Identificação de Biomarcadores Candidatos Associados à Disfunção Mitocondrial e SUMOilação em Insuficiência Cardíaca com Base em Abordagens Bioinformáticas

Resumo

Utilizando bioinformática, aprendizado de máquina e validação por qPCR, este estudo identificou cinco biomarcadores candidatos associados à SUMOilação e à disfunção mitocondrial na insuficiência cardíaca. Esses achados melhoram a compreensão dos mecanismos de insuficiência cardíaca e sugerem possíveis direções para futuras pesquisas diagnósticas.

Resumo

A insuficiência cardíaca (IC) apresenta um desafio clínico persistente. Embora a SUMOilação e a função mitocondrial sejam vitais para a saúde dos cardiomiócitos, sua influência combinada sobre a IC permanece difícil de alcançar. Dois conjuntos de dados relacionados à HF foram baixados do GEO. Os genes sobrepostos foram obtidos de todos os genes do conjunto de treinamento, genes relacionados ao SUMO e genes relacionados à mitocondria. Três algoritmos de aprendizado de máquina foram aplicados para identificar genes-chave diagnósticos. Posteriormente, modelos diagnósticos foram construídos e avaliados com base nesses genes. Além disso, o microambiente imunológico em IC versus controles saudáveis foi avaliado usando CIBERSORT, MCP-counter e ssGSEA. As diferenças na infiltração imune entre IC e controles saudáveis foram analisadas. Foram realizadas previsões de fármacos e acoplamento molecular para identificar potenciais candidatos a medicamentos que visam esses genes. Por fim, a qPCR foi empregada para validar os níveis de expressão gênica em amostras clínicas. Um total de 113 genes comuns com enriquecimento notável na regulação mitocondrial foi identificado. Cinco genes-chave, a saber: NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 e FKBP4, foram identificados por três algoritmos de aprendizado de máquina. Análises de enriquecimento funcional relacionaram esses genes à resposta imune, processamento de RNA e regulação do ciclo celular. Além disso, o perfilamento da infiltração imune revelou que a infiltração neutrófila contribui para respostas imunes desreguladas na HF. O acoplamento molecular revelou que o medicamento de pequenas moléculas IMX-942 tem afinidade favorável de ligação com SQSTM1 (-5,8 kcal/mol). A validação qPCR apoiou os resultados da bioinformática. NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 e FKBP4 foram identificados como genes-chave que ligam a SUMOilação e a função mitocondrial na HF. Esses achados fornecem novos insights sobre a fisiopatologia da IC e podem contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas.

Introdução

A insuficiência cardíaca (IC), estágio terminal de várias doenças cardiovasculares, é caracterizada por função cardíaca comprometida que não atende às demandas metabólicas do^corpo. Essa condição debilitante representa ameaças significativas à saúde dos pacientes, levando à diminuição da qualidade de vida e ao aumento das taxas^{de mortalidade 2}. As modalidades diagnósticas atuais para IC incluem principalmente detecção de marcadores^{bioquímicos 3,4}, ecocardiografia e imagem radiológica⁵. Embora os tratamentos disponíveis incluam agentes farmacológicos, intervenções baseadas em dispositivos e procedimentos cirúrgicos, os resultados clínicos continuam^{insatisfatórios 6}. Limitações como reações adversas a medicamentos, aplicabilidade limitada dos dispositivos, rejeição imune e outras complicações frequentemente dificultam a eficácia terapêutica 7,8,9,10,11. Portanto, há uma necessidade urgente de elucidar os mecanismos subjacentes da IC, identificar biomarcadores diagnósticos precoces e precisos, e desenvolver estratégias terapêuticas mais eficazes e seguras.

Pequenas proteínas modificadoras do tipo ubiquitina (SUMO) são conjugadas covalentemente aos resíduos de lisina das proteínas do substrato por meio de um processo dinâmico e reversível, regulando a estrutura e a função das proteínas do^{substrato 12}. SUMOilação, uma modificação pós-traducional crítica, atua como regulador fundamental de vários processos celulares^13,14. Mitocôndrias, como centro de metabolismo energético das células, estão criticamente envolvidas na patogênese da IC. No processo patológico da IC, a disfunção mitocondrial, como produção insuficiente de ATP, explosão de espécies reativas de oxigênio (ROS) e desequilíbrio da homeostase do Ca²+, contribui significativamente para a progressão 15,16,17,18. Notavelmente, evidências emergentes sugerem uma possível interação entre SUMOilação e função mitocondrial. O estresse mitocondrial pode desencadear vias relacionadas à SUMOilação, enquanto proteínas SUMO e suas proteases específicas são essenciais para manter a homeostase mitocondrial 19,20,21. Estudos recentes destacaram ainda mais a importância do controle de qualidade mitocondrial e da dinâmica mitocondrial em doenças cardiovasculares e na progressão da IC^22,23. No entanto, o efeito sinérgico da SUMOilação e da regulação mitocondrial no desenvolvimento da IC permanece incerto, especialmente no nível gênico.

Neste estudo, investigamos sistematicamente genes na interseção entre SUMOilação e disfunção mitocondrial na IC, dois processos biológicos chave que foram individualmente implicados na IC, mas ainda não integrados de forma abrangente. Genes sobrepostos foram identificados por genes diferencialmente expressos relacionados à HF, genes relacionados à SUMOilação e genes relacionados a mitocôndrias. Genes-chave foram então triados usando algoritmos de aprendizado de máquina e usados para construir um modelo diagnóstico. Análises de enriquecimento funcional e infiltração imune foram realizadas para explorar seus potenciais papéis biológicos na IC. Essa abordagem integrada pode fornecer uma estrutura sistemática para explorar a comunicação cruzada entre SUMOilação e disfunção mitocondrial na IC.

Protocolo

O estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque, e o protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Terceiro Hospital da Universidade Médica de Hebei (W2025-065-1) em novembro de 2024. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes envolvidos no estudo.

Fonte de dados e pré-processamento

Foram obtidos dados de RNA-seq associados à HF, incluindo dois conjuntos de dados de microarranjos do Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Dois conjuntos de dados microarray de sangue periférico foram selecionados: GSE59867 (34 amostras de IC e 30 controles) foi usado como conjunto de dados de treinamento; GSE57338 (177 amostras HF e 136 controles) foi usado como conjunto de dados de validação. As informações clínicas disponíveis para GSE57338, incluindo idade, gênero e estado da doença, foram retiradas do GEO e estão resumidas na Tabela Suplementar 1. Além disso, um total de 3.893 genes relacionados à SUMOilação (SRGs) foram obtidos do banco de dados dbPTM (https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php) (Tabela Suplementar 2), enquanto 2.030 genes relacionados a mitocôndrias (MRGs) foram coletados com base em um estudo^{anterior 24} (Tabela Suplementar 3). Em seguida, o pacote R GEOquery (v 2.72.0)²⁵ foi usado para baixar conjuntos de dados do banco de dados GEO, extrair a matriz de expressão e obter as informações do fenótipo da amostra. A anotação era realizada mapeando o arquivo de anotação e comparando os IDs de genes. Identificações genéticas inválidas foram removidas, e as sondas mais expressas foram mantidas.

Seleção de genes-chave via aprendizado de máquina

Uma abordagem em múltiplas etapas foi usada para selecionar os genes relacionados à HF, SUMOilação e mitocôndrias. Primeiro, os genes comuns entre o conjunto de dados de treinamento, os SRGs e os MRGs foram identificados por meio de análise de interseção. A função potencial dos genes comuns foi identificada pela análise de enriquecimento da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) usando o pacote R ClusterProfiler (v 4.12.6)²⁶. Depois, três abordagens de aprendizado de máquina, a saber, regressão LASSO, XGBoost e floresta aleatória (RF), foram empregadas para filtrar ainda mais os genes. Na regressão LASSO, o parâmetro ótimo de regularização λ foi selecionado por meio de validação cruzada para identificar as características genéticas com maior valor preditivo. Os genes com coeficientes não nulos foram selecionados para análises subsequentes. Depois, algoritmos XGBoost e RF foram usados para calcular as pontuações de importância das características e triar os 20 genes principais.

Construção e avaliação de modelos diagnósticos

Um modelo diagnóstico foi construído usando regressão logística baseado no conjunto de dados GSE59867. O modelo foi então aplicado para prever o status da doença e calcular escores de probabilidade. Para validar o modelo, os mesmos genes-chave foram extraídos do conjunto de dados GSE57338, normalizados para corresponder ao conjunto de dados de treinamento e usados para previsão externa. O desempenho do modelo foi avaliado usando curvas de Característica de Operação do Receptor (ROC), Matriz de Confusão, Curva de Calibração e Análise de Curva de Decisão (DCA).

Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) e localização subcelular

A análise de correlação de Spearman foi usada para identificar genes correlacionados para cada gene-chave. A análise GSEA foi realizada usando o pacote R ClusterProfiler (v 4.12.6) nos genes relacionados aos genes-chave. Enquanto isso, para determinar a localização subcelular precisa dos genes-chave dentro da célula, sua localização subcelular foi determinada usando o banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/).

Associação gene-doença e previsão de fármacos

Para avaliar a relevância clínica dos genes-chave identificados, foram realizadas análises sistemáticas de associação de doenças e interações medicamentosas. As associações doença-gene foram analisadas usando o Banco de Dados Comparativo de Toxicogenômica (CTD; https://ctdbase.org/), com resultados classificados tanto por escores de inferência quanto por contagem de referências (as 10 principais associações relatadas). Os dados de interação gênico-fármaco para genes-chave foram obtidos do banco de dados Drug-Gene Interaction (DGIdb), e os medicamentos foram excluídos com base em um escore de interação < 0,5. Posteriormente, baixamos as estruturas 3D das proteínas correspondentes a genes-chave do banco de dados PDB (https://www.rcsb.org/) e as estruturas moleculares de potenciais medicamentos do PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Em seguida, foi realizada uma análise de acoplamento molecular usando CB-Dock2²⁷ (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php) para calcular as pontuações de ligação entre os potenciais fármacos e proteínas. Uma energia livre de ligação menor indica uma interação mais estável, sugerindo que o composto pode ter maior potencial de direcionamento.

Análise de infiltração imune

A infiltração de células imunes foi avaliada usando três métodos complementares: contador de populações celulares de microambiente (MCP-contador⁾²⁸, identificação de tipos celulares estimando subconjuntos relativos de transcritos de RNA (CIBERSORT⁾²⁹ e análise de enriquecimento por amostra única (ssGSEA⁾³⁰. A análise por contador MCP e CIBERSORT foi realizada usando o pacote R IOBR (v 0.99.0)³¹. O contador MCP foi usado para estimar a abundância de células imunes e estromais, enquanto o CIBERSORT foi usado para quantificar as proporções relativas de 22 tipos de células imunes. O ssGSEA foi realizado usando o pacote GSVA (v1.52.3)³² para avaliar o enriquecimento em nível amostral de subtipos de células imunológicas.

Construção da rede reguladora concorrente de RNA endógeno (ceRNA)

Para investigar os possíveis papéis regulatórios do miRNA–lncRNA associados a genes-chave previamente identificados, foi construída uma rede reguladora de ceRNA. O pacote R multiMiR (v 1.26.0)³³ foi usado para prever potenciais interações microRNA (miRNA)–mRNA para genes-chave, integrando dados do PITA (https://omictools.com/pita-tool/) e do banco de dados miRDB (https://mirdb.org/). Pares miRNA–mRNA com alta confiança e consistência foram selecionados. Posteriormente, as interações lncRNA–miRNA foram recuperadas do banco de dados StarBase (https://rnasysu.com/encori/) e filtradas para interações suportadas por ≥ 10 experimentos CLIP-seq e categorizadas como lincRNAs. Uma rede de ceRNA foi construída integrando interações lncRNA-miRNA-mRNA.

Validação qPCR

Para validar a expressão dos genes-chave, amostras de sangue de pacientes com IC e controles saudáveis foram coletadas da coorte clínica (n = 6 por grupo) no Terceiro Hospital da Universidade Médica de Hebei (W2025-065-1) sob protocolos aprovados e consentimento informado. O RNA total foi isolado usando o reagente TRIzol em conjunto com clorofórmio e isopropanol. Após a extração, o RNA foi dissolvido em água tratada com DEPC, e sua concentração e pureza foram avaliadas usando um espectrofotômetro NanoDrop. Para análise transcricional, o RNA foi transcrito reversamente em cDNA usando a Mistura Rápida de Síntese de CDNA de Primeira Fita para RT (com dsDNase). A PCR quantitativa foi posteriormente realizada usando o Fast Taq qPCR SYBR Green Mix. As sequências específicas de estúdios são detalhadas na Tabela de Materiais. Os níveis relativos de expressão gênica foram calculados usando o método ^2-ΔΔCT , com a normalização adequada.

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software R e o GraphPad Prism. Comparações estatísticas entre dois grupos independentes foram realizadas usando o teste t de Student ou o teste U de Mann-Whitney, dependendo da distribuição dos dados. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado indicativo de significância estatística.

Resultados

Identificação e enriquecimento funcional de genes que se intersectam

Para identificar genes envolvidos na SUMOilação e na função mitocondrial na IC, o controle de qualidade foi realizado primeiro no conjunto de treinamento GSE59867 (Figura Suplementar 1A). Foi realizada uma análise de interseção tripla entre todos os genes do conjunto de treinamento, SRGs e MRGs, identificando 113 genes sobrepostos (Figura...

Discussão

A IC, um estágio progressivo e terminal de várias doenças cardiovasculares, é caracterizada por mecanismos fisiopatológicos altamente complexos e^{multifatoriais 17,34}. Embora tanto a SUMOilação quanto a disfunção mitocondrial tenham sido individualmente implicadas na IC, seus papéis sinérgicos potenciais ainda são insuficientemente explorados, especialmente no nível gênico. No presente estudo, identificamos cinco genes-chave — NFK...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Substituto de clorofórmio	Servicebio	G3014-02	Reagente qPCR
Água tratada com DEPC	Biosharp	BL510A	Reagente qPCR
Mistura rápida de síntese de cDNA de primeira fita para RT (com dsDNase)	Albatross Biology	500-101	Reagente qPCR
Mistura Fast Taq qPCR SYBR Green	Albatross Biology	500-102	Reagente qPCR
Primers FKBP4	Tsingke	N/A	Direto: 5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’ Reverso: 5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’
Isopropanol	Hushi	80109218	Reagente qPCR
Primers MYEF2	Tsingke	N/A	Direto: 5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’ Reverso: 5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’
Espectrofotômetro NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000C	Reagente qPCR
Primers NFKB1	Tsingke	N/A	Direto: 5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’ Reverso: 5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’
Primers NSUN2	Tsingke	N/A	Direto: 5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’ Reverso: 5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’
Primers SQSTM1	Tsingke	N/A	Direto: 5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’ Reverso: 5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’
Reagente TRIzol	Vazyme	R401-01	Reagente qPCR
Primers β-actina	Tsingke	N/A	Direto: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’ Reverso: 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’