É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Sistema Óptico para Avaliação da Mecânica Atrial e Ventricular em Corações de Camundongo Perfundidos por Langendorff

67 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 de agosto de 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento para extração e cânulação do coração de camundongo, bem como o preparo e configuração do sistema de perfusão retrógrada Langendorff. A montagem experimental é acoplada a um sistema óptico de alta resolução projetado para avaliar as respostas mecânicas dos átrios e ventrículos, mantendo suas dinâmicas naturais.

Resumo

O coração de camundongo serve como um modelo amplamente utilizado na pesquisa cardiovascular, facilitado por avanços em tecnologias de engenharia. No entanto, a avaliação da contratilidade atrial e ventricular permanece desafiadora devido ao pequeno tamanho do coração de camundongo. Este estudo apresenta uma nova metodologia para avaliar a contratilidade e a frequência cardíaca em um coração isolado e intacto. O uso de um coração de camundongo perfundido pelo método Langendorff em combinação com um sistema óptico de alta resolução permite a avaliação da contratilidade atrial e ventricular. A montagem experimental supera os desafios associados ao pequeno tamanho do coração e às altas taxas de contração, ao mesmo tempo que obtém sinais de alta resolução. A sincronização entre a frequência de estímulo e a frequência de contração cardíaca na faixa de 420 a 660 batimentos por minuto (bpm) foi consistente com os resultados obtidos pelo método auxotônico. Além disso, medições do encurtamento ventricular e dos sinais dinâmicos atriais permitem a determinação da contração átrio-ventricular. Este método é adequado para avaliar a contratilidade e a frequência cardíaca em um coração isolado e intacto, sem influências farmacológicas ou sistêmicas. Esses resultados demonstram que o sistema óptico permite a medição das respostas de encurtamento ventricular e atrial.

Introdução

Há muito a descobrir na fisiologia cardíaca; processos fundamentais, como a geração do ritmo cardíaco e o acoplamento excitação-contração, são princípios centrais que estão em constante investigação1. Embora os efeitos do ruído biológico na contratilidade cardíaca2 e na atividade de marca-passo permaneçam pouco compreendidos1, novos métodos de imagem óptica permitiram a apresentação de novos paradigmas3,4.

Duas metodologias experimentais utilizando o sistema Langendorff contribuíram de forma inestimável para a medição da função cardíaca. Primeiro, o método de contração isovolumétrica, no qual um sinal é obtido por meio de um pequeno balão inserido no ventrículo esquerdo5,6,7. Segundo, o método de registro auxotônico, no qual um sinal é obtido suturando uma das extremidades de um fio ao ápice do coração e a outra extremidade a um dispositivo mecânico de registro, para medir contrações auxotônicas ao longo do eixo do coração2,8. No entanto, avaliar a contratilidade atrial e ventricular no coração de camundongo é desafiador devido ao seu tamanho diminuto. Além disso, o preparo exige certo grau de delicadeza, já que o coração é suscetível a lesões9,10,11,12,13.

O sistema óptico para avaliar a dinâmica mecânica de corações de camundongos possui várias características e vantagens inovadoras. Primeiramente, este método é adequado para avaliar a contratilidade e a frequência cardíaca em um coração intacto e isolado, na ausência de influências farmacológicas ou sistêmicas. O protocolo também pode ser efetivamente empregado em experimentos que avaliam lesão por isquemia-reperfusão ao investigar tratamentos baseados em abordagens farmacológicas, regeneração celular ou terapia com oxigênio.

Neste artigo, apresentamos um protocolo para registrar parâmetros biofísicos da função contrátil do coração de camundongo utilizando um sistema óptico de alta resolução. Este método auxilia na avaliação da contratilidade e da frequência cardíaca em um coração isolado e intacto. Além disso, permite a avaliação da contratilidade atrial e ventricular. O preparo Langendorff de coração de camundongo apresenta um aperfeiçoamento que inclui uma leve modificação para minimizar a perda de temperatura do perfusato e artefatos de movimento, sem inibir as contrações musculares.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as Regulamentações Federais para Experimentação e Cuidados com Animais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais do CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., México). Neste estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J, pesando 28–34 g e com idade entre 8 e 14 semanas. Todos os materiais e equipamentos utilizados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Os Arquivos Suplementares 1–11 fornecem diagramas complementares, guias de software, programas de análise, dados de estimulação cardíaca e arquivos de aplicação para o protocolo.

1. Preparação do estoque

  1. Prepare previamente duas soluções estoque e armazene-as em geladeira a 4 °C: (1) Estoque I, 1 L (em água desionizada; em g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) e (2) Estoque II, 0,1 L (em água desionizada; em g/L: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    NOTA: As soluções podem ser utilizadas por até 30 dias após a preparação. Armazene-as a 4 °C.

2. Conexão ao sistema Langendorff e limpeza

  1. Conecte o reservatório (1), banho térmico do reservatório (2), bomba de perfusão (3), serpentina (4), recirculador da serpentina (5), sistema de monitoramento (6) e sistema de drenagem (8), conforme mostrado na Figura 1A.
    NOTA: A conexão entre o sistema de monitoramento e o sistema de drenagem é mostrada em maior detalhe no Arquivo Suplementar 1.
  2. Encha o sistema Langendorff com 1 L de água deionizada a 50 °C, em seguida, inicie as bombas de perfusão e drenagem (Arquivo Suplementar 1, sistema de drenagem). Após aproximadamente 20–30 min, remova o líquido do sistema e prossiga para o próximo passo.
    NOTA: Verifique se há vazamentos ou quedas de pressão no sistema. Caso isso ocorra, não prossiga com o experimento.
  3. Encha o sistema com 1 L de ácido acético a 1% (dissolvido em água deionizada), em seguida, desligue as bombas de perfusão e drenagem e aguarde 60 min; depois, ligue as bombas para remover o líquido.
  4. Repita o passo 2.2 duas vezes.
  5. Encha o sistema com etanol a 70% (dissolvido em água deionizada) para prevenir a adesão dos componentes da solução.
    NOTA: O sistema de perfusão Langendorff deve ser limpo a cada dez experimentos ou mensalmente. O protocolo de limpeza antes do experimento é explicado na seção 4. Já o protocolo de limpeza após o experimento é detalhado na seção 8.

3. Preparação da solução de Tyrode durante o experimento

  1. Prepare 1 L de solução em mM: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-glucose, 10 HEPES, ajustado para pH 7,35 ± 0,05 com NaOH.
    1. Misture 100 mL do Estoque I com 700 mL de água deionizada sob agitação constante, depois eleve a temperatura da solução a 37 °C; mantenha a oxigenação da solução conectando o cilindro de O2 à pedra de ar, conforme mostrado na Figura 1A (1).
    2. Adicione 3,6 mL do Estoque II e 96,4 mL de água deionizada para obter 1,8 mM de CaCl2(2H2O), depois adicione NaOH para ajustar o pH a 7,35 ± 0,05.
    3. Complete com água deionizada até obter 1 L de solução de Tyrode.
      NOTA: Recomenda-se armazenar 100 mL da solução na geladeira a 4 °C; esse volume será necessário posteriormente na etapa 6.

4. Preparação do sistema Langendorff

OBSERVAÇÃO: Se o sistema Langendorff não estiver preenchido com etanol no dia do experimento, não é recomendado prosseguir com o procedimento; nesse caso, repita seção 2.

  1. Ligue as bombas de perfusão e drenagem. Ajuste a taxa de fluxo da bomba de perfusão para 3 mL/min e da bomba de drenagem para 10 mL/min. Drene o sistema.
  2. Preencha o sistema com 1 L de água desionizada a 37 °C, em seguida, drenar a água.
  3. Preencha o sistema com a solução de Tyrode preparada em passo 3 e mantenha a solução à temperatura fisiológica e com oxigenação constante.
  4. Ligue as banheiras térmicas do reservatório e o recirculador serpentinado. Ajuste a temperatura do reservatório (Figura 1A (2)) para 38 °C para manter a solução em condições fisiológicas. Ajuste a temperatura do serpentinão (Figura 1A (5)) em 40 °CIsso compensa a perda de temperatura na solução do sistema Langendorff.
    OBSERVAÇÃO: Se a temperatura da solução de Tyrode na saída do sistema não estiver fisiológica (37 ± 0.5 °C), ajuste a temperatura do recirculador serpentinado. Não é recomendado prosseguir para a etapa 6 até que a temperatura tenha se estabilizado no valor apropriado.
  5. Ligue o monitor de pressão (Arquivo Suplementar 1, sistema de monitoramento) e calibrar na faixa de 0–200 mmHg. O aplicativo de monitoramento e estimulação está disponível para ajudar a calibrar o sistema (Arquivo Suplementar 3 e Arquivo Suplementar 11).
    OBSERVAÇÃO: É essencial verificar se não há perda de pressão e se não existem bolhas no sistema. Se o sistema contiver bolhas, bloqueie temporariamente a saída inferior do serpentino e abra a válvula superior; isso fará com que a coluna se encha, permitindo que as bolhas sejam liberadas para o exterior. Não é recomendado prosseguir com o experimento até que esta condição tenha sido verificada.

5. Sistema óptico14

  1. Monte a câmera CMOS (Figura 1A, 10), a lente ajustável da câmera (LC) e o sistema de iluminação.
    NOTA: O sistema de iluminação consiste em dois LEDs (Figura 1A, 9), duas lentes de iluminação plano-convexas (LI), um controle de iluminação (Figura 1A, 11), uma placa de aquisição (Arquivo Suplementar 1, sistema de monitoramento) e peças de suporte projetadas em 3D (Arquivo Suplementar 1).
  2. Posicione um objeto de referência com volume aproximado de 1.000 mm3 a uma distância de 100–200 mm da lente da câmera (centro da Figura 1A).
    NOTA: O objeto deve ser posicionado na posição do coração no sistema Langendorff. Essa posição pode ser observada na Figura 1B, especificamente no centro da imagem onde os feixes de luz incidem.
  3. Inicie o software de aquisição da câmera e configure a câmera com uma subamostragem de 4x (4 pixels = 1 subpixel). Defina uma região de interesse (ROI) de 200 x 200 subpixels (Arquivo Suplementar 2).
    NOTA: Com essa configuração, é possível alcançar uma resolução temporal de 750 quadros por segundo (fps).
  4. Ligue o sistema de iluminação (Arquivo Suplementar 1), ajuste os feixes de luz para focar no objeto de referência e obtenha uma iluminação homogênea (Figura 1B).
  5. Ajuste a intensidade da luz no objeto de referência para evitar superexposição da imagem.
    NOTA: A imagem deve se assemelhar à Figura 2A (ou Figura 1C, PC do controlador). Os reflexos na superfície do objeto (coração) devem ser reduzidos ao máximo sem perder a definição do seu contorno. Isso pode ser feito ajustando a potência do controle de iluminação ou reduzindo o tempo de exposição nas configurações da câmera.
  6. Foque a lente da câmera para obter uma imagem nítida do objeto de referência (Figura 1C, PC do controlador). Certifique-se de que o objeto de referência ocupe 80% do campo de visão (Figura 2A) para obter uma escala de conversão de aproximadamente 61 µm por subpixel.
    NOTA: O sistema óptico ativa automaticamente o sistema de iluminação quando a câmera é configurada no modo de aquisição (Figura 1A e Arquivo Suplementar 2). Recomenda-se manter a câmera em modo de espera para que o sistema de iluminação permaneça desligado, ativando-o apenas durante os períodos de coleta de dados experimentais, a fim de evitar superaquecimento.

6. Procedimentos cirúrgicos e de cânulação

  1. Heparinização e anestesia
    1. Prepare uma mistura anestésica contendo tiletamina-zolazepan (40 mg/kg de peso corporal do camundongo) e xilazina (10 mg/kg de peso corporal do camundongo), depois dilua até 200 µL com solução salina.
    2. Administre a mistura anestésica por via intraperitoneal usando uma agulha de 27 G. Aguarde até que o camundongo entre em anestesia profunda.
      OBSERVAÇÃO: Verifique a ausência de reflexo em resposta a um estímulo nas patas ou na cauda (normalmente, 10 min é suficiente).
    3. Administre 200 UI de heparina não fracionada por via intraperitoneal usando uma agulha de 27 G e aguarde aproximadamente 5 min antes de prosseguir com o experimento.
  2. Extração e cânulação
    1. Posicione o camundongo em decúbito dorsal, remova os pelos e a pele da região torácica com tesoura cirúrgica.
    2. Realize uma incisão abdominal abaixo do diafragma, tomando cuidado para manter sua integridade.
    3. Continue com uma incisão transversal no diafragma e realize rapidamente uma toracotomia bilateral ascendente através das costelas, em seguida remova a parede torácica.
      OBSERVAÇÃO: Tenha cuidado para não danificar o coração. Caso o coração seja comprometido ou danificado durante o procedimento, recomenda-se não prosseguir com o experimento.
    4. Segure suavemente as estruturas superiores do coração com pinça fina, o arco aórtico e os vasos adjacentes. Levante delicadamente para fazer um corte por baixo e para cima, removendo juntos o coração e os pulmões.
    5. Transfira rapidamente o coração para uma placa de Petri contendo 50 mL de solução de Tyrode a 4 °C para uma lavagem inicial.
      OBSERVAÇÃO: A partir do momento em que o diafragma é incisado, o animal começará a apresentar desconforto respiratório; a partir desse ponto, há uma janela de 60 s para realizar os passos 6.2.3–6.2.6. Exceder esse limite de tempo pode induzir danos isquêmicos.
    6. Remova os pulmões e o tecido adiposo em excesso para expor o arco aórtico, utilizando microscópio estereoscópico e tesoura fina.
      OBSERVAÇÃO: Durante a limpeza do tecido, certifique-se de não danificar o arco aórtico. Se a aorta for cortada abaixo da artéria braquiocefálica, a cânulação será difícil, podendo levar a vazamentos de pressão.
    7. Transfira o coração para a base personalizada de cânulação contendo 50 mL de tampão de Tyrode a 4 °C e insira a extremidade aórtica na cânula, fabricada especialmente a partir de uma agulha de 20 G (Arquivo Suplementar 1).
      OBSERVAÇÃO: Tenha cuidado para não danificar a válvula aórtica. Se a válvula for comprometida, o coração inchará e a circulação coronariana não será adequadamente lavada.
    8. Amarre dois nós de cânulação usando fio de seda 4/0: o primeiro no sulco distal à ponta da cânula e o segundo antes do tronco braquiocefálico (Arquivo Suplementar 1).
    9. Aplicar lentamente a solução de Tyrode usando uma seringa de 1 mL preenchida com tampão à temperatura ambiente. Verifique se o tecido coronariano se torna transparente para confirmar uma boa cânulação.
    10. Remova o tecido adiposo para permitir o acesso aos ventrículos e átrios.
      OBSERVAÇÃO: Evite exceder 5 min de cânulação para preservar a viabilidade do coração.
    11. Transfira o coração para um sistema Langendorff e permita que se estabilize por 30 min.
      OBSERVAÇÃO: O coração é posicionado no centro do sistema (Figura 1A,B), suspenso verticalmente. Ao pendurar o coração, tenha extremo cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. Se isso ocorrer, a pressão aumentará acima de 140 mmHg, o coração começará a inchar e deixará de ser viável.
      OBSERVAÇÃO: A montagem Langendorff está completa quando o coração exibe uma resposta mecanicamente estável, uma frequência de oscilação natural de aproximadamente 360 batimentos por minuto (BPM) e uma pressão de perfusão entre 60 e 110 mmHg.

7. Protocolo de estimulação e gravação em vídeo

  1. Viabilidade cardíaca
    1. Verifique se a pressão coronariana está na faixa de 60–110 mmHg com uma bomba de perfusão de 3 mL/min. Se a pressão de perfusão coronariana cair abaixo de 60 mmHg, aumente ligeiramente a taxa de fluxo da bomba de perfusão (baixa pressão fará com que o coração fique pálido e flácido). Por outro lado, se a pressão exceder 110 mmHg, diminua ligeiramente a taxa de fluxo da bomba (pressão excessiva induzirá edema tecidual e aumento progressivo da pressão até ocorrer a parada cardíaca).}
      NOTA: Manter a pressão de perfusão fora da faixa ótima mencionada por um período prolongado comprometerá irreversivelmente a viabilidade cardíaca.
    2. Posicione o coração em posição frontal para obter uma visão completa na câmera. Ajuste a posição para que ambos os átrios sejam visíveis na câmera (Figura 2A).
    3. Coloque suavemente os eletrodos de platina superficialmente na parte superior do átrio direito, no nó do marcapasso. Use a imagem da câmera como guia para trazer os eletrodos para o campo de visão. Posicione o eletrodo de modo que não obstrua o átrio direito. Enquanto monitora a visualização ao vivo da câmera, avance lentamente o eletrodo até que entre em contato com o tecido atrial, tomando cuidado para não exercer compressão excessiva (o que achataria o átrio direito na imagem).
      NOTA: Se realizado corretamente, a visão da câmera será semelhante à Figura 2A.
    4. Inicie o aplicativo de monitoramento e estimulação (Arquivo Suplementar 11) e ligue a placa de aquisição (Figura 1A (6)). Defina os valores dos parâmetros de estímulo: amplitude em 2 V, frequência em 420, 540 e 720 pulsos por minuto (PPM) com pulso quadrado de ciclo de trabalho de 7 ms (inseto da Figura 2A).
    5. Aplique as estimulações de viabilidade começando com a frequência mais baixa, usando uma duração de estímulo de 20 s seguida por um período de recuperação de 20 s (tempo de repouso) entre os eventos.
      NOTA: Avalie a viabilidade cardíaca por meio do monitoramento pela câmera. Se o órgão for funcional fisiologicamente, será observada uma sincronização entre o estímulo aplicado e a resposta cardíaca, acompanhada de coordenação adequada entre as câmaras cardíacas. Por outro lado, a falta de viabilidade se manifestará pela perda da coordenação das câmaras ou pela presença exclusiva de contrações atriais isoladas.
    6. Feche a porta da câmara, pois o experimento é sensível à luz ambiente e às flutuações térmicas (Figura 1C).
      NOTA: A porta da câmara deve permanecer fechada durante o tempo experimental. Monitore a viabilidade cardíaca com a câmera e a pressão de perfusão.
  2. Gravação de dados
    1. Aplique o protocolo de estimulação, que consiste em trens de pulsos quadrados de 30 s de duração, seguidos por 30 s sem sinal. Defina os valores dos parâmetros de estímulo em cada trem de estimulação: amplitude em 2 V, ciclo de trabalho de 7 ms e frequência na faixa de 360 a 720 PPM.
      NOTA: O protocolo de estimulação começa em 360 PPM e aumenta em 60 PPM em cada ponto temporal (inseto da Figura 2A).
    2. Grave continuamente vídeos da dinâmica da visão frontal do coração no formato .avi usando o software de aquisição da câmera (Arquivo Suplementar 2). Faça uma gravação de vídeo de 20 s para cada trem de estimulação. Grave o segmento de 20 s iniciando 5 s após o início da estimulação. Um registro bruto representativo é fornecido no Filme Suplementar 1.
      NOTA: Um computador grava simultaneamente o trem de estimulação aplicado (.xls, Arquivo Suplementar 9) para cada vídeo gravado (.avi), gerado pelo aplicativo de monitoramento e estimulação e pelo software de aquisição da câmera, respectivamente (Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3).
    3. Verifique a viabilidade cardíaca comparando o primeiro vídeo, gravado antes de iniciar o protocolo de estimulação, com o segundo vídeo, gravado após a aplicação do protocolo (Figura 2B).

8. Limpeza do sistema de perfusão de Langendorff após o experimento

  1. Remova os estímulos e os eletrodos de platina para ECG. Retire o coração do sistema e drene todas as soluções residuais de Tyrode.
  2. Desligue o sistema óptico e feche a válvula de O2.
  3. Lave o sistema com 1 L de água desionizada a 37 °C e drene o sistema.
  4. Repita os passos 2.4 e 2.5.
  5. Desligue todos os sistemas e equipamentos.

9. Processamento de vídeo

  1. Inicie importando cada vídeo para um software computacional e aplicando uma função de normalização de vídeo15.
  2. Selecione uma região de interesse (ROI) que inclua a área do coração. Realize a segmentação da imagem para remover ruídos de fundo, eletrodos e a cânula (Arquivo Suplementar 4).
    NOTA: Para selecionar corretamente a área da imagem a ser removida, consulte o Arquivo Suplementar 10.
  3. Realize uma análise global da dinâmica mecânica (Arquivo Suplementar 5). Exemplos de variabilidade e sinais são apresentados na Figura Suplementar S1, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3.
    1. Aplique operadores morfológicos a cada quadro do vídeo para detectar o perímetro do coração, em seguida, aplique um algoritmo de preenchimento de quadro para gerar uma máscara15.
    2. Conte os pixels dentro da área segmentada em cada quadro, depois normalize essa contagem pelo número total de pixels na imagem para produzir um sinal dinâmico (inset em Figura 2B e Figura Suplementar S3).
    3. Aplique um filtro Butterworth bidirecional de 5ª ordem entre 3 e 100 Hz ao sinal obtido para suprimir ruídos de alta frequência e artefatos de gotejamento da perfusão15.
    4. Normalize os sinais em todos os vídeos utilizando os valores máximos e mínimos registrados.
    5. Determine a frequência cardíaca calculando o intervalo entre dois valores de amplitude máxima (IAA (s)) para cada sinal dinâmico e de estímulo.
    6. Obtenha a frequência em BPM com a seguinte fórmula:
      Equação de cálculo da frequência mostrando a frequência cardíaca em BPM igual a 60 dividido por IAA.
    7. Gere mapas de Poincaré a partir dos dados de IAA para ilustrar a variabilidade em períodos curtos e longos16,17,18 (Figura Suplementar S1 e Figura Suplementar S2).
      NOTA: Para obter informações mais detalhadas, consulte o Arquivo Suplementar 10.
  4. Realize uma análise segmentar da dinâmica mecânica ventricular (Arquivo Suplementar 6).
    1. Aplique a binarização da imagem. Use operadores morfológicos para delimitar a área ventricular, ajustando-a a uma geometria elíptica sem comprometer a ROI15.
    2. Ajuste uma elipse mínima à área ventricular em cada quadro. Extraia as coordenadas de um conjunto de pontos distais em um quadro. Utilize um conjunto de 10–20 pontos em cada extremidade ao longo do eixo Y (Figura 3A). Uma saída representativa da estimativa da elipse é fornecida no Vídeo Suplementar 2.
    3. Calcule o encurtamento ventricular como a distância média entre os pontos extremos ao longo do eixo Y em cada vídeo19.
    4. Aplique um filtro Butterworth bidirecional de 5ª ordem entre 3 e 100 Hz ao sinal obtido para suprimir ruídos de alta frequência e artefatos de gotejamento da perfusão15.
    5. Normalize o sinal de encurtamento ventricular em relação a todos os vídeos obtidos para cada estimulação e calcule a frequência cardíaca e o atraso conforme os passos 9.3.5–9.3.6.
      NOTA: Parâmetros, como duração do ciclo ventricular (DVE), duração da relaxação (DVW), intervalo interventricular (IVV) e amplitude ventricular (VA), são obtidos (Figura 3A).
      NOTA: Para obter informações mais detalhadas, consulte o Arquivo Suplementar 10.
  5. Realize uma análise segmentar da dinâmica mecânica das aurículas (Arquivo Suplementar 7).
    1. Use duas ROIs para delimitar as aurículas (Figura 3C).
    2. Analise cada aurícula individualmente.
      1. Use operadores morfológicos para delinear as aurículas, ajustando-as sem comprometer a ROI15. Utilize um algoritmo de aumento de contraste para delinear cada aurícula20,21.
      2. Aplique a binarização da imagem e quantifique o número de pixels diferentes de zero por quadro para obter um sinal dinâmico atrial.
      3. Aplique um filtro Butterworth bidirecional de 5ª ordem entre 3 e 100 Hz aos sinais obtidos para suprimir ruídos de alta frequência e artefatos de gotejamento da perfusão15.
      4. Calcule a média dos dois sinais atriais (Figura 3D).
    3. Normalize o sinal de encurtamento atrial em relação a todos os vídeos obtidos para cada estimulação e calcule a frequência cardíaca e o atraso conforme os passos 9.3.5–9.3.6.
      NOTA: Parâmetros, como duração do ciclo atrial (DAE), intervalo atrial-atrial (IAT) e amplitude atrial (AA), são obtidos (Figura 3D). Para obter informações mais detalhadas, consulte o Arquivo Suplementar 10.
  6. Realize uma análise eletromecânica13,22 (Arquivo Suplementar 8).
    1. Compare os dados de estimulação com os sinais atrial e ventricular (Figura 3D).
    2. Calcule o tempo de propagação no sistema de condução cardíaca, obtendo o atraso entre os eventos atrial e ventricular (AVD), tomando o estímulo aplicado como referência.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Os experimentos de função mecânica cardíaca são realizados utilizando o aparelho de Langendorff, conforme mostrado na Figura 1A (Superior). Os sistemas de monitoramento e óptico permitem a gravação de vídeo quando o controle de iluminação é acionado, conforme mostrado na Figura 1A (Inferior). A Figura 1C ilustra a vista externa do gabinete com controle térmico, projetado para manter o coração isolad...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O coração de camundongo é muito sensível a variações de temperatura2,9,10,11,22. Neste experimento, o coração perfundido foi posicionado verticalmente. Incluímos uma pequena modificação para minimizar a perda de temperatura do perfusato e artefatos de movimento no método de perfusão Langendorff. Uma bomba de recirculação foi adicionada ao serpentino para minim...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Secretaria de Ciência, Humanidades, Tecnologia e Inovação (SECIHTI), com concessão financiada sob o número LN-2025-C-23.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
seringa de 1 mLBD Plastipak302485procedimento cirúrgico
agulha 20 GNIPROAH-2032cânula aórtica
lente ajustável de 25 mm com ampliação de 8x-100xGenéricoN/Alente da câmera do sistema óptico; citada genericamente como lente de câmera ajustável
agulha 27 GBD PrecisionGlide302358procedimento cirúrgico
peças de suporte projetadas em 3DCINVESTAVN/Apeças de suporte personalizadas projetadas em 3D
fio de seda 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901cânula aórtica
fonte de alimentação 40-ASTERENPRL-25fonte de alimentação para LED
piedra de arN/AN/Aoxigenação da solução de Tyrode
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306solução de Tyrode
D-GlucoseJ.T. Baker1916-01solução de Tyrode
bomba de drenagemCINVESTAVN/Abomba de drenagem personalizada; citada genericamente como bomba de drenagem
Lente plano-convexa, F = 25,4 mmTHORLABSLA1951-Alente de iluminação do sistema óptico; citada genericamente como lente de iluminação plano-convexa
ácido acético glacialSigma-Aldrich695092limpeza do sistema Langendorff
heparinaPiSA060M91anticoagulante
HEPESSigma-AldrichH3375solução de Tyrode
LEDs de alta potênciaLuminiusCBT-90-G-L11-C12fonte de luz LED
sistema de iluminaçãoCINVESTAVN/Asistema de iluminação personalizado; citado genericamente como sistema de iluminação
KClCTR SCIENTIFICCTR02196solução de Tyrode
software LabVIEW versão 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Asoftware utilizado para executar o aplicativo de monitoramento e marcação; citado genericamente como aplicativo de monitoramento e marcação
software MATLABThe MathWorksN/Asoftware computacional para programas de normalização, segmentação e análise de vídeo; citado genericamente como software computacional
oxigênio médicoGRUPO INFRAN/Aoxigenação da solução de Tyrode
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104solução de Tyrode
bomba de fluxo variável Mini-PumpCONTROL COMPANY3385bomba de perfusão
Kit cirúrgico para camundongosKent ScientificINSMOUSEKITprocedimento cirúrgico
NaClSigma-AldrichS5886solução de Tyrode
NaH2PO4DEQDEQF290400250solução de Tyrode
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108ajuste de pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01placa de aquisição
eletrodos de platina, diâm. 0,25 mmSigma-Aldrich349402eletrodos de estimulação elétrica
fonte de alimentação (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30Afonte de alimentação do recirculador
monitor de pressãoCINVESTAVN/Amonitor de pressão personalizado; citado genericamente como monitor de pressão
transdutor de pressãoLA BOUVETB17295monitor de pressão do sistema Langendorff
álcool etílico puroSigma-Aldrich493511etanol para limpeza do sistema
bainha térmica recirculante (LXC)PolyScienceL113A0412recirculador do reservatório
solução salinaPiSA111848solução de cloreto de sódio a 0,9% (NaCl)
bainha térmica serpentinaCINVESTAVN/Arecirculador/bainha térmica serpentina personalizada
estereomicroscópioN/AN/Aprocedimento cirúrgico
iluminação do estereomicroscópioN/AN/Aprocedimento cirúrgico
software uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/Asoftware de aquisição da câmera; citado genericamente como software de aquisição da câmera
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624câmera CMOS de alta velocidade; citada genericamente como câmera CMOS
XilazinaPiSA4001211anestésico
Zoletil 100Virbac83048907mistura anestésica de tiletamina-zolazepam; citada genericamente como mistura anestésica

Referências

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Cora o Perfundido de LangendorffModelo de Cora o de CamundongoAvalia o pticaContratilidade AtrialContratilidade VentricularMedi o da Frequ ncia Card acaImagem de Alta Resolu oEncurtamento VentricularDin mica AtrialMec nica Card aca

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.