Pílula Zuogui Modula o Acoplamento Osteoblasto-Osteoclasto em Ratas Ovariectomizadas: Um Estudo Fatorial Três por Três

Resumo

Este estudo avalia os efeitos da pílula Zuogui na osteoporose pós-menopausa em ratas ovariectomizadas, utilizando um delineamento fatorial três por três. Os resultados apoiam efeitos sinérgicos dos componentes Yin e Yang no metabolismo ósseo e nos marcadores associados da via EphB4/ephrinB2, embora as evidências mecanicistas permaneçam associativas e não causais.

Resumo

A osteoporose pós-menopausa é causada pelo desacoplamento da formação e reabsorção óssea associado à deficiência de estrogênio. Este estudo quantificou os efeitos independentes e interativos das subformulações Yin-nutritivas do Zuogui Pill em um modelo de rato ovariectomizado e examinou as associações com a via EphB4/ephrinB2/RhoA/fosfatase alcalina. De acordo com o ARRIVE 2.0, 130 ratas fêmeas Sprague-Dawley livres de patógenos específicos foram randomizadas em 13 grupos (n=10/grupo), incluindo nove grupos em um delineamento fatorial três por três. Os desfechos incluíram P1NP, CTX-1, densidade mineral óssea do fêmur medida por absorciometria de dupla energia com raios X (DXA), histologia trabecular e expressão de ácido ribonucleico mensageiro e proteína medida por reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa e Western blotting. A fórmula completa (I2A2) foi associada a níveis mais elevados de P1NP, níveis mais baixos de CTX-1 e maior DMO em comparação com o grupo modelo. A análise fatorial identificou uma interação Yin-Yang entre P1NP e DMO, apoiando a sinergia farmacológica. As alterações moleculares foram associadas ao aumento da expressão de EphB4/ephrinB2/ALP e à redução da expressão de RhoA. Esses achados sustentam uma associação entre o tratamento com Zuogui Pill, melhora dos fenótipos ósseos e modulação de marcadores da via; a dependência causal da via requer validação com inibidores, silenciamento gênico e culturas em co-cultura.

Introdução

A osteoporose pós-menopausa (OPM) afeta uma grande população de mulheres e é caracterizada pela desregulação do equilíbrio entre formação e reabsorção óssea associada à deficiência de estrogênio^1,2. O sistema receptor-ligante EphB4/ephrinB2 media a comunicação entre osteoblastos e osteoclastos; o sinal de EphB4 favorece a diferenciação dos osteoblastos e a atividade da fosfatase alcalina (FA), enquanto o sinal reverso de ephrinB2 pode inibir a osteoclastogênese por mecanismos relacionados à RhoA^3,4. O acoplamento reduzido no osso com deficiência de estrogênio fornece uma base mecanicista para avaliar intervenções que afetam ambos os compartimentos celulares da remodelação óssea.

As terapias atuais para osteoporose, incluindo agentes anti-reabsortivos e anabólicos, reduzem o risco de fratura, mas podem ser limitadas pela adesão, custo, contraindicações, efeitos de rebound ou eventos adversos durante o uso prolongado⁵. Portanto, tratamentos candidatos que melhorem a formação óssea ao mesmo tempo que limitam a reabsorção excessiva permanecem cientificamente relevantes.

A Pílula Zuogui (ZGP; Zuo Gui Wan) é uma prescrição clássica multicomponente utilizada na medicina tradicional chinesa para deficiência da essência renal, um padrão teórico associado à fragilidade óssea. Os componentes nutritivos do Yin incluem Rehmannia glutinosa (raiz preparada, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (rizoma, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (fruto, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (fruto, Gou Qi Zi, 12 g), gelatina do plastrão de Chinemys reevesii (gelatina derivada do plastrão, Gui Ban Jiao, 12 g) e Cyathula officinalis (raiz, Chuan Niu Xi, 9 g). Os componentes potencializadores do Yang incluem Cuscuta australis (semente, Tu Si Zi, 12 g) e gelatina de chifre de Cervus elaphus (gelatina derivada de chifre, Lu Jiao Jiao, 12 g). Na teoria clássica, o princípio de buscar o Yang dentro do Yin prevê que ervas potencializadoras do Yang podem potencializar uma base nutritiva do Yin, em vez de atuar como aditivos simples e independentes. Evidências clínicas e estudos pré-clínicos relataram atividade antiosteoporótica da ZGP ou de intervenções contendo ZGP, incluindo efeitos sobre a DMO, osteogênese e comportamento farmacocinético^6,7,8,9,10.

A novidade deste estudo reside na separação formal fatorial três por três dos componentes nutritivos do Yin e potencializadores do Yang em ratos ovariectomizados (OVX), com avaliação simultânea dos fenótipos ósseos e dos marcadores da via EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Este delineamento testa a teoria da compatibilidade da fórmula de maneira mais direta do que estudos que utilizam apenas a prescrição completa ou um único comparador, reconhecendo ao mesmo tempo que as alterações nos marcadores da via permanecem associativas, a menos que sejam bloqueadas ou silenciadas mecanicamente¹¹.

Protocolo

Todos os procedimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Médica da Mongólia Interior (número de aprovação: YKD202404105) e foram realizados de acordo com o ARRIVE 2.0¹².

Desenho do estudo

O estudo foi realizado na plataforma experimental animal da Universidade Médica da Mongólia Interior. Foi aplicado um delineamento fatorial completo três por três com dois fatores: formulação base de tonificação do Yin (I; três níveis de dose: 0, 27, 54 g de equivalente de droga bruta) e formulação de tonificação do Yang (A; três níveis de dose: 0, 8, 16 g de equivalente de droga bruta), resultando em nove células fatoriais mais quatro grupos de referência. O delineamento fatorial é apresentado na Tabela 1. I2A2 representa a fórmula completa do ZGP na dose equivalente clínica. A conversão das doses utilizou o método da área da superfície corporal (fator rato:humano = 6,25)¹³.

Animais, randomização e cegamento

Cento e trinta ratas Sprague-Dawley livres de patógenos específicos (6 meses de idade, 220–250 g) foram alocadas por meio de uma tabela de números aleatórios gerada por computador. Os códigos de alocação foram colocados em envelopes lacrados sequencialmente por um pesquisador não envolvido na avaliação dos resultados. Os ratos foram mantidos em grupos de 3 a 4 por gaiola ventilada, sob ciclo claro/escuro de 12 h, a 22 ± 2 ^oC e umidade de 50–60%, com água ad libitum, ração padrão para roedores com teor documentado de cálcio e fósforo, atividade na gaiola e enriquecimento ambiental. Ensaios moleculares, pontuação histológica, quantificação de imagens e densitometria foram realizados por pesquisadores cegos em relação à alocação. O tamanho da amostra foi determinado por análise de poder a priori, resultando em n = 10 por grupo.

Modelo OVX e tratamento com fármaco

Realizou-se OVX bilateral sob isofluorano inalado, administrado por meio de vaporizador de precisão. A anestesia foi induzida a 3–4% em oxigênio e mantida entre 1,5–2,5% por meio de cone nasal. A profundidade adequada foi confirmada pela ausência de reflexo de retirada podal e reflexo palpebral, com respiração estável. A eficácia da OVX foi avaliada pela ausência de ciclos estrais vaginais no dia 5 e redução da DMO após 12 semanas de cirurgia. Após a validação do modelo, o tratamento por gavagem foi administrado durante 8 semanas (1 mL/100 g/dia). As decocções foram preparadas por extração aquosa sequencial em ebulição contínua (100 °C, refluxo), com 10 volumes por 2 h, seguido de 8 volumes por 1,5 h, filtradas por quatro camadas de gaze médica e concentradas sob pressão reduzida até 0,968 g de droga bruta/mL. O extrato concentrado foi armazenado a 4 °C e utilizado no prazo de 7 dias após o preparo. Os controles positivos foram os grânulos Gusukang (1,8 g/kg/dia) e o dietilstilbestrol (0,04 mg/kg/dia). Ao final do experimento, os ratos foram profundamente anestesiados com 5% de isofluorano até perda dos reflexos podal e corneano, seguidos de exsanguinação e fratura cervical. A morte foi confirmada pela cessação dos batimentos cardíacos e da respiração. Os cadáveres e tecidos foram descartados como resíduo biológico; os resíduos químicos foram descartados como resíduo perigoso; e as agulhas ou lâminas foram colocadas em recipientes aprovados para objetos perfurocortantes.

Medidas de desfecho

Os níveis séricos de P1NP e CTX-1 foram medidos por ELISA de captura (Jiyinmei)¹⁴. A DMO femoral foi quantificada por DXA. A histologia trabecular foi avaliada por coloração com hematoxilina e eosina em aumento de 200x. A expressão gênica foi avaliada por RT-qPCR utilizando o método 2^-ΔΔCt, normalizado pela gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). A expressão proteica foi avaliada por Western blot e quantificação com ImageJ (ver Tabela de Materiais). Os pesos moleculares observados e as informações dos catálogos dos anticorpos estão fornecidos em Tabela Suplementar 1. As sequências dos primers foram: EphB4 sentido/antissenso, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.

Análise estatística

A normalidade foi avaliada utilizando o teste de Shapiro-Wilk, e a homogeneidade da variância foi avaliada utilizando o teste de Levene antes da análise paramétrica. Os dados são expressos como média ± DP, e todas as barras de erro nas figuras quantitativas indicam o DP. Uma ANOVA fatorial de dois fatores foi aplicada às nove células fatoriais para estimar os efeitos principais e a interação I por A, com eta quadrado parcial (ηp²) como medida do tamanho do efeito. Comparações par a par entre os 13 grupos foram realizadas utilizando uma ANOVA de um fator com correção de Bonferroni. As análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism. Os símbolos de significância são definidos de forma consistente da seguinte maneira: *, **, ***, **** indicam p <0,05, p <0,01, p <0,001, p <0,0001 em relação ao modelo; #, ##, ###, #### indicam os mesmos limiares em relação ao ZGP na fórmula completa.

Resultados

Validação do modelo por citologia vaginal

O sucesso da OVX foi confirmado em todos os animais ovariectomizados, evidenciado pela perda do ciclo estral dentro de 5 dias após a cirurgia (Figura 1A), enquanto os animais submetidos a cirurgia simulada mantiveram um ciclo de 4 dias (Figura 1B). Após 12 semanas, a DXA mostrou menor DMO femoral no grupo modelo OVX em comparação com os controles simulados (0,214 ± 0,020 vs. 0...

Discussão

O termo de interação fatorial apoia uma relação não aditiva entre os componentes de tonificação do Yin e do Yang na ZGP. Esse resultado é consistente com o princípio tradicional de buscar o Yang dentro do Yin, no qual espera-se que os componentes que potencializam o Yang ativem ou potencializem a base nutritiva do Yin¹⁵. A descoberta deve ser interpretada como uma sinergia farmacológica em nível de formulação. Ela não identifica os constituintes ativos individuais responsáveis pelo efeito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Água amoniacal 1%	N/A	N/A	Solução de azulamento após diferenciação com hematoxilina.
Álcool com ácido clorídrico 1%	N/A	N/A	Solução de diferenciação para coloração com hematoxilina.
Mistura qPCR 2x	N/A	N/A	Mistura mestra para PCR quantitativo. Volume da reação original: 12,5 uL por reação.
Solução de paraformaldeído 4%	N/A	N/A	Fixação das amostras do fêmur e tíbia esquerdos para análise histológica.
Tampão de carregamento 5x	N/A	N/A	Desnaturação da amostra antes da eletroforese.
Anticorpo primário ALP	Affinity Biosciences	N/A	Anticorpo para Western blot. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE.
Par de primers ALP	N/A	N/A	O mRNA de ALP foi medido por qRT-PCR, mas a tabela principal de primers não fornece as sequências dos primers ALP. Confirmação do autor necessária.
Reagente de anticorpo biotinilado	Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei	Componente do kit	Adicionado aos poços da amostra durante o ELISA.
Gelatina de chifre de Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que fortalece o Yang. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4. A gelatina foi derretida na decocção.
Gelatina de plastrão de Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4. A gelatina foi derretida na decocção.
Clorofórmio	N/A	N/A	Separção de fases durante a extração de RNA.
Estágio de resfriamento	Leica	1150	Suporte criogênico ou de resfriamento para o fluxo de corte em seções.
Cornus officinalis, Shan Zhu Yu	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4.
Cuscuta australis, Tu Si Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que fortalece o Yang. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4.
Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 9 g, proporção 3.
PBS tratado com DEPC	N/A	N/A	Enxágue das vértebras lombares L4 a L5 antes do congelamento em nitrogênio líquido.
Diethylstilbestrol	N/A	N/A	Controle positivo com medicamento ocidental. Dose original: 0,04 mg/kg/dia, 1 mL/100 g/dia. O documento principal também contém uma inconsistência na nomenclatura chinesa que deve ser harmonizada como diethylstilbestrol.
Dioscorea opposita, Huai Shan Yao	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4.
Mistura de dNTP	N/A	N/A	Incluída na reação de transcrição reversa.
Reagente quimioluminescente ECL	N/A	N/A	Reagente de detecção para Western blot.
Reagente cromogênico ELISA A	Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei	Componente do kit	Reagente de desenvolvimento de cor para ELISA.
Reagente cromogênico ELISA B	Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei	Componente do kit	Reagente de desenvolvimento de cor para ELISA.
Solução de parada do ELISA	Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei	Componente do kit	Usada para interromper a reação de cor do ELISA.
Reagente enzimático marcado para ELISA	Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei	Componente do kit	Adicionado aos poços não brancos no ELISA.
Anticorpo primário EphB4	Proteintech	N/A	Anticorpo para Western blot. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE.
Par de primers EphB4	N/A	Produto de PCR 232 pb	Sentido CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Antissentido GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Erro tipográfico na tabela original: Rat RphB4 deve ser corrigido para Rat EphB4.
Anticorpo primário ephrinB2	Affinity Biosciences	N/A	Anticorpo para Western blot. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE.
Par de primers ephrinB2	N/A	Produto de PCR 172 pb	Sentido CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Antissentido ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT.
Etanol absoluto e em gradiente 95%, 85%, 75%	N/A	N/A	Desidratação e reidratação em gradiente durante a coloração com hematoxilina e eosina.
Ratas Sprague-Dawley fêmeas	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	Número do certificado animal e da licença não fornecidos no artigo original	Fêmeas saudáveis, não grávidas, livres de patógenos específicos, com 6 meses de idade. O documento original em chinês indica 230 a 270 g; um rascunho anterior em inglês indica 220 a 250 g. Verificar uma faixa final antes do envio.
Anticorpo primário GAPDH	Servicebio	N/A	Anticorpo de controle de carga. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE.
Par de primers GAPDH	N/A	Produto de PCR 253 pb	Sentido ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Antissentido TTTGAGGGTGCAGCGAACTT.
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	Versão 9.4.1; RRID:SCR_002798	Análise estatística e geração de gráficos. Normalidade, homogeneidade da variância, ANOVA, correção de Bonferroni e tamanhos de efeito devem ser mantidos nos arquivos de saída.
Grânulos Gusukang	Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	Controle positivo com medicina tradicional chinesa. Dose original: 1,8 g/kg/dia ou 0,5 mL/100 g/dia.
Solução de coloração com hematoxilina	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Coloração histológica. O procedimento original utilizou coloração com hematoxilina por 5 minutos.
Microcentrífuga de alta velocidade	N/A	TG16W	Centrifugação para procedimentos com soro e ácidos nucleicos.
Absorciometria de raios X de dupla energia Hologic	Hologic	N/A	Análise de densidade mineral óssea. O documento original relata varredura femoral in vivo e ex vivo.
Software ImageJ	National Institutes of Health	RRID:SCR_003070	Quantificação densitométrica das bandas de Western blot. Versão não fornecida no artigo original.
Fogão de indução	Midea	N/A	Listado na tabela de instrumentos do documento original em chinês.
Isóflurano	N/A	N/A	Anestesia para ooforectomia bilateral e posicionamento para DXA. O protocolo revisado deve especificar indução, manutenção, via e critérios de profundidade anestésica.
Isopropanol	N/A	N/A	Precipitação de RNA durante a extração.
Nitrogênio líquido	N/A	N/A	Congelamento rápido das amostras de vértebras lombares.
Lycium barbarum, Gou Qi Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 12 g, proporção 4.
Leitor de microplacas	N/A	AMR-100	Detecção de absorbância do ELISA a 450 nm.
Lavador de microplacas	N/A	APW-200	Etapa de lavagem para placas de ELISA.
Transcriptase reversa MMLV	N/A	N/A	Enzima de transcrição reversa.
Bálsamo de montagem neutro	Sinopharm Group	N/A	Meio de montagem para lâminas coradas com hematoxilina e eosina.
Soro fisiológico	N/A	N/A	Veículo administrado por gavagem para os grupos controle branco, falso-operado e modelo.
Primer Oligo(dT)18	N/A	N/A	Utilizado para transcrição reversa.
Penicilina	N/A	N/A	Profilaxia de infecção pós-operatória. Dose original: 20.000 U/kg intramuscularmente por 3 dias.
Panela de pressão	Xinfei	N/A	Listada na tabela de instrumentos do documento original em chinês.
Inibidor de protease	N/A	N/A	Adicionado durante a extração de proteínas.
Tampão de lise protéica	N/A	N/A	Extração de proteínas de tecido ósseo para Western blot.
Membrana PVDF	N/A	N/A	Membrana de transferência para Western blot ativada com metanol.
Aparelho de qRT-PCR	N/A	N/A	PCR quantitativo de transcrição reversa para EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP e GAPDH.
Kit ELISA Rat CTX-1	Jiyinmei	JYM0026Ra	ELISA sandwich para telopeptídeo C-terminal do colágeno tipo 1 no soro. Detecção a 450 nm.
Kit ELISA Rat P1NP	Jiyinmei	JYM0030Ra	ELISA sandwich para propeptídeo N-terminal do procólageno tipo 1 no soro. Detecção a 450 nm.
Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre o Yin. Dose total da fórmula na fonte: 24 g, proporção 8.
Anticorpo primário RhoA	Proteintech	N/A	Anticorpo para Western blot. Diluição original: 1:2000. RRID e número de lote exigidos para o JoVE.
Par de primers RhoA	N/A	Produto de PCR 177 pb	Sentido GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Antissentido ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminologia harmonizada de RHoA para RhoA.
Inibidor de RNase	N/A	N/A	Incluído na reação de transcrição reversa.
Água livre de RNase	N/A	N/A	Dissolução do RNA após secagem.
Micrótomo rotativo	Leica	2245	Seccionamento histológico.
Anticorpo secundário para Western blot	N/A	N/A	Diluição original: 1:15000. Reatividade do hospedeiro e RRID exigidos para o JoVE.
Leite desnatado, 5%	N/A	N/A	Reagente de bloqueio para Western blot, incubação por 2 h à temperatura ambiente.
Máquina de espalhamento e aquecimento de lâminas	Jinhua Yidi	N/A	Preparação de lâminas para histologia.
Pentobarbital sódico, 3%	N/A	N/A	Anestesia terminal antes da coleta de sangue na aorta abdominal no documento original em chinês. O procedimento final de eutanásia e o método de confirmação devem ser verificados.
Diluente padrão de amostra	Fornecido com o kit ELISA, Jiyinmei	Componente do kit	Utilizado para diluição seriada padrão no procedimento ELISA.
Tampão TBST	N/A	N/A	Tampão de lavagem para Western blot.
Incubadora termostática com agitação	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	N/A	Incubação e agitação laboratorial.
Reagente TRIzol	N/A	N/A	Extração de RNA de 100 mg de tecido ósseo.
Microscópio ereto	Leica	DM1000	Imagens histológicas com hematoxilina e eosina em 200x.
Incubadora termostática com camisa de água	N/A	GNP-9080	Incubação para procedimentos de ensaio.
Solução aquosa de coloração com eosina	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Contracoloração histológica. O procedimento original utilizou coloração com eosina por 3 minutos.
Sistema de eletroforese para Western blot	N/A	N/A	Separção de proteínas. Eletroforese original: 80 V inicialmente, depois 120 V.
Sistema de imagem para Western blot	N/A	N/A	Imagem de membrana quimioluminescente. Membranas não recortadas exigidas para submissão.
Sistema de transferência para Western blot	N/A	N/A	Transferência de proteínas para membrana PVDF. Condição de transferência original: 400 mA, 90 min, banho de gelo.
Xilol	N/A	N/A	Desparafinação e clareamento tecidual durante a histologia.
Ervas componentes da pílula Zuogui	Beijing Tongrentang	N/A	Fórmula com oito ervas: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, gelatina de plastrão de Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis e gelatina de chifre de Cervus elaphus.