre osteoblastos e osteoclastos; o sinal de EphB4 favorece a diferenciação dos osteoblastos e a atividade da fosfatase alcalina (FA), enquanto o sinal reverso de ephrinB2 pode inibir a osteoclastogênese por mecanismos relacionados à RhoA3,4. O acoplamento reduzido no osso com deficiência de estrogênio fornece uma base mecanicista para avaliar intervenções que afetam ambos os compartimentos celulares da remodelação óssea.
As terapias atuais para osteoporose, incluindo agentes anti-reabsortivos e anabólicos, reduzem o risco de fratura, mas podem ser limitadas pela adesão, custo, contraindicações, efeitos de rebound ou eventos adversos durante o uso prolongado5. Portanto, tratamentos candidatos que melhorem a formação óssea ao mesmo tempo que limitam a reabsorção excessiva permanecem cientificamente relevantes.
A Pílula Zuogui (ZGP; Zuo Gui Wan) é uma prescrição clássica multicomponente utilizada na medicina tradicional chinesa para deficiência da essência renal, um padrão teórico associado à fragilidade óssea. Os componentes nutritivos do Yin incluem Rehmannia glutinosa (raiz preparada, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (rizoma, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (fruto, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (fruto, Gou Qi Zi, 12 g), gelatina do plastrão de Chinemys reevesii (gelatina derivada do plastrão, Gui Ban Jiao, 12 g) e Cyathula officinalis (raiz, Chuan Niu Xi, 9 g). Os componentes potencializadores do Yang incluem Cuscuta australis (semente, Tu Si Zi, 12 g) e gelatina de chifre de Cervus elaphus (gelatina derivada de chifre, Lu Jiao Jiao, 12 g). Na teoria clássica, o princípio de buscar o Yang dentro do Yin prevê que ervas potencializadoras do Yang podem potencializar uma base nutritiva do Yin, em vez de atuar como aditivos simples e independentes. Evidências clínicas e estudos pré-clínicos relataram atividade antiosteoporótica da ZGP ou de intervenções contendo ZGP, incluindo efeitos sobre a DMO, osteogênese e comportamento farmacocinético6,7,8,9,10.
A novidade deste estudo reside na separação formal fatorial três por três dos componentes nutritivos do Yin e potencializadores do Yang em ratos ovariectomizados (OVX), com avaliação simultânea dos fenótipos ósseos e dos marcadores da via EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Este delineamento testa a teoria da compatibilidade da fórmula de maneira mais direta do que estudos que utilizam apenas a prescrição completa ou um único comparador, reconhecendo ao mesmo tempo que as alterações nos marcadores da via permanecem associativas, a menos que sejam bloqueadas ou silenciadas mecanicamente11.
Protocolo
Todos os procedimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Médica da Mongólia Interior (número de aprovação: YKD202404105) e foram realizados de acordo com o ARRIVE 2.012.
Desenho do estudo
O estudo foi realizado na plataforma experimental animal da Universidade Médica da Mongólia Interior. Foi aplicado um delineamento fatorial completo três por três com dois fatores: formulação base de tonificação do Yin (I; três níveis de dose: 0, 27, 54 g de equivalente de droga bruta) e formulação de tonificação do Yang (A; três níveis de dose: 0, 8, 16 g de equivalente de droga bruta), resultando em nove células fatoriais mais quatro grupos de referência. O delineamento fatorial é apresentado na Tabela 1. I2A2 representa a fórmula completa do ZGP na dose equivalente clínica. A conversão das doses utilizou o método da área da superfície corporal (fator rato:humano = 6,25)13.
Animais, randomização e cegamento
Cento e trinta ratas Sprague-Dawley livres de patógenos específicos (6 meses de idade, 220–250 g) foram alocadas por meio de uma tabela de números aleatórios gerada por computador. Os códigos de alocação foram colocados em envelopes lacrados sequencialmente por um pesquisador não envolvido na avaliação dos resultados. Os ratos foram mantidos em grupos de 3 a 4 por gaiola ventilada, sob ciclo claro/escuro de 12 h, a 22 ± 2 oC e umidade de 50–60%, com água ad libitum, ração padrão para roedores com teor documentado de cálcio e fósforo, atividade na gaiola e enriquecimento ambiental. Ensaios moleculares, pontuação histológica, quantificação de imagens e densitometria foram realizados por pesquisadores cegos em relação à alocação. O tamanho da amostra foi determinado por análise de poder a priori, resultando em n = 10 por grupo.
Modelo OVX e tratamento com fármaco
Realizou-se OVX bilateral sob isofluorano inalado, administrado por meio de vaporizador de precisão. A anestesia foi induzida a 3–4% em oxigênio e mantida entre 1,5–2,5% por meio de cone nasal. A profundidade adequada foi confirmada pela ausência de reflexo de retirada podal e reflexo palpebral, com respiração estável. A eficácia da OVX foi avaliada pela ausência de ciclos estrais vaginais no dia 5 e redução da DMO após 12 semanas de cirurgia. Após a validação do modelo, o tratamento por gavagem foi administrado durante 8 semanas (1 mL/100 g/dia). As decocções foram preparadas por extração aquosa sequencial em ebulição contínua (100 °C, refluxo), com 10 volumes por 2 h, seguido de 8 volumes por 1,5 h, filtradas por quatro camadas de gaze médica e concentradas sob pressão reduzida até 0,968 g de droga bruta/mL. O extrato concentrado foi armazenado a 4 °C e utilizado no prazo de 7 dias após o preparo. Os controles positivos foram os grânulos Gusukang (1,8 g/kg/dia) e o dietilstilbestrol (0,04 mg/kg/dia). Ao final do experimento, os ratos foram profundamente anestesiados com 5% de isofluorano até perda dos reflexos podal e corneano, seguidos de exsanguinação e fratura cervical. A morte foi confirmada pela cessação dos batimentos cardíacos e da respiração. Os cadáveres e tecidos foram descartados como resíduo biológico; os resíduos químicos foram descartados como resíduo perigoso; e as agulhas ou lâminas foram colocadas em recipientes aprovados para objetos perfurocortantes.
Medidas de desfecho
Os níveis séricos de P1NP e CTX-1 foram medidos por ELISA de captura (Jiyinmei)14. A DMO femoral foi quantificada por DXA. A histologia trabecular foi avaliada por coloração com hematoxilina e eosina em aumento de 200x. A expressão gênica foi avaliada por RT-qPCR utilizando o método 2-ΔΔCt, normalizado pela gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). A expressão proteica foi avaliada por Western blot e quantificação com ImageJ (ver Tabela de Materiais). Os pesos moleculares observados e as informações dos catálogos dos anticorpos estão fornecidos em Tabela Suplementar 1. As sequências dos primers foram: EphB4 sentido/antissenso, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
Análise estatística
A normalidade foi avaliada utilizando o teste de Shapiro-Wilk, e a homogeneidade da variância foi avaliada utilizando o teste de Levene antes da análise paramétrica. Os dados são expressos como média ± DP, e todas as barras de erro nas figuras quantitativas indicam o DP. Uma ANOVA fatorial de dois fatores foi aplicada às nove células fatoriais para estimar os efeitos principais e a interação I por A, com eta quadrado parcial (ηp2) como medida do tamanho do efeito. Comparações par a par entre os 13 grupos foram realizadas utilizando uma ANOVA de um fator com correção de Bonferroni. As análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism. Os símbolos de significância são definidos de forma consistente da seguinte maneira: *, **, ***, **** indicam p <0,05, p <0,01, p <0,001, p <0,0001 em relação ao modelo; #, ##, ###, #### indicam os mesmos limiares em relação ao ZGP na fórmula completa.
Resultados
Validação do modelo por citologia vaginal
O sucesso da OVX foi confirmado em todos os animais ovariectomizados, evidenciado pela perda do ciclo estral dentro de 5 dias após a cirurgia (Figura 1A), enquanto os animais submetidos a cirurgia simulada mantiveram um ciclo de 4 dias (Figura 1B). Após 12 semanas, a DXA mostrou menor DMO femoral no grupo modelo OVX em comparação com os controles simulados (0,214 ± 0,020 vs. 0,281 ± 0,019 mg/cm3; Bonferroni-ajustado p < 0,001), confirmando o estabelecimento do modelo de perda óssea induzida por OVX antes do tratamento.
Densidade mineral óssea
A fórmula completa de ZGP (I2A2) apresentou a maior recuperação de DMO entre as subfórmulas fatoriais e foi estatisticamente comparável a ambos os controles positivos (Tabela 2, Figura 2). Todas as subfórmulas fatoriais aumentaram a DMO em relação ao grupo modelo. O alto nutrição do Yin isoladamente (I3A1: 0,253 mg/cm3) e o alto reforço do Yang isoladamente (I1A3: 0,243 mg/cm3) permaneceram abaixo do ZGP completo (I2A2: 0,307 mg/cm3), o que apoia uma interação em vez de um efeito simples de dose.
Marcadores séricos de remodelação óssea
Em comparação com o grupo modelo, a fórmula completa de ZGP foi associada a um aumento de P1NP (+51%; IC 95%: 210,3–327,5 pg/mL; p <0,0001) e diminuição do CTX-1 (-16%; p <0,01), consistente com um equilíbrio formação-reabsorção melhorado (Figura 3A, B). Os braços com monoterapia de alta dose produziram valores absolutos mais elevados de P1NP em algumas comparações, mas o padrão fatorial apoiou uma atividade combinada otimizada em vez de uma resposta máxima à dose em um único braço. Os dados completos no nível dos grupos estão em Tabela 3.
ANOVA fatorial e interação sinérgica
A ANOVA fatorial de dois fatores nas nove células fatoriais identificou efeitos principais significativos dos fatores de nutrição do Yin e de reforço do Yang, bem como termos de interação I por A significativos em todos os desfechos primários (Tabela 4). O efeito de interação para P1NP (ηp2 = 0,74) sugere que os componentes de reforço do Yang amplificaram a atividade dos componentes de nutrição do Yin nessas condições experimentais.
Densidade óssea (validação do modelo)
A densidade óssea femoral foi menor no grupo Modelo (OVX) em comparação com os grupos Controle e Sham-operado, confirmando a indução bem-sucedida do fenótipo de perda óssea por OVX antes do tratamento, conforme mostrado na Figura 4.
Expressão de EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP
As análises de RT-qPCR utilizaram amostras biológicas de cada grupo com reações técnicas em triplicata, e a densitometria de Western blot foi realizada em lisados biológicos independentes (Figura 5 e Figura 6). Em comparação com o grupo modelo, a fórmula completa de ZGP esteve associada a níveis mais altos de EphB4 (0,498 ± 0,009 vs. 0,048 ± 0,002; p < 0,0001), ephrinB2 (0,411 ± 0,036 vs. 0,048 ± 0,003; p < 0,0001) e ALP (0,842 ± 0,019 vs. 0,090 ± 0,003; p < 0,0001), com níveis mais baixos de RhoA (1,658 ± 0,028 vs. 7,332 ± 0,430; p < 0,0001). Essas descobertas moleculares são interpretadas como associações com marcadores de via, e não como prova de mediação causal.
Disponibilidade de Dados
Os arquivos de dados originais utilizados para gerar os resultados do presente estudo são fornecidos como um Arquivo Suplementar de Código acompanhando este artigo
Figura 1. Citologia vaginal representativa utilizada para verificar a ciclicidade estral após ovarioectomia (coloração com hematoxilina e eosina, 200x). (A) Esfregaço vaginal representativo de uma rata ovarioectomizada mostrando citologia persistente não cíclica. (B) Esfregaço vaginal representativo de uma rata submetida a cirurgia simulada demonstrando ciclicidade estral normal. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2. DMO femoral em todos os grupos. As barras de erro indicam o desvio padrão (DP). Os símbolos estatísticos indicam comparações ajustadas pelo método de Bonferroni em relação ao modelo ou à fórmula completa de ZGP, conforme definido na seção Análise estatística. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3. Marcadores séricos de remodelação óssea. (A) P1NP, um marcador de formação óssea. (B) CTX-1, um marcador de reabsorção óssea. As barras de erro indicam o desvio padrão (DP). Os símbolos estatísticos indicam comparações ajustadas pelo método de Bonferroni em relação ao modelo ou à fórmula completa de ZGP. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4. Densidade óssea femoral confirmando a perda óssea induzida pela OVX antes do tratamento. Gráfico de barras comparando a densidade óssea femoral (mg/cm3) entre os grupos Controle (não ovariectomizado, sem tratamento), Sham-operado e Modelo (OVX) no ponto temporal de validação do modelo pré-tratamento. As barras representam média ± DP (n = 10/grupo). *** = p < 0,001 versus Controle e versus Sham (ANOVA unifatorial com correção de Bonferroni). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5. Expressão gênica relativa de mRNA. Níveis de expressão de (A) EphB4 (B) ephrinB2 (C) RhoA (D) ALP utilizando o método 2^-ΔΔCt normalizado em relação a GAPDH. A qPCR utilizou reações em triplicata técnica para cada amostra biológica. As barras de erro indicam o desvio padrão (DP). Os símbolos estatísticos indicam comparações ajustadas pelo teste de Bonferroni. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 6. Expressão proteica por Western blot. Os painéis mostram imunoblotagens representativas para EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP e controle de carga GAPDH, selecionadas a partir de amostras biológicas independentes. A densitometria foi normalizada em relação ao GAPDH utilizando o ImageJ. Pesos moleculares observados: EphB4, 110 kDa; ephrinB2, 36 kDa; RhoA, 22 kDa; ALP, 39 kDa; GAPDH, 37 kDa (ver Tabela Suplementar 1). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Fator nutritivo do Yin (I) | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| Fator de potencialização de Yang (A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ (Modelo) | I₂A₁ (Yin) | I₃A₁ (Hi-Yin) |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (Yang) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ (Hi-Yin+Yang) | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ (Hi-Yang) | I₂A₃ (Yin+Hi-Yang) | I₃A₃ (Full-Hi) | |
Tabela 1: Desenho fatorial 3x3 e grupos experimentais. A tabela apresenta os 13 grupos experimentais organizados em um desenho fatorial 3x3 de níveis de dose de Yin-nutriente (I) e Yang-estimulante (A), além de 4 grupos de referência. †I₂A₂ = fórmula completa da Pílula Zuogui na dose equivalente clínica. Conversão de dose utilizando o método da área da superfície corporal (rato : humano = 6,25).
| Grupo | Célula fatorial | DBM (mg/cm³, x̄ ± DP) | vs. Modelo |
| Controle em branco | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| Sham-operado | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| Modelo (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| Fortalecimento do Yang | I₁A₂ | 0.258 ± 0.011 | ** |
| Alto fortalecimento do Yang | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| Nutrição do Yin | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| Alta nutrição do Yin | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| Yin + Alto-Yang | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Alto-Yin + Yang | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| Totalmente alto | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| Fórmula completa ZGP | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| Controle positivo da MTC | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| Controle de medicina ocidental | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
Tabela 2: DMO femoral em todos os grupos (n=10/grupo, média ± DP). * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p<0,001, **** = p<0,0001 versus modelo (correção de Bonferroni).
| Grupo | Célula | P1NP (pg/mL, x̄ ± DP) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± DP) |
| Controle em branco | — | 1388,8 ± 29,7****#### | 33,4 ± 6,8****#### |
| Sham-operado | — | 1268,7 ± 124,1****#### | 45,0 ± 6,7****#### |
| Modelo (OVX) | I₁A₁ | 526,4 ± 78,7 | 105,5 ± 9,9 |
| Fortalecedor do Yang | I₁A₂ | 845,1 ± 76,7**** | 84,2 ± 6,6**** |
| Alto fortalecedor do Yang | I₁A₃ | 1013,0 ± 73,7 ****## | 65,5 ± 6,6****#### |
| Nutritivo do Yin | I₂A₁ | 870,7 ± 63,6**** | 88,2 ± 7,6** |
| Alto nutritivo do Yin | I₃A₁ | 1068,0 ± 48,7****#### | 64,5 ± 4,0****#### |
| Yin + Alto Yang | I₂A₃ | 951,5 ± 146,5****# | 63,1 ± 6,0****#### |
| Alto Yin + Yang | I₃A₂ | 990,2 ± 116,8****## | 62,6 ± 4,4****#### |
| Total-Alto | I₃A₃ | 739,5 ± 93,5** | 97,1 ± 8,9 |
| Fórmula completa ZGP | I₂A₂ | 794,8 ± 66,0**** | 88,2 ± 6,0**** |
| Controle positivo MTC | — | 967,7 ± 49,9****# | 66,3 ± 6,1****#### |
| Controle medicina ocidental | — | 1026,6 ± 65,1****### | 68,8 ± 7,3****### |
Tabela 3: P1NP e CTX-1 séricos em todos os grupos (n=10/grupo, média ± DP). ** = p <0,01, **** = p <0,0001 versus modelo; # = p <0,05, ## = p <0,01, ### = p <0,001, #### = p <0,0001 versus ZGP (Bonferroni). IC 95% para ZGP P1NP versus modelo: 210,3–327,5 pg/mL.
| Resultado | Fator | df | F | Valor-p | η² parcial |
| P1NP (pg/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 17,84 | <0,001 | 0,31 |
| Yang (A) | 2, 81 | 6,22 | 0,003 | 0,13 | |
| I × A | 4, 81 | 57,21 | <0,001 | 0,74 | |
| BMD (mg/cm³) | Yin (I) | 2, 81 | 31,90 | <0,0001 | 0,44 |
| Yang (A) | 2, 81 | 28,70 | <0,0001 | 0,41 | |
| I × A | 4, 81 | 24,60 | <0,0001 | 0,55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 14,22 | <0,001 | 0,26 |
| Yang (A) | 2, 81 | 5,88 | 0,004 | 0,13 | |
| I × A | 4, 81 | 19,43 | <0,001 | 0,49 |
Tabela 4: ANOVA fatorial 3x3 com efeitos principais e termos de interação, e comparações post hoc corrigidas por Bonferroni. Eta quadrado parcial é apresentado como medida do tamanho do efeito. gl indica graus de liberdade.
Tabela Suplementar 1. Informações sobre os anticorpos utilizados na análise por Western blot. A tabela lista as proteínas-alvo, os pesos moleculares observados, fornecedores, números de catálogo, espécies hospedeiras e diluições de trabalho dos anticorpos primários e secundários utilizados neste estudo.Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de Código Suplementar 1. Dados experimentais brutos que apoiam o estudo. Este arquivo contém os arquivos de dados originais utilizados para gerar os resultados apresentados no manuscrito, incluindo medições individuais de DMO, dados brutos de ELISA, valores de Ct de RT-qPCR com amplificação e curvas de dissociação, imagens originais de Western blot e arquivos de análise de densitometria, imagens representativas de microscopia histológica e arquivos de saída gerados pelos instrumentos associados a esses experimentos.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
O termo de interação fatorial apoia uma relação não aditiva entre os componentes de tonificação do Yin e do Yang na ZGP. Esse resultado é consistente com o princípio tradicional de buscar o Yang dentro do Yin, no qual espera-se que os componentes que potencializam o Yang ativem ou potencializem a base nutritiva do Yin15. A descoberta deve ser interpretada como uma sinergia farmacológica em nível de formulação. Ela não identifica os constituintes ativos individuais responsáveis pelo efeito.
EphB4 e ephrinB2 são mediadores biologicamente plausíveis do acoplamento entre osteoblastos e osteoclastos3,4, mas as evidências atuais são meramente correlativas. O aumento observado de EphB4, ephrinB2 e ALP com a redução de RhoA é compatível com uma melhora no acoplamento, mas não estabelece se essa via é necessária ou suficiente para a ação do ZGP. São necessários inibidores de vias, abordagens com anticorpos anti-EphB4 ou bloqueadores de ephrinB2, modulação de RhoA/ROCK16, silenciamento gênico e experimentos de co-cultura de osteoblastos e osteoclastos para testar a dependência causal.
A tradução clínica exige cautela. A conversão da dose equivalente em humanos a partir de ratos apoia o escalonamento inicial, mas a dosagem em humanos também requer estudos de farmacocinética, farmacodinâmica e segurança de longo prazo. Um produto padronizado de ZGP precisaria de perfilagem química por HPLC ou LC-MS, limites para compostos marcadores, comparabilidade entre lotes, testes para contaminantes e documentação da origem das ervas, extração, concentração e práticas de fabricação17. A tradução regulatória também deve considerar as interações entre os constituintes, a compatibilidade com medicamentos antiosteoporóticos já existentes e os resultados clínicos comparativos, como a redução de fraturas, e não apenas a DMO.
Este estudo apresenta várias limitações. O modelo de rato OVX induz uma retirada abrupta do estrogênio e não consegue reproduzir completamente a menopausa humana, o envelhecimento, a regulação imunológica, a longevidade, as comorbidades ou a dinâmica de remodelação óssea a longo prazo18,19. Efeitos endócrinos sistêmicos podem contribuir para os resultados observados, portanto, não se deve presumir sinalização direta nas células ósseas. A ausência de inibição de vias ou silenciamento gênico impede afirmações causais sobre mecanismos. A falta de perfilagem por CLAE ou LC-MS limita a reprodutibilidade e impede atribuir os efeitos a constituintes específicos. Não foi realizada a avaliação quantitativa da microarquitetura óssea trabecular. Estudos futuros deveriam incorporar análises por micro-TC ou histomorfometria quantitativa, incluindo BV/TV, Tb.N, Tb.Th e Tb.Sp, para fornecer uma avaliação mais abrangente das alterações estruturais ósseas20. A variabilidade entre lotes de plantas medicinais, os procedimentos de extração e os requisitos de controle de qualidade continuam sendo barreiras importantes para a transposição clínica.
Em ratos com PMOP induzida por OVX, a fórmula completa do Zuogui Pill foi associada à melhoria da DMO, marcadores séricos favoráveis de remodelação óssea e alterações coordenadas nos marcadores da via EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. A análise fatorial três por três apoia uma interação sinérgica entre os componentes nutritivos do Yin e potencializadores do Yang, consistente com a teoria tradicional de compatibilidade de fórmulas. Esses dados sustentam a investigação adicional do ZGP como candidato multialvo para PMOP, mas estudos com inibidores, experimentos de silenciamento gênico, culturas co-cultivo de osteoblastos-osteoclastos, perfilagem química, microarquitetura óssea quantitativa, farmacocinética, testes de segurança de longo prazo e ensaios clínicos são necessários antes que afirmações mecanicistas ou translacionais possam ser finalizadas.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da Mongólia Interior (número do convênio: 2025LHMS08047), pelo Projeto Geral da Universidade Médica da Mongólia Interior (número do convênio: YKD2025MS015) e pelo Fundo de Início de Doutorado da Universidade Médica da Mongólia Interior (número do convênio: YKD2023BSQD007). Os financiadores não tiveram papel no planejamento do estudo, na coleta de dados, na análise, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Água amoniacal 1% | N/A | N/A | Solução de azulamento após diferenciação com hematoxilina. |
| Álcool com ácido clorídrico 1% | N/A | N/A | Solução de diferenciação para coloração com hematoxilina. |
| Mistura qPCR 2x | N/A | N/A | Mistura mestra para PCR quantitativo. Volume da reação original: 12,5 uL por reação. |
| Solução de paraformaldeído 4% | N/A | N/A | Fixação das amostras do fêmur e tíbia esquerdos para análise histológica. |
| Tampão de carregamento 5x | N/A | N/A | Desnaturação da amostra antes da eletroforese. |
| Anticorpo primário ALP | Affinity Biosciences | N/A | Anticorpo para Western blot. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE. |
| Par de primers ALP | N/A | N/A | O mRNA de ALP foi medido por qRT-PCR, mas a tabela principal de primers não fornece as sequências dos primers ALP. Confirmação do autor necessária. |
| Reagente de anticorpo biotinilado | Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei | Componente do kit | Adicionado aos poços da amostra durante o ELISA. |
| Gelatina de chifre de Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que fortalece o Yang. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4. A gelatina foi derretida na decocção. |
| Gelatina de plastrão de Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4. A gelatina foi derretida na decocção. |
| Clorofórmio | N/A | N/A | Separção de fases durante a extração de RNA. |
| Estágio de resfriamento | Leica | 1150 | Suporte criogênico ou de resfriamento para o fluxo de corte em seções. |
| Cornus officinalis, Shan Zhu Yu | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4. |
| Cuscuta australis, Tu Si Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que fortalece o Yang. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4. |
| Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 9 g, proporção 3. |
| PBS tratado com DEPC | N/A | N/A | Enxágue das vértebras lombares L4 a L5 antes do congelamento em nitrogênio líquido. |
| Diethylstilbestrol | N/A | N/A | Controle positivo com medicamento ocidental. Dose original: 0,04 mg/kg/dia, 1 mL/100 g/dia. O documento principal também contém uma inconsistência na nomenclatura chinesa que deve ser harmonizada como diethylstilbestrol. |
| Dioscorea opposita, Huai Shan Yao | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4. |
| Mistura de dNTP | N/A | N/A | Incluída na reação de transcrição reversa. |
| Reagente quimioluminescente ECL | N/A | N/A | Reagente de detecção para Western blot. |
| Reagente cromogênico ELISA A | Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei | Componente do kit | Reagente de desenvolvimento de cor para ELISA. |
| Reagente cromogênico ELISA B | Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei | Componente do kit | Reagente de desenvolvimento de cor para ELISA. |
| Solução de parada do ELISA | Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei | Componente do kit | Usada para interromper a reação de cor do ELISA. |
| Reagente enzimático marcado para ELISA | Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei | Componente do kit | Adicionado aos poços não brancos no ELISA. |
| Anticorpo primário EphB4 | Proteintech | N/A | Anticorpo para Western blot. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE. |
| Par de primers EphB4 | N/A | Produto de PCR 232 pb | Sentido CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Antissentido GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Erro tipográfico na tabela original: Rat RphB4 deve ser corrigido para Rat EphB4. |
| Anticorpo primário ephrinB2 | Affinity Biosciences | N/A | Anticorpo para Western blot. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE. |
| Par de primers ephrinB2 | N/A | Produto de PCR 172 pb | Sentido CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Antissentido ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| Etanol absoluto e em gradiente 95%, 85%, 75% | N/A | N/A | Desidratação e reidratação em gradiente durante a coloração com hematoxilina e eosina. |
| Ratas Sprague-Dawley fêmeas | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Número do certificado animal e da licença não fornecidos no artigo original | Fêmeas saudáveis, não grávidas, livres de patógenos específicos, com 6 meses de idade. O documento original em chinês indica 230 a 270 g; um rascunho anterior em inglês indica 220 a 250 g. Verificar uma faixa final antes do envio. |
| Anticorpo primário GAPDH | Servicebio | N/A | Anticorpo de controle de carga. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE. |
| Par de primers GAPDH | N/A | Produto de PCR 253 pb | Sentido ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Antissentido TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| Software GraphPad Prism | GraphPad Software | Versão 9.4.1; RRID:SCR_002798 | Análise estatística e geração de gráficos. Normalidade, homogeneidade da variância, ANOVA, correção de Bonferroni e tamanhos de efeito devem ser mantidos nos arquivos de saída. |
| Grânulos Gusukang | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | Controle positivo com medicina tradicional chinesa. Dose original: 1,8 g/kg/dia ou 0,5 mL/100 g/dia. |
| Solução de coloração com hematoxilina | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Coloração histológica. O procedimento original utilizou coloração com hematoxilina por 5 minutos. |
| Microcentrífuga de alta velocidade | N/A | TG16W | Centrifugação para procedimentos com soro e ácidos nucleicos. |
| Absorciometria de raios X de dupla energia Hologic | Hologic | N/A | Análise de densidade mineral óssea. O documento original relata varredura femoral in vivo e ex vivo. |
| Software ImageJ | National Institutes of Health | RRID:SCR_003070 | Quantificação densitométrica das bandas de Western blot. Versão não fornecida no artigo original. |
| Fogão de indução | Midea | N/A | Listado na tabela de instrumentos do documento original em chinês. |
| Isóflurano | N/A | N/A | Anestesia para ooforectomia bilateral e posicionamento para DXA. O protocolo revisado deve especificar indução, manutenção, via e critérios de profundidade anestésica. |
| Isopropanol | N/A | N/A | Precipitação de RNA durante a extração. |
| Nitrogênio líquido | N/A | N/A | Congelamento rápido das amostras de vértebras lombares. |
| Lycium barbarum, Gou Qi Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4. |
| Leitor de microplacas | N/A | AMR-100 | Detecção de absorbância do ELISA a 450 nm. |
| Lavador de microplacas | N/A | APW-200 | Etapa de lavagem para placas de ELISA. |
| Transcriptase reversa MMLV | N/A | N/A | Enzima de transcrição reversa. |
| Bálsamo de montagem neutro | Sinopharm Group | N/A | Meio de montagem para lâminas coradas com hematoxilina e eosina. |
| Soro fisiológico | N/A | N/A | Veículo administrado por gavagem para os grupos controle branco, falso-operado e modelo. |
| Primer Oligo(dT)18 | N/A | N/A | Utilizado para transcrição reversa. |
| Penicilina | N/A | N/A | Profilaxia de infecção pós-operatória. Dose original: 20.000 U/kg intramuscularmente por 3 dias. |
| Panela de pressão | Xinfei | N/A | Listada na tabela de instrumentos do documento original em chinês. |
| Inibidor de protease | N/A | N/A | Adicionado durante a extração de proteínas. |
| Tampão de lise protéica | N/A | N/A | Extração de proteínas de tecido ósseo para Western blot. |
| Membrana PVDF | N/A | N/A | Membrana de transferência para Western blot ativada com metanol. |
| Aparelho de qRT-PCR | N/A | N/A | PCR quantitativo de transcrição reversa para EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP e GAPDH. |
| Kit ELISA Rat CTX-1 | Jiyinmei | JYM0026Ra | ELISA sandwich para telopeptídeo C-terminal do colágeno tipo 1 no soro. Detecção a 450 nm. |
| Kit ELISA Rat P1NP | Jiyinmei | JYM0030Ra | ELISA sandwich para propeptídeo N-terminal do procólageno tipo 1 no soro. Detecção a 450 nm. |
| Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 24 g, proporção 8. |
| Anticorpo primário RhoA | Proteintech | N/A | Anticorpo para Western blot. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE. |
| Par de primers RhoA | N/A | Produto de PCR 177 pb | Sentido GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Antissentido ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminologia harmonizada de RHoA para RhoA. |
| Inibidor de RNase | N/A | N/A | Incluído na reação de transcrição reversa. |
| Água livre de RNase | N/A | N/A | Dissolução do RNA após secagem. |
| Micrótomo rotativo | Leica | 2245 | Seccionamento histológico. |
| Anticorpo secundário para Western blot | N/A | N/A | Diluição original: 1:15000. Reatividade do hospedeiro e RRID exigidos para o JoVE. |
| Leite desnatado, 5% | N/A | N/A | Reagente de bloqueio para Western blot, incubação por 2 h à temperatura ambiente. |
| Máquina de espalhamento e aquecimento de lâminas | Jinhua Yidi | N/A | Preparação de lâminas para histologia. |
| Pentobarbital sódico, 3% | N/A | N/A | Anestesia terminal antes da coleta de sangue na aorta abdominal no documento original em chinês. O procedimento final de eutanásia e o método de confirmação devem ser verificados. |
| Diluente padrão de amostra | Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei | Componente do kit | Utilizado para diluição seriada padrão no procedimento ELISA. |
| Tampão TBST | N/A | N/A | Tampão de lavagem para Western blot. |
| Incubadora termostática com agitação | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | N/A | Incubação e agitação laboratorial. |
| Reagente TRIzol | N/A | N/A | Extração de RNA de 100 mg de tecido ósseo. |
| Microscópio ereto | Leica | DM1000 | Imagens histológicas com hematoxilina e eosina em 200x. |
| Incubadora termostática com camisa de água | N/A | GNP-9080 | Incubação para procedimentos de ensaio. |
| Solução aquosa de coloração com eosina | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Contracoloração histológica. O procedimento original utilizou coloração com eosina por 3 minutos. |
| Sistema de eletroforese para Western blot | N/A | N/A | Separção de proteínas. Eletroforese original: 80 V inicialmente, depois 120 V. |
| Sistema de imagem para Western blot | N/A | N/A | Imagem de membrana quimioluminescente. Membranas não recortadas exigidas para submissão. |
| Sistema de transferência para Western blot | N/A | N/A | Transferência de proteínas para membrana PVDF. Condição de transferência original: 400 mA, 90 min, banho de gelo. |
| Xilol | N/A | N/A | Desparafinação e clareamento tecidual durante a histologia. |
| Ervas componentes da pílula Zuogui | Beijing Tongrentang | N/A | Fórmula com oito ervas: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, gelatina de plastrão de Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis e gelatina de chifre de Cervus elaphus. |
Referências
- Compston JE, McClung MR, Leslie WD. Osteoporosis. Lancet. 2019;393(10169):364-376. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)32112-3
- Shen Y, Huang X, Wu J, et al. The global burden of osteoporosis, low bone mass, and its related fracture in 204 countries and territories, 1990-2019. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:882241. https://doi.org/10.3389/fendo.2022.882241
- Zhao C, Irie N, Takada Y, et al. Bidirectional ephrinB2-EphB4 signaling controls bone homeostasis. Cell Metab. 2006;4(2):111-121. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2006.05.012
- Wu Z, Li W, Jiang K, et al. Regulation of bone homeostasis: signaling pathways and therapeutic targets. MedComm (2020). 2024;5(8):e657. https://doi.org/10.1002/mco2.657
- Reid IR, Billington EO. Drug therapy for osteoporosis in older adults. Lancet. 2022;399(10329):1080-1092. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)02646-5
- Li J, Sun K, Qi B, et al. An evaluation of the effects and safety of Zuogui pill for treating osteoporosis: current evidence for an ancient Chinese herbal formula. Phytother Res. 2021;35(4):1754-1767. https://doi.org/10.1002/ptr.6908
- Shi T, Liu T, Kou Y, et al. The synergistic effect of Zuogui Pill and eldecalcitol on improving bone mass and osteogenesis in type 2 diabetic osteoporosis. Medicina (Kaunas). 2023;59(8):1414. https://doi.org/10.3390/medicina59081414
- Yang S, Zhang B, Wang YG, et al. Zuo Gui Wan promotes osteogenesis via PI3K/AKT signaling pathway: network pharmacology analysis and experimental validation. Curr Med Sci. 2023;43(5):1051-1060. https://doi.org/10.1007/s11596-023-2782-x
- Qiu J, Zhu Y, Xing J, Wang L, Zhang J, Yin H. Comparative pharmacokinetic study of 5 active ingredients after oral administration of Zuogui Pill in osteoporotic rats with different syndrome types. Int J Anal Chem. 2023;2023:1473878. https://doi.org/10.1155/2023/1473878
- Gong W, Zhang N, Cheng G, et al. Rehmannia glutinosa Libosch extracts prevent bone loss and architectural deterioration and enhance osteoblastic bone formation by regulating the IGF-1/PI3K/mTOR pathway in streptozotocin-induced diabetic rats. Int J Mol Sci. 2019;20(16):3964. https://doi.org/10.3390/ijms20163964
- Wang K, Kou Y, Rong X, Wei L, Li J, Liu H, Li M, Song H. ED-71 improves bone mass in ovariectomized rats by inhibiting osteoclastogenesis through EphrinB2-EphB4-RANKL/OPG axis. Drug Des Devel Ther. 2024;18:1515-1528. https://doi.org/10.2147/DDDT.S454116
- Percie du Sert N, Hurst V, Ahluwalia A, et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000410. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000410
- Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-661. https://doi.org/10.1096/fj.07-9574LSF
- Eastell R, Szulc P. Use of bone turnover markers in postmenopausal osteoporosis. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(11):908-923. https://doi.org/10.1016/S2213-8587(17)30184-5
- Yao ZY, Fan SY, Song ZF, Li ZC. Network pharmacology-based and molecular docking-based analysis of You-Gui-Yin for the treatment of osteonecrosis of the femoral head. Medicine (Baltimore). 2023;102(43):e35581. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000035581
- Wang J, Xu C, Zhang J, Bao Y, Tang Y, Lv X, Ma B, Wu X, Mao G. RhoA promotes osteoclastogenesis and regulates bone remodeling through mTOR-NFATc1 signaling. Mol Med. 2023;29(1):49. https://doi.org/10.1186/s10020-023-00638-1
- Noviana E, Indrayanto G, Rohman A. Advances in fingerprint analysis for standardization and quality control of herbal medicines. Front Pharmacol. 2022;13:853023. https://doi.org/10.3389/fphar.2022.853023
- Fischer V, Haffner-Luntzer M. Interaction between bone and immune cells: implications for postmenopausal osteoporosis. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:14-21. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2021.05.014
- Komori T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 2015;759:287-294. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2015.03.028
- Dempster DW, Compston JE, Drezner MK, et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2013;28(1):2-17. https://doi.org/10.1002/jbmr.1805