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Artigo de investigação

Liuwei Dihuang Wan inibe a osteoclastogênese e a perda óssea induzida por ovariectomia ao suprimir a sinalização de NF-κB

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DOI:

10.3791/72270

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28 de julho de 2026

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1School of Medicine, Nankai University, 2School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 3Emergency Medical Center, Ningbo Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 4The Second People's Hospital of Changzhou, the Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo demonstrou que a Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) suprime a diferenciação de osteoclastos e a perda óssea induzida por ovariectomia ao inibir a via de sinalização NF-κB, conforme revelado por análise LC-MS/MS, farmacologia em rede e validação in vivo e in vitro.

Resumo

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW), uma fórmula clássica da medicina tradicional chinesa, é amplamente utilizada para tratar várias doenças associadas à deficiência renal e demonstrou eficácia clínica satisfatória na osteoporose pós-menopáusica (PMOP). No entanto, seus mecanismos farmacológicos permanecem incertos. Para resolver isso, primeiro analisamos os componentes químicos do LWDHW usando LC-MS/MS, que identificou 1.615 componentes. A farmacologia em redes então previu que a inflamação e a via de sinalização NF-κB são potenciais mecanismos terapêuticos subjacentes aos efeitos do LWDHW sobre o PMOP. Subsequentemente, 27 camundongos Fêmeas C57BL/6J foram aleatoriamente atribuídas aos grupos Sham, Model e LWDHW. Os camundongos dos dois últimos grupos passaram por ovariectomia bilateral (OVX), e os do grupo LWDHW receberam LWDHW oral a 9,75 g/kg/dia durante 8 semanas. Amostras de soro e fêmur foram coletadas para o Ensaio de Imunossorvio Ligado a Enzimas (ELISA), Microtomografia Computacional (μCT), exame histológico e imunohistoquímica (IHC). Macrófagos primários derivados da medula óssea (BMMs) foram tratados com LWDHW e depois submetidos à coloração por TRAP e qRT-PCR. Em camundongos OVX, o LWDHW aliviou significativamente a perda óssea e a deterioração da microarquitetura óssea, acompanhadas por redução dos níveis séricos de β-CTX e diminuição dos números de osteoclastos nos tecidos femorais. A coloração com IHC revelou expressão notavelmente menor de TNF-α, IL-1β e p-P65 em tecidos femurais de camundongos tratados com LWDHW em comparação com o grupo-modelo. In vitro, a coloração TRAP demonstrou que LWDHW inibiu a diferenciação de osteoclastos induzida por RANKL/M-CSF e reduziu a expressão de Ctsk, MMP9 e Nfatc1. A análise Western blot mostrou ainda que os níveis de proteína de P65, p-P65, IκBα e p-IκBα foram significativamente reduzidos nos BMMs após o tratamento com LWDHW. Coletivamente, o LWDHW alivia a osteoporose pós-menopáusica, possivelmente suprimindo a osteoclastogênese mediada pela sinalização de NF-κB.

Introdução

A osteoporose pós-menopáusica (PMOP) é uma doença metabólica óssea prevalente caracterizada pela perda de massa óssea e deterioração da microarquiteturaóssea 1. Com o crescimento da população envelhecida, a incidência crescente de PMOP tornou-se uma questão global de saúde pública que ameaça seriamente a saúde das mulherespós-menopáusicas 2. Na China, a prevalência geral do PMOP chega a 32,1%. Indivíduos afetados são mais suscetíveis a complicações graves, como dor crônica nas costas, deformidades na coluna e fraturas porfragilidade 4,5. Atualmente, medicamentos aprovados pela FDA para osteoporose incluem bisfosfonatos6, hormônio paratireoidiano67e denosumabe8, amplamente utilizados na prática clínica. No entanto, sua aplicação a longo prazo é frequentemente limitada por vários efeitosadversos 9. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver agentes terapêuticos mais seguros e eficazes para o PMOP. Entre as alternativas potenciais, os remédios fitoterápicos chineses têm ganhado cada vez mais atenção devido à sua eficácia reconhecida e perfil de segurançafavorável 10.

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) é uma fórmula clássica da medicina tradicional chinesa (MTC), documentada pela primeira vez no antigo texto Chave para a Terapêutica das Doenças Infantis durante a Dinastia Song. Por milhares de anos, o LWDHW tem sido amplamente utilizado na prática clínica para tratar várias doenças atribuídas à deficiência renal 11,12,13,14. De acordo com a teoria da MTC de "ossos que regem o rim", a perda de massa óssea e a deterioração óssea em pacientes com PMOP são causadas principalmente pela nutrição insuficiente da essência renal15. Consequentemente, a LWDHW é comumente aplicada no manejo clínico da PMOP e demonstrou eficácia terapêuticadefinitiva 16,17. No entanto, embora estudos em animais e clínicos tenham revelado que o LWDHW exerce múltiplos efeitos farmacológicos, incluindoantioxidativo 18,anti-inflamatório 19 e antifibróticos14, seu mecanismo subjacente contra o PMOP permanece amplamente desconhecido.

A homeostase óssea depende do equilíbrio entre a reabsorção óssea por osteoclastos e a formação óssea porosteoblastos 20. Esse equilíbrio é prejudicado à medida que a diferenciação e atividade dos osteoclastos são intensificadas sob condições inflamatórias, levando a uma reabsorção ósseaacelerada 21. Nesse processo, a via NF-κB serve como reguladora central. Fatores inflamatórios como TNF-α e IL-1β podem induzir a fosforilação e degradação de IκBα, desencadeando a translocação nuclear de p65 fosforilado (p-P65)22. Consequentemente, genes específicos do osteoclasto a jusante, incluindo Ctsk, Mmp9 e Nfatc1, são ativados para promover a osteoclastogênese23,24.

Farmacologia de redes é um campo interdisciplinar que integra ciência da computação, farmacologia e bioinformática25. Apresenta vantagens distintas em explorar de forma abrangente os mecanismos farmacológicos subjacentes aos efeitos terapêuticos das ervaschinesas 26. No presente estudo, a farmacologia em redes foi empregada para prever os potenciais processos biológicos e vias de sinalização envolvidos nos efeitos antiosteoporóticos do LWDHW. Simultaneamente, os componentes químicos do LWDHW foram analisados usando LC-MS/MS. Além disso, foram realizados testes in vivo utilizando um modelo de camundongo OVX e experimentos in vitro com macrófagos derivados da medula óssea primária (BMMs) para investigar mais a fundo o mecanismo farmacológico do LWDHW contra o PMOP. O fluxo de trabalho é apresentado na Figura 1.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (IACUC-202402-07).

Preparação e análise LC-MS/MS do LWDHW

A fórmula do LWDHW consiste em seis ervas chinesas: Rehmannia glutinosa (Gaertn.), Cornus officinalis (Sieb.), Paeonia suffruticosa (Andr.), Dioscoreae oposta (Thunb.), Poria cocos (Schw.) e Alisma orientale (Sam.). Informações detalhadas sobre essas ervas estão listadas na Tabela 1. Todas as ervas cruas eram fornecidas pelo Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (Hangzhou, China) e fervidas em água purificada com uma proporção erva-água de 0,1 kg/L. O extrato aquoso resultante foi filtrado e concentrado em uma solução funcional a 0,5 g/mL para análises posteriores de LC-MS/MS e experimentos com animais. Além disso, a solução de trabalho era processada em pó liofilizado para experimentos celulares.

Na análise LC-MS/MS, as condições da cromatografia líquida foram as seguintes: fase móvel A (aquosa) e fase móvel B (orgânica) consistiram em 0,1% de ácido fórmico na água e acetonitrila, respectivamente, para o modo iônico positivo, ou 5 mM de formato de amônio na água e acetonitrila, respectivamente, para o modo íon negativo. O tempo total de funcionamento era de 8 min, com vazão de 0,3 mL/min, temperatura na coluna de 40 °C e volume de injeção de 2 μL. Para espectrometria de massa, os dados foram adquiridos no modo MS-ddMS2 completo, com tensões de pulverização ajustadas a +3,50 kV (positivo) e –2,50 kV (negativo).

Ingredientes bioativos e alvos previsão do LWDHW

Os nomes individuais de seis ervas constituintes foram inseridos no banco de dados do Sistema de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP) para obter a lista completa de ingredientes do LWDHW. Os ingredientes bioativos foram posteriormente triados usando os parâmetros farmacocinéticos de biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e semelhança com o medicamento (DL) ≥ 0,18, 27,28,29,30. As proteínas correspondentes dos ingredientes bioativos foram identificadas e submetidas à UniProt para recuperar seus nomes geneais padronizados, que foram definidos como os alvos genéticos finais do LWDHW.

Alvos sobrepostos entre LWDHW e PMOP

Alvos gênicos associados ao PMOP foram recuperados pesquisando a palavra-chave "osteoporose pósmenopausal" tanto nos bancos de dados GeneCards quanto DisGeNET em 2 de outubro de 2024. Os alvos foram filtrados usando limiares de pontuação de >0,1 no DisGeNET e >10 no GeneCards, e entradas duplicadas foram removidas para obter um conjunto não redundante de genes relacionados ao PMOP. Posteriormente, os alvos derivados de ervas do LWDHW e os alvos associados ao PMOP foram importados para a ferramenta online do Venny para gerar um diagrama de Venn representando os alvos sobrepostos entre LWDHW e PMOP.

Ontologia Gênica (GO) e análise de enriquecimento de vias de sinalização

Os alvos sobrepostos entre LWDHW e PMOP foram sujeitos a análise de enriquecimento GO usando o banco de dados DAVID. Os termos GO recuperados foram classificados em três categorias, incluindo componente celular, função molecular e processo biológico (BP). Após filtrar FDR < 0,01, os 30 principais termos BP foram listados em um diagrama de bolhas em ordem decrescente de enriquecimento de dobra.

Em seguida, os alvos sobrepostos foram inseridos nos bancos de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) e Metascape para análise de enriquecimento de vias de sinalização. Os caminhos enriquecidos dos bancos de dados KEGG e Metascape foram classificados pelo número de alvos correspondentes em ordem decrescente, e os 25 melhores caminhos de cada banco de dados foram exibidos como gráficos de barras.

Construção da rede

As redes "Fórmula-Ervas-Ingredientes-Alvos-Doença" e "Alvos-Vias" foram construídas no Cytoscape para visualizar as inter-relações entre os componentes. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi gerada ao inserir os alvos sobrepostos no banco de dados STRING. Os alvos do hub dentro da rede foram identificados por triagem baseada em características topológicas, incluindo centralidade de grau (DC), centralidade entre os centros (BC) e centralidade de proximidade (CC).

Agrupamento animal, modelo de osteoporose induzida por OVX e intervenção medicamentosa

Um total de 27 fêmeas de camundongos C57BL/6J (2 meses, pesando 22 ± 2 g) foram fornecidos pelo Centro de Experimentos Animais da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang). Todos os animais foram alojados sob condições específicas livres de patógenos (FPS), com ciclo de 12 horas luz/escuro, temperatura ambiente mantida em 25 °C e umidade entre 40% e 60%, com livre acesso a alimento e água. Após 1 semana de alimentação adaptativa, os camundongos foram aleatoriamente atribuídos a três grupos (n = 9 por grupo) usando uma tabela de números aleatórios: Sham, Model e LWDHW. Ratos dos grupos Model e LWDHW passaram por ovariectomia bilateral (OVX) para estabelecer o modelo PMOP, enquanto o grupo Sham passou por um procedimento sham envolvendo a resseção de um volume equivalente de tecido adiposo periovariano. A partir de dois dias após a cirurgia, camundongos do grupo LWDHW receberam diariamente uma dose oral de solução de trabalho LWDHW em dose de 9,75 g/kg/dia (convertida da dose equivalente humana baseada na área da superfície corporal), enquanto os grupos Model e Sham receberam volume igual de soro fisiológico. Amostras biológicas, incluindo tecidos séricos e femurais, foram coletadas 8 semanas após a administração para análise subsequente. Nenhuma morte ou mortalidade inesperada ocorreu em nenhum dos grupos durante o período experimental.

Ensaio de imunossorvejante ligado a enzimas séricas (ELISA)

O sangue total foi coletado do plexo retroorbital e centrifugado a 1000 x g por 15 minutos a 4 °C para obter soro. As concentrações séricas de osteocalcina (OCN) e telopeptídeo β-C-terminal do colágeno tipo I (β-CTX) foram medidas usando os kits ELISA correspondentes, de acordo com os protocolos do fabricante.

μCT e análise biomecânica

Amostras femorais foram escaneadas usando um equipamento de microtomografia computorizada (μCT) de alta resolução com resolução isotrópica de 10 μm. A microestrutura tridimensional (3D) do fêmur distal foi reconstruída a partir das imagens adquiridas usando o software NRecon. Subsequentemente, os seguintes parâmetros da microarquitetura óssea, incluindo densidade mineral óssea (DMO, g/mm3), fração de volume ósseo (BV/TV, %), espessura trabecular (Tb.Th, mm) e número trabecular (Tb.N, 1/mm), foram quantificados dentro da região de interesse (ROI) do fêmur distal.

As propriedades biomecânicas das amostras femures (n = 3 por grupo) foram avaliadas por meio de um teste de flexão em três pontos usando um Sistema de Teste de Fadiga por Torção Axial. Uma carga compressiva foi aplicada à diáfise média a uma taxa constante de deslocamento de 2 mm/min até a falha estrutural. A carga máxima (N) era registrada automaticamente pelo software do sistema.

Coloração histomorfologia, imuno-histoquímica (IHC) e imunofluorescência (IF)

Após fixação com paraformaldeído a 4%, descalcificação em solução de EDTA a 14% e desidratação por uma série graduada de etanol, amostras femuris foram processadas em seções de parafina com 3 μm de espessura, conforme descritoanteriormente 31. As seções foram coradas com Alcian Blue Hematoxylin (ABH)/Orange G para avaliação morfológica. A análise quantitativa da área do osso trabecular na metáfise distal do femur foi realizada utilizando o software OsteoMetrics.

Amostras de fígado e rim foram fixadas, embutidas em parafina e cortadas em seções de 4 μm. Após desparafinização e reidratação rotineiras, as seções foram coradas com hematoxilina e eosina. O exame histológico foi realizado sob um microscópio óptico.

Os ensaios IHC e IF foram realizados em seções embutidas em parafina de acordo com procedimentos estabelecidos. Brevemente, a coleta de antígeno foi realizada incubando seções em tampão de citrato de 0,01 M a 60 °C por 4 horas. As cções foram então incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários incluindo ALP (1:300), IL-1β (1:500), TNF-α (1:500) e p-P65 (1:300). Após a incubação com anticorpos secundários correspondentes por 20 minutos, as seções foram submetidas à solução de diaminobenzidina (DAB) e contracoloração de hematoxilina para IHC ou coloridas com DAPI para marcação nuclear em IF. Para quantificação positiva por coloração, quatro campos selecionados aleatoriamente foram capturados de cada uma das três seções de tecido por amostra. Na coloração IHC, a densidade óptica média foi definida como a razão entre a densidade óptica integrada (IOD) e a área de cavidade correspondente, conforme determinado usando o software Image-Pro Plus. Na coloração de FI, a área positiva de coloração foi normalizada para a área do campo e expressa como porcentagem, e a quantificação foi realizada com o mesmo software.

Cultura primária de macrófagos da medula óssea (BMMs) e ensaio de contagem celular

As células da medula óssea foram removidas dos fêmures e tíbias de camundongos C57BL/6 de 2 meses com solução salina tamponada com fosfato (PBS). A suspensão resultante da célula foi filtrada por um filtro de 70 μm e centrifugada a 200 x g por 5 minutos. O pellet celular foi ressuspenso em meio completo α-MEM contendo 10% de soro bovino fetal. Após 24 horas de incubação a 37 °C em uma atmosfera com 5% de CO₂, células não aderentes foram removidas. Para induzir diferenciação de macrófagos, células aderentes foram cultivadas em meio contendo 50 ng/mL fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) e 40 ng/mL de RANKL por 5–7 dias até que BMMs maduros fossem observados.

Os BMMs eram revestidos em 3 x 10células de 4 poços em placas de 96 poços. Após 24 horas de tratamento com concentrações gradientes de LWDHW, os BMMs foram incubados com solução funcional do Kit de Contagem Celular 10% 8 (CCK-8) a 37 °C por 1 hora. A absorção de cada poço foi medida em 450 nm usando um leitor de microplacas.

Análise quantitativa de expressão gênica em BMMs primários

Os BMMs foram semeados em pratos de 6 cm com densidade de 3 x 106 células por prato. Após o tratamento com 500 e 1.000 μg/mL de LWDHW por 24 horas, o RNA total foi extraído dos BMMs usando o Kit de Purificação Rápida de RNA, conforme as instruções do fabricante. Após quantificação por espectrofotometria, 500 ng de RNA total foram transcritos reversamente em cDNA. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foi realizada usando primers específicos para genes (Tabela 2), e as condições de ciclo da PCR foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 30 s. Os níveis de expressão gênica foram analisados usando o método 2ΔΔCt , com o GAPDH como gene de referência interno.

Análise Western blot em BMMs primários

Após serem pratados em 3 x 106 células por recipiente em recipientes de 6 cm, os BMMs foram tratados com várias intervenções e depois lisados em gelo com tampão de lise RIPA. A proteína total foi coletada e quantificada com um Kit de Ensaio de Proteína BCA. Amostras de proteína (30 μg por pista) foram separadas por SDS-PAGE em géis de poliacrilamida a 12,5% e transferidas para membranas PVDF de 0,2 μm. Após bloqueio por 20 minutos, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com os seguintes anticorpos primários: P65 (1:1000), p-P65 (1:1000), IκBα (1:1000), p-IκBα (1:1000) e β-actina (1:1000). No dia seguinte, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas usando um Kit de Detecção de Quimiluminescência ECL e capturadas usando um Sistema Automático de Análise de Imagem por Quimioluminescência.

Coloração de TRAP em tecidos femurais e BMMs

Seções de tecido femoral e BMMs placados em placas de 24 poços em 1 x 10 célulasde 5 poços foram corados usando um kit de coloração com fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP), seguindo o protocolo do fabricante. A superfície do osso trabecular coberta por osteoclasto (Oc.S/BS) em seções de tecido e a área de formação do osteoclasto nas culturas de BMM foram quantificadas usando o software Image-Pro Plus.

Análise estatística

Todos os dados foram apresentados como média ± desvio padrão. Uma ANOVA unidirecional seguida pelo teste de Dunnett foi usada para análise estatística no SPSS. *p < 0,05 e **p < 0,01 foram considerados estatisticamente significativos.

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Resultados

Componentes químicos do LWDHW analisados por LC-MS/MS

O perfil químico da solução aquosa LWDHW foi caracterizado por análise LC-MS/MS. Um total de 1615 componentes foram identificados, compreendendo 968 detectados em modo de ionização positiva e 647 em modo de ionização negativa (Figura 2A). Os detalhes dos 10 principais componentes de cada modo de ionização estão listados na Figura 2B,C<...

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Discussão

Com o envelhecimento da população global, o PMOP tornou-se uma grave preocupação de saúde mundial, afetando milhões de mulheresanualmente, 36. Diante dos efeitos colaterais associados aos atuais medicamentos antiosteoporóticos, é fundamental desenvolver estratégias terapêuticas mais seguras e eficazes. LWDHW é uma fórmula clássica tonificante de rins na MTC e serve como medicina alternativa para tratar várias doençasósseas 37,38<...

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Divulgações

Todos os autores declaram não haver interesses financeiros ou não financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (ZCLQN25H2701).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,01 M de tampão citratoSolarbioC1010Para recuperação de antígeno de secções femoral para coloração IHC e IF na Etapa 10 do Protocolo
Membranas PVDF de 0,2 μmBioRad1620177Para eletrotransferência de proteínas de SDS-PAGE para membrana na Etapa 13 do Protocolo
Géis de poliacrilamida de 12,5%Epizyme BiotechPG113Para separação de proteínas por SDS-PAGE na Etapa 13 do Protocolo
Anticorpo ALPARIGOARG57422Para detecção IHC em secções femoral na Etapa 10 do Protocolo
Sistema Automático de Análise de Imagens de QuimiluminescênciaTanon5200Para visualização de bandas de Western blot na Etapa 13 do Protocolo
Sistema de Teste de Fadiga Axial-TorsãoInstronmodelo 5569R1412Para teste biomecânico de amostras femoral na Etapa 9 do Protocolo
Kit de Ensaio de Proteína BCABeyotimeP0010SPara quantificação de proteínas antes do Western blot na Etapa 13 do Protocolo
CCK-8BeyotimeC0039Para medição da viabilidade celular de BMMs na Etapa 11 do Protocolo
CytoscapeNão aplicávelNão aplicávelVersão 3.8.0
Banco de dados DAVIDNão aplicávelNão aplicávelVersão 6.8; https://david.ncifcrf.gov/home.jsp
Banco de dados DisGeNETNão aplicávelNão aplicávelhttps://www.disgenet.org/
Kit de Detecção de Quimiluminescência ECLVazymeE411-04Para detecção quimioluminescente de sinais de Western blot na Etapa 13 do Protocolo
Kit de ELISA de OCNMEIMIANMM-0551M1Para medição de níveis séricos de osteocalcina na Etapa 8 do Protocolo
Kit de ELISA de β-CTXMEIMIANMM-44858M1Para medição de níveis séricos de β-CTX na Etapa 8 do Protocolo
Banco de dados GeneCardsNão aplicávelNão aplicávelhttps://www.genecards.org/
Green Premix Ex Taq II FASTTakaraCN830APara amplificação qRT-PCR na Etapa 12 do Protocolo
Equipamento de microtomografia computadorizada de alta resolução (μCT)BrukerSkyscan 1176Para imagem de alta resolução de microestrutura óssea femoral por μCT na Etapa 9 do Protocolo
Anticorpo IL-1βBIOSSbs6319RPara detecção IHC em secções femoral na Etapa 10 do Protocolo
Anticorpo IκBαCST4812Para detecção por Western blot na Etapa 13 do Protocolo
Banco de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)Não aplicávelNão aplicávelhttps://www.kegg.jp/
M-CSFAMIZONAAMK1001-S1Para indução de diferenciação de BMMs na Etapa 11 do Protocolo
Banco de dados MetascapeNão aplicávelNão aplicávelhttps://metascape.org/
Orbitrap Exploris 120Thermo Fisher ScientificBRE725531Para análise LC-MS/MS de LWDHW na Etapa 2 do Protocolo
Anticorpo P65CST8242Para detecção por Western blot na Etapa 13 do Protocolo
Anticorpo p-IκBαCST2859Para detecção por Western blot na Etapa 13 do Protocolo
Anticorpo p-P65CST3033SPara detecção por Western blot na Etapa 13 do Protocolo
Anticorpo p-P65Suzhou RuiyingRLP0187Para detecção IHC em secções femoral na Etapa 10 do Protocolo
Kit PrimeScript RT ReagentTakaraRR047APara transcrição reversa de RNA total em BMMs para análise qRT-PCR na Etapa 12 do Protocolo
Sistema QuantStudio 5Applied BiosystemsA28573Para análise qRT-PCR de genes marcadores de osteoclastos na Etapa 12 do Protocolo
RANKLAMIZONAAMK1001-S1Para indução de diferenciação de BMMs na Etapa 11 do Protocolo
Tampão de lise RIPAEpizyme BiotechPC101Para extração de proteína total de BMMs na Etapa 13 do Protocolo
Kit de Purificação Rápida de RNATransGen BiotechER501-01-V2Para extração de RNA total em BMMs na Etapa 12 do Protocolo
Software SPSSIBMversão 26Para análise estatística de dados experimentais na Etapa 15 do Protocolo
Banco de dados STRINGNão aplicávelNão aplicávelhttps://string-db.org/
Kit de coloração de Fosfatase Ácida Resistente a Tartrato (TRAP)AMIZONAAMK1001-S1Para coloração TRAP para identificar e quantificar osteoclastos na Etapa 14 do Protocolo
Sistema Thermo Vanquish UPLCThermo Fisher ScientificTSLC-002Para análise LC-MS/MS de LWDHW na Etapa 2 do Protocolo
Anticorpo TNF-αSuzhou RuiyingRLM3472Para detecção IHC em secções femoral na Etapa 10 do Protocolo
Banco de dados Traditional Chinese Medicine System Pharmacology (TCMSP)Não aplicávelNão aplicávelhttp://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
Banco de dados UniProtNão aplicávelNão aplicávelhttps://www.uniprot.org/
Coluna UPLCWatersACQUITY HSS T3Para análise LC-MS/MS de LWDHW na Etapa 2 do Protocolo
Ferramenta online VennyNão aplicávelNão aplicávelhttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html
Anticorpo β-actinaAbcamab8227Para detecção por Western blot na Etapa 13 do Protocolo

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