Artigo de método

Reconstituição Funcional de Supercomplexos Respiratórios Mitocondriais

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DOI:

10.3791/72243

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21 de agosto de 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo simples para a reconstrução de supercomplexos respiratórios mitocondriais funcionais em proteolipossomos bem definidos, para caracterização estrutural e funcional correlacionada.

Resumo

As mitocôndrias são centros centrais no metabolismo bioenergético e são a principal fonte de ATP. A membrana interna mitocondrial abriga o sistema de fosforilação oxidativa, que inclui os complexos da cadeia de transporte de elétrons (CI, CII, CIII2, e CIV) e a ATP sintase (CV). Em mamíferos, CI, CIII2, e o CIV formam estruturas de ordem superior denominadas supercomplexos (SCs), como o SC I+III2+IV, SC I+III2, e SC III2+IV. Embora os fatores fisiológicos que favorecem a formação de complexos superiores (SC) permaneçam pouco claros, tem-se proposto que a formação de SCs pode aumentar as taxas de transferência de elétrons entre complexos, reduzir a produção de espécies reativas de oxigênio ou prevenir a agregação proteica inespecífica na membrana interna mitocondrial densamente compactada. Estudos estruturais e funcionais dos SCs respiratórios basearam-se amplamente em complexos extraídos com detergentes. Embora esses estudos tenham aprimorado nossa compreensão da cadeia de transporte de elétrons, a ausência de uma bicamada lipídica selada limita a capacidade de investigar os benefícios funcionais do agrupamento em supercomplexos. Avanços recentes, contudo, demonstraram que proteínas de membrana podem ser caracterizadas estruturalmente em ambientes de membrana reconstituídos e semelhantes ao nativo, oferecendo um contexto mais fisiológico para essas investigações. Aqui, apresentamos um protocolo simples, rápido e reprodutível para a reconstituição de SCs respiratórios em lipossomos. Este método permite testar os efeitos de diferentes composições lipídicas, concentrações proteicas e potencial de membrana sobre a função dos SCs respiratórios, fornecendo uma ferramenta valiosa para futuros estudos mecanicistas.

Introdução

As mitocôndrias são centrais para a respiração eucariótica. A membrana interna mitocondrial (MIM) abriga o sistema de fosforilação oxidativa, composto pelos complexos da cadeia de transporte de elétrons (CI–CIV) e pela ATP sintase (CV)1. O CI e o CII transferem elétrons a partir de substratos reduzidos para a ubiquinona (CoQ), gerando ubiquinol (CoQH2), que doa elétrons ao CIII2 e, por meio do citocromo c, ao CIV, onde o oxigênio é reduzido a água. A bomba de prótons realizada pelo CI, CIII2 e CIV estabelece a força próton-motriz (FPM), que é utilizada pela CV para sintetizar ATP a partir de ADP e fosfato inorgânico (P)1.

Além de funcionarem de forma independente, CI, CIII2 e CIV podem se associar em estruturas de supercomplexos (SC) de ordem superior com estequiometrias definidas, como SC I+III2+IV (também conhecido como respirassomo), SC I+III2 e SC III2+IV2,3,4,5. As vantagens funcionais dessas associações permanecem pouco claras6. As hipóteses sobre suas funções variam desde papéis na montagem e no direcionamento de substratos até a possibilidade de serem um subproduto da alta densidade proteica na membrana interna mitocondrial (IMM)3,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Estudos recentes sugerem que propriedades da membrana, incluindo a tensão induzida pelo descompasso hidrofóbico, interações proteína-proteína e interações proteína-lipídio, contribuem para a formação e estabilidade dos SC16.

Estudos estruturais e funcionais de proteínas de membrana tradicionalmente dependem de complexos solubilizados por detergentes, o que perturba os ambientes nativos de membrana e limita a investigação de processos dependentes do potencial de membrana e gradientes iônicos. Em contraste, avanços recentes demonstram que as proteínas de membrana podem ser caracterizadas estruturalmente em membranas reconstituídas17,18,19 ou nativas20,21,22,23, aumentando significativamente nossa capacidade de examinar mecanismos funcionais de proteínas de membrana que dependem do potencial de membrana e gradientes iônicos.

Este protocolo descreve um método simples e reprodutível para a reconstrução de supercomplexos respiratórios mitocondriais (SCs) em proteolipossomos definidos. O sistema resultante fornece uma plataforma poderosa para investigar questões fundamentais relacionadas à formação, estabilidade e função dos SCs respiratórios em um ambiente de membrana controlado e semelhante ao nativo. Ao incorporar CoQ10 e citocromo c durante a reconstrução, demonstramos que os SCs reconstruídos em proteolipossomos suportam o consumo de oxigênio impulsionado por NADH, indicando que os complexos permanecem funcionalmente competentes dentro da bicamada lipídica. Além disso, mostramos que os SCs podem ser facilmente visualizados em proteolipossomos utilizando microscopia eletrônica criogênica (crio-EM), permitindo assim uma correlação direta entre a organização estrutural e a atividade bioquímica.

Embora o método seja robusto e facilmente reprodutível, a reconstrução bem-sucedida depende da otimização cuidadosa da composição lipídica, da concentração de detergente, da proporção proteína-lipídio e do selamento eficiente da membrana para preservar a estabilidade e a atividade do supercomplexo.

O objetivo geral deste método é permitir a análise integrada da estrutura e função de SCs respiratórios sob condições de membrana definidas. Esta abordagem supera limitações importantes dos sistemas baseados em detergentes, restaurando os SCs em uma bicamada lipídica selada capaz de sustentar a formação de um potencial de membrana e interações proteína-lipídio fisiologicamente relevantes. Além disso, o sistema permite controle preciso sobre a composição lipídica, cofatores e conteúdo proteico, tornando-o especialmente adequado para testes sistemáticos de como as propriedades da membrana influenciam a estabilidade e atividade dos SCs. Em comparação com preparações solubilizadas por detergentes ou abordagens in situ, este método oferece a vantagem distinta de combinar ensaios funcionais, como o consumo de oxigênio impulsionado por NADH, com análise estrutural baseada em criomicroscopia eletrônica (crio-EM), permitindo assim correlações entre estrutura e função difíceis de alcançar com outros sistemas.

Protocolo

Membranas mitocondriais de coração suíno foram isoladas de coração adquirido comercialmente tecido colhido de animais abatidos para consumo humano. Nenhum animal vivo foi utilizado especificamente para este protocolo. O uso deste material foi considerado isento de aprovação ética em pesquisa com animais, pois o tecido foi obtido como subproduto de animais abatidos para consumo humano

1. Purificação dos supercomplexos mitocondriais SC I+III2/SC I+III2+IV a partir de membranas lavadas de mitocôndrias de coração de porco

  1. Descongele 40 mg (4 mL) de membranas mitocondriais lavadas em alíquotas de 10 mg/mL (as membranas lavadas são preparadas conforme relatado anteriormente24,25).
  2. Dilua as membranas em 4 mL do tampão MX (30 mM HEPES, pH 7,7, 150 mM acetato de potássio, 10% glicerol, 1 mM EDTA, 0,002% (p/v) fenilmetilsulfonil fluoreto, 0,1% (p/v) CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanossulfonato), 1 mM ferricianeto de potássio). Adicione 8 mL de digitonina a 2% (p/v) no tampão MX (160 mg de digitonina em 8 mL; razão final 4:1, mg de digitonina:mg de proteína total de membrana). O volume final é de 16 mL.
  3. Homogeneíze manualmente em um homogeneizador Dounce (50 golpes), tomando cuidado para não introduzir bolhas. Incube (em rotação) por 1 h a 4 °C.
  4. Centrifugue o homogeneizado a 16.000 × g, 4 °C por 30 min. Recolha o sobrenadante.
  5. Concentre o sobrenadante até 1 mL usando um concentrador por filtração centrífuga com corte de 100 kDa a 3.000 × g, 4 °C. Concentre em ciclos de 10 min, ressuspendendo bem entre as centrifugações, até atingir o volume desejado (as amostras tendem a se agregar se não forem ressuspendidas entre os ciclos de centrifugação devido ao aumento da concentração local do detergente próximo ao filtro).
  6. Divida a amostra concentrada em quatro alíquotas de 250 µL. 
  7. Equilibre a coluna de cromatografia de exclusão por tamanho (volume da coluna: 24 mL) com tampão de cromatografia de exclusão por tamanho (tampão SEC; 30 mM HEPES pH 7,8, 150 mM acetato de potássio, 1 mM EDTA, 0,005% de detergente glycocide) por 48 mL (2 volumes de coluna).
  8. Configure o programa de cromatografia para coletar frações de 1 mL a partir de um volume de eluição de 6 mL e continue até um volume de eluição de 24 mL. Injete uma alíquota de 250 µL (do passo 1.6) em uma resina de cromatografia de exclusão por tamanho de 24 mL. Use a coluna previamente equilibrada com o tampão de cromatografia de exclusão por tamanho (do passo 1.7). Colete as frações do fracionador antes de iniciar a próxima corrida.
  9. Repita os passos 1.7 e 1.8 para as demais alíquotas concentradas do passo 1.6.
  10. Carregue 10 µL de cada fração das corridas SEC misturados com 5 µL de corante de carregamento para eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) em um gradiente de acrilamida de 3%–12% e realize um ensaio de atividade no gel com NADH/cloreto de nitro tetrazólio azul para CI26  para verificar a atividade de CI nas frações. 
    OBSERVAÇÃO: Os complexos respiratórios SC eluem do meio de filtração em gel de agarose reticulada de 24 mL em um volume de eluição de aproximadamente 11,5 mL.
  11. Agrupe as frações que apresentarem atividade máxima de CI de alto peso molecular no ensaio de atividade no gel para CI. Concentre a amostra conforme descrito no passo 1.5 acima.
    OBSERVAÇÃO: Os SCs concentrados em detergente glicosídico glyco-diosgenina (GDN) podem ser armazenados com 30% (v/v) de glicerol em concentração final de aproximadamente 10 mg/mL em N2 líquido. 40 mg de complexo mitocondrial lavado renderam 3,4 mg de proteína total com base em ensaio BCA.

2. Preparação da mistura de lipídios

OBSERVAÇÃO: Modificado de protocolos previamente descritos27,28. O clorofórmio é tóxico, volátil e suspeito de ser carcinogênico. Manipule-o apenas em capela de exaustão química certificada e com EPI apropriado. O pentano é altamente inflamável. Mantenha-o afastado de fontes de ignição. Manipule-o apenas em capela de exaustão química certificada e com EPI apropriado. Descarte os resíduos de solventes orgânicos em recipientes aprovados para resíduos de solventes halogenados/não halogenados, conforme as políticas institucionais de saúde e segurança no trabalho (EH&S).

  1. No capela, prepare soluções estoque de 25 mg/mL de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina), POPE (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina) e CL (cardiolipina: 1,3-bis(sn-3’-fosfatidil)-sn-glicerol; de tecido cardíaco bovino) em clorofórmio separadamente. 
  2. Prepare CoQ10 10 mM em clorofórmio. Para 25 mg da mistura lipídica total, adicione 0,4 mL (10 mg) de POPC, 0,4 mL (10 mg) de POPE, 0,2 mL (5 mg) de CL e 50 µL de CoQ10 10 mM (500 nmol finais de CoQ10 (20 nmol de CoQ10/mg de lipídio)) das soluções estoque em um tubo de ensaio de vidro de 13 mL. A proporção final em peso de POPC:POPE:CL é de 2:2:1.
  3. Seque a mistura sob fluxo de gás inerte (argônio ou nitrogênio) para remover o clorofórmio, girando suavemente o tubo para formar uma camada fina da mistura lipídica ao longo das paredes do tubo. Seque com fluxo contínuo de gás inerte por 10 min.
  4. Reconstitua a camada lipídica seca com 1 mL de pentano e repita o passo 2.3, facilitando a remoção do clorofórmio residual.
  5. Incube o tubo com lipídio seco em um dessecador a vácuo à temperatura ambiente durante a noite para remoção completa dos solventes. 
  6. Adicione 5 mL de Tampão de Proteolipossomo (PLB; 10 mM MOPS pH 7,4, 150 mM KCl) para reidratar a mistura lipídica, feche bem o tubo para evitar derramamento e vortexe suavemente até que os lipídios estejam completamente solubilizados (os lipídios secos não devem mais ser visíveis na superfície do tubo).
  7. Remova o fechamento, encha o tubo com gás inerte (argônio ou nitrogênio), feche novamente o tubo e incube à temperatura ambiente por 1 h. Após 1 h de incubação, prepare alíquotas de 300 µL da mistura lipídica e armazene a −20 °C. 
    NOTA: A mistura POPC:POPE:cardiolipina (2:2:1) foi escolhida com base na otimização empírica e porque PE e cardiolipina são constituintes majoritários da membrana interna mitocondrial; no entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para testar outras composições lipídicas.

3. Reconstituição de SCs mitocondriais em lipossomos

  1. Descongele as alíquotas de SC armazenadas em N₂ líquido  (passo 1.12) em gelo. Realize uma troca de tampão para remover o glicerol da amostra, ressuspendendo-a no tampão SEC. Concentre a amostra utilizando filtros centrífugos com corte de 100 kDa a 3000 × g a 4 °C. Entre as centrifugações para concentração (~a cada 5 min), continue realizando a troca de tampão ressuspendendo a amostra no tampão SEC.
  2. Verifique a concentração final do SC utilizando um ensaio BCA (um kit de ensaio proteico com ácido bicinconínico).
  3. Descongele uma alíquota de 300 µL da mistura lipídica preparada no passo 2.7 e extruda-a através de um extrusor montado com uma membrana de policarbonato de 100 nm por seis ciclos à temperatura ambiente (um ciclo consiste em passar a mistura lipídica da seringa esquerda para a direita e de volta). Após a conclusão dos ciclos de extrusão, colete os lipossomos resultantes de 100 nm da seringa oposta ao lado inicial. Alternativamente, os lipossomos podem ser gerados por sonicação. 
  4. Adicione 9 µL de detergente a 20% (p/v) (concentração final de 0,6% p/v) a 250 µL da mistura lipídica extrudada em um tubo separado.
    NOTA: Pode-se testar diferentes detergentes. O colato de sódio, um detergente aniônico de sal biliar, apresentou os melhores resultados nestes experimentos.
  5. Misture por inversão e incube a 4 °C por 30 min. 
  6. Adicione 120 µg (ou mais) de SC mitocondrial e 3 µL de citocromo c a 10 mM (concentração final de 100 µM) à mistura. Complete o volume para 300 µL com PLB. A razão final lipídio:proteína é aproximadamente 10:1 (p:p). Como controle adicional, gere lipossomos vazios em paralelo, adicionando tampão SEC (30 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM acetato de potássio, 1 mM EDTA, 0,005% de um detergente glicosídico) à mistura de lipídio-detergente em vez de SCs mitocondriais e citocromo c. 
  7. Misture por inversão e incube a 4 °C por 30 min. 
  8. Lave uma coluna de centrifugação dessalinizadora pré-embalada contendo resina G-25 com tampão PLB quatro vezes usando fluxo por gravidade. Em seguida, lave a coluna por centrifugação a 1.000 × g por 2 min.
  9. Adicione a amostra de proteolipossomos à coluna dessalinizadora de resina G-25 pré-embalada e lavada e centrifugue a 1.000 × g a 4 °C por 2 min para remover o detergente. Colete o eluato.
    NOTA: Os lipossomos preparados por extrusão exibiram uma distribuição de tamanho mais uniforme do que aqueles gerados por sonicação. Não centrifugue a coluna dessalinizadora pré-embalada por mais tempo do que o recomendado pelo fabricante, para evitar contaminação da amostra com detergente. Os proteolipossomos foram armazenados a 4 °C e geralmente utilizados dentro de 36 h para minimizar a perda potencial de atividade e preservar a integridade do supercomplexo.

4. Ensaio de flutuação de lipídios29

  1. Prepare soluções de sacarose a 27% e 7% (p/v) em PLB. Prepare um gradiente em etapas adicionando 1,5 mL da solução de 27% de sacarose e 0,9 mL da solução de 7% de sacarose em um tubo de centrífuga de 3,5 mL.
  2. Adicione cuidadosamente 300 µL de proteolipossomos (do passo 3.9) contendo SC sobre o gradiente de sacarose. Centrifugue os gradientes a 100.000 × g em rotor de ângulo fixo por 2 h a 4 °C.
  3. Colete cuidadosamente (evitando misturar, se possível) nove frações de 300 µL (ou dez frações de 270 µL) de cima para baixo. Re-suspenda o pellet, se houver, na última fração e colete-o como fração 9 ou 10. Qualquer SC não reconstituído deve acumular-se na fração 9 ou 10.
    NOTA: O ensaio de flutuação ajuda a separar proteolipossomos reconstituídos de lipossomos vazios e complexos proteicos não reconstituídos. É utilizado para otimizar a reconstituição.

5. Ensaio espectroscópico de atividade da CI com ferricianeto e ensaio de atividade da CI em gel

  1. Prepare a quantidade necessária de tampão de reação de ferricianeto (FRB; 20 mM Tris HCl, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1% p/v 3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanossulfonato (CHAPS), 1 mM ferricianeto de potássio).
  2. Aliquote 990 µL do tampão de reação em uma cubeta de 1 mL. Adicione 5 µL da amostra (de cada fração do gradiente) à cubeta, depois adicione 5 µL de NADH 20 mM (concentração final 100 µM) à reação. Sobreponha a cubeta com filme transparente e homogeneíze por inversão.
  3. Monitore a taxa de decaimento da absorbância a 340 nm a 25 °C em um espectrômetro. O decaimento da absorbância a 340 nm indica a oxidação de NADH. Repita para todas as frações em triplicata. Use 5 µL de PLB em vez da amostra para registrar o branco.
  4. Calcule a taxa de oxidação de NADH após subtrair o branco e plote a atividade total de cada uma das frações.
    NOTA: Alternativamente, o experimento pode ser realizado em uma placa de 96 poços.
  5. Agrupe as frações com atividade total máxima (evite frações no fundo do tubo que contenham atividade, pois correspondem a proteína não reconstruída). Ajuste o volume das frações agrupadas para 20 mL com PLB para diluir a sacarose.
  6. Centrifugue as amostras a 150.000 × g, 4 °C por 1 h em um rotor de ângulo fixo. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 µL de PLB.
  7. Misture 25 µL do pellet ressuspenso do passo anterior com 25 µL de digitonina 2% p/v em PLB e incube (com rotação) a 4 °C por 1 h.
  8. Centrifugue as proteínas não extraídas a 16.000 × g por 20 min. Recolha o sobrenadante.
  9. Adicione 10 µL de corante de carga para BN-PAGE a 30 µL do sobrenadante e aplique em um gel BN-PAGE com gradiente de 3%–12%. Execute dois géis para realizar os ensaios de atividade no gel para CI e CIV26.
  10. Execute o gel a 150 V por 30 min com tampão escuro para BN-PAGE (25 mM Tris, 0,192 g Glicina, 200 mg Azul de Comassie). Substitua o tampão azul escuro por tampão azul claro (25 mM Tris, pH 8,3, 0,192 g Glicina, 20 mg Azul de Comassie) e execute por mais 2 h a 200 V.
  11. Após a eletroforese, transfira os géis para um recipiente adequado e realize os ensaios de atividade no gel para CI e CIV26.
    NOTA: Para estudos estruturais e funcionais de complexos reconstruídos em lipossomos, utilize os proteolipossomos ressuspensos remanescentes do passo 5,6. Uma vez que a reconstrução tenha sido plenamente otimizada, é possível omitir os passos 4 e 5 e usar diretamente os proteolipossomos reconstruídos do passo 3.

6. Ensaio de supressão de fluorescência de ACMA para medir a integridade da membrana dos proteolipossomos reconstituídos29

  1. Prepare a quantidade necessária de tampão de reação ACMA (9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina) (10 mM MOPS pH 7,4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0,5 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA), 2 mM 2-mercaptoetanol). 
  2. Aliquote 930 µL do tampão de reação em uma cubeta de 1 mL. Adicione 50 µL dos proteolipossomas reconstituídos à cubeta, feche-a e misture por inversão. Incube ao abrigo da luz por 8 min.
  3. Configure os parâmetros do espectrômetro para: comprimento de onda de excitação 410 nm, comprimento de onda de emissão 490 nm. 
  4. Após a incubação, misture novamente a cubeta por inversão e leia a fluorescência com o espectrômetro à temperatura ambiente durante 8 min.
  5. Adicione 4 µL de valinomicina 20 µM (concentração final de 80 nM) à cubeta, misture por inversão e meça por 8 min.
  6. Adicione 6 µL de CCCP (carbamil cianeto m-clorofenila hidrazona) 1 mM (concentração final de 6 µM) à cubeta, misture por inversão e meça por 8 min.
  7. Para estabelecer um controle de vesículas vazias, repita os passos 6,2–6,6, substituindo os proteolipossomas reconstituídos por "lipossomas vazios". Lipossomas vazios são gerados pelos mesmos passos dos proteolipossomas reconstituídos, mas com o tampão SEC substituindo a adição de SCs durante a reconstituição (passo 3,6).
  8. Repita a medida em triplicata tanto para os proteolipossomas reconstituídos quanto para os lipossomas vazios e plote a fluorescência relativa ao longo do tempo.
    NOTA: Os dados obtidos com proteolipossomas reconstituídos ou lipossomas vazios são normalizados por (Fi − Fmín)/(Fmáx−Fmín), em que Fmáx é o valor inicial da fluorescência de base dessa amostra e Fmín é o menor valor da linha de base dessa amostra após a adição de CCCP.
    ADVERTÊNCIA: CCCP é um desacoplador mitocondrial tóxico e deve ser manipulado com luvas em capela.

7. Medidas de respirometria do consumo de oxigênio para avaliar a função de SCs reconstituídas30.

OBSERVAÇÃO: A taxa de consumo de oxigênio é medida utilizando um sistema de eletrodo de oxigênio do tipo Clark. Os ensaios funcionais dos SCs reconstruídos são realizados diretamente no eluato da coluna de dessalinização (etapa 3.9).

  1. Configure o sistema do eletrodo de oxigênio de acordo com as instruções do fabricante e abra o software de controle do instrumento. Adicione 2 mL de água ultrapura à câmara de medição.
  2. Ajuste a velocidade de agitação até que o gráfico da concentração de oxigênio permaneça inalterado ao aumentar a velocidade de agitação (inicie em 10, aumentando em incrementos de 10). Remova a água MQ e adicione água oxigenada (água MQ em um frasco agitado vigorosamente).
  3. Clique em Calibrar > Calibração em fase líquida > Água saturada com ar e aguarde a estabilização da calibração (taxa de 0 nmol por min). Usando uma espátula pequena, adicione alguns cristais (4–6) de ditionito de sódio ao vaso de reação para estabelecer zero oxigênio na câmara.
  4. Aguarde o sinal atingir um platô antes de continuar. Salve a calibração e limpe a câmara de reação com 5 × 1 mL de etanol 70%, com 5 × 1 mL de EDTA 0,1 mM, com 5 × 1 mL de água MQ e com 5 × 1 mL de tampão de reação para oxigrafia (ORB; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 5 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, 0,02 mM EGTA, 0,5 mg/mL BSA).
  5. Adicione 2 mL de ORB, clique no botão “iniciar leitura” no software e aguarde a estabilização do gráfico. Ao adicionar proteolipossomos (amostra) na câmara de reação, rotule o gráfico no software para indicar a adição da amostra.
    NOTA: A concentração de proteína na amostra de proteolipossomos é estimada a partir da quantidade total de proteína adicionada aos lipossomos. Uma proporção proteína:lipídio de 1:12 e uma concentração final de 50 µg/mL de proteína na câmara do sistema de eletrodo de oxigênio (2 mL) apresentou os melhores resultados. O rendimento exato de proteolipossomos não foi medido.
  6. Após a estabilização da leitura do sistema de eletrodo de oxigênio, adicione NADH à câmara de reação e simultaneamente rotule o gráfico no software para indicar a adição de NADH. Continue a leitura por 5 min.
  7. Adicione CCCP e rotule a adição no software, e continue a leitura por 5 min.
  8. Adicione um inibidor (por exemplo, inibidor de CI (Piericidina A) ou inibidor de CIII2 (Mixotiazol) ou inibidor de CIV (NaN3)) e rotule a adição no software, leia por 2 min e, em seguida, pare a leitura. 
  9. Salve o gráfico e limpe a câmara de reação com 5 × 1 mL de etanol 70%, 5 × 1 mL de EDTA 0,1 mM, 7 × 1 mL de água MQ e 5 × 1 mL de ORB antes de realizar outra medição.
  10. Para corrigir os dados em relação à taxa de fundo, calcule a taxa de fundo, ou seja, a inclinação da leitura anterior à adição de NADH, e extrapole linearmente essa taxa ao longo do curso temporal da medição, calculando uma concentração esperada de [O2] de fundo para cada ponto temporal. Em seguida, subtraia a [O2] de fundo extrapolada do valor de [O2] medido em cada ponto temporal.
  11. Calcule as taxas de consumo de oxigênio (OCRs) como a inclinação das medições de concentração de [O2] corrigidas para o fundo após a adição de cada reagente.
  12. Para calcular as taxas em relação à OCR após a adição de NADH, para cada traçado individual, divida cada OCR medida (por exemplo, OCR após adição de NADH, CCCP e inibidor, respectivamente) pela OCR medida após a adição de NADH.     
    NOTA: CUIDADO: O ditionito de sódio é um agente redutor forte e pode reagir violentamente com oxidantes ou umidade. Manipule com luvas. Descarte resíduos contendo inibidores como resíduos químicos perigosos, conforme as diretrizes institucionais.

8. Estimativa do tamanho dos lipossomos reconstruídos utilizando dispersão dinâmica da luz

  1. Ligue o instrumento de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e aguarde cerca de 30 min para estabilização do laser.
  2. Abra o software de aquisição do instrumento e feche quaisquer arquivos anteriores.
  3. Filtre os proteolipossomos (0,2 μm) para remover quaisquer partículas.
  4. Transfira 70 µL dos proteolipossomos para uma cubeta limpa, evitando impressões digitais ou manchas.
  5. Coloque a cubeta no instrumento e feche a tampa firmemente.
  6. Crie um novo arquivo e selecione Medição Manual > Tamanho.
  7. Defina a temperatura como 25 °C e mantenha o índice de atenuação em automático.
  8. Defina as propriedades do dispersante (viscosidade e índice de refração; por exemplo, IR = 1,330 para água/tampão).
  9. Defina os parâmetros de aquisição (duração automática, cerca de 3 medições, processamento de Uso Geral).
  10. Inicie a medição e monitore o tamanho, índice de polidispersidade (PDI) e taxa de contagem (alvo ~100–500 kcps).
  11. Analise os resultados: verifique a distribuição de tamanho (intensidade/volume), PDI (<0,3 aceitável) e qualidade da autocorrelação (decaimento suave, linha de base estável); salve os dados.

9. Preparação e triagem de grades para microscopia eletrônica criogênica

  1. Utilize a amostra de proteolipossoma do passo 5.11 (ou do passo 3.9, se os passos 4 e 5 forem ignorados) para preparar as grades de microscopia eletrônica (EM). Concentre os proteolipossomas, se necessário, repetindo o passo 5.6 e ressuspendendo em um volume menor de PLB.
  2. Submeta grades de cobre com 300 malhas recobertas com carbono poroso a descarga luminosa por 90 s a 20 mA, utilizando ar em um sistema de limpeza por descarga luminosa.
  3. Configure um sistema automatizado de congelamento por imersão para congelamento a 95% de umidade e a 15 °C com os seguintes parâmetros: tempo de absorção de 10 s, força de absorção −8, tempo de espera de 10 s e tempo de drenagem 0.
  4. Fixe a pinça com a grade submetida à descarga luminosa ao sistema de congelamento por imersão.
  5. Adicione 4,0 µL da amostra de proteolipossoma à grade submetida à descarga luminosa em um plunger automático.
  6. Incube as grades por 10 s antes de absorver por 10 s e congelar por imersão em etano líquido. Transfira cuidadosamente as grades para a caixa de grades na câmara de N2 líquido e, posteriormente, para o recipiente de armazenamento de N2 líquido.
  7. Carregue as grades congeladas e a tela na microscopia eletrônica de transmissão com um carregador de amostras criogênico. Utilizou-se uma microscopia eletrônica de transmissão com detector direto de elétrons.
  8. Configure o microscópio conforme as instruções do fabricante e analise as grades em busca de proteolipossomas reconstituídos. Salve as imagens.
    NOTA: CUIDADO: O etano líquido é altamente inflamável e criogênico; manuseie com EPI apropriado e longe de fontes de ignição para evitar incêndios e lesões por queimadura fria. O nitrogênio líquido é criogênico e pode causar queimaduras severas por frio e deslocamento de oxigênio. Manuseie com EPI criogênico adequado e utilize apenas em áreas bem ventiladas.

Resultados

Utilizando este protocolo, identificamos as condições ideais de reconstituição para supercomplexos mitocondriais (SCs) isolados de mitocôndrias cardíacas de suíno (Figura 1A,B). O protocolo com gradiente em degraus de sacarose separa efetivamente proteolipossomos reconstituídos de vesículas vazias e proteínas não incorporadas, permitindo testes rápidos e a otimização de condições. Os resultados representativos na Figura 2 mostram um gradiente com a amostra aplicada antes e após a centrifugação. Além disso, otimizamos o detergente utilizado para reconstituir os SCs respiratórios em lipossomos. Quatro detergentes diferentes — detergente aniônico de sal biliar, CHAPS, digitonina e detergente glicosídico — foram usados separadamente para a reconstituição com os SCs. A atividade total da CI nas frações foi medida pelo ensaio de oxirredução NADH-ferricianeto para cada detergente testado (Figura 3A–D). Nas reconstituições bem-sucedidas, a atividade máxima da CI foi observada nas frações localizadas na interface entre as duas concentrações de sacarose (27% p/v de sacarose e 7% p/v de sacarose). Notavelmente, atividade mínima foi detectada na Fração #10 com o detergente aniônico de sal biliar e com o CHAPS, enquanto a Fração #10 com digitonina e com detergente glicosídico mostrou atividade considerável, indicando que a digitonina e um detergente glicosídico não reconstituem efetivamente os supercomplexos nos lipossomos. Um detergente aniônico de sal biliar foi utilizado em todas as reconstituições subsequentes.

O ensaio de atividade em gel de CI e CIV realizado em gel de eletroforese nativa azul de poliacrilamida de proteolipossomos POPC:POPE:CL (2:2:1) extraídos com digitonina demonstra as quantidades relativas do SC e dos complexos individuais da cadeia de transporte de elétrons (ETC) após a reconstituição (Figura 4). Os resultados indicam que a interação entre CI e CIII2 é amplamente mantida nos proteolipossomos após a re-extração com digitonina e BN-PAGE. Embora alguma atividade de CIV esteja presente na faixa do supercomplexo, um sinal forte também é observado em menor peso molecular, compatível com CIV isolado, indicando dissociação. A permeabilidade da membrana dos lipossomos reconstituídos foi medida utilizando o ensaio de quenching de fluorescência ACMA, indicando que os proteolipossomos não eram significativamente permeáveis a prótons (Figura 5A,B). O tamanho dos lipossomos reconstituídos foi estimado utilizando DLS, mostrando que a extrusão antes da reconstituição resulta em uma distribuição final de tamanho de 82,9 ± 0,8 nm de diâmetro para vesículas vazias e 110,6 ± 0,4 nm para proteolipossomos supercomplexos reconstituídos (RSPs) (Figura 6). O consumo de oxigênio pelos proteolipossomos foi utilizado para avaliar a função do SC, revelando um claro consumo de oxigênio impulsionado por NADH e sensível a inibidores (Figura 7A). O traçado das OCRs em relação à OCR após a adição direta de NADH fornece informações sobre o grau de acoplamento dentro dos RSPs, ou seja, a OCR aumenta em um fator de aproximadamente 1,5 após a adição de CCCP em comparação com a adição de NADH isoladamente (Figura 7B). As grades de criomicroscopia eletrônica triadas permitiram a visualização dos SCs na membrana dos proteolipossomos, confirmando a reconstituição bem-sucedida (Figura 8A–I).

figure-results-1
Figura 1: Isolamento e caracterização de supercomplexos solubilizados por detergente provenientes de mitocôndrias cardíacas de suíno. (A) Cromatograma representativo da purificação por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) de complexos de membrana mitocondrial de suíno extraídos com digitonina. (B)  PAGE nativo azul (BN-PAGE) de frações provenientes de A, visualizado por coloração de atividade enzimática in-gel da CI. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Gradientes em etapas de sacarose com proteolipossomos. Antes da centrifugação (à esquerda), após a centrifugação (à direita) a 100.000 × g por 2 h em uma ultracentrífuga. A amostra de proteolipossomos aplicada no gradiente é separada em vesículas vazias, proteolipossomos e proteína agregada no fundo. Em seguida, esse gradiente é fracionado para caracterização adicional, conforme descrito. A extensão aproximada de cada fração é indicada e identificada. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Ensaio de flutuação para avaliar a eficiência de reconstrução em diferentes detergentes. Atividade de NADH-ferricianeto da CI nas frações do gradiente de sacarose em escada após reconstrução com (A) detergente aniônico de sal biliar, (B) 3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanossulfonato (CHAPS) (0,6% (w/v)), (C) digitonina (0,6% w/v), (D) detergente glicosídico (GDN) (0,6% (w/v)). A fração #10 é obtida pela ressuspensão de qualquer precipitado na última fração. A atividade na fração #10 indica que as proteínas não foram reconstruídas. n = 3 e as barras de erro mostram o DP = desvio padrão. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Ensaio de atividade em gel em proteolipossomos extraídos com digitonina, separados em BN-PAGE de 3%–12%. Ensaio de atividade em gel para CI (esquerda) e CIV (direita). R = respirassomo (SC I+III2+IV), SC1,3 (SC I+III2), IGA CI = (ensaio de atividade em gel para CI); IGA = ensaio de atividade em gel, CIV = (ensaio de atividade em gel para CIV). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Ensaio de extinção da fluorescência de ACMA para detectar vazamento de prótons em proteolipossomos reconstruídos. Com um corante sensível ao pH (ACMA), o pH interno de proteolipossomos reconstruídos (azul-ciano) foi comparado ao de lipossomos vazios (laranja) após a adição sequencial de valinomicina e CCCP. São apresentados traços representativos de fluorescência de ACMA obtidos a partir de diferentes preparações de proteolipossomos para comparação. (A) Lipossomos reconstruídos com membrana comprometida (com vazamento). (B) Lipossomos reconstruídos com membrana íntegra. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Medidas de dispersão dinâmica da luz de lipossomos vazios e proteolipossomos SC reconstituídos. São mostradas as distribuições médias ponderadas por volume dos lipossomos vazios extrudidos (laranja) e dos proteolipossomos reconstituídos com SC (ciano). As medições foram realizadas em três repetições técnicas. Os lipossomos vazios apresentam um diâmetro hidrodinâmico médio de 82,9 ± 0,8 nm, enquanto os RSPs apresentam um diâmetro hidrodinâmico médio de 110,6 ± 0,4 nm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-7
Figura 7: Ensaios de consumo de oxigênio para avaliar o acoplamento de SCs reconstruídos em lipossomos. O consumo de oxigênio foi medido para avaliar a atividade respiratória e o acoplamento dos complexos da cadeia transportadora de elétrons (ETC) após a reconstrução em lipossomos gerados por extrusão. (A) Traçado representativo corrigido para o fundo, obtido com eletrodo de oxigênio, mostrando as alterações na concentração de oxigênio após a adição sequencial de NADH para iniciar a respiração mediada pelo CI, CCCP para dissipar o gradiente de prótons e medir a taxa máxima de consumo de oxigênio desacoplado (OCR), piericidina A para inibir o CI, antimicina A para inibir o CIII2 ou NaN3 (azida) para inibir o CIV. (B) Quantificação da OCR nas condições indicadas e corrigida conforme o passo 7.10. São apresentados os pontos de dados relativos à OCR após a adição de NADH para cada traçado, juntamente com a média ± DP (barras de erro). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-8
Figura 8: Visualização por microscopia eletrônica criogênica de SCs reconstituídos em membranas de proteolipossomos. (A–C) Micrografias eletrônicas representativas das grades analisadas, mostrando SCs reconstituídos associados às membranas de proteolipossomos. Os SCs reconstituídos estão indicados por setas amarelas. Barras de escala = 50 nm. (D–I) Partículas representativas de SCs visualizadas com maior aumento nas membranas de proteolipossomos. Barras de escala = 10 nm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

Apresenta-se um método simples e reprodutível para a reconstrução de supercomplexos respiratórios mitocondriais em proteolipossomos definidos, permitindo a investigação controlada de sua estrutura e função. Várias etapas deste protocolo são críticas para uma reconstrução bem-sucedida. Em nossos experimentos, lipossomos gerados por extrusão apresentam uma distribuição de tamanho mais uniforme (avaliada por espalhamento dinâmico da luz) do que aqueles produzidos por sonicação. A remoção eficiente do detergente utilizando uma coluna giratória de dessalinização pré-embalada é essencial para promover o selamento da membrana e a incorporação adequada dos supercomplexos em uma bicamada lipídica; a remoção incompleta pode resultar em proteolipossomos com vazamentos ou instáveis. A otimização da composição lipídica, das proporções proteína/lipídio e da escolha do detergente é igualmente importante, pois esses parâmetros influenciam fortemente a eficiência de reconstrução e a estabilidade dos supercomplexos. O ensaio de flutuação em gradiente de sacarose é útil para a otimização inicial; no entanto, uma vez estabelecidas as condições, é preferível utilizar os proteolipossomos diretamente após a coluna giratória de dessalinização pré-embalada para análises estruturais e funcionais subsequentes, evitando assim perda de amostra e perturbação durante a fracionamento em gradiente. O volume da fração necessário para observar atividade varia entre diferentes preparações. Ajuste o volume a ser adicionado à mistura de reação conforme a preparação. A orientação do supercomplexo respiratório na membrana do proteolipossomo pode influenciar significativamente as medidas respiratórias. O procedimento de reconstrução não foi otimizado para impor uma única topologia; portanto, embora se espere uma população mista de orientações, ensaios de acessibilidade de ferrocianeto ao CI indicam uma forte tendência para braços periféricos do CI voltados para fora.

A orientação dos supercomplexos reconstruídos foi avaliada experimentalmente, e a atividade da ferricianida do CI foi medida na presença e na ausência do detergente. Em RSPs intactos, o NADH adicionado externamente só pode acessar moléculas de CI cujo braço periférico está exposto ao meio externo, enquanto a permeabilização com detergente permite o acesso de NADH a todos os complexos. Assim, este ensaio estima a fração de braços periféricos de CI funcionalmente acessíveis voltados para o meio externo, em vez de fornecer uma determinação estrutural completa da topologia dos proteolipossomos. A comparação das atividades medidas nessas condições indicou que 83,1% ± 0,04% dos respirassomos (o SC) estavam orientados com o braço periférico do CI voltado para fora, revelando uma tendência significativa de orientação durante a reconstrução.

Várias modificações e estratégias de solução de problemas podem melhorar a reprodutibilidade e a estabilidade. Ensaios de atividade em gel para CI e CIV, realizados em frações agrupadas extraídas com digitonina provenientes de gradientes de sacarose, mostram bandas para o SC, indicando que o SC não se dissocia completamente durante a reconstrução. No entanto, a banda do SC é mais intensa no gel de atividade da CI em comparação com o gel de atividade da CIV, indicando que a CIV pode se dissociar parcialmente da CI e da CIII2 após a reconstrução (Figura 4). O ajuste da composição lipídica pode aumentar a estabilidade do SC. A dissociação parcial da CIV também pode resultar da escolha do detergente ou da remoção rápida do detergente durante a reconstrução, o que poderia desestabilizar interações proteína-proteína mais fracas dentro do supercomplexo. Uma otimização adicional das condições de troca de detergente pode melhorar a retenção da CIV. Além disso, minimizar o estresse mecânico, evitar etapas desnecessárias de purificação e manipular cuidadosamente as amostras podem ajudar a preservar a integridade dos proteolipossomos. Para ensaios funcionais, é essencial garantir o fechamento completo dos proteolipossomos, pois a vazamento da membrana impede o acoplamento ao gradiente transmembranar de prótons. Para o preparo das grades de criomicroscopia eletrônica, o uso de grades revestidas com carbono contínuo é importante, pois demonstrou-se que melhora a distribuição das partículas dentro dos orifícios da grade19.

Apesar de suas vantagens, essa abordagem apresenta limitações. Os proteolipossomos não recapitulam completamente a complexidade composicional e dinâmica da membrana mitocondrial interna nativa, e a dissociação parcial dos componentes do complexo de supercomplexos (SC), particularmente o CIV, permanece um desafio. As leituras funcionais também podem ser influenciadas por acoplamento incompleto ou heterogeneidade na eficiência de reconstrução. Contudo, em comparação com sistemas solubilizados por detergentes, este método preserva as interações lipídio-proteína e sustenta um ambiente de membrana semelhante ao nativo, ao mesmo tempo que oferece maior controle experimental do que abordagens in situ. Assim, fornece uma plataforma valiosa para a investigação sistemática de como a composição lipídica e as propriedades da membrana regulam a estabilidade e a atividade do SC.

Compreender essas relações é particularmente importante porque a desorganização dos supercomplexos respiratórios tem sido implicada em uma ampla gama de distúrbios mitocondriais e metabólicos31,32,33,34,35,36,37,38,39,40. Defeitos na montagem dos complexos da CTE, na síntese de cardiolipina ou na remodelação de lipídios, como observado em distúrbios como a síndrome de Leigh41,42,43,44,45,46,47, a síndrome de Barth48,49,50,51,52,53,54 e a síndrome de Sengers48, podem desestabilizar os supercomplexos, prejudicar a transferência de elétrons, reduzir a produção de ATP e aumentar a geração de espécies reativas de oxigênio. Esses defeitos bioenergéticos afetam desproporcionalmente tecidos com alta demanda energética, como o coração, o músculo esquelético e o cérebro, levando a fenótipos como cardiomiopatia, intolerância ao exercício e neurodegeneração36,37,38. Por outro lado, evidências recentes sugerem que a formação de supercomplexos pode desempenhar papéis compensatórios e protetores sob estresse, estabilizando os complexos da CTE e limitando a produção patológica de ERO55,56. A plataforma de proteolipossomos reconstituídos descrita aqui fornece um sistema controlado para testar diretamente como remodelações lipídicas associadas a doenças, mutações ou intervenções farmacológicas alteram a montagem e a função dos supercomplexos, permitindo assim estudos mecanicistas da disfunção mitocondrial e orientando estratégias terapêuticas futuras.

Taxas baixas de consumo de oxigênio podem resultar de má incorporação de supercomplexos, dissociação parcial do CIV, resíduo de detergente, concentração insuficiente de CoQ10 ou citocromo c, NADH degradado ou baixa concentração proteica na câmara do oxigrafo. Confirme a reconstituição por ensaio de flutuação ou BN-PAGE, verifique a integridade da membrana por ensaio de extinção de ACMA, prepare NADH fresco e otimize a razão proteína-lipídio, concentração de cofatores, remoção de detergente e concentração da amostra. Proteolipossomos com vazamento podem resultar de remoção incompleta de detergente, concentração excessiva de detergente, manipulação agressiva, ciclos repetidos de congelamento-descongelamento ou lipídios danificados. Se vazamento de prótons for observado no ensaio de ACMA, repita a remoção de detergente utilizando uma coluna de dessalinização recentemente equilibrada, evite sobrecentrifugação da coluna, prepare lipossomos frescos, minimize o estresse mecânico e utilize os proteolipossomos imediatamente após a reconstituição. Agregação durante as etapas de concentração pode ocorrer devido a altas concentrações locais de proteína ou detergente na membrana do concentrador. Concentre as amostras em ciclos curtos (10 min) de centrifugação, ressuspenda suavemente a amostra entre as centrifugações, evite sobrec concentração, mantenha as amostras a 4 °C e remova agregados visíveis por clarificação de baixa velocidade antes do uso subsequente. Comportamento de flutuação inconsistente pode refletir tamanho variável de lipossomos, remoção incompleta de detergente, agregação, empilhamento incorreto de sacarose ou perturbação do gradiente durante a carga da amostra ou coleta de frações. Prepare soluções frescas de sacarose, empilhe os gradientes lentamente sem misturar as interfaces, utilize lipossomos extrusados uniformemente, mantenha as condições de centrifugação constantes e colete as frações suavemente de cima para baixo. Distribuição inadequada de partículas em criomicroscopia eletrônica pode surgir de baixa concentração de proteolipossomos, agregação, adsorção preferencial ao carbono, molhamento inadequado da grade, gelo espesso ou tempo excessivo de blotting. Otimize a concentração de proteolipossomos, remova agregados antes da preparação da grade, ajuste as condições de descarga luminosa, teste o tempo e a força de blotting, teste diferentes tipos de grades ou suportes de carbono e utilize amostras recém-preparadas sempre que possível.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

As grades foram analisadas na instalação UC Davis BioEM Core. Agradecemos ao Dr. Fei Guo pela assistência na análise. O trabalho foi financiado pelo NIGMS do NIH sob a concessão R35GM137929 (JAL).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC)Avanti Research860320
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina (POPE)Avanti Research850757
1,3-bis(sn-3’-fosfatidil)-sn-glicerol (cardiolipina, de tecido cardíaco bovino)Avanti Research840012
2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfônico --- HEPESSigma-AldrichH23830
3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS)Sigma-AldrichM12545
3,3′-Diaminobenzidina ---- DABBSigma-AldrichD4293
Cianeto de carbamil m-clorofenilhidrazone ---- CCCPSigma-AldrichC2759
CHAPSSigma-Aldrich220201
ClorofórmioSigma-Aldrich650948
Coenzima Q10Sigma-AldrichC9538
Citocromo c do coração equinoSigma-AldrichC2506
DigitoninaSigma-Aldrich300410
Ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-tetraacético --- EGTASigma-AldrichE3889
Ácido etilenodiaminotetraacético -- EDTASigma-AldrichE6758
GlicerolSigma-AldrichG7893
Glico-diosgeninaAnatraceGDN101detergente
Lauroil maltose neopentil glicol ---- LMNGSigma-AldrichNG310
Cloreto de magnésioSigma-AldrichM8266
MyxotiazolSigma-AldrichT5580
NADH, sal de dissódioSigma-Aldrich481913
Cloridrato de nitrotetrazólio azulSigma-AldrichN6876
Piericidina ASigma-Aldrich96861
Acetato de potássioSigma-AldrichP5708
Cloreto de potássioSigma-AldrichP3911
Ferricianeto de potássioSigma-Aldrich702587
Fosfato monobásico de potássio ---- KH2PO4Sigma-AldrichP0662
Azida de sódioSigma-AldrichS2002
Colato de sódio hidratadoSigma-AldrichC1254
Cloreto de sódioSigma-AldrichS9888
Ditionito de sódioSigma-Aldrich71699
SacaroseSigma-AldrichS9378
TRISSigma-AldrichT1503
ACMA (9-amino-6cloro-2-metoxiacridina)Sigma-AldrichSML4162
Equipamentos e Kits
Filtro Centrífugo Amicon®, 100 kDa MWCO 0,5 mLMilliporeUFC5100
Filtro Centrífugo Amicon®, 100 kDa MWCO 15 mLMilliporeUFC9100
Ultracentrífuga Beckman Optima TLXBeckman Coulter
Gel BN-PAGEgel de eletroforese nativa azul em poliacrilamida
Ultracentrífuga Beckman Optima XEBeckman Coulter
Sistema de Limpeza por Descarga de Plasmasistema de limpeza por descarga de plasma
Glacios 2 Cryo-TEM com detector Gatan K3Thermo Fisher Scientifico microscópio eletrônico de transmissão
Conjunto de triturador de tecidos Dounce KIMBLESigma-AldrichD9188
Plunger Automático Leica GP2Leica
Microcentrífuga 16Beckman CoulterA46474
Sistema de Cromatografia NGC Discover 10Bio-Rad7880009
Oxygraph+sistema de eletrodo de oxigênio
Coluna de Dessalinização PD-10Cytiva28918007coluna giratória de exclusão por tamanho
Kit de ensaio de proteína Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225kit de ensaio de proteína por ácido bicinconínico
Sonicador Q-125Q-sonicaQ125-110
Coluna Sephadex G-25 Mcoluna giratória pré-embalada com resina G-25 para dessalinização
Leitor de microplacas SpectraMax M2Molecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GLCytiva29091596meio de filtração em gel de agarose reticulada
Pacote de rotor de ângulo fixo TLA-100.3Beckman Coulter349490
Rotor de ângulo fixo Tipo 50.2 TiBeckman Coulter337901
Água Milli-Q (MQ)água ultrapura
Malvern Zetasizer ZS Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)Malvern Paranytical
Sistema Hansatech Oxygraph+Hansatech Instruments
Sistema PELCO easiGlow de Limpeza por Descarga de PlasmaTED PELLA, INC
Sistema Vitrobot Mark IVThermo Fisher Scientifico congelador por imersão
Grade de cobre Quantifoil R 1.2/1.3 de 300 mesh com 2 nm de carbonoTED PELLA, INC668-300-Cu-100com revestimento de carbono perfurado
Extrusor mini AvantiAvanti Lipids610000

Referências

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