Sistema Óptico para Avaliação da Mecânica Atrial e Ventricular em Corações de Camundongo Perfundidos por Langendorff

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento para extração e cânulação do coração de camundongo, bem como o preparo e configuração do sistema de perfusão retrógrada Langendorff. A montagem experimental é acoplada a um sistema óptico de alta resolução projetado para avaliar as respostas mecânicas dos átrios e ventrículos, mantendo suas dinâmicas naturais.

Resumo

O coração de camundongo serve como um modelo amplamente utilizado na pesquisa cardiovascular, facilitado por avanços em tecnologias de engenharia. No entanto, a avaliação da contratilidade atrial e ventricular permanece desafiadora devido ao pequeno tamanho do coração de camundongo. Este estudo apresenta uma nova metodologia para avaliar a contratilidade e a frequência cardíaca em um coração isolado e intacto. O uso de um coração de camundongo perfundido pelo método Langendorff em combinação com um sistema óptico de alta resolução permite a avaliação da contratilidade atrial e ventricular. A montagem experimental supera os desafios associados ao pequeno tamanho do coração e às altas taxas de contração, ao mesmo tempo que obtém sinais de alta resolução. A sincronização entre a frequência de estímulo e a frequência de contração cardíaca na faixa de 420 a 660 batimentos por minuto (bpm) foi consistente com os resultados obtidos pelo método auxotônico. Além disso, medições do encurtamento ventricular e dos sinais dinâmicos atriais permitem a determinação da contração átrio-ventricular. Este método é adequado para avaliar a contratilidade e a frequência cardíaca em um coração isolado e intacto, sem influências farmacológicas ou sistêmicas. Esses resultados demonstram que o sistema óptico permite a medição das respostas de encurtamento ventricular e atrial.

Introdução

Há muito a descobrir na fisiologia cardíaca; processos fundamentais, como a geração do ritmo cardíaco e o acoplamento excitação-contração, são princípios centrais que estão em constante investigação¹. Embora os efeitos do ruído biológico na contratilidade cardíaca² e na atividade de marca-passo permaneçam pouco compreendidos¹, novos métodos de imagem óptica permitiram a apresentação de novos paradigmas^3,4.

Duas metodologias experimentais utilizando o sistema Langendorff contribuíram de forma inestimável para a medição da função cardíaca. Primeiro, o método de contração isovolumétrica, no qual um sinal é obtido por meio de um pequeno balão inserido no ventrículo esquerdo^5,6,7. Segundo, o método de registro auxotônico, no qual um sinal é obtido suturando uma das extremidades de um fio ao ápice do coração e a outra extremidade a um dispositivo mecânico de registro, para medir contrações auxotônicas ao longo do eixo do coração^2,8. No entanto, avaliar a contratilidade atrial e ventricular no coração de camundongo é desafiador devido ao seu tamanho diminuto. Além disso, o preparo exige certo grau de delicadeza, já que o coração é suscetível a lesões^{9,10,11,12,13}.

O sistema óptico para avaliar a dinâmica mecânica de corações de camundongos possui várias características e vantagens inovadoras. Primeiramente, este método é adequado para avaliar a contratilidade e a frequência cardíaca em um coração intacto e isolado, na ausência de influências farmacológicas ou sistêmicas. O protocolo também pode ser efetivamente empregado em experimentos que avaliam lesão por isquemia-reperfusão ao investigar tratamentos baseados em abordagens farmacológicas, regeneração celular ou terapia com oxigênio.

Neste artigo, apresentamos um protocolo para registrar parâmetros biofísicos da função contrátil do coração de camundongo utilizando um sistema óptico de alta resolução. Este método auxilia na avaliação da contratilidade e da frequência cardíaca em um coração isolado e intacto. Além disso, permite a avaliação da contratilidade atrial e ventricular. O preparo Langendorff de coração de camundongo apresenta um aperfeiçoamento que inclui uma leve modificação para minimizar a perda de temperatura do perfusato e artefatos de movimento, sem inibir as contrações musculares.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as Regulamentações Federais para Experimentação e Cuidados com Animais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais do CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., México). Neste estudo, utilizam-se camundongos machos C57BL/6J, pesando 28–34 g e com idade entre 8 e 14 semanas. Todos os materiais e equipamentos utilizados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Os Arquivos Suplementares 1–11 fornecem diagramas complementares, guias de software, programas de análise, dados de estimulação cardíaca e arquivos de aplicação para o protocolo.

1. Preparação do estoque

1. Prepare previamente duas soluções estoque e armazene-as em geladeira a 4 °C: (1) Estoque I, 1 L (em água desionizada; em g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl₂(6H₂O), 0,4 NaH₂PO₄) e (2) Estoque II, 0,1 L (em água desionizada; em g/L: 73,5 CaCl₂(2H₂O)).
   NOTA: As soluções podem ser utilizadas por até 30 dias após a preparação. Armazene-as a 4 °C.

2. Conexão ao sistema Langendorff e limpeza

1. Conecte o reservatório (1), banho térmico do reservatório (2), bomba de perfusão (3), serpentina (4), recirculador da serpentina (5), sistema de monitoramento (6) e sistema de drenagem (8), conforme mostrado na Figura 1A.
   NOTA: A conexão entre o sistema de monitoramento e o sistema de drenagem é mostrada em maior detalhe no Arquivo Suplementar 1.
2. Encha o sistema Langendorff com 1 L de água deionizada a 50 °C, em seguida, inicie as bombas de perfusão e de drenagem (Arquivo Suplementar 1, sistema de drenagem). Após aproximadamente 20–30 min, remova o líquido do sistema e prossiga para o próximo passo.
   NOTA: Verifique se há vazamentos ou quedas de pressão no sistema. Caso isso ocorra, não prossiga com o experimento.
3. Encha o sistema com 1 L de ácido acético a 1% (dissolvido em água deionizada), em seguida, desligue as bombas de perfusão e de drenagem e aguarde 60 min; depois, ligue as bombas para remover o líquido.
4. Repita o passo 2.2 duas vezes.
5. Encha o sistema com etanol a 70% (dissolvido em água deionizada) para prevenir a adesão dos componentes da solução.
   NOTA: O sistema de perfusão Langendorff deve ser limpo a cada dez experimentos ou mensalmente. O protocolo de limpeza antes do experimento é explicado na seção 4. Já o protocolo de limpeza após o experimento é detalhado na seção 8.

3. Preparação da solução de Tyrode durante o experimento

1. Prepare 1 L de solução em mM: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl₂(6H₂O), 0,33 NaH₂PO₄, 1,8 CaCl₂(2H₂O), 10 D-glucose, 10 HEPES, ajustado para pH 7,35 ± 0,05 com NaOH.
   1. Misture 100 mL do Estoque I com 700 mL de água desionizada sob agitação constante, em seguida eleve a temperatura da solução para 37 °C; mantenha a oxigenação da solução conectando o cilindro de O₂ à pedra de ar, conforme mostrado na Figura 1A (1).
   2. Adicione 3,6 mL do Estoque II e 96,4 mL de água desionizada para obter 1,8 mM de CaCl₂(2H₂O), em seguida adicione NaOH para ajustar o pH a 7,35 ± 0,05.
   3. Complete com água desionizada até obter 1 L de solução de Tyrode.
      NOTA: Recomenda-se armazenar 100 mL da solução na geladeira a 4 °C; este volume será necessário posteriormente na etapa 6.

4. Preparação do sistema Langendorff

OBSERVAÇÃO: Se o sistema Langendorff não estiver preenchido com etanol no dia do experimento, não é recomendado prosseguir com o procedimento; em vez disso, repita a seção 2.

1. Ligue as bombas de perfusão e drenagem. Ajuste a taxa de fluxo da bomba de perfusão para 3 mL/min e da bomba de drenagem para 10 mL/min. Drene o sistema.
2. Encha o sistema com 1 L de água deionizada a 37 °C e, em seguida, drene a água.
3. Encha o sistema com a solução de Tyrode preparada no passo 3 e mantenha a solução à temperatura fisiológica e com oxigenação constante.
4. Ligue os banhos térmicos do reservatório e o recirculador serpentinado. Ajuste a temperatura do reservatório (Figura 1A (2)) para 38 °C para manter a solução em condições fisiológicas. Ajuste a temperatura do serpentinado (Figura 1A (5)) para 40 °C. Isso compensa a perda de temperatura na solução do sistema Langendorff.
   NOTA: Se a temperatura da solução de Tyrode na saída do sistema não estiver fisiológica (37 ± 0,5 °C), ajuste a temperatura do recirculador serpentinado. Não é recomendado prosseguir para o passo 6 até que a temperatura tenha se estabilizado no valor adequado.
5. Ligue o monitor de pressão (Arquivo Suplementar 1, sistema de monitoramento) e calibre na faixa de 0–200 mmHg. O aplicativo de monitoramento e estimulação está disponível para auxiliar na calibração do sistema (Arquivo Suplementar 3 e Arquivo Suplementar 11).
   NOTA: É essencial verificar se não há perda de pressão nem bolhas no sistema. Se houver bolhas no sistema, bloqueie temporariamente a saída inferior do serpentinado e abra a válvula superior; isso fará com que a coluna se encha, permitindo que as bolhas sejam liberadas para o exterior. Não é recomendado prosseguir com o experimento até que esta condição tenha sido verificada.

5. Sistema óptico¹⁴

1. Monte a câmera CMOS (Figura 1A, 10), a lente ajustável da câmera (LC) e o sistema de iluminação.
   NOTA: O sistema de iluminação é composto por dois LEDs (Figura 1A, 9), duas lentes de iluminação plano-convexas (LI), um controle de iluminação (Figura 1A, 11), uma placa de aquisição (Arquivo Suplementar 1, sistema de monitoramento) e peças de suporte projetadas em 3D (Arquivo Suplementar 1).
2. Posicione um objeto de referência com volume aproximado de 1.000 mm³ a uma distância de 100–200 mm da lente da câmera (centro da Figura 1A).
   NOTA: O objeto deve ser posicionado na posição correspondente ao coração no sistema Langendorff. Essa posição pode ser observada na Figura 1B, especificamente no centro da imagem onde os feixes de luz incidem.
3. Inicie o software de aquisição da câmera e configure a câmera com subamostragem de 4x (4 pixels = 1 subpixel). Defina uma região de interesse (ROI) de 200 x 200 subpixels (Arquivo Suplementar 2).
   NOTA: Com essa configuração, é possível alcançar uma resolução temporal de 750 quadros por segundo (fps).
4. Ligue o sistema de iluminação (Arquivo Suplementar 1), ajuste os feixes de luz para focalizá-los no objeto de referência e obtenha uma iluminação homogênea (Figura 1B).
5. Ajuste a intensidade da luz no objeto de referência para evitar superexposição da imagem.
   NOTA: A imagem deve se assemelhar à Figura 2A (ou Figura 1C, PC do controlador). Os reflexos na superfície do objeto (coração) devem ser reduzidos ao máximo sem perder a definição do seu contorno. Isso pode ser feito ajustando a potência do controle de iluminação ou reduzindo o tempo de exposição nas configurações da câmera.
6. Focalize a lente da câmera para obter uma imagem nítida do objeto de referência (Figura 1C, PC do controlador). Certifique-se de que o objeto de referência ocupe 80% do campo de visão (Figura 2A) para obter uma escala de conversão de aproximadamente 61 µm por subpixel.
   NOTA: O sistema óptico ativa automaticamente o sistema de iluminação quando a câmera é configurada para o modo de aquisição (Figura 1A e Arquivo Suplementar 2). Recomenda-se manter a câmera em modo de espera para que o sistema de iluminação permaneça desligado, ativando-o apenas durante os períodos de coleta de dados experimentais, a fim de evitar superaquecimento.

6. Procedimentos cirúrgicos e de cânulação

1. Heparinização e anestesia
   1. Prepare uma mistura anestésica contendo tiletamina-zolazepam (40 mg/kg de peso corporal do camundongo) e xilazina (10 mg/kg de peso corporal do camundongo), depois dilua para 200 µL com solução salina.
   2. Administre a mistura anestésica por via intraperitoneal usando uma agulha de 27 G. Aguarde até que o camundongo entre em anestesia profunda.
      NOTA: Verifique a ausência de reflexo em resposta a um estímulo nas patas ou na cauda (geralmente, 10 min é suficiente).
   3. Administre 200 UI de heparina não fracionada por via intraperitoneal usando uma agulha de 27 G e aguarde aproximadamente 5 min antes de prosseguir com o experimento.
2. Extração e cânulação
   1. Posicione o camundongo em decúbito dorsal, remova os pelos e a pele da região torácica com tesoura cirúrgica.
   2. Realize uma incisão abdominal abaixo do diafragma, tomando cuidado para manter sua integridade.
   3. Continue com uma incisão transversal no diafragma e realize rapidamente uma toracotomia bilateral ascendente através das costelas, depois remova a parede torácica.
      NOTA: Tendo cuidado para não danificar o coração. Caso o coração seja comprometido ou danificado durante o procedimento, recomenda-se não prosseguir com o experimento.
   4. Segure suavemente as estruturas superiores do coração com pinça fina, o arco aórtico e os vasos adjacentes. Levante suavemente para fazer um corte por baixo e para cima, e remova juntos o coração e os pulmões.
   5. Transfira rapidamente o coração para uma placa de Petri contendo 50 mL de solução de Tyrode a 4 °C para uma lavagem inicial.
      NOTA: A partir do momento em que o diafragma é incisado, o animal começará a apresentar dificuldade respiratória; a partir desse ponto, há uma janela de 60 s para realizar os passos 6.2.3–6.2.6. Exceder esse limite de tempo pode induzir danos isquêmicos.
   6. Remova os pulmões e o tecido adiposo em excesso para expor o arco aórtico usando um microscópio estereoscópico e tesoura fina.
      NOTA: Durante a limpeza do tecido, assegure-se de não danificar o arco aórtico. Se a aorta for cortada abaixo da artéria braquiocefálica, a cânulação será difícil, podendo levar a vazamentos de pressão.
   7. Transfira o coração para a base personalizada de cânulação contendo 50 mL de tampão Tyrode a 4 °C e insira a extremidade aórtica na cânula feita sob medida a partir de uma agulha de 20 G (Arquivo Suplementar 1).
      NOTA: Tenha cuidado para não danificar a válvula aórtica. Se a válvula for comprometida, o coração inchará e a circulação coronariana não será adequadamente lavada.
   8. Amarrar dois nós de cânulação usando fio de seda 4/0: o primeiro na reentrância distal à ponta da cânula e o segundo antes do tronco braquiocefálico (Arquivo Suplementar 1).
   9. Aplicar lentamente a solução de Tyrode usando uma seringa de 1 mL preenchida com tampão à temperatura ambiente. Verifique se o tecido coronariano clareia para confirmar uma boa cânulação.
   10. Remova o tecido adiposo para permitir o acesso aos ventrículos e átrios.
       NOTA: Evite exceder 5 min de cânulação para preservar a viabilidade do coração.
   11. Transfira o coração para um sistema Langendorff e permita que se estabilize por 30 min.
       NOTA: O coração é posicionado no centro do sistema (Figura 1A,B), suspenso verticalmente. Ao pendurar o coração, tenha extremo cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. Se isso ocorrer, a pressão aumentará acima de 140 mmHg, o coração começará a inchar e não será mais viável.
       NOTA: A montagem Langendorff está completa quando o coração exibe uma resposta mecanicamente estável, uma frequência de oscilação natural de aproximadamente 360 batimentos por minuto (BPM) e uma pressão de perfusão entre 60 e 110 mmHg.

7. Protocolo de estimulação e gravação em vídeo

1. Viabilidade cardíaca
   1. Verifique se a pressão coronariana está na faixa de 60–110 mmHg com uma bomba de perfusão de 3 mL/min. Se a pressão de perfusão coronariana cair abaixo de 60 mmHg, aumente ligeiramente a taxa de fluxo da bomba de perfusão (baixa pressão fará com que o coração fique pálido e flácido). Por outro lado, se a pressão exceder 110 mmHg, diminua ligeiramente a taxa de fluxo da bomba (pressão excessiva induzirá edema tecidual e aumento progressivo da pressão até ocorrer a parada cardíaca).}
      NOTA: Manter a pressão de perfusão fora da faixa ótima mencionada por um período prolongado comprometerá irreversivelmente a viabilidade cardíaca.
   2. Posicione o coração em posição frontal para obter uma visão completa de frente pela câmera. Ajuste a posição para que ambos os átrios sejam visíveis na câmera (Figura 2A).
   3. Coloque suavemente os eletrodos de platina superficialmente no topo do átrio direito, no nó do marcapasso. Use a imagem da câmera como guia para posicionar os eletrodos no campo de visão. Posicione o eletrodo de modo que não obstrua o átrio direito. Enquanto monitora a visualização ao vivo da câmera, avance lentamente o eletrodo até que entre em contato com o tecido atrial, tomando cuidado para não exercer compressão excessiva (o que achataria o átrio direito na imagem).
      NOTA: Se realizado corretamente, a visão da câmera será semelhante à Figura 2A.
   4. Inicie o aplicativo de monitoramento e estimulação cardíaca (Arquivo Suplementar 11) e ligue a placa de aquisição (Figura 1A (6)). Defina os parâmetros do estímulo: amplitude em 2 V, frequência em 420, 540 e 720 pulsos por minuto (PPM) com pulso quadrado de ciclo de trabalho de 7 ms (inseto da Figura 2A).
   5. Aplique as estimulações de viabilidade começando com a frequência mais baixa, utilizando uma duração de estimulação de 20 s, seguida por um período de recuperação de 20 s (tempo de repouso) entre os eventos.
      NOTA: Avalie a viabilidade cardíaca por meio do monitoramento pela câmera. Se o órgão for funcional fisiologicamente, será observada uma sincronização entre o estímulo aplicado e a resposta cardíaca, acompanhada de coordenação adequada entre as câmaras cardíacas. Por outro lado, a falta de viabilidade se manifestará pela perda da coordenação entre as câmaras ou pela presença exclusiva de contrações atriais isoladas.
   6. Feche a porta da câmara, pois o experimento é sensível à luz ambiente e às flutuações térmicas (Figura 1C).
      NOTA: A porta da câmara deve permanecer fechada durante todo o tempo experimental. Monitore a viabilidade cardíaca pela câmera e pela pressão de perfusão.
2. Gravação de dados
   1. Aplique o protocolo de estimulação, que consiste em trens de pulsos quadrados de 30 s de duração, seguidos por 30 s sem sinal. Defina os parâmetros do estímulo em cada trem de estimulação: amplitude de 2 V, ciclo de trabalho de 7 ms e frequência na faixa de 360 a 720 PPM.
      NOTA: O protocolo de estimulação começa em 360 PPM e aumenta em 60 PPM em cada ponto temporal (inseto da Figura 2A).
   2. Grave continuamente vídeos da dinâmica da visão frontal do coração no formato .avi usando o software de aquisição da câmera (Arquivo Suplementar 2). Faça uma gravação de vídeo de 20 s para cada trem de estimulação. Grave o segmento de 20 s iniciando 5 s após o início da estimulação. Um exemplo de gravação bruta é fornecido no Filme Suplementar 1.
      NOTA: Um computador grava simultaneamente o trem de estimulação aplicado (.xls, Arquivo Suplementar 9) para cada vídeo gravado (.avi), gerados pelo aplicativo de monitoramento e estimulação e pelo software de aquisição da câmera, respectivamente (Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3).
   3. Verifique a viabilidade cardíaca comparando o primeiro vídeo, gravado antes de iniciar o protocolo de estimulação, com o segundo vídeo, gravado após a aplicação do protocolo (Figura 2B).

8. Limpeza do sistema de perfusão Langendorff após o experimento

1. Remova os estímulos e os eletrodos de platina para ECG. Retire o coração do sistema e drene todas as soluções residuais de Tyrode.
2. Desligue o sistema óptico e feche a válvula de O₂.
3. Lave o sistema com 1 L de água desionizada a 37 °C e drene o sistema.
4. Repita os passos 2.4 e 2.5.
5. Desligue todos os sistemas e equipamentos.

9. Processamento de vídeo

1. Inicie importando cada vídeo para um software computacional e aplicando uma função de normalização de vídeo¹⁵.
2. Selecione uma região de interesse (ROI) que inclua a área do coração. Realize segmentação de imagem para remover ruídos de fundo, eletrodos e a cânula (Arquivo Suplementar 4).
   NOTA: Para selecionar corretamente a área da imagem a ser removida, consulte o Arquivo Suplementar 10.
3. Realize uma análise global da dinâmica mecânica (Arquivo Suplementar 5). Exemplos de variabilidade e sinais são apresentados na Figura Suplementar S1, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3.
   1. Aplique operadores morfológicos a cada quadro do vídeo para detectar o perímetro do coração, em seguida, aplique um algoritmo de preenchimento de quadro para gerar uma máscara¹⁵.
   2. Conte os pixels dentro da área segmentada em cada quadro e normalize essa contagem pelo número total de pixels da imagem para produzir um sinal dinâmico (inseto em Figura 2B e Figura Suplementar S3).
   3. Aplique um filtro Butterworth bidirecional de 5ª ordem entre 3 e 100 Hz ao sinal obtido para suprimir ruídos de alta frequência e artefatos provocados por gotejamento da perfusão¹⁵.
   4. Normalize os sinais em todos os vídeos utilizando os valores máximos e mínimos registrados.
   5. Determine a frequência cardíaca calculando o intervalo entre dois valores de amplitude máxima (IAA (s)) para cada sinal dinâmico e de estímulo.
   6. Obtenha a frequência em BPM com a seguinte fórmula:
      
   7. Gere mapas de Poincaré a partir dos dados de IAA para ilustrar a variabilidade em períodos curtos e longos^16,17,18 (Figura Suplementar S1 e Figura Suplementar S2).
      NOTA: Para obter informações mais detalhadas, consulte o Arquivo Suplementar 10.
4. Realize uma análise segmentar da dinâmica mecânica ventricular (Arquivo Suplementar 6).
   1. Aplique binarização da imagem. Use operadores morfológicos para delimitar a área ventricular, ajustando-a a uma geometria elíptica sem comprometer a ROI¹⁵.
   2. Ajuste uma elipse mínima à área ventricular em cada quadro. Extraia as coordenadas de um conjunto de pontos distais em um quadro. Utilize um conjunto de 10–20 pontos em cada extremidade ao longo do eixo Y (Figura 3A). Uma saída representativa da estimativa da elipse é fornecida no Vídeo Suplementar 2.
   3. Calcule o encurtamento ventricular como a distância média entre os pontos extremos ao longo do eixo Y em cada vídeo¹⁹.
   4. Aplique um filtro Butterworth bidirecional de 5ª ordem entre 3 e 100 Hz ao sinal obtido para suprimir ruídos de alta frequência e artefatos provocados por gotejamento da perfusão¹⁵.
   5. Normalize o sinal de encurtamento ventricular em relação a todos os vídeos obtidos para cada estimulação e calcule a frequência cardíaca e o atraso conforme os passos 9.3.5–9.3.6.
      NOTA: Parâmetros como duração do ciclo ventricular (DVE), duração da relaxação (DVW), intervalo interventricular (IVV) e amplitude ventricular (VA) são obtidos (Figura 3A).
      NOTA: Para obter informações mais detalhadas, consulte o Arquivo Suplementar 10.
5. Realize uma análise segmentar da dinâmica mecânica das aurículas (Arquivo Suplementar 7).
   1. Utilize duas ROIs para delimitar as aurículas (Figura 3C).
   2. Analise cada aurícula individualmente.
      1. Use operadores morfológicos para delinear as aurículas, ajustando-as sem comprometer a ROI¹⁵. Utilize um algoritmo de aumento de contraste para delinear cada aurícula^20,21.
      2. Aplique binarização da imagem e quantifique o número de pixels diferentes de zero por quadro para obter um sinal dinâmico auricular.
      3. Aplique um filtro Butterworth bidirecional de 5ª ordem entre 3 e 100 Hz aos sinais obtidos para suprimir ruídos de alta frequência e artefatos provocados por gotejamento da perfusão¹⁵.
      4. Calcule a média dos dois sinais auriculares (Figura 3D).
   3. Normalize o sinal de encurtamento auricular em relação a todos os vídeos obtidos para cada estimulação e calcule a frequência cardíaca e o atraso conforme os passos 9.3.5–9.3.6.
      NOTA: Parâmetros como duração do ciclo auricular (DAE), intervalo aurícula-aurícula (IAT) e amplitude auricular (AA) são obtidos (Figura 3D). Para obter informações mais detalhadas, consulte o Arquivo Suplementar 10.
6. Realize uma análise eletromecânica^13,22 (Arquivo Suplementar 8).
   1. Compare os dados de estimulação com os sinais auriculares e ventriculares (Figura 3D).
   2. Calcule o tempo de propagação no sistema de condução cardíaca, obtendo o atraso entre os eventos auriculares e ventriculares (AVD), tomando como referência o estímulo aplicado.

Resultados

Os experimentos de função mecânica cardíaca são realizados utilizando o aparelho de Langendorff, conforme mostrado na Figura 1A (Superior). Os sistemas de monitoramento e óptico permitem a gravação de vídeo quando o controle de iluminação é acionado, conforme ilustrado na Figura 1A (Inferior). A Figura 1C mostra a vista externa do gabinete com controle térmico, projetado para manter o coração isolado de flutuações térmicas e luminosas do ambiente. Conforme representado na Figura 1B, o coração isolado é posicionado como objeto de referência na montagem experimental, composta pelos sistemas de Langendorff, óptico e de estimulação.

Conforme mostrado na Figura 2A, o coração isolado foi posicionado para obter uma visão frontal clara das aurículas e ventrículos sob perfusão retrógrada. O uso da base de drenagem (Arquivo Suplementar 1, sistema de drenagem) foi essencial para atenuar artefatos de movimento gerados pelo gotejamento do fluido de perfusão e para estabilizar os sinais adquiridos. Os protocolos de estimulação consistiram em trens de pulsos (2 V, 7 ms) em frequências variando de 360 a 720 bpm, cada um com duração de 30 s.

O sistema óptico registra alterações na área do coração (HA). Esse sinal dinâmico também permite obter o intervalo de tempo entre picos (IAA) (inseto na Figura 2B). A viabilidade do modelo foi avaliada comparando a frequência cardíaca média antes (Início) e após (Fim) o protocolo de estimulação em uma coorte de n = 6 corações. Não houve diferenças significativas nas frequências cardíacas médias (Início: 385 ± 38 BPM vs. Fim: 372 ± 18 BPM, teste t de Student P > 0,05), indicando que o procedimento experimental não afetou a função cardíaca (Figura 2B).

A Figura 2C apresenta a resposta de frequência do coração a sete frequências de estimulação diferentes, demonstrando uma relação linear clara² (R2 = 0,98 ± 0,01, modo 1:1). O valor mínimo de marcação é limitado pelas características fisiológicas do camundongo (360 bpm)^22,23. O coração perfundido por Langendorff exibe um perfil taquicárdico. Estímulos de marcação representativos e as respostas correspondentes são mostrados nos insetos da Figura 2C.

Posteriormente, para avaliar a dinâmica das câmaras cardíacas, são implementadas técnicas específicas de segmentação. Os parâmetros do encurtamento ventricular foram obtidos a partir de gravações ópticas (Figura 3A). O inseto na Figura 3A mostra o encurtamento ventricular normalizado. A partir desse sinal dinâmico, quatro parâmetros são obtidos: amplitude do encurtamento ventricular (VA), intervalo de tempo entre contrações ventriculares (IVV), duração da contração ventricular (DVE) e duração do relaxamento ventricular (DVW).

Figura 3B mostra a amplitude do encurtamento ventricular para sete valores de estimulação. As barras azuis representam este estudo. As barras laranjas correspondem aos dados obtidos com o método de registro auxotônico². Foi aplicada uma análise estatística utilizando ANOVA de dois fatores seguida pelo teste de Sidak. A amplitude do encurtamento ventricular (VA) para os valores mais altos de estimulação, 600 PPM e 660 PPM, aumenta significativamente (P < 0,05*, P < 0,005**), respectivamente. VA (ref. 15 vs. 360 P > 0,05, ref. 15 vs. 420 P > 0,05, ref. 15 vs. 480 P > 0,05, ref. 15 vs. 540 P > 0,05, ref. 15 vs. 600 P < 0,005, ref. 15 vs. 660 P < 0,05, ref. 15 vs. 720 P > 0,05).

Para obter a área atrial, são implementadas técnicas específicas de segmentação (Figura 3C). Uma ROI é definida em cada átrio. Figura 3D mostra o sinal médio atrial e o encurtamento ventricular. A partir desse sinal dinâmico, dois parâmetros são obtidos: amplitude atrial (AA) e o intervalo de tempo entre contrações atriais (IAT). Ao comparar os sinais ventricular e atrial, obtém-se o atraso entre os eventos atriais e ventriculares (AVD).

Figura 1. Configuração experimental para o coração isolado Langendorff e sistema óptico montado em uma cabine. (A) Diagrama esquemático do sistema de perfusão Langendorff em fluxo constante e retrogrado acoplado a um sistema óptico. O sistema Langendorff (superior) inclui: (1) um reservatório contendo solução de Tyrode continuamente oxigenada. A temperatura do perfusato é mantida a 37 °C por meio de (2) um banho térmico e (5) um recirculador serpentinado. (3) Uma bomba de perfusão peristáltica garante um fluxo constante de 3 mL/min. (8) Um sistema de drenagem remove a solução. (4) A serpentina de resfriamento atua como trocador de calor e como armadilha de bolhas. O monitoramento da pressão e as aplicações de estimulação elétrica são controlados por (6) o sistema de monitoramento. O sistema óptico (inferior) inclui a sincronização entre (11) o controle de iluminação, (10) a câmera de alta velocidade com lente telecentricidade e duas fontes de luz (LEDs). A lente da câmera permite foco manual em uma faixa de 100–200 mm. (9) Dois LEDs, acoplados a uma lente plano-convexa (LI), iluminam o coração de forma homogênea. Os dados de estimulação são registrados utilizando o aplicativo de monitoramento e estimulação (Arquivo Suplementar 11). (7) O PC controlador está conectado à câmera e ao aplicativo de monitoramento e estimulação para registrar simultaneamente os dados (vídeo e estimulação elétrica). (B) Vista interna da cabine. A posição vertical do coração é mostrada por meio do objeto de referência. Outros elementos do aparelho Langendorff são exibidos. (C) Vista externa da cabine. A cabine é termicamente isolada, e as paredes interna e externa pretas minimizam reflexões e luz ambiente. É mostrado o computador que executa os aplicativos de monitoramento e aquisição de vídeo. Abreviações: LC = lente telecentricidade; LEDs = diodos emissores de luz; LI = lente de iluminação; PC = computador pessoal. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2. Coração de camundongo montado e validação do sistema óptico. (A) Vista frontal do coração mostrando átrios, ventrículos, eletrodos de estimulação e de ECG. A imagem corresponde a um quadro com estimulação de 420 bpm (Vídeo Suplementar 1). O quadro interno mostra a estimulação aplicada. O vídeo foi adquirido entre 5 e 25 s do protocolo de estimulação. (B) Teste de viabilidade cardíaca. Dois vídeos são registrados para obter a frequência de oscilação, um antes e outro após a aplicação do protocolo de estimulação. A frequência de resposta é calculada. O teste t de Student foi aplicado (P > 0,05). A diferença entre os grupos não é significativa. Os dados são apresentados como valores médios ± desvio padrão (n = 6). O quadro interno mostra a área cardíaca (HA) obtida no passo 9.3 do protocolo e a estimulação aplicada. (C) Resposta da frequência cardíaca à estimulação aplicada. As barras azuis indicam a resposta cardíaca a sete valores de estimulação (R2 = 0,98 ± 0,01). As barras laranja correspondem aos dados relatados por Peña-Romo². O quadro interno mostra traçados típicos de resposta. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de dois fatores seguida pelo teste de Sidak. A diferença entre os grupos não é significativa (P > 0,05). Os dados são apresentados como valores médios ± desvio padrão (n = 6). Abreviações: ANOVA = análise de variância; BPM = batimentos por minuto; ECG = eletrocardiograma; HA = área cardíaca; PPM = pulsos por minuto. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3. Análise da resposta mecânica atrial e ventricular. (A) Encurtamento ventricular. A imagem corresponde a um quadro com estimulação de 420 bpm (Filme Suplementar 1). Uma elipse vermelha permite a estimativa do encurtamento ventricular (VS) (Filme Suplementar 2). O VS é calculado pela média dos valores máximos e mínimos ao longo de um conjunto de 10–20 linhas ao longo do eixo maior (NV; linhas laranja). O encurtamento ventricular normalizado é mostrado no inseto. Um conjunto de parâmetros pode ser obtido: duração do encurtamento (DVE), duração da relaxação (DVW), intervalo de tempo entre contrações ventriculares (IVV) e amplitude do encurtamento ventricular (VA). (B) A amplitude da resposta cardíaca, VA em função da estimulação, é apresentada. As barras azuis representam este estudo. As barras laranja correspondem a dados obtidos com o método de registro auxotônico². Foi aplicada análise estatística utilizando ANOVA de dois fatores seguida pelo teste de Sidak. A amplitude do encurtamento ventricular (VA) para valores mais altos de estimulação, 600 PPM e 660 PPM, aumenta significativamente (P < 0,05*, P < 0,005**), respectivamente. VA (ref. 15 vs. 360 P > 0,05, ref. 15 vs. 420 P > 0,05, ref. 15 vs. 480 P > 0,05, ref. 15 vs. 540 P > 0,05, ref. 15 vs. 600 P < 0,005, ref. 15 vs. 660 P < 0,05, ref. 15 vs. 720 P > 0,05). Os dados são apresentados como valores médios ± desvio padrão (n = 6). (C) Segmentação atrial. A imagem corresponde a um quadro com estimulação de 420 bpm (Filme Suplementar 1). A imagem ilustra as regiões de interesse aplicadas ao átrio direito (círculo amarelo) e ao átrio esquerdo (círculo azul). O sinal mecânico atrial é obtido pela média de ambas as ROI. (D) Dinâmica atrial e ventricular. A área atrial média (linha preta), o encurtamento ventricular (linha azul) normalizado e a estimulação (linha vermelha) a 420 bpm são mostrados. Um conjunto de parâmetros pode ser obtido: o intervalo de tempo entre contrações atriais (IAT), amplitude atrial média (AA) e atraso átrio-ventricular (AVD). Abreviações: AA = amplitude atrial; ANOVA = análise de variância; AVD = atraso átrio-ventricular; DVE = duração do encurtamento ventricular; DVW = duração da relaxação ventricular; IAT = intervalo átrio-átrio; IVV = intervalo interventricular; NV = número de linhas ventriculares; PPM = pulsos por minuto; ROI = região de interesse; VA = amplitude do encurtamento ventricular; VS = encurtamento ventricular. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Filme Suplementar 1. Vídeo sob estimulação de 420 PPM. Gravação de um coração de camundongo isolado capturada com resolução espacial de 200 x 200 subpixels e resolução temporal de 750 fps. Abreviações: fps = quadros por segundo; PPM = pulsos por minuto.Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme Suplementar 2. Vídeo representativo da estimativa da elipse para encurtamento ventricular. Demonstração do algoritmo de segmentação utilizando a gravação do Filme Suplementar 1, reamostrada a 75 fps. Abreviação: fps = quadros por segundo.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S1. Análise da variabilidade dos intervalos da área cardíaca. (A) Estado basal sem estimulação, (B) 360 PPM, (C) 420 PPM e (D) 480 PPM. A variabilidade de curto e longo prazo foi calculada como a dispersão em relação à média dos dados, conforme mostrado pela elipse vermelha. Abreviações: IAA = intervalo da área cardíaca; PPM = pulsos por minuto; SD1 = variabilidade de curto prazo; SD2 = variabilidade de longo prazo.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S2. Análise da variabilidade dos intervalos de área cardíaca. (A) 540 PPM, (B) 600 PPM, (C) 660 PPM e (D) 720 PPM. A variabilidade de curto e longo prazo foi calculada como a dispersão em relação à média dos dados, indicada pela elipse vermelha. Abreviaturas: IAA = intervalo de área cardíaca; PPM = pulsos por minuto; SD1 = variabilidade de curto prazo; SD2 = variabilidade de longo prazo.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S3. Gráfico temporal dos sinais normalizados obtidos a partir da dinâmica contrátil. O estímulo aplicado foi de 420 PPM (vermelho), e as respostas incluem a área global do coração (preto), encurtamento ventricular (azul) e dinâmica da área atrial (amarelo). Abreviação: PPM = pulsações por minuto.Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivos Suplementares 1–11. Algoritmos e documentação técnica. Pasta compactada contendo: 1) Imagens e especificações das peças impressas em 3D. 2) Guias detalhados para o software de aquisição de imagens. 3) Guias detalhados para os aplicativos de monitoramento e estimulação. 4) Programa computacional para normalização e segmentação de vídeos (passos 9.1–9.2). 5) Programa computacional para calcular a mecânica global do coração (passo 9.3). 6) Programa computacional para o cálculo segmentado da mecânica ventricular (passo 9.4). 7) Programa computacional para segmentação da mecânica das aurículas (passo 9.5). 8) Programa computacional para calcular o atraso átrio-ventricular (passo 9.6). 9) Estimulação elétrica aplicada ao Filme Suplementar 1. 10) Guia detalhado sobre o funcionamento dos programas computacionais (Arquivos 4–7). 11) O aplicativo de monitoramento e estimulação. Além disso, há cinco funções externas (AumCont, filterPeaks, FucCordenada, FucMaskIm, FucPoincare) necessárias para o funcionamento dos programas computacionais.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O coração de camundongo é muito sensível a variações de temperatura^2,9,10,11,22. Neste experimento, o coração perfundido foi posicionado verticalmente. Incluímos uma pequena modificação para minimizar a perda de temperatura do perfusato e artefatos de movimento no método de perfusão Langendorff. Uma bomba de recirculação foi adicionada ao serpentino para minimizar a perda de temperatura do perfusato a 37 ± 0,5 °C, e uma base de drenagem foi acrescentada para reduzir artefatos de movimento. Além disso, utilizou-se um gabinete termicamente isolado equipado com um sistema óptico e duas fontes de luz LED de intensidade ajustável, posicionadas bilateralmente para irradiar uniformemente o tecido cardíaco, conforme mostrado na Figura 1.

Para investigar a viabilidade da montagem experimental, foi conduzido um conjunto de experimentos para acompanhar as alterações na área cardíaca sob diferentes condições de estimulação. Obteve-se uma faixa de sincronização entre a frequência de estimulação e a resposta cardíaca, compatível com a região de sincronização relatada por Peña-Romo², que utilizou o método de registro auxotônico⁸. Pode-se concluir que a configuração experimental óptica é suficiente para apoiar estudos experimentais adicionais sobre encurtamento ventricular (Figura 2).

Investigamos ainda se os sinais de encurtamento ventricular e dinâmica da área atrial permitem a análise do acoplamento eletromecânico do coração. Os sinais ventricular e atrial permitem determinar a duração do atraso na contração átrio-ventricular (AVD). Em uma frequência de estimulação de 420 PPM, obteve-se um valor de 53 ± 14 ms (média ± DP). Esse resultado está de acordo com os de VanderBrink²⁴, que relata um intervalo PR de 44 ± 6 ms medido com eletrocardiograma (ECG).

Este método também apresenta algumas limitações; a imprecisão no atraso átrio-ventricular em comparação com técnicas de ECG e na amplitude ventricular em comparação com os resultados obtidos pelo método de registro auxotônico, conforme mostrado na Figura 3B, pode ser devida a artefatos de movimento externo.

Este método contribui para a avaliação da contratilidade e da frequência cardíaca sem influências farmacológicas ou sistêmicas em um coração isolado intacto. Esses resultados demonstram que o sistema óptico permite a medição das respostas de encurtamento ventricular e atrial do coração, destacando sua utilidade para estudos de arritmias que comprometem a coordenação átrio-ventricular ou para a avaliação de efeitos farmacológicos.

Este método também apresenta algumas limitações. Primeiro, por ser uma aproximação bidimensional, não é possível medir a força de contração como no método auxotônico. Esse método também é benéfico para reduzir artefatos de movimento provenientes de gotas de solução e para controlar a temperatura da solução. Segundo, as diferenças sexuais em modelos de camundongos impactam significativamente a validade, reprodutibilidade e segurança da pesquisa biomédica. Historicamente, os pesquisadores preferiam fortemente camundongos machos para evitar a variabilidade nos dados causada pelos ciclos estrais femininos, uma premissa que desde então tem se mostrado amplamente incorreta^25,26. Dependendo do tipo de estudo, este protocolo pode ser aplicado a pesquisas envolvendo camundongos machos ou fêmeas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
seringa de 1 mL	BD Plastipak	302485	procedimento cirúrgico
agulha 20 G	NIPRO	AH-2032	cânula aórtica
lente ajustável de 25 mm com ampliação de 8x-100x	Genérico	N/A	lente da câmera do sistema óptico; citada genericamente como lente de câmera ajustável
agulha 27 G	BD PrecisionGlide	302358	procedimento cirúrgico
peças de suporte projetadas em 3D	CINVESTAV	N/A	peças de suporte personalizadas projetadas em 3D
fio de seda 4-0	AMERICAN SUTURE	TGSN0901	cânula aórtica
fonte de alimentação 40-A	STEREN	PRL-25	fonte de alimentação para LED
piedra de ar	N/A	N/A	oxigenação da solução de Tyrode
CaCl2 (2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	solução de Tyrode
D-Glucose	J.T. Baker	1916-01	solução de Tyrode
bomba de drenagem	CINVESTAV	N/A	bomba de drenagem personalizada; citada genericamente como bomba de drenagem
Lente plano-convexa, F = 25,4 mm	THORLABS	LA1951-A	lente de iluminação do sistema óptico; citada genericamente como lente de iluminação plano-convexa
ácido acético glacial	Sigma-Aldrich	695092	limpeza do sistema Langendorff
heparina	PiSA	060M91	anticoagulante
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	solução de Tyrode
LEDs de alta potência	Luminius	CBT-90-G-L11-C12	fonte de luz LED
sistema de iluminação	CINVESTAV	N/A	sistema de iluminação personalizado; citado genericamente como sistema de iluminação
KCl	CTR SCIENTIFIC	CTR02196	solução de Tyrode
software LabVIEW versão 2018	NATIONAL INSTRUMENTS	N/A	software utilizado para executar o aplicativo de monitoramento e marcação; citado genericamente como aplicativo de monitoramento e marcação
software MATLAB	The MathWorks	N/A	software computacional para programas de normalização, segmentação e análise de vídeo; citado genericamente como software computacional
oxigênio médico	GRUPO INFRA	N/A	oxigenação da solução de Tyrode
MgCl2 (6H2O)	CTR SCIENTIFIC	CTR02104	solução de Tyrode
bomba de fluxo variável Mini-Pump	CONTROL COMPANY	3385	bomba de perfusão
Kit cirúrgico para camundongos	Kent Scientific	INSMOUSEKIT	procedimento cirúrgico
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	solução de Tyrode
NaH2PO4	DEQ	DEQF290400250	solução de Tyrode
NaOH	CTR SCIENTIFIC	CTR03108	ajuste de pH
NI USB-6009	NATIONAL INSTRUMENTS	779026-01	placa de aquisição
eletrodos de platina, diâm. 0,25 mm	Sigma-Aldrich	349402	eletrodos de estimulação elétrica
fonte de alimentação (12 V, 30 A)	Karnick	PTA-12V30A	fonte de alimentação do recirculador
monitor de pressão	CINVESTAV	N/A	monitor de pressão personalizado; citado genericamente como monitor de pressão
transdutor de pressão	LA BOUVET	B17295	monitor de pressão do sistema Langendorff
álcool etílico puro	Sigma-Aldrich	493511	etanol para limpeza do sistema
bainha térmica recirculante (LXC)	PolyScience	L113A0412	recirculador do reservatório
solução salina	PiSA	111848	solução de cloreto de sódio a 0,9% (NaCl)
bainha térmica serpentina	CINVESTAV	N/A	recirculador/bainha térmica serpentina personalizada
estereomicroscópio	N/A	N/A	procedimento cirúrgico
iluminação do estereomicroscópio	N/A	N/A	procedimento cirúrgico
software uEye Cockpit	IDS Imaging Development System GmBH	N/A	software de aquisição da câmera; citado genericamente como software de aquisição da câmera
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2	IDS	AB00624	câmera CMOS de alta velocidade; citada genericamente como câmera CMOS
Xilazina	PiSA	4001211	anestésico
Zoletil 100	Virbac	83048907	mistura anestésica de tiletamina-zolazepam; citada genericamente como mistura anestésica