Este estudo apresenta um fluxo de trabalho integrado de visualização que combina a coleta e o processamento padronizados do fluido de lavagem broncoalveolar, um painel de citometria de fluxo com sete marcadores, um ensaio multiplex de citocinas com 13 analitos e um pipeline unificado de análise.
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Artigo de investigação
Visualização Integrada do Recrutamento de Neutrófilos e do Perfil de Citocinas Inflamatórias em Fluido de Lavagem Broncoalveolar
Neste artigo
Resumo
Resumo
O líquido de lavagem broncoalveolar (LLBA) é a matriz de amostragem mais diretamente acessível para o estudo da inflamação das vias aéreas inferiores, porém as análises convencionais baseiam-se em citometria de fluxo de marcador único combinada com ensaio imunoenzimático (ELISA) analito por analito, uma abordagem que limita a densidade de informações e oculta o acoplamento célula-fator. Este estudo apresenta um fluxo de trabalho integrado de visualização que associa coleta e pré-processamento padronizados a um painel de citometria de fluxo com sete marcadores para neutrófilos e monócitos, um ensaio multiplex de citocinas com 13 analitos e um pipeline unificado de análise baseado na aproximação uniforme de variedades e projeção (UMAP), metaagrupamento FlowSOM, agrupamento hierárquico, redes de correlação de Spearman e análise de componentes principais (PCA).
O fluxo de trabalho foi aplicado a uma coorte prospectiva de centro único composta por 112 adultos submetidos à broncoscopia, incluindo 64 pacientes com infecção pulmonar confirmada microbiologicamente e 48 controles sem infecção. As análises citológicas e de citometria de fluxo revelaram uma mudança acentuada de um perfil alveolar dominado por macrófagos para um dominado por neutrófilos durante a infecção, com o percentual de neutrófilos aumentando de uma mediana de 3,2% para 68,4% e a concentração absoluta de neutrófilos elevando-se aproximadamente 50 vezes. O perfil multiplex identificou uma resposta coordenada de citocinas em três módulos, com os módulos quimiocina, pró-inflamatório e regulador todos regulados para cima, e CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α e G-CSF apresentando a melhor discriminação individual dentro da coorte do estudo (área sob a curva [AUC] de 0,89 a 0,94). A visualização integrativa utilizando PCA, uma matriz de correlação e um gráfico em rede revelou um eixo neutrófilo–quimiocina fortemente acoplado ao nível dos participantes, com a contagem de neutrófilos no LBA surgindo como o principal centro da rede.
O fluxo de trabalho utiliza apenas materiais rotineiramente obtidos de lavado broncoalveolar indicado clinicamente, não requer volume adicional de amostra e fornece uma estrutura rica em informações para resolver a inflamação das vias aéreas em infecções respiratórias, o que pode ser viável em laboratórios de atenção terciária equipados com citometria de fluxo multiparamétrica e plataformas de matriz de microesferas multiplex, estendendo-se a estudos longitudinais, de única célula e de avaliação terapêutica. A adoção clínica mais ampla de analitos individuais como biomarcadores exigirá validação prospectiva em coortes multicêntricas independentes.
Introdução
As mortes por infecções do trato respiratório inferior continuam sendo uma causa significativa de mortalidade global, apesar dos avanços nas estratégias de vacinação e modalidades de tratamento; no entanto, isso permanece especialmente verdadeiro entre as populações pediátrica e idosa1. Os neutrófilos são as principais células relatadas nas fases iniciais de uma resposta imune inata no sistema respiratório afetado, um processo vital para a eliminação do patógeno invasor; entretanto, a inflamação neutrófila descontrolada resulta na ruptura da barreira alveolocapilar, em danos oxidativos aos tecidos e no desenvolvimento da síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA)2,3. Os neutrófilos no espaço aéreo pulmonar também exibem cinética de recrutamento, padrões de retenção e comportamento efetor que diferem de outros tecidos, e essas diferenças influenciam se a infecção se resolve ou progride para pneumonia grave4.
O líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) é uma fonte importante de informações sobre o microambiente alveolar e oferece a representação mais próxima da imunidade clínica neste local5. A quimiocina CXCL8 desempenha um papel essencial no recrutamento de neutrófilos para os pulmões por meio de seus receptores, CXCR1 e CXCR2, juntamente com outras quimiocinas, incluindo CXCL1, CXCL2 e CXCL56. As citocinas IL-1β, IL-6 e TNF-α potencializam ainda mais esse processo, enquanto a IL-10 atua como uma citocina contrarreguladora. Os níveis dessas citocinas no BALF demonstraram correlação com a gravidade das infecções pulmonares e com o desenvolvimento de complicações pulmonares devido à pneumonia bacteriana, viral e atípica7, e perfis multiplex de biomarcadores no BALF estão sendo adotados para diagnóstico precoce e discriminação de patógenos em infecções do trato respiratório inferior8.
A análise rotineira de LBA geralmente não abrange completamente a biologia subjacente ao exame. As contagens celulares podem ser estimadas por diferenciação manual de células em amostras de citocentrifugação, enquanto mediadores solúveis são medidos por meio de ensaios imunoenzimáticos individuais (ELISA) e apresentados em gráficos de barras. Quimiocinas, citocinas e cada tipo celular são avaliados separadamente, sem estabelecer correlação entre um gradiente de concentração específico de quimiocina e as populações celulares que ela afeta na amostra. A combinação de módulos de citocinas, relações dose-resposta entre quimiocinas e neutrófilos e subpopulações de pacientes com suas próprias assinaturas inflamatórias é frequentemente ignorada na ausência de análise multivariada9.
Os avanços na computação tornam essa abordagem holística progressivamente realista. A combinação da citometria de fluxo multiparamétrica e da citometria de fluxo espectral com abordagens de redução de dimensionalidade, como o t-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding) ou o UMAP (uniform manifold approximation and projection), permite o mapeamento de fenótipos imunes de alta dimensionalidade em um espaço bidimensional, sendo que o UMAP demonstrou melhor retenção da topologia global e maior reprodutibilidade ao ser aplicado a dados de citometria10. Painéis multianalíticos de citocinas, seguidos por agrupamento hierárquico e redes de correlação, ajudam a identificar assinaturas associadas à gravidade que não são detectáveis por abordagens baseadas em uma única citocina11. Apesar dos avanços na área, ainda não existe um fluxo de trabalho que reúna esses métodos para estudar o recrutamento de neutrófilos e as assinaturas de citocinas a partir das mesmas amostras de LBA em infecções respiratórias. Este estudo descreve um fluxo de trabalho integrado de visualização para investigar o recrutamento de neutrófilos utilizando citologia e citometria de fluxo multiparamétrica, seguido de análises de UMAP e de assinaturas de citocinas por meio de imunoensaio multiplexado, com agrupamento hierárquico, matrizes de correlação e análise de componentes principais. O fluxo de trabalho gera uma visualização integrada que engloba leituras imunes celulares e solúveis das vias aéreas em um único gráfico, utilizando amostras de LBA obtidas rotineiramente durante broncoscopia indicada clinicamente em infecções do trato respiratório inferior.
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Protocolo
População do estudo e ética
Este foi um estudo observacional prospectivo de centro único conduzido em um hospital universitário terciário entre janeiro de 2026 e abril de 2026. O protocolo foi aprovado sob o número de aprovação 2026HL-038, e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes de qualquer procedimento do estudo.
Adultos com idade entre 18 e 75 anos submetidos à broncoscopia flexível diagnóstica com lavado broncoalveolar (LBA) como parte do atendimento clínico de rotina foram recrutados consecutivamente e alocados em um grupo de infecção ou em um grupo controle sem infecção, com base nos diagnósticos clínicos e microbiológicos finais. Uma visão geral do fluxo de trabalho de visualização integrada, desde o recrutamento dos pacientes até as saídas visuais integradas, é apresentada na Figura 1.
Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho integrado de visualização para o perfilamento baseado em LBA da recrutamento de neutrófilos e respostas inflamatórias de citocinas. Os cinco estágios resumem, da esquerda para a direita, o recrutamento prospectivo dos grupos de infecção e controle com broncoscopia e LBA, o pré-processamento do LBA em um pellet celular e uma fração de sobrenadante, medições celulares paralelas (citologia com Wright–Giemsa e citometria de fluxo multiparamétrica) e solúveis (ensaio imunológico com microesferas 13-plex), o pipeline unificado de visualização (UMAP com metaagrupamento FlowSOM, mapa térmico hierárquico, análise de componentes principais e rede de correlação de Spearman) e a saída visual integrada. Abreviações: LBA = lavado broncoalveolar; LBAF = fluido de LBA; UMAP = aproximação uniforme de variedades e projeção. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Os critérios de inclusão para o grupo de infecção foram os seguintes: (1) pacientes diagnosticados com pneumonia adquirida na comunidade (PAC), pneumonia associada a atendimento em saúde (PAS) ou pneumonia associada a ventilação mecânica (PAVM), conforme diretrizes da Sociedade de Doenças Infecciosas da América (IDSA) e da Sociedade Torácica Americana (ATS); (2) detecção de um ou mais patógenos por meio de cultura de LBA com ≥104 unidades formadoras de colônia (UFC)/mL, reação em cadeia da polimerase (PCR) respiratória multiplex, sequenciamento metagenômico de nova geração do LBA ou testes específicos de antígeno/anticorpo a partir de espécimes respiratórios/séricos pareados.
Os critérios para o grupo controle foram os seguintes: (1) razões não infecciosas para broncoscopia, consistindo na avaliação de um nódulo pulmonar indeterminado, resultados de radiologia anormais que não sugerem infecção ou exame para tosse crônica; (2) ausência de infecção pulmonar aguda, demonstrada por resultados negativos nos testes microbiológicos e ausência de quaisquer sinais de inflamação ou infecção sistêmica no momento da broncoscopia; e (3) ausência de uso de antibióticos nos 30 dias anteriores à participação. Os controles foram recrutados entre pacientes submetidos à broncoscopia por outras condições pulmonares clinicamente indicadas, e não entre voluntários saudáveis, refletindo a população da qual a LBA clinicamente indicada é rotineiramente obtida no centro do estudo.
Os critérios de exclusão incluíram: (1) neoplasia maligna e/ou quimioterapia citotóxica nos últimos seis meses; (2) soropositividade para HIV; (3) transplante de órgão sólido ou de células-tronco hematopoiéticas; (4) terapia imunossupressora prolongada envolvendo uma dose diária equivalente de prednisona > 0,3 mg/kg por mais de 3 semanas; (5) mulheres grávidas ou em período de amamentação; (6) histórico de diatese hemorrágica ou quaisquer contraindicações à broncoscopia flexível; (7) doença respiratória crônica grave preexistente (doença pulmonar obstrutiva crônica [DPOC] estágio III/IV da Iniciativa Global para Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica [GOLD], fibrose pulmonar idiopática, asma persistente grave ou bronquiectasias clinicamente significativas); (8) tuberculose ativa; (9) participação em outro estudo intervencionista nos últimos 30 dias. A lavagem broncoalveolar (LBA) foi realizada durante a primeira broncoscopia, nas primeiras 72 horas após a admissão por infecções e nas primeiras 48 horas após a intubação em pacientes sob ventilação mecânica com infecções.
Os cálculos do tamanho da amostra foram focados no desfecho celular primário: o número de neutrófilos no LBA entre os grupos. Considerando um tamanho do efeito esperado de 0,6 DP entre vias aéreas infectadas e não infectadas e uma margem de 15% para perdas, foi necessário um tamanho mínimo de amostra de 45 indivíduos por grupo, com α bicaudal = 0,05 e poder estatístico de 80%. Dos 156 candidatos elegíveis, 27 não atenderam aos critérios de elegibilidade (18 não cumpriram os critérios de inclusão, principalmente devido à incapacidade de identificar um agente patogênico responsável pela doença dentro do período estipulado ou à falta de concordância com o próprio procedimento; 9 descumpriram os critérios de exclusão, principalmente por malignidade ativa ou histórico de administração de quimioterapia, uso crônico de corticosteroides, doença pulmonar crônica pré-existente grave ou diatese hemorrágica). Os 129 participantes restantes foram submetidos à broncoscopia. Posteriormente, 17 indivíduos foram excluídos do estudo (7 devido à coleta inadequada de LBA < 40%; 4 por retirada do consentimento durante a hospitalização; e 6 por reclassificação dos indivíduos após a avaliação microbiológica final – 4 candidatos do grupo controle diagnosticados com infecção oculta com base nos resultados de cultura; e 2 candidatos do grupo infecção que não apresentaram evidência de infecção após a análise de cultura). O grupo final de participantes do estudo foi composto por 112 indivíduos: 64 com infecção e 48 sem infecção.
Coleta e pré-processamento de LBA
A broncoscopia foi realizada por operadores qualificados seguindo o protocolo institucional padrão, conforme as recomendações técnicas publicadas para lavagem broncoalveolar12. A lidocaína foi usada topicamente, e os pacientes receberam sedação intravenosa moderada enquanto oxigênio suplementar era fornecido para manter a saturação de oxigênio (SpO₂) >92%. O broncoscópio flexível foi inserido e posicionado no segmento brônquico-pulmonar com anormalidades radiológicas. Nos casos em que as anormalidades radiológicas eram difusas ou não localizáveis, os segmentos do lobo médio direito ou da língula esquerda foram escolhidos. Após cada instilação, foi realizada sucção manual suave com pressão negativa < 100 mmHg. Foram administradas um total de três a cinco instilações de solução salina estéril a 37 °C, com 20–40 mL cada, totalizando um volume de 100–150 mL. A proporção de recuperação foi estimada como o volume recuperado em relação ao volume instilado, e somente amostras com recuperação ≥40% foram consideradas para análise.
As amostras coletadas a partir do segundo lavado e dos subsequentes foram agrupadas para reduzir a contaminação brônquica e obter uma amostra enriquecida em alvéolos. O pool de líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) foi mantido sob gelo e processado dentro de 2 h após a coleta, levando em consideração descobertas recentes sobre alterações na composição celular e nas contagens diferenciais após armazenamento prolongado e aquecimento de amostras humanas de BALF13. Após a filtração utilizando uma malha de náilon estéril com porosidade de 70 micrômetros para remover o muco, realizada apenas por passagem mecânica, sem adição de agente mucolítico ou anticlumpante como o ditiotreitol, já que testes pilotos demonstraram que isso era suficiente para remover os coágulos de muco sem perda mensurável da integridade dos epítopos superficiais em etapas subsequentes, o fluido foi submetido à centrifugação a 400 × g durante 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi decantado e fracionado em criotubos de baixa ligação proteica para análise de citocinas, e as células foram suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,5% de albúmina sérica bovina e 2 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), sendo parte delas mantida para citologia e citometria de fluxo. As amostras de citocinas foram congeladas em nitrogênio líquido, armazenadas a –80 °C e submetidas a não mais do que um ciclo de congelamento-descongelamento antes do uso.
Citologia de neutrófilos e quantificação por citometria de fluxo
Em termos de citopatologia, 100 µL da suspensão celular de LBA foi aplicado em lâmina de vidro utilizando um citocentrífugo (ver Tabela de Materiais) a 300 ×g durante 5 min, secado ao ar e corado com Wright-Giemsa. A contagem diferencial foi realizada por um tecnologista em hematologia sem conhecimento do histórico clínico do paciente, que contou um mínimo de 400 células por lâmina e calculou as porcentagens de macrófagos, linfócitos, neutrófilos e eosinófilos. As porcentagens de neutrófilos no LBA foram consideradas a medida primária de desfecho para citopatologia, dada a evidência atual que sugere sua utilidade na distinção entre doenças pulmonares infecciosas e não infecciosas em pacientes com infiltrados pulmonares14.
O protocolo de quantificação por citometria de fluxo baseou-se em uma validação recente do protocolo de diferenciação de leucócitos em fluido de lavado broncoalveolar (BALF) com quatro cores15 e incluiu marcadores adicionais para identificar neutrófilos. Especificamente, cerca de 5 × 105 células isoladas do BALF foram bloqueadas com um reagente bloqueador de receptor Fc humano (ver Tabela de Materiais) por 10 min a 4 °C, e então coradas por 20 min a 4 °C com anticorpos contra CD45 (clone HI30), CD66b (clone G10F5), CD15 (clone HI98), CD16 (clone 3G8), CD11b (clone ICRF44), CD14 (clone M5E2) e HLA-DR (clone L243), além de um corante fixável de viabilidade (ver Tabela de Materiais). Para a lise de eritrócitos, foi utilizada uma solução comercial de lise de eritrócitos (ver Tabela de Materiais) por 10 min à temperatura ambiente. Após a lise de eritrócitos, as células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 2% de soro fetal bovino e ressuspendidas em tampão de citometria, sendo então analisadas em um citômetro de fluxo multicolorido (ver Tabela de Materiais). A compensação foi realizada utilizando microesferas de compensação monocromáticas (ver Tabela de Materiais), e foram incluídos tubos de fluorescência menos um e tubos não corados para cada painel.
Foram adquiridos pelo menos 1 × 105 eventos CD45⁺ para cada amostra. Primeiro, foram selecionados os singletos no gráfico FSC-A/FSC-H, seguidos pelos leucócitos viáveis (negativos para corante de viabilidade) CD45⁺, após o que foi realizada a exclusão de monócitos-macrófagos CD14⁺HLA-DR⁺ para selecionar os granulócitos CD66b⁺ com alta dispersão lateral. Os neutrófilos foram então definidos dentro da população de granulócitos como eventos CD15⁺CD16⁺CD11b⁺. Este primeiro gate de granulócitos CD66b⁺ foi desenhado de forma ampla ao redor de todos os eventos com alta dispersão lateral, em vez de ser restrito ao limite CD15⁺CD16⁺CD11b⁺, de modo que neutrófilos ativados CD16 fraco e CD11b alto, bem como outras formas de granulócitos menos maduras, permanecessem incluídos na contagem automatizada total de neutrófilos; a definição mais rigorosa CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ foi aplicada apenas para caracterizar o subconjunto de neutrófilos maduros, relatado separadamente nas análises de agrupamento subsequentes. A contagem de neutrófilos no LBA (células/µL) foi estimada com base na porcentagem de neutrófilos e na contagem total de células nucleadas determinada por meio de um analisador hematológico automatizado (ver Tabela de Materiais). As matrizes de compensação, a estratégia de seleção de gates e os relatórios individuais de controle de qualidade das amostras foram arquivados, e os analistas permaneceram cegos quanto à atribuição dos grupos dos participantes durante toda a aquisição e análise.
Perfilagem multiplex de citocinas inflamatórias
Os sobrenadantes de LBA foram descongelados uma vez em gelo úmido, seguidos por vortexação breve e clarificação por centrifugação a 10.000 × g por 5 min a 4 °C imediatamente antes do ensaio. A medição de 13 analitos em três categorias funcionais foi realizada utilizando uma plataforma de ensaio imunoenzimático multiplex baseada em microesferas, com um painel personalizado de microesferas magnéticas (ver Tabela de Materiais). O grupo pró-inflamatório compreendeu IL-1β, IL-6, IL-17A e TNF-α; o grupo de quimiocinas compreendeu CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 e CCL3/MIP-1α; e o grupo regulador compreendeu IL-10, IFN-γ, IL-1RA e G-CSF. A escolha dos analitos baseou-se nos que são mais frequentemente relatados como informativos em análises multiplex de citocinas em LBA ou soro em estudos de pneumonia/infeção respiratória grave.7,11. O fator de diluição (1:2 em tampão de ensaio) foi determinado a partir de um experimento piloto realizado em um subconjunto representativo de amostras infectadas e controles para garantir que >90% das medições estiveram dentro da curva padrão.
As curvas padrão foram determinadas utilizando diluições seriadas de sete pontos dos padrões recombinantes do fabricante, preparadas em duplicata em cada placa, incluindo um poço em branco para subtrair o fundo. O ajuste da curva foi realizado por regressão logística de cinco parâmetros (5PL) por meio do software proprietário de aquisição e análise do instrumento (consulte a Tabela de Materiais). O limite inferior de quantificação (LIQ) foi calculado como a menor quantidade de padrão que gerou uma recuperação por retroajuste entre 80% e 120% e um coeficiente de variação intrarrodada (CV) ≤ 20%. Os valores que ficaram abaixo do LIQ foram substituídos por LIQ/√2. Duas amostras pool de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) para controle de qualidade, cada uma proveniente de um paciente infectado representativo e de um indivíduo não afetado, foram aliquotadas e adicionadas a cada placa para acompanhar o desempenho a longo prazo. Os padrões de garantia de qualidade basearam-se em recomendações de boas práticas derivadas de um programa de proficiência multicêntrico de ensaio multiplex baseado em microesferas com 12 anos de duração16, incluindo requisitos de CV intraensaio ≤ 10% em poços em duplicata, CV interplaca ≤ 20% para controle de qualidade e contagem mínima de microesferas de ≥ 50 por analito por poço. As placas que não atenderam aos critérios acima foram repetidas. A análise foi realizada em um único lote dentro de quatro semanas, utilizando um único lote do kit, com aleatorização intercalada das amostras de infecção e controle.
Fluxo de análise de visualização
Os arquivos no Padrão de Citometria de Fluxo (FCS) foram inicialmente analisados usando software comercial de citometria de fluxo (consulte a Tabela de Materiais) para compensação e seleção de singletos viáveis CD45⁺, e posteriormente exportados para análise imparcial no R v4.4. Para cada amostra, 10.000 eventos CD45⁺ foram subamostrados e concatenados, e as intensidades de sinal foram transformadas utilizando a função arcsinh com um fator de cofator igual a 150. A redução de dimensionalidade e as projeções UMAP foram realizadas usando o pacote uwot com 15 vizinhos mais próximos e uma distância mínima de 0,1, juntamente com incorporações t-SNE paralelas usando o pacote Rtsne com perplexidade 3010. Os agrupamentos fenotípicos foram identificados utilizando o FlowSOM com 100 nós de mapas autoorganizáveis e posteriormente divididos em 12–15 agrupamentos por meio de metaagrupamento, utilizando uma abordagem baseada em otimização que foi recentemente validada para dados de citometria de alta dimensionalidade17. Cada agrupamento foi anotado com base na expressão mediana de marcadores de linhagem e ativação e revisado em comparação com os gates manuais.
Para a análise de dados multiplex de citocinas, os valores brutos foram primeiramente transformados por log₁₀ e, em seguida, padronizados entre analitos por meio de escore z antes das análises adicionais. Tanto os analitos quanto os pacientes passaram por agrupamento hierárquico utilizando distância euclidiana e ligação Ward.D2; os resultados foram exibidos em um mapa de calor com agrupamento em linhas e colunas. Essa abordagem foi utilizada para detectar módulos de citocinas coexpressas e classificar subconjuntos de pacientes em coortes inflamatórias multiplex9. Matrizes de correlação foram geradas para todos os biomarcadores celulares e solúveis utilizando correlações de postos de Spearman pareadas. Mapas de calor das matrizes de correlação foram plotados ao lado de uma rede na qual os nós correspondem aos biomarcadores e as arestas indicam correlações que resistiram à correção para testes múltiplos pelo método de Benjamini–Hochberg (BH). A largura das arestas foi ajustada de acordo com a magnitude do coeficiente de correlação |ρ|, sendo incluídas apenas as arestas com |ρ| ≥ 0,30 e p < 0,05 após a correção. A análise de componentes principais (PCA) foi realizada na matriz padronizada contendo células e citocinas utilizando a função prcomp() com escala de variância unitária. Os participantes foram projetados nos dois primeiros componentes principais, com os grupos de infecção e controle sobrepostos. O subamostragem consistente e a padronização de todas as análises garantiram a comparabilidade entre as leituras de biomarcadores celulares e solúveis em todas as visualizações.
Análise estatística
As variáveis contínuas foram descritas utilizando a mediana (intervalo interquartil, IIQ) quando não normais de acordo com os testes de Shapiro–Wilk, e a média (desvio padrão, DP) caso contrário. As variáveis categóricas foram descritas por meio de frequências e proporções. As comparações entre grupos foram realizadas utilizando o teste de Mann–Whitney U teste quando as variáveis contínuas tinham distribuições não normais, o Welch t-test quando as variáveis contínuas apresentavam distribuição normal e o teste qui-quadrado/teste exato de Fisher quando aplicável para variáveis categóricas. As associações entre variáveis contínuas foram avaliadas por meio do coeficiente de correlação de postos de Spearman. Para controlar a taxa de falsa descoberta (FDR) nas análises multiplex de citocinas e de correlação, os valores de p foram ajustados utilizando o método de Benjamini–Hochberg com um limiar de q < 0,05. Bicaudal p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todas as análises primárias. Sempre que possível, os casos com dados ausentes em variáveis individuais foram mantidos e analisados por análise de casos completos para a variável afetada, enquanto imputações múltiplas usando equações encadeadas (m = 20) foram realizadas para conduzir análises de sensibilidade. Curvas de característica operacional do receptor e a área correspondente sob a curva (AUC) foram geradas para citocinas individuais utilizando o pacote pROC na coorte completa do estudo; uma coorte separada de validação externa não foi utilizada. Análises de sensibilidade pré-especificadas repetiram as comparações entre os grupos primários após a exclusão dos participantes que tinham recebido antibióticos nas 72 horas anteriores à broncoscopia, e após estratificar o grupo de infecção conforme o status de ventilação mecânica e o subtipo de pneumonia (adquirida na comunidade, adquirida no hospital ou associada à ventilação). As análises foram realizadas utilizando os pacotes rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC e mice no R v4.4. As figuras foram geradas utilizando software comercial de gráficos científicos (ver Tabela de Materiais).
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Resultados
Características da população e da amostra do estudo
Houve 112 indivíduos na coorte final de análise, sendo 64 indivíduos no grupo de infecção e 48 no grupo controle sem infecção. As características demográficas basais foram semelhantes entre os grupos, enquanto os parâmetros laboratoriais relacionados à infecção foram mais elevados no grupo de infecção, conforme mostrado na Tabela 1. As infecções foram causadas principalmente por bactérias Gram-negativas, send...
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Discussão
A robustez deste protocolo depende de algumas decisões tomadas antes e durante a análise. Estabelecer a taxa de recuperação mínima em 40% e combinar a segunda alíquota e as subsequentes foi uma decisão intencional, já que a primeira alíquota contém um enriquecimento maior de materiais das vias aéreas brônquicas, enquanto a taxa de recuperação varia sistematicamente com a idade, sexo, histórico de tabagismo e o brônquio-alvo18. O bloqueio de receptores Fc e a titulação de anticorpos contra clones i...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos sinceramente a todos os pacientes e voluntários que participaram deste estudo pela sua valiosa cooperação. Agradecemos com gratidão ao Comitê de Ética pela aprovação ética (Número de Aprovação 2026HL-038) e orientação normativa durante todo o processo de pesquisa.
Agradecemos à equipe médica do Departamento de Pneumologia, do Centro de Broncoscopia e do Laboratório Clínico pelo apoio na coleta de espécimes clínicos, no processamento de lavado broncoalveolar e na detecção microbiológica. Também agradecemos pelo apoio técnico da plataforma do laboratório central do hospital para experimentos de citometria de fluxo de alta dimensão e perfis multiplex de citocinas.
Esta pesquisa não recebeu nenhuma bolsa específica de agências financiadoras dos setores público, comercial ou sem fins lucrativos.
Agradecemos a todos os pesquisadores, técnicos e profissionais de enfermagem envolvidos neste projeto pelos seus esforços na triagem de pacientes, manejo de amostras, operação experimental e organização de dados.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-CD11b humano, Brilliant Violet 421, clone ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | Marcador de ativação de neutrófilos; canal do laser violeta URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-CD14 humano, APC/Cyanine7, clone M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | Marcador de exclusão de monócito-macrófago; canal do laser vermelho URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-CD15 humano, PE, clone HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | Marcador de linhagem de neutrófilos; canal do laser azul URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-CD16 humano, Brilliant Violet 510, clone 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | Marcador de maturação de neutrófilos e células NK; canal do laser violeta URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-CD45 humano, PerCP, clone HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | Marcador pan-leucocitário; canal do laser azul URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Anticorpo anti-CD66b humano, FITC, clone G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | Marcador de granulócitos; canal do laser azul URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-HLA-DR humano, PerCP/Cyanine5.5, clone L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | Marcador de células apresentadoras de antígeno; canal do laser azul URL: https://www.biolegend.com |
| Analisador hematológico automatizado (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | Instrumento (modelo XN-1000) | Utilizado para determinar a contagem total de células nucleadas para o cálculo absoluto de neutrófilos URL: https://www.sysmex.com |
| Albumina sérica bovina | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | Utilizada no tampão de marcação para citometria de fluxo (0,5% p/v em PBS com 2 mM EDTA) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| Pacote ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Projeto Bioconductor | v2.20 (código aberto) | Utilizado para mapas de calor de agrupamento hierárquico de dados multiplex de citocinas URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Citocentrífuga (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | Utilizada para preparar lâminas citológicas a partir de suspensão celular de LBA URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| Solução concentrada de lise de eritrócitos (BD FACS Lysing Solution, 10X) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | Utilizada para lise de eritrócitos após marcação de superfície URL: https://www.bdbiosciences.com |
| Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | Utilizado no tampão de marcação para citometria de fluxo na concentração de 2 mM URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| Corante viável fixável (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | Exclusão de células mortas antes do gateamento; canal do laser vermelho URL: https://www.biolegend.com |
| Broncoscópio flexível com vídeo | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Instrumento (modelo BF-1TQ290) | Utilizado para LBA com sedação moderada URL: https://www.olympus-global.com |
| Citômetro de fluxo multicolorido (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Instrumento (modelo CytoFLEX LX, configuração com seis lasers) | Utilizado para aquisição do painel de citometria de fluxo de sete marcadores para neutrófilos/monócitos URL: https://www.beckman.com |
| Software de análise de citometria de fluxo (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Utilizado para compensação e gateamento manual de arquivos FCS URL: https://www.flowjo.com |
| Pacote FlowSOM (R/Bioconductor) | Projeto Bioconductor | v2.12 (código aberto) | Utilizado para agrupamento por mapa auto-organizável e meta-agrupamento de dados de citometria de fluxo URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (software de análise e representação gráfica estatística) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | Utilizado para gerar as figuras finais URL: https://www.graphpad.com |
| Reagente bloqueador de receptor Fc humano (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | Bloqueio de receptor Fc antes da marcação com anticorpos URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| Pacote igraph (R) | CRAN | v2.0 (código aberto) | Utilizado para construir e visualizar o gráfico de rede de correlação URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Frascos criogênicos de baixa ligação proteica, 2,0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | Utilizados para alíquotas de sobrenadante de LBA para análise de citocinas URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Plataforma de imunoensaio multiplex baseada em microesferas magnéticas (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Instrumento (modelo MAGPIX) | Utilizada para aquisição do ensaio multiplex de citocinas URL: https://www.luminexcorp.com |
| Solução de corante May-Grünwald-Giemsa | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | Utilizada para contagem diferencial de células em citospin URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| Pacote mice (R) | CRAN | v3.16 (código aberto) | Utilizado para imputação múltipla por equações encadeadas na análise de sensibilidade URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| Painel multiplex magnético de citocinas/quimiocinas (13-plex, personalizado; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | Painel personalizado que mede os 13 analitos descritos na Seção 2.4 URL: https://www.merckmillipore.com |
| Peneira de malha de náilon, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | Utilizada para filtração mecânica de LBA para remover coágulos de muco URL: https://www.corning.com |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | Tampão base para ressuspensão e marcação celular URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Pacote pROC (R) | CRAN | v1.18 (código aberto) | Utilizado para gerar curvas ROC e valores de AUC URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (ambiente de computação estatística) | Equipe R Core | v4.4 (código aberto) | Plataforma para análises e visualizações estatísticas URL: https://www.r-project.org |
| Pacote rstatix (R) | CRAN | v0.7 (código aberto) | Utilizado para comparações entre grupos e estatísticas de correlação URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Pacote Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (código aberto) | Utilizado para incorporações t-SNE URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Controles de compensação com microesferas marcadas com um único corante (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | Utilizadas como controles de compensação monocromática URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| Solução de cloreto de sódio para injeção, 0,9% (solução salina estéril) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | Utilizada para instilação na LBA (100–150 mL, alíquotas de 20–40 mL a 37 °C) URL: https://www.baxter.com |
| Pacote uwot (R) | CRAN | v0.2 (código aberto) | Utilizado para redução de dimensionalidade UMAP URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (software de aquisição de ensaio multiplex e ajuste de curva) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Software proprietário do instrumento para ajuste de curva padrão 5PL URL: https://www.luminexcorp.com |
Referências
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