Este protocolo descreve um método padronizado de acupuntura mecânica utilizando um dispositivo de estimulação vibratória que fornece estímulo reprodutível com agulha no ponto de acupuntura HT7 em ratos. Validado em um modelo de atividade locomotora induzida por cocaína, este método fornece uma plataforma quantitativa e reprodutível para investigar os mecanismos neurofisiológicos periféricos e centrais subjacentes aos efeitos mediados pela acupuntura.
Artigo de método
Um Instrumento de Acupuntura Mecânica para Estimulação Vibratória Reprodutível de Pontos de Acupuntura em Ratos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embora a acupuntura manual seja amplamente utilizada em pesquisas experimentais e clínicas, sua aplicação é limitada pela baixa reprodutibilidade decorrente da variabilidade dependente do praticante na manipulação da agulha. Para superar essa limitação, um instrumento mecânico de acupuntura (IMA) foi desenvolvido para fornecer estímulo vibratório controlado por meio de uma agulha de acupuntura inserida, sem o uso de corrente elétrica. Este artigo apresenta um protocolo padronizado para aplicação da estimulação com IMA no ponto de acupuntura HT7 em ratos, incluindo preparo do animal, localização do ponto de acupuntura, inserção da agulha, configuração dos parâmetros de estimulação e avaliação comportamental. Estudos representativos de validação mostraram que a estimulação com IMA no HT7 reduziu a atividade locomotora induzida pela cocaína e ativou preferencialmente as vias de fibras A associadas a mecanorreceptores. Estudos adicionais confirmaram o envolvimento dos aferentes periféricos ulnares, da via do cordão dorsal e da circuitaria de recompensa mesolímbica na mediação desses efeitos. Os resultados representativos apresentados neste artigo baseiam-se em estudos de validação previamente publicados que utilizaram a plataforma de IMA. Este protocolo fornece um método reprodutível e quantitativo para investigar os mecanismos neurofisiológicos da estimulação de acupuntura em modelos animais experimentais.
Introdução
A acupuntura manual é um método tradicional de estimulação baseado em agulhas que fornece entrada mecânica dinâmica aos tecidos periféricos por meio da manipulação direta da agulha e tem sido amplamente utilizada em ambientes clínicos e experimentais1,2. Diferentemente da eletroacupuntura (EA), a acupuntura manual gera uma estimulação mecânica complexa, incluindo deformação tecidual e ativação de mecanorreceptores periféricos, por meio da manipulação física da agulha inserida2. Considera-se que esses componentes mecânicos contribuem significativamente para os efeitos fisiológicos característicos da acupuntura e acredita-se que eles ativam as vias aferentes somatossensoriais de maneira distinta da estimulação elétrica3,4.
Apesar de sua relevância fisiológica e uso amplo, a aplicação experimental da acupuntura manual permanece limitada pela baixa reprodutibilidade2. Os efeitos terapêuticos da acupuntura manual dependem em grande parte de fatores dependentes do operador, incluindo técnicas de manipulação da agulha, intensidade, frequência e duração da estimulação, os quais podem variar substancialmente entre profissionais e condições experimentais1. Essa variabilidade representa um grande obstáculo para estudos mecanicistas que tentam estabelecer relações causais entre a estimulação da acupuntura e os resultados neurofisiológicos.
Para superar essas limitações, a EA tem sido frequentemente adotada como um método alternativo, pois permite controle preciso dos parâmetros de estimulação, como frequência, amplitude e duração. No entanto, a EA introduz uma entrada elétrica que pode recrutar vias neurais distintas daquelas ativadas pela punção manual5. Consequentemente, ainda é difícil isolar e avaliar a contribuição específica da estimulação mecânica, que representa um componente fundamental da acupuntura manual tradicional. Portanto, é necessário um método reprodutível capaz de fornecer estimulação mecânica controlada, sem interferências elétricas, para pesquisas mecanicistas em acupuntura.
Para superar essa limitação, um instrumento de acupuntura mecânica (MAI) foi desenvolvido em 2013 para reproduzir a estimulação mecânica baseada em vibração, ao mesmo tempo que permite o controle quantitativo dos parâmetros de estimulação3,5. Esse dispositivo fornece uma estimulação vibratória controlada diretamente a uma agulha de acupuntura inserida, padronizando assim a entrada mecânica aplicada ao tecido. Com essa abordagem, estudos anteriores demonstraram que a acupuntura mecânica modula circuitos neurais somatossensoriais, relacionados à recompensa e autônomos, em diversos modelos experimentais4,6,7,8. Por exemplo, a estimulação mecânica nos pontos de acupuntura HT7 atenuou respostas comportamentais induzidas pela cocaína e a dependência alcoólica por meio da modulação da circuitaria dopaminérgica mesolímbica, das vias opioides endógenas e dos circuitos de retransmissão somatossensorial6,7. Além disso, a estimulação combinada mecânica e elétrica aplicada em pontos neurogênicos suprimiu a hipertensão por meio de mecanismos mediados por opioides em regiões autônomas centrais5. Em conjunto, cerca de 30 estudos utilizando essa plataforma contribuíram para a compreensão mecanicista da acupuntura em dependência, regulação autônoma e outras condições experimentais.
Diferentemente dos sistemas gerais de estimulação apenas por vibração, este protocolo fornece um fluxo de trabalho integrado para acupuntura mecânica, acoplada a agulha e não elétrica, em ratos acordados. Ele combina montagem do dispositivo, acoplamento da agulha ao motor, padronização da profundidade de inserção, calibração baseada em acelerômetro, localização de pontos de acupuntura e validação comportamental representativa utilizando a estimulação do ponto HT7 em um modelo de atividade locomotora induzida por cocaína em ratos. Assim, este artigo fornece um protocolo experimental reprodutível para estimulação controlada de acupuntura mecânica, em vez de apresentar um novo dispositivo terapêutico.
A saída padronizada e controlada quantitativamente do MAI também pode fornecer uma plataforma útil para a futura integração com abordagens analíticas baseadas em dados. Como parâmetros de estimulação, tais como frequência de vibração, aceleração, profundidade de inserção e duração da estimulação, podem ser precisamente definidos e reproduzidos, essas variáveis podem servir como entradas estruturadas para modelagem computacional. Estudos recentes mostraram que abordagens de aprendizado de máquina, aprendizado profundo e aprendizado por transferência podem melhorar a extração de características, classificação de sinais, reconhecimento de padrões e otimização em imagens biomédicas complexas e conjuntos de dados de sinais baseados em vibração9,10,11,12. Abordagens semelhantes poderiam potencialmente ser aplicadas à pesquisa acupuntural baseada em MAI, integrando parâmetros de estimulação com dados comportamentais, neurofisiológicos e de saída de vibração, para apoiar a análise de sinais, classificação comportamental, otimização de parâmetros de estimulação e predição de respostas relacionadas à acupuntura. Assim, estudos futuros que combinem estimulação baseada em MAI com metodologias de aprendizado de máquina podem aprimorar ainda mais a precisão, reprodutibilidade e interpretação mecanicista da pesquisa em acupuntura.
É importante destacar que os dados representativos de validação apresentados neste artigo são reproduzidos, adaptados ou resumidos de estudos previamente publicados que utilizam a plataforma MAI. O objetivo principal deste artigo não é relatar novas descobertas experimentais, mas sim fornecer um protocolo detalhado, passo a passo, para a aplicação reprodutível de estímulos padronizados de acupuntura mecânica em modelos animais experimentais.
Protocolo
Todos os protocolos com animais descritos neste artigo foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais (IACUCs) da Daegu Haany University (DHU2012-008, DHU2022-12) e da Yonsei University College of Medicine (# 2023-0006) e foram conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Preparação do instrumento de acupuntura mecânica
- Monte o instrumento de acupuntura mecânica (IAM) (Figura 1).
- Prepare um instrumento de acupuntura mecânica (IAM) composto por uma unidade de controle personalizada e um vibrador mecânico conectado a uma agulha de acupuntura (Figura 1D). Use a unidade de controle para ajustar a intensidade da estimulação, a frequência de vibração e a duração da estimulação3,4,13.
- Utilize uma agulha de acupuntura estéril com diâmetro de 0,10 mm, haste de 10 mm e cabo de 10 mm. Fixe uma rolha de borracha à haste da agulha a uma distância de 3 mm da ponta da agulha para padronizar a profundidade de inserção.
- Conecte o motor vibratório à agulha de acupuntura usando um conector tipo clipe estável. Verifique se a agulha não escorrega durante a vibração e se a rolha permanece fixa durante a estimulação.
- Configure os parâmetros de estimulação.
- Defina a condição de estimulação como vibração contínua a 85 Hz e 1,3 m/s2 durante 20 s, o que gera formas de onda de aceleração estáveis durante a estimulação (Figura 1E).
NOTA: Experimentos de validação anteriores13 mostraram que a acupuntura manual gerou frequências de vibração de aproximadamente 70–90 Hz e valores de aceleração média de cerca de 1,3 m/s2 (Figura 1A,B). Com base nessas medições, o IAM foi configurado para fornecer estímulo vibratório a 85 Hz e 1,3 m/s2, o que se aproxima bastante das características mecânicas da acupuntura manual, ao mesmo tempo que oferece saída estável e reprodutível. A duração de 20 s da estimulação foi adotada a partir de estudos publicados anteriormente sobre otimização de parâmetros13 em um modelo de atividade locomotora induzida por cocaína em ratos, nos quais diferentes durações e intensidades de aceleração da estimulação foram comparadas para identificar uma condição eficaz e bem tolerada. Neste protocolo, “frequência” refere-se ao componente de frequência dominante da vibração da ponta da agulha, medido a partir do sinal do acelerômetro. Esse valor reflete a vibração transmitida à ponta da agulha durante a manipulação manual de torção do cabo, e não o ritmo mais lento de movimentos manuais repetidos realizados pelo operador. - Aplique a condição de 85 Hz e 1,3 m/s2 para gerar um padrão de vibração estável e reprodutível, comparável à manipulação manual da agulha (Figura 1E).
- Defina a condição de estimulação como vibração contínua a 85 Hz e 1,3 m/s2 durante 20 s, o que gera formas de onda de aceleração estáveis durante a estimulação (Figura 1E).
- Valide a saída de vibração.
- Para validar a saída estável de vibração, fixe firmemente a ponta da agulha ao acelerômetro, de modo que a vibração mecânica do motor seja transmitida diretamente da agulha ao sensor.
- Registre o sinal de aceleração durante o período de estimulação usando um sistema de aquisição de dados e analise o sinal com o software LabVIEW ou equivalente.
- Defina o valor de aceleração como a aceleração estável da ponta da agulha medida durante a fase de platô da estimulação, após a resposta transitória inicial, e calcule a frequência dominante de vibração a partir do sinal de aceleração.
- Realize a calibração antes de cada sessão experimental e sempre que o motor, conector, agulha ou acoplamento entre agulha e motor for substituído ou ajustado.
- Prossiga com os experimentos em animais somente quando a frequência dominante medida e a aceleração permanecerem estáveis durante a fase de platô e estiverem dentro de uma faixa aceitável dos parâmetros alvo de estimulação, como aproximadamente ±10% de 85 Hz e 1,3 m/s2.
NOTA: Traços representativos de aceleração gerados durante acupuntura manual e estimulação com IAM são mostrados nas Figuras 1B,E.
2. Preparação dos animais e modelo de atividade locomotora induzida por cocaína
- Prepare os animais experimentais.
- Utilize ratos machos Sprague-Dawley pesando entre 270–320 g para experimentos de atividade locomotora induzida por cocaína3,4,5. Mantenha os animais em ciclo claro/escuro de 12 h com acesso livre a alimento e água.
- Atribua 6–8 animais a cada grupo experimental, salvo indicação em contrário.
- Habitue os animais.
- Habitue cada rato aos procedimentos experimentais um dia antes dos testes. Realize manipulação suave e simulação de acupuntura sem inserção de agulhas por 2–3 min.
- Coloque os animais na câmara de atividade locomotora por 90 min para reduzir respostas comportamentais relacionadas ao estresse durante os procedimentos de estimulação em estado de vigília.
- Antes do experimento de acupuntura, habitue os ratos diariamente ao manuseio com pinça e à contenção manual leve pela mesma duração do procedimento de acupuntura planejado.
- Durante a estimulação, segure suavemente o animal à mão para estabilizar o corpo e o membro anterior sem pressão excessiva. Contenha levemente os animais do grupo controle (sem acupuntura) da mesma forma e pela mesma duração, mas sem inserção de agulhas, para controlar os efeitos generalizados do estresse por imobilização.
NOTA: Os operadores devem ser treinados para realizar a contenção, inserção de agulhas e estimulação de maneira consistente. - Se forem observadas luta persistente, vocalização, tentativas de fuga ou outras respostas excessivas de estresse, interrompa o procedimento e forneça habituação adicional antes dos testes.
NOTA: Realize todos os procedimentos de estimulação por acupuntura em animais acordados sob contenção manual leve.
3. Localização do ponto de acupuntura
- Localize os pontos de acupuntura HT7 e LI5.
- Localize os acupontos utilizando o método transposicional, no qual a localização do acuponto humano é mapeada no sítio anatômico correspondente no animal.
- Identifique o HT7 (Shenmen) na prega transversal do punho da pata dianteira, na região radial ao tendão do músculo flexor ulnar do carpo3,4,5,8.
NOTA: Esta localização corresponde anatomicamente à região do túnel ulnar/canal de Guyon, próxima ao nervo ulnar. Em contraste, o LI5 está localizado na extremidade radial da face dorsal do punho, entre os tendões do músculo extensor do polegar e do músculo extensor curto do polegar. O LI5 está posicionado no lado oposto ao HT7 e a cerca de 5 mm de distância (Figura 1F). Esses marcos anatômicos foram utilizados para garantir a localização reprodutível dos pontos de acupuntura14.
- Localize pontos de acupuntura controle.
- Utilize o LI5 como ponto controle próximo ao punho. Localize o LI5 a aproximadamente 5 mm do HT7, próximo à extremidade distal do rádio, entre os tendões do músculo palmar longo e do músculo flexor radial do carpo.
4. Procedimento de estimulação mecânica
- Realize experimentos de atividade locomotora.
- Coloque a rata na câmara de campo aberto e permita 60 min de habituação. Registre a atividade locomotora basal por 30 min.
- Administre cocaína por via intraperitoneal na dose de 15 mg/kg para induzir ativação locomotora3,4,5. Restrinja levemente o animal 1 min após a injeção de cocaína.
- Para padronizar a profundidade de inserção, fixe um tampão de borracha no eixo da agulha a 3 mm da ponta da agulha (Figura 1D). Certifique-se de que o tampão esteja firmemente preso para permanecer estável durante a inserção e a vibração.
- Durante a inserção da agulha, avance-a até que o tampão entre em contato suave com a superfície da pele, evitando compressão excessiva da pele, o que poderia alterar a profundidade efetiva de inserção.
- Aplique estimulação mecânica.
- Aplique estimulação vibratória contínua a 85 Hz e 1,3 m/s2 durante 20 s, a condição de estimulação otimizada identificada em experimentos de validação de parâmetros (Figura 2A–C). Mantenha a agulha no lugar por 1 min após a inserção, depois retire-a.
- Continue registrando a atividade locomotora por até 60 min após a injeção de cocaína. Analise a atividade locomotora em intervalos de 10 min ou como distância total percorrida ao longo de 60 min (Figura 1C).
- Aplique a estimulação de 20 s como condição padrão, pois essa duração produziu inibição acentuada da atividade locomotora induzida por cocaína em experimentos de validação anteriores (Figura 2A–C).
NOTA: A estimulação contínua de 40 s induziu comportamentos semelhantes ao estresse, incluindo vocalização e respostas de evitação, e por isso foi excluída das condições padrão de estimulação.
- Realize experimentos de validação de parâmetros do estímulo.
- Compare durações de estimulação de 0 s, 10 s, 20 s e 40 s ou compare diferentes configurações de aceleração, como 0,7 e 1,3 m/s2, para validar os parâmetros de estimulação (Figura 2).
- Aplique estimulação de 50 Hz como condição com viés para corpúsculos de Meissner e estimulação de 200 Hz como condição com viés para corpúsculos de Pacini em experimentos relacionados a mecanorreceptores, conforme descrito anteriormente4,8.
5. Aquisição de dados e análise estatística
- Meça a atividade locomotora utilizando um sistema de rastreamento por vídeo com câmera acima. Coloque os animais em uma câmara quadrada de campo aberto (40 cm × 40 cm × 45 cm) e quantifique a distância total percorrida usando software de rastreamento de vídeo.
- Registre os traços de aceleração-tempo a partir da saída do acelerômetro durante experimentos de calibração de vibração. Relate a frequência dominante, a amplitude de aceleração e a duração estável da vibração (Figura 1D,E).
- Avalie a distribuição dos dados quanto à normalidade antes da análise estatística paramétrica. Quando os dados atenderem às premissas de normalidade, analise as diferenças entre grupos utilizando análise de variância unidirecional ou bidirecional, seguida de comparações post hoc apropriadas.
- Realize o rastreamento e análise comportamental por pesquisadores cegos quanto à alocação do grupo experimental sempre que possível.
- Expresse os dados comportamentais e fisiológicos como média ± erro padrão da média (SEM). Analise a atividade locomotora utilizando análise de variância (ANOVA) unidirecional ou bidirecional com medidas repetidas, seguida do teste post hoc de Tukey.
NOTA: Os tamanhos das amostras foram selecionados com base em estudos anteriores que utilizaram o mesmo modelo de atividade locomotora induzida por cocaína em ratos e o mesmo protocolo de estimulação mecânica de acupuntura. Para garantir potência estatística suficiente, foram utilizados 6–8 ratos por grupo. Os animais foram excluídos da análise apenas quando ocorreram problemas técnicos ou procedimentais pré-definidos, incluindo localização incorreta do ponto de acupuntura, mau funcionamento do dispositivo, saída de vibração instável durante a calibração ou falha no rastreamento de vídeo.
Resultados
Validação da estimulação mecânica reproduzível
A configuração representativa do dispositivo e a validação da saída de vibração mostradas na Figura 1 foram geradas para o presente manuscrito, enquanto as faixas de referência quantitativas para os parâmetros de vibração derivados da acupuntura manual foram resumidas de estudos de validação anteriores.
O MAI foi validado comparando a saída mecânica gerada durante a manipulação manual da acupuntura com aquela gerada pela estimulação por dispositivo (Figura 1). A manipulação manual de uma agulha de acupuntura produziu picos abruptos e irregulares de aceleração na ponta da agulha, com variabilidade substancial entre operadores13. No estudo original de validação, os valores de aceleração variaram de 0,1 m/s2 a 2,9 m/s2, com um valor médio de aproximadamente 1,3 m/s2, e foram detectadas frequências dominantes de vibração de aproximadamente 70–90 Hz durante a manipulação manual da agulha (Figura 1A,B)3,13.
Com base nessas medições, o MAI foi configurado para fornecer estímulos vibratórios reprodutíveis a 85 Hz e 1,3 m/s2. Nessas condições, o dispositivo gerou formas de onda de aceleração estáveis e contínuas durante a estimulação, demonstrando que a vibração manual de agulhas pode ser convertida em uma entrada mecânica quantificável e reprodutível (Figura 1D,E).
Essa observação representa uma validação mecânica direta da saída do dispositivo, e não uma interpretação comportamental ou mecanicista. Esses achados confirmam a capacidade da plataforma MAI de padronizar a estimulação mecânica da acupuntura, ao mesmo tempo que preserva as características de vibração comparáveis às da manipulação manual da acupuntura.
Validação comportamental em um modelo de atividade locomotora induzida por cocaína
Os dados comportamentais mostrados na Figura 2 são apresentados como dados representativos de validação de estudos anteriores de IMA utilizando um modelo de atividade locomotora induzida por cocaína em ratos, salvo indicação em contrário na legenda da figura.
A eficácia biológica do protocolo foi avaliada utilizando um modelo de atividade locomotora induzida por cocaína (Figura 2). A administração de cocaína aumentou acentuadamente a atividade locomotora, enquanto a estimulação por MAI no ponto HT7 atenuou significativamente a hiperlocomoção induzida pela cocaína4,5,7,8,13. Esses experimentos foram geralmente realizados com 6–8 ratos por grupo, e a significância estatística foi determinada por meio de comparações baseadas em ANOVA, conforme relatado nos estudos originais. O efeito inibitório dependia da duração da estimulação e foi mais acentuado após 20 s de estimulação em 85 Hz e 1,3 m/s2 (Figura 2A–C).
Experimentos de otimização de parâmetros de estimulação demonstraram ainda que o efeito inibitório dependia da intensidade da estimulação e da localização do ponto de acupuntura. A estimulação mecânica aplicada no ponto HT7 reduziu significativamente as respostas locomotoras induzidas pela cocaína, enquanto a estimulação do ponto de controle próximo LI5, em condições idênticas, não conseguiu suprimir a atividade locomotora4,13. Assim, a observação comportamental direta foi que a estimulação do HT7 reduziu a atividade locomotora induzida pela cocaína, enquanto a estimulação do LI5 não produziu o mesmo efeito inibitório sob condições de estimulação equivalentes (Figura 2D,E). Esses achados indicam que o efeito comportamental era específico do ponto de acupuntura, e não uma consequência inespecífica da contenção ou da estimulação do punho.
Evidências prévias de validação para as vias periféricas e centrais envolvidas na estimulação da IMA
Os resultados desta seção são resumidos de estudos prévios de validação mecanicista. Experimentos de validação periférica e central apoiaram ainda mais a especificidade do protocolo MAI (Figura 3). O efeito inibitório da estimulação de HT7 foi significativamente reduzido pela injeção de anestésico local e abolido pela secção do nervo ulnar, indicando que a sinalização aferente ulnar periférica intacta é necessária para os efeitos comportamentais da estimulação de acupuntura mecânica3,13. Em contraste, a secção dos nervos radial ou mediano não aboliu o efeito inibitório da estimulação de HT7, o que sustenta a especificidade anatômica da via aferente ulnar. Esses experimentos foram realizados com tamanhos de grupo relatados nos estudos originais, tipicamente 6–8 ratos por grupo, salvo indicação em contrário.
Gravações representativas demonstraram que a estimulação do IAM ativou preferencialmente vias de fibras A mielinizadas de grande calibre associadas aos mecanorreceptores, incluindo corpúsculos de Pacini e de Meissner, enquanto respostas relativamente mais fracas foram observadas na via nociceptiva de fibras C/Aδ5,13. Esta afirmação refere-se a observações eletrofisiológicas diretas das respostas aferentes. A interpretação de que essas respostas refletem sinalização associada aos mecanorreceptores é apresentada como uma inferência em nível de via, baseada em estudos de validação prévios. Além disso, a estimulação mecânica do nervo ulnar ativou a via coluna dorsal–núcleo cuneiforme, e a interrupção dessa via impediu o efeito inibitório sobre as respostas locomotoras induzidas pela cocaína3. Estudos posteriores demonstraram ainda o envolvimento do hipotálamo lateral, da via córtex pré-frontal medial–habenula lateral, do núcleo tegmental rostromedial e da circuitaria dopaminérgica mesolímbica na supressão mediada pelo IAM das respostas comportamentais relacionadas à cocaína (Figura 4)3,4,7,8,13,15. Esses estudos sobre vias centrais incluíram abordagens de interrupção ou inibição de vias, tais como lesão eletrolítica, lesão química induzida por ácido ibotênico e inibição optogenética mediada por halorodopsina, para testar se esses circuitos eram necessários para os efeitos comportamentais da estimulação do HT7. Como esses experimentos envolvem manipulações especializadas em nível de circuito, são aqui resumidos como evidências de validação prévia, em vez de serem apresentados como procedimentos experimentais passo a passo.
Coletivamente, esses resultados representativos demonstram que a estimulação baseada em MAI fornece um protocolo de acupuntura mecânica reprodutível e quantificável, capaz de ativar vias periféricas definidas de mecanorreceptores e modular circuitos neurais e respostas comportamentais relacionados à recompensa.
Figura 1: Desenvolvimento e validação do instrumento mecânico de acupuntura (MAI). (AIlustração esquemática mostrando a variabilidade na manipulação da acupuntura manual entre diferentes operadores.B) Traços representativos de aceleração gerados durante a manipulação de acupuntura manual. (C) Efeito da acupuntura manual em HT7 realizada por quatro operadores diferentes sobre a atividade locomotora induzida pela cocaína, ilustrando a variabilidade entre operadores nos efeitos comportamentais da estimulação manual. (D) Imagem anotada do MAI montado mostrando a agulha, o clipe de crocodilo, o motor de vibração e a rolha de borracha utilizada para padronizar a profundidade de inserção de 3 mm. (E) Forma de onda de aceleração representativa gerada pelo MAI a 85 Hz e 1,3 m/s2, demonstrando estimulação mecânica estável e reprodutível. (FImagens representativas mostrando as localizações anatômicas de HT7 e LI5 na pata dianteira de rato. Pontos vermelhos indicam as localizações dos pontos de acupuntura utilizadas para a inserção da agulha. HT7 foi identificado na prega transversal do punho próximo ao tendão do flexor ulnar do carpo, enquanto LI5 foi identificado no lado radial do dorso do punho, entre os tendões do extensor do polegar e do extensor curto do polegar, fornecendo referências anatômicas reprodutíveis para a localização dos pontos de acupuntura. Esta figura foi adaptada com permissão de Kim et al.13. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Otimização dos parâmetros de estimulação mecânica no modelo de atividade locomotora induzida por cocaína. (A–C) Efeitos da duração da estimulação, intensidade da estimulação e profundidade de inserção da agulha na atividade locomotora induzida por cocaína. (A) A estimulação HT7-MAI foi aplicada por 0, 10, 20 ou 40 s a 85 Hz e 1,3 m/s2. (B) A estimulação HT7-MAI foi aplicada por 20 s com diferentes intensidades de aceleração. (C) A estimulação HT7-MAI foi aplicada com diferentes profundidades de inserção da agulha. (D) Traços representativos de movimento durante o teste de atividade locomotora após administração de solução salina, cocaína, cocaína com estimulação em HT7 ou cocaína com estimulação em LI5. (E) A estimulação de acupuntura mecânica em HT7, mas não em LI5, aplicada a 85 Hz e 1,3 m/s2 por 20 s, atenuou significativamente o aumento da atividade locomotora induzido pela cocaína. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). *p < 0,05 em comparação com o controle tratado com cocaína. Esta figura foi adaptada com permissão de Kim et al.13. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Validação dos efeitos da acupuntura mediada por MAI em aferentes periféricos e mecanorreceptores. (A) Diagrama esquemático da sinalização periférica para central induzida pela acupuntura mecânica. A estimulação vibratória em HT7 ativa mecanorreceptores, incluindo corpúsculos de Meissner e de Pacini, nos tecidos cutâneos e subcutâneos. Esses sinais são transmitidos por aferentes de grandes fibras mielinizadas do tipo A do nervo ulnar até os segmentos medulares C8–T1 e, subsequentemente, influenciam o sistema dopaminérgico mesolímbico. (B) Efeito da injeção de anestésico local sobre o efeito inibitório da estimulação HT7-MAI. A injeção de bupivacaína ao redor de HT7 reduziu o efeito supressor da estimulação HT7 sobre a atividade locomotora induzida pela cocaína, indicando o envolvimento da sinalização aferente periférica local. (C–H) Respostas aferentes somáticas de fibras associadas aos corpúsculos de Pacini e de fibras associadas aos corpúsculos de Meissner durante a estimulação MAI em HT7. (I–N) Respostas de fibras A e fibras C durante a estimulação MAI em HT7. A estimulação MAI ativou robustamente os aferentes das fibras A e produziu respostas mais fracas nas fibras C. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). *p < 0,05 em comparação com a linha de base ou controle tratado com cocaína, conforme apropriado. Esta figura foi adaptada com permissão de Kim et al.13. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Via neural periférica a central proposta que sustenta a modulação mediada por IA na resposta induzida pela cocaína e no sistema dopaminérgico mesolímbico. A estimulação de IA na pele ativa os nervos sensoriais periféricos e transmite sinais somatossensoriais por meio de vias ascendentes espinhais. Essas entradas são retransmitidas para circuitos cerebrais que envolvem o mPFC, LHb, RMTg, VTA e NAc. A ativação da via mPFC–LHb–RMTg pode aumentar a inibição GABAérgica dos neurônios dopaminérgicos do VTA, reduzindo assim a liberação de dopamina no NAc e suprimindo a ativação psicomotora induzida pela cocaína. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
Discussão
Este estudo apresenta um protocolo padronizado para aplicação de acupuntura mecânica utilizando um dispositivo de estimulação vibratória que permite a administração reprodutível de estímulo mecânico baseado em vibração. Ao fornecer controle quantitativo da frequência de estimulação, intensidade de aceleração e duração, esta abordagem supera uma limitação importante da acupuntura manual tradicional, que depende inerentemente da técnica do profissional e é difícil de padronizar.
Uma das principais vantagens deste protocolo é a sua capacidade de isolar e padronizar o componente mecânico da estimulação de acupuntura. Diferentemente da acupuntura manual, que varia significativamente entre profissionais, o MAI gera uma estimulação vibratória estável e reprodutível diretamente através da agulha de acupuntura inserida. Essa reprodutibilidade é particularmente importante para estudos mecanicistas que investigam a base neural e fisiológica dos efeitos da acupuntura.
Em comparação com a eletroacupuntura (EA), o presente protocolo permite investigar a estimulação mecânica sem introduzir corrente elétrica externa. Essa distinção é importante porque a estimulação elétrica pode diretamente despolarizar fibras nervosas periféricas de acordo com a excitabilidade elétrica, configuração do eletrodo, intensidade da corrente e impedância tecidual16,17. Em contraste, o IMA gera principalmente deformação mecânica dos tecidos cutâneos e subcutâneos locais ao redor da agulha inserida. Portanto, este protocolo reproduz mais fielmente o componente físico da acupuntura manual, ao mesmo tempo que permite o controle quantitativo dos parâmetros de estimulação.
Estudos prévios de validação demonstraram que a estimulação por IMA em HT7 suprime a atividade locomotora induzida pela cocaína por meio de mecanismos aferentes periféricos13. O efeito inibitório foi bloqueado pela anestesia local em HT7 e abolido pela secção do nervo ulnar, indicando que a sinalização aferente ulnar intacta é necessária para os efeitos comportamentais da estimulação por acupuntura mecânica. Importante ressaltar que o efeito inibitório não foi impedido pelo bloqueio das vias das fibras C/Aδ e não foi reproduzido pela estimulação nociceptiva seletiva, sugerindo que a estimulação por IMA ativa principalmente vias de fibras A mielinizadas de grande calibre, ao invés de aferentes nociceptivos.
A natureza baseada em mecanorreceptores deste protocolo distingue ainda mais a estimulação por MAI da AE. A frequência de estimulação descrita aqui representa a frequência dominante da vibração oscilatória transmitida à ponta da agulha, e não o ritmo de movimentos manuais repetidos. Estudos anteriores mostraram que frequências de vibração associadas à ativação dos corpúsculos de Meissner e de Pacini suprimiram efetivamente as respostas locomotoras induzidas pela cocaína5,18. Esses achados sustentam a interpretação de que a acupuntura mecânica baseada em vibração ativa aferentes associados a mecanorreceptores de baixo limiar nos tecidos superficiais e profundos e transmite sinais por meio de vias de grandes fibras A do nervo ulnar3,13. Assim, o MAI representa um modelo experimental intermediário entre a acupuntura manual e a AE, preservando o componente mecânico baseado em agulha da acupuntura manual, ao mesmo tempo que permite que a estimulação seja padronizada e quantificada.
A validade biológica deste protocolo é ainda apoiada por evidências em nível de vias metabólicas. A estimulação mecânica ulnar ativou a via coluna dorsal–núcleo cuneiforme, e a interrupção dessa via aboliu o efeito inibitório sobre a atividade locomotora induzida pela cocaína3. Em contraste, lesões do trato espinotalâmico não impediram o efeito comportamental, sugerindo que vias somatossensoriais táteis inócuas e relacionadas à vibração, e não a sinalização nociceptiva, estão envolvidas. Mecanicamente, esses estudos anteriores indicam que a estimulação HT7 baseada em MAI ativa uma via periférica para central que conecta as fibras aferentes mielinizadas de grande calibre (fibras A) no nervo ulnar à regulação dopaminérgica mesolímbica. Esses sinais somatossensoriais são transmitidos através da via coluna dorsal–núcleo cuneiforme e subsequentemente recrutam circuitos moduladores mesolímbicos descendentes, incluindo a via mPFC–LHb–RMTg–VTA–NAc. Essa via pode contribuir para a supressão da atividade locomotora induzida pela cocaína e das respostas comportamentais relacionadas à dopamina4,6,7,8. Em conjunto, esses achados indicam que o protocolo MAI fornece uma plataforma experimental reprodutível para investigar como a estimulação mecânica periférica definida modula circuitos neurais centrais e comportamentos relacionados à recompensa.
Várias etapas críticas devem ser consideradas para a aplicação bem-sucedida deste protocolo. Primeiro, a localização do ponto de acupuntura deve ser anatomicamente precisa. Para a estimulação de HT7 em roedores, a prega transversal do punho e o tendão do flexor ulnar do carpo servem como marcos anatômicos essenciais13,19. Segundo, a profundidade de inserção deve ser padronizada utilizando o limitador, pois variações não controladas na profundidade de inserção podem aumentar a variabilidade experimental20. Terceiro, é necessária uma acoplamento estável entre a agulha e o motor para garantir a transmissão precisa da vibração até a ponta da agulha. Por fim, deve-se evitar a estimulação excessiva. Estudos prévios de validação mostraram que a estimulação contínua prolongada, como vibração de 40 s, induziu respostas comportamentais semelhantes ao estresse, enquanto a estimulação de 20 s produziu efeitos comportamentais robustos com melhor tolerabilidade13.
Apesar dessas vantagens, várias limitações devem ser reconhecidas. A estimulação gerada pelo MAI representa apenas um subconjunto das técnicas de acupuntura manual e não reproduz completamente as manipulações multidirecionais realizadas por profissionais experientes. Além disso, a maioria das validações deste protocolo foi realizada em modelos animais, e sua aplicabilidade direta em ambientes clínicos humanos permanece a ser mais investigada.
O MAI não reproduz a complexidade multidimensional completa da acupuntura manual tradicional, incluindo movimentos de elevação-empurrão, rotação, deformação tecidual bidirecional e feedback tátil dependente do praticante. Portanto, a estimulação vibratória fornecida pelo MAI não deve ser interpretada como uma representação completa da acupuntura manual. Em vez disso, este protocolo padroniza o componente mecânico baseado em vibração transmitido à ponta da agulha durante a manipulação manual por movimentos rápidos no cabo.
Embora este protocolo tenha sido validado principalmente utilizando a estimulação do ponto HT7 em ratos Sprague-Dawley machos em um modelo de atividade locomotora induzida por cocaína, o IMA pode ser adaptado a outros pontos de acupuntura e modelos experimentais. No entanto, pode ser necessária uma re-otimização dos parâmetros, pois a profundidade dos tecidos, a anatomia local, a distribuição de mecanorreceptores e a composição dos nervos aferentes podem variar entre pontos de acupuntura, espécies, linhagens, sexos e condições patológicas.
Aplicações futuras dessa abordagem podem incluir sua integração em plataformas padronizadas de pesquisa em neuromodulação e sua adaptação para estudos translacionais e clínicos de acupuntura. Um aprimoramento adicional do dispositivo pode permitir um controle mais preciso dos padrões de estimulação e facilitar uma aplicação mais ampla em diversos modelos de doenças. Em última análise, este protocolo pode ajudar a conectar a prática tradicional da acupuntura com as modernas neurociências, permitindo a investigação reproduzível e quantificável dos mecanismos fisiológicos mediados pela acupuntura.
Divulgações
Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes nem conflitos de interesse relacionados a este estudo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Korea Institute of Oriental Medicine (KIOM) sob a concessão nº KSN2512011, pela Korea Health Technology R&Projeto #38;D através do Instituto de Desenvolvimento da Indústria da Saúde da Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde & Bem-Estar da República da Coreia (RS-2024-00443893) e pela concessão do National Research Foundation da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (RS-2024-00349070). Gostaríamos de expressar nossa sincera gratidão à Equipe de Pesquisa de Pontos de Acupuntura do Instituto Coreano de Medicina Oriental, ao Departamento de Estudos de Meridianos e Pontos de Acupuntura da Universidade Daegu Haany e ao Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina da Universidade Yonsei pelo apoio inestimável e pelas discussões perspicazes relacionadas ao desenvolvimento e validação do instrumento mecânico de acupuntura.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acelerômetro | PCB Piezotronics | PO-AXA-12-01 | Utilizado para medição de vibração |
| Agulha de acupuntura (0,10 mm × 10 mm) | Dongbang Acupuncture Inc. | DB102 | Agulha de acupuntura descartável e estéril |
| Conector com clipe de jacaré | N/A | N/A | Utilizado para conectar o vibrador à agulha de acupuntura |
| Bupivacaína hidrocloreto (0,5%) | Huons Pharm, Korea | HIRA Code (199502333) | Utilizado em experimentos de anestesia local |
| Cocaína hidrocloreto | Macfarlan Smith Ltd | 53-21-4 | Utilizado em experimentos de locomoção induzida por cocaína |
| Unidade de controle | Personalizado | N/A | Utilizado para ajustar a frequência de estimulação, intensidade de aceleração e duração |
| Software de aquisição de dados | LabVIEW | LabVIEW 7 Express (7.0) | Utilizado para análise de sinal de vibração |
| Sistema de aquisição de dados | National Instruments | DAQ-NI USB-6200 | Utilizado para digitalização do sinal |
| Instrumento de acupuntura mecânica (MAI) | Personalizado | N/A | Dispositivo construído sob medida, composto por unidade de controle, motor vibratório, conector do tipo clipe, agulha de acupuntura e rolha de borracha |
| Câmara de locomoção em campo aberto | Personalizado | caixa quadrada de campo aberto (40 cm × 40 cm× 45 cm) feita de acrílico preto. | Utilizado para análise de atividade locomotora |
| Rolha de borracha | N/A | N/A | Montada a 3 mm da ponta da agulha para padronizar a profundidade de inserção |
| Ratos Sprague-Dawley | Orient Bio | Crl:CD(SD)IGS | Machos, 270–320 g |
| Motor vibratório | Motor Bank | MB-0412V | Utilizado para estimulação vibratória mecânica |
| Software de rastreamento por vídeo | EthoVision XT | Ethovision 3.1 | Utilizado para rastreamento locomotor |
Referências
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Reimpressões e permissões
