Coleta Voluntária de Amostras Fezes Compatível com Abrigo em Grupo em Camundongos Usando Sistema de Gaula Personalizado

Resumo

Este protocolo descreve um sistema de gaiolas personalizado para coleta voluntária, favorável ao bem-estar social, simultânea e individual de amostras fecais de camundongos alojados em grupo.

Resumo

A medição confiável dos metabólitos fecais da corticosterona requer amostras fecais que possam ser atribuídas a animais individuais e coletadas dentro de uma janela de tempo definida. Isso é desafiador em camundongos alojados em grupo, onde amostras agrupadas em gaiolas caseiras não permitem a atribuição individual, e a separação temporária pode interferir no bem-estar animal e nos resultados dos estudos. O objetivo deste protocolo é apresentar um sistema de gaiolas simples e barato que permita a coleta voluntária, simultânea e individual de amostras fecais de camundongos alojados em grupo. O sistema consiste em uma gaiola doméstica de policarbonato com tampa de arame, conectada a três caixas de coleta individuais. Após a habituação e o treinamento, os camundongos entram voluntariamente nas caixas para receber uma pequena recompensa alimentar. As portas podem então ser fechadas sem perseguição, manuseio ou transferência forçada. Pellets fecais são coletados de cada caixa separadamente, permitindo que amostras sejam atribuídas a animais individuais enquanto se mantém habitação social fora do período de amostragem. Este protocolo apoia amostragem longitudinal não invasiva e é adequado para estudos que mediam metabólitos da corticosterona fecal ou outros biomarcadores fecais. O design é fácil de construir com material padrão para gaiolas e vidro acrílico, pode ser desmontado para limpeza e permite que várias gaiolas sejam amostradas em paralelo. Ao reduzir distúrbios relacionados ao manuseio e melhorar a padronização da janela de amostragem, o método oferece um aprimoramento prático para o monitoramento endócrino em camundongos alojados em grupo.

Introdução

Um grande desafio na avaliação das concentrações plasmáticas de corticosterona é que o próprio procedimento de amostragem pode induzir um aumento agudo da corticosterona, confundindo a medição e potencialmente afetando a interpretação dos resultados^{do estudo 1,2,3}. Medir metabólitos da corticosterona fecal (MCF) oferece uma alternativa não invasiva, já que as concentrações de MCF refletem níveis circulantes de glucocorticoides várias horas antes da amostragem, dependendo da espécie, cepa, sexo e tempo de passagem intestinal ^4,5. No entanto, a análise confiável de FCM em camundongos alojados em grupo continua sendo desafiadora. Amostras fecais agrupadas coletadas da gaiola doméstica não podem ser atribuídas a animais individuais e podem apresentar alta variabilidade devido a diferenças interindividuais na secreção de glicocorticoides e à incerteza na janela exata de amostragem. Separar animais por períodos prolongados pode interferir nos objetivos do estudo, enquanto a separação de curto prazo para coleta individual de amostras é trabalhosa, limita o fluxo de produção e pode induzir^{estresse 2}.

Para possibilitar a coleta individual de amostras fecais de camundongos alojados em grupo com manuseio mínimo, foi desenvolvida uma gaiola personalizada para a coleta fecal (Figura 1A-E). O design foi adaptado de uma gaiola de coleta fecal previamente descrita para camundongos^{espinhosos 6} e modificado para uso com camundongos de laboratório. O sistema consiste em uma gaiola padrão de policarbonato tipo III conectada a três caixas individuais de coleta, que os animais podem acessar voluntariamente e fechar usando portas deslizantes. Esse sistema permite coletar amostras fecais de camundongos individuais sem manuseio direto durante o período de amostragem e possibilita amostragem simultânea de múltiplos animais. Portanto, a gaiola oferece uma abordagem prática para amostragem de MCF não invasiva e atribuível individualmente em camundongos alojados em grupo.

O protocolo a seguir descreve um sistema de amostragem fecal que permite a coleta e identificação de amostras fecais de camundongos individuais, mantendo um ambiente de abrigo em grupo, utilizando gaiolas personalizadas para amostragem de fezes sem contato.

Protocolo

O comitê responsável de ética animal da Universidade Médica de Viena foi consultado antes da realização do estudo e informou que não era necessária licença formal para experimentos com animais; portanto, não há número de aprovação ou protocolo disponível. O estudo envolveu apenas práticas estabelecidas de reprodução e criação de plantas, juntamente com coleta de amostras fecais não invasivas. Nenhum procedimento invasivo foi realizado. De acordo com a Diretiva 2010/63/UE, a carga esperada para os animais foi avaliada como estando abaixo do limiar de dor, sofrimento, sofrimento ou dano duradouro, equivalente ou superior ao causado pela introdução de uma agulha, de acordo com boas práticas veterinárias. Todos os animais eram alojados e cuidados de acordo com os padrões institucionais de bem-estar animal.

1. Construção das gaiolas (veja a lista de materiais)

1. Corte as partes 1-4 de plexiglass/vidro acrílico de 5 mm de acordo com os modelos mostrados na Figura 2A-C.
   NOTA: Modelos com dimensões exatas podem ser impressos no formato DIN A3 (Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2).
2. Corte a parte inferior da gaiola de policarbonato tipo II (PTII) conforme indicado na Figura 2D. Essa parte servirá posteriormente como a cobertura superior das caixas de coleta de fezes.
3. Perfure os furos e ranhuras na antiga parte inferior da gaiola PTII, conforme indicado na Figura 2D.
   NOTA: As dimensões exatas são fornecidas na Figura Suplementar 3.
4. Fure furos na frente e no lado curto da gaiola PTIII, conforme indicado na Figura 2E.
   NOTA: As dimensões exatas são fornecidas na Figura Suplementar 4.
5. Use a parte 2 como modelo para marcar os furos correspondentes no lado curto da gaiola PTIII e no lado longo da gaiola PTII.
6. Fure os furos marcados e fixe a gaiola PTIII, a gaiola PTII e a parte 2 usando os parafusos roscados, como mostrado na Figura 2F.
7. Insira a parte 1 como a parte inferior da gaiola PTII. Posicione as partes 4a e 4b para que segurem a parte 1 no lugar e divida a gaiola de amostragem em caixas de coleta separadas. Use a pistola de cola quente para fixá-las no lugar.
8. Deslize as saliências inferiores das partes 4a e 4b nos slots da parte 1. Essas saliências formam as pernas das caixas de coleta.
9. Deslize as saliências superiores das partes 4a e 4b pela tampa superior, a antiga parte inferior da gaiola PTII, para mantê-la no lugar.
10. Passe os hashis ou varas de madeira pelos furos das saliências, usando uma haste no topo e duas varas na parte inferior, para estabilizar e fixar a construção.
    NOTA: Materiais de madeira só devem ser usados no vivário se forem descartáveis, pois não são limpáveis. Se isso não for o caso, bastões de composição alternativa devem ser usados.
11. Feche as lacunas restantes ou pequenas imprecisões usando uma pistola de cola quente. Use as partes 3a, 3b e 3c (Figura 2B) como portas deslizantes entre a gaiola da casa e as caixas coletoras.
    NOTA: Certifique-se de que não haja bordas afiadas, resíduos de cola ou material saliente acessível aos animais. Os componentes de vidro acrílico/plexiglass usados neste protótipo não são adequados para esterilização por autoclave a vapor. Portanto, se o sistema for usado em instalações de FPS que exijam material esterilizado relacionado a gaiolas, deve ser utilizado um procedimento de desinfecção não autoclave aprovado institucionalmente, ou os componentes acrílicos devem ser substituídos por material autoclavável, mantendo as mesmas dimensões.

2. Preparação e hospedagem de animais

1. Obtenha o número necessário de camundongos da(s) cepa(s) apropriada(s) para o estudo.
   NOTA: Os dados representativos foram obtidos de 30 camundongos C57BL/6J de oito semanas, compreendendo 20 fêmeas e 10 machos. Os camundongos estavam livres de patógenos específicos segundo os padrões da FELASA e foram obtidos dos Laboratórios Charles River, em Sulzfeld, Alemanha.
2. Animais domésticos em condições convencionais em gaiolas adaptadas de policarbonato tipo III, com no máximo três camundongos adultos por gaiola.
   NOTA: Machos separados foram alojados em gaiolas padrão de policarbonato tipo II para este estudo.
3. Mantenha a sala dos animais em 22 ± 2 °C e 55 ± 10% de umidade relativa sob um ciclo de 12 horas luz/escuro com as luzes acesas às 6h.
4. Forneça uma dieta padrão de manutenção e água à vontade.
5. Adicione roupas de cama de madeira de álamo, papel higiênico, uma casa de plástico transparente vermelho e papel toalha como material de ninho em cada gaiola.
6. Identifique camundongos principalmente pelas marcas naturais da cauda. Aplique temporariamente marcas de curral em animais com marcas semelhantes na cauda durante a pesagem, se necessário.

3. Habituação e treinamento dos animais

NOTA: A gaiola completa consiste em uma gaiola doméstica, PTIII, conectada a uma gaiola de amostragem com três caixas de coleta separadas, PTII. As gaiolas domésticas podem ser usadas como as tradicionais, com cama, enriquecimento de gaiolas, tampa de arame sem fixadores externos e fornecendo comida e água. O sistema pode ser desmontado para lavagem e pode ser usado apenas durante as semanas de amostragem. Durante semanas sem amostragem, os animais podem ser alojados em gaiolas padrão PTIII.

1. Coloque os animais no sistema de gaiolas pelo menos duas semanas antes da primeira sessão de amostragem planejada.
2. Habitue os animais às caixas de coleta removendo as portas deslizantes por uma noite, permitindo que explorem livremente as caixas.
3. Realize três sessões de treinamento antes da primeira sessão de amostragem. Realizar treinamento sob as mesmas condições de luz e no mesmo horário do dia planejado para amostragem posterior, idealmente sob luz vermelha logo após o início da fase escura.
4. Aplique uma pequena quantidade de recompensa, como creme de avelã, manteiga de amendoim, pasta de malte ou um alimento semelhante palatável, na parede oposta à entrada de cada caixa de coleta.
5. No primeiro dia de treinamento, deixe as portas abertas e permita que os animais descubram e consumam a recompensa voluntariamente.
6. No segundo dia de treinamento, espere até que um animal entre em uma caixa de coleta e comece a lamber a recompensa. Feche cuidadosamente a porta deslizante atrás do animal e solte-a após 10 minutos.
7. No terceiro dia de treinamento, repita o procedimento e aumente gradualmente o tempo que os animais permanecem nas caixas de coleta.
   NOTA: O treinamento deve ser calmo e consistente. Evite correr atrás dos animais para dentro das caixas, pois isso pode aumentar o estresse e reduzir a participação voluntária em sessões futuras de amostragem.

4. Coleta de amostras fecais

1. Momento da coleta da amostra
   1. Planeje o tempo de amostragem de acordo com a questão biológica e o atraso esperado entre a excreção plasmática da corticosterona e do metabólito da corticosterona fecal. Em camundongos, os metabólitos da corticosterona fecal normalmente refletem os níveis circulantes de glucocorticoides aproximadamente 8-10 horas antes da amostragem.
      NOTA: Se o tempo preciso for crítico, realize um estudo piloto para determinar o curso temporal da excreção de FCM na cepa, sexo e condições experimentais específicas. Esse piloto pode ser combinado com as sessões de treinamento.
   2. Programe amostragem durante um período de alta produção fecal. A amostragem geralmente é mais eficiente no início da fase escura e ativa.
   3. Realize todas as sessões de amostragem no mesmo horário do dia durante todo o estudo para reduzir a variação causada pelo ritmo diurno dos níveis de FCM.
      NOTA: Em nossa experiência, eventos que ocorrem pela manhã por volta das 10h00 são bem refletidos quando a amostragem é agendada entre 18h e 20h, dependendo do horário de luz da sala dos animais.
2. Procedimento de amostragem e conselhos práticos
   1. Marque os animais individualmente antes de amostrar. Use marcas nas orelhas ou marcas individuais na cauda.
      NOTA: Marcas nos dedos dos pés e códigos de cores podem ser difíceis de reconhecer dentro das caixas sob luz vermelha.
   2. Prepare as caixas de coleta durante a fase de luz, aplicando a recompensa na parede de trás de cada caixa.
      NOTA: Preparar as caixas durante o dia melhora a visibilidade para o experimentador e permite que os animais sintam o cheiro da recompensa antes da amostra.
   3. No horário planejado da amostra, abra as caixas de coleta e espere até que os animais entrem voluntariamente.
   4. Assim que um rato entrar em uma caixa de coleta, feche cuidadosamente a porta deslizante atrás dele.
   5. Depois que todos os animais entrarem em uma caixa, registre a identidade e a posição de cada camundongo em uma folha de amostragem preparada.
   6. Se mais de 10 gaiolas forem amostradas em uma sessão, envolva um segundo experimentador para apoiar a identificação dos animais, manuseio de portas e documentação.
   7. Mantenha os animais nas caixas de coleta durante a duração planejada da amostragem, tipicamente de 30 minutos a 2 horas, dependendo da produção fecal esperada e do desenho do estudo.
      NOTA: Exclua amostras se a identidade individual não puder ser atribuída com certeza, se os pellets fecais estiverem contaminados com urina, cama ou fezes de outro animal, se a duração da amostragem se desviar substancialmente da janela de tempo planejada, ou se a quantidade de material fecal for insuficiente para análise de MCF.
      NOTA: O uso de 50 mg é nosso protocolo padrão, e essa quantidade foi usada em todas as validações e em todos os outros artigos ^5,7,8. Normalmente, pode ser facilmente obtida.
   8. Ao final do período de amostragem, abra as portas deslizantes e permita que os camundongos retornem à gaiola.
   9. Feche as caixas de coleta imediatamente após a saída dos camundongos para evitar a reentrada e a contaminação cruzada das amostras.
   10. Remova os pellets fecais de cada caixa de coleta usando pinças longas e transfira-os para tubos de coleta rotulados individualmente.
   11. Armazene as amostras a -20 °C até a preparação adicional do ensaio FCM.
       NOTA: Se as caixas estiverem bem fechadas e não puderem ser reabertas pelos camundongos, a coleta de pellets fecais pode ser adiada até a próxima fase de luz. No entanto, isso deve ser feito de forma consistente dentro de um estudo.
   12. Mantenha os animais na parte da gaiola em casa (PTIII) até a próxima troca de gaiola. Depois, podem ser desmontados e lavados em uma arruela de gaiola comum.

Resultados

Metabólitos da corticosterona fecal (MCF) foram quantificados com sucesso a partir de amostras coletadas com gaiolas de amostragem fecal feitas sob medida, em um estudo longitudinal comparando camundongos reproduzidos de forma permanente e intermitente. A análise representativa da FCM incluiu 30 animais: grupo de reprodução permanente, n = 15 animais em 5 gaiolas; Grupo de reprodução intermitente, n = 10 animais em 5 gaiolas, com 5 machos hospedados individualmente, exceto em 3 eventos reprodutivos, onde eram alojados juntos com as fêmeas. As amostras foram coletadas em 19 pontos quinzenais, nos dias de troca de gaiola, bem como nos fins de semana. O tempo médio até a maioria dos animais entrar na caixa foi de 7,5 min (DS = 3,07), com a maioria dos animais representando uma média de 27,6 (SD = 1,44) camundongos totalizando 30 camundongos. Todos os camundongos entraram na caixa após uma média de 11,69 min (SD = 3,29). A duração média de confinamento para todos os camundongos foi de 24,56 min (DS = 15,51), e o tempo médio desde o primeiro camundongo entrando na caixa até o início da liberação foi de 43,14 min (DS = 8,51). A duração média da liberação foi de 14,86 min (DS = 22,82), e a duração média de todo o procedimento foi de 68,00 min (DS = 11,87). De 19 amostras (3 ensaios + 16 regulares), esperando 480 amostras, duas amostras estavam faltando porque os camundongos não defecaram durante o confinamento, três amostras não puderam ser coletadas porque os camundongos estavam muito grávidos ou logo após o nascimento, e 5 ratos precisaram de apoio suave para entrar. O peso médio das amostras coletadas nas três primeiras amostragens foi de 51,16 mg (DE = 25,39). De todas as amostras coletadas (475), 473 puderam ser analisadas e obtiveram resultados.

Animais individuais eram considerados réplicas biológicas. Amostras fecais repetidas coletadas dos mesmos animais durante o período de oito semanas do estudo foram tratadas como medições repetidas longitudinais e não como réplicas biológicas independentes. A análise foi realizada usando um modelo linear de efeitos mistos, com sexo, grupo de reprodução, dia de amostragem e número de camundongos por gaiola como efeitos fixos, e gaiola como um intercepto aleatório. Interações entre sexo, grupo reprodutivo e dia de amostragem foram incluídas no modelo. O número de camundongos por gaiola foi incluído como efeito fixo adicional, mas não foi testado em termos de interação, pois essa variável foi parcialmente confundida com o desenho experimental, especialmente em machos reproduzidos intermitentemente.

O modelo mostrou um efeito claro do sexo nas concentrações de FCM (Figura 3A-D). As fêmeas apresentaram concentrações de FCM maiores do que os machos em todas as condições reprodutivas e dias de amostragem, estimativa = 28,30, SE = 2,58, t = 10,98, P < 0,0001. Comparações post hoc confirmaram essa diferença de sexo em ambos os grupos reprodutores e em ambos os dias de amostragem. Em animais reproduzidos permanentemente, as fêmeas apresentavam concentrações de FCM maiores do que os machos aos domingos, estimativa = 53,41, SE = 8,28, P < 0,0001, e às quartas-feiras, estimativa = 55,27, SE = 8,37, P < 0,0001. O mesmo padrão foi observado em animais reproduzidos intermitentemente aos domingos, estimativa = 58,04, SE = 12,00, P < 0,0001, e às quartas-feiras, estimativa = 59,68, SE = 9,88, P < 0,0001.

O modelo também indicou um efeito principal significativo do grupo reprodutor, estimativa = 11,59, SE = 4,65, t = 2,49, P = 0,0227. No entanto, comparações post hoc ajustadas por Tukey não revelaram diferenças significativas entre animais criados de forma permanente e intermitente dentro das combinações individuais de sexo/dia. Nas fêmeas, animais reproduzidos de forma permanente e intermitente não diferiram significativamente aos domingos, estimativa = 24,51, SE = 12,20, P = 0,2085, ou às quartas-feiras, estimativa = 17,31, SE = 12,20, P = 0,4950. Da mesma forma, nos machos, não foi detectada diferença significativa entre grupos reprodutores aos domingos, estimativa = 29,14, SE = 14,00, P = 0,1708, ou às quartas-feiras, estimativa = 21,72, SE = 13,30, P = 0,3682. O efeito principal significativo do grupo reprodutor deve, portanto, ser interpretado como um efeito geral em nível modelo, enquanto as comparações post hoc ajustadas por Tukey mais específicas dentro do sexo e do dia da amostragem não identificaram uma diferença robusta entre grupos em pares.

A ausência de uma diferença significativa entre os machos entre os grupos de reprodução é particularmente importante, já que os machos sempre eram hospedados sozinhos aos domingos. Assim, a comparação de domingo em machos mostra que o próprio método de amostragem não aumenta as concentrações de FCM, pelo menos em camundongos machos. As gaiolas de amostragem fecal também foram usadas em outro estudo que comparou MCF em camundongos sentinela sujos e^controles.

Figura 1: Visão geral da gaiola de amostragem fecal feita sob medida. O sistema de gaiola permite coletar amostras fecais de camundongos individuais alojados em uma gaiola coletiva, sem manuseio direto durante a amostragem. (A) Sistema de gaiola totalmente montado, composto por uma gaiola doméstica e uma gaiola de amostragem fecal anexada. (B) Vista lateral da gaiola de amostragem anexada. (C) Vista superior mostrando as três entradas separadas das caixas de coleta individuais. (D) Vista de dentro da gaiola de casa em direção às entradas das caixas de amostragem. (E) Abriu a gaiola de amostragem, permitindo acesso às caixas de coleta para remoção e limpeza de pellets de fezes. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Plano de construção e montagem da gaiola de amostragem fecal. (A-C) Peças de vidro acrílico são usadas para construir o piso, paredes laterais, portas deslizantes e divisórias da gaiola de amostragem. (D) Modificação da gaiola de policarbonato tipo II removendo o fundo e perfurando furos e ranhuras para a tampa da caixa de coleta. (E) Modificação da gaiola doméstica de policarbonato tipo III perfurando três furos de entrada na parte frontal. (F) Vista lateral esquemática do sistema de gaiolas montadas, mostrando a gaiola doméstica de policarbonato tipo III conectada à gaiola de amostragem de policarbonato modificada tipo II e o posicionamento das partes 1, 2 e 4. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Dados representativos da FCM obtidos após a coleta de amostras fecais usando a gaiola feita sob medida. Metabólitos fecais da corticosterona (FCMs) foram medidos em amostras fecais coletadas individualmente de camundongos alojados em grupo, utilizando a gaiola personalizada de amostragem fecal. Os valores são mostrados em oito pontos semanais de amostragem para camundongos criados de forma permanente e intermitente. As amostras eram coletadas em dias de troca de gaiola ou nos fins de semana. Pontos e linhas de conexão representam médias de grupo em cada ponto temporal. Barras de erro e fitas sombreadas indicam a média ± desvio padrão (DS). (A) Fêmeas amostradas nos dias de troca de gaiola. (B) As fêmeas foram amostradas durante os fins de semana. (C) Machos amostrados nos dias de troca de gaiola. (D) Machos amostrados nos fins de semana. A figura ilustra que o método produziu concentrações mensuráveis de FCM em todos os grupos e pontos de tempo. As fêmeas geralmente apresentaram concentrações maiores de FCM do que os machos, enquanto as diferenças entre os grupos reprodutores foram menos consistentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Modelos para componentes de vidro acrílico 1-3. Moldes para cortar as Partes 1, 2 e 3a-c a partir de vidro acrílico/Plexiglass de 5 mm para a construção da gaiola de amostragem fecal. A Parte 1 serve como o inserto inferior da gaiola de policarbonato modificado tipo II. A Parte 2 é usada para conectar a gaiola de policarbonato tipo III à gaiola de policarbonato tipo II e para marcar os furos de perfuração correspondentes. As partes 3a-c formam divisores internos/elementos estruturais do sistema de coleta. Marcações circulares brancas indicam furos de ar, e marcas menores indicam furos para parafusos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Modelos para componentes de vidro acrílico 4a e 4b. Moldes para cortar as Peças 4a e 4b a partir de vidro acrílico/Plexiglas de 5 mm. Essas partes são inseridas na Parte 1 para manter o insert inferior no lugar e dividir a gaiola de amostragem em caixas separadas de coleta de fezes. As saliências inferiores formam as pernas das caixas de coleta, enquanto as superiores passam pela tampa superior e são fixadas com varas de madeira ou hashis para estabilizar a construção. Círculos brancos indicam aberturas para as hastes ou orifícios de ar. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Modificação da gaiola de policarbonato tipo II. Modelo esquemático para modificar a gaiola de policarbonato tipo II. A parte inferior da gaiola é cortada, conforme indicado, e depois usada como a tampa superior das caixas de coleta de fezes. Furos e ranhuras são perfurados na seção inferior removida para permitir a inserção e fixação das Partes 4a e 4b. Furos para parafusos são usados para fixar a gaiola de policarbonato tipo II, a gaiola de policarbonato tipo III e a Parte 2. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Modificação da frente da gaiola tipo III em policarbonato. Molde esquemático para perfurar a parte frontal da gaiola de policarbonato tipo III. Três aberturas circulares são perfuradas no lado curto da gaiola para permitir o acesso entre a gaiola doméstica e a gaiola de amostragem fecal. Furos adicionais para parafusos são usados para fixação na Parte 2 e na gaiola de policarbonato tipo II. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo descreve um sistema simples de gaiolas para coletar amostras fecais individualmente atribuídas de camundongos alojados em grupo. A principal vantagem do método é que ele combina a atribuição individual de amostras com a manutenção de aspectos-chave da habitação social, especialmente o contato visual e olfatório com companheiros de gaiola. Isso é relevante porque a moradia em grupo é frequentemente exigida para o bem-estar animal e pode também fazer parte do desenho^{experimental 10}. Em contraste com a amostragem em gaiolas domésticas agrupadas, o sistema permite que valores de MCF sejam atribuídos a animais individuais, evitando alojamento prolongado antes ou durante a coleta da amostra.

Abordagens comumente utilizadas para coleta de amostras fecais em camundongos de laboratório incluem amostragem em gaiolas domésticas agrupadas, alojamento temporário individual em gaiolas limpas, gaiolas metabólicas e coleta direta após manuseio ou transferência. Amostras em jaulas caseiras agrupadas são fáceis de obter, não invasivas, baratas e compatíveis com amostragem paralela de muitas gaiolas, mas não permitem atribuição individual em animais alojados em grupo. Alojamento individual temporário ou transferência para gaiolas limpas permite a atribuição individual de amostras, mas remove os animais de seu grupo social e pode introduzir estresse agudo devido ao manuseio, novidade ou separação social. Isso é particularmente relevante para a análise de FCM, porque as medidas relacionadas à corticosterona são sensíveis ao estresse causado pelo próprio procedimento^{de amostragem 11}. Gaiolas metabólicas proporcionam coleta controlada de amostras e permitem a separação de fezes e urina, mas exigem equipamentos especializados, são menos compatíveis com a manutenção rotineira e geralmente envolvem alojamento individual. A coleta baseada em manuseio direto também pode fornecer amostras atribuídas individualmente, mas requer manuseio ou manipulação repetida dos animais e, portanto, pode afetar as leituras relacionadas ao estresse.

Comparado a essas abordagens existentes, o sistema atual foi projetado como um refinamento compatível com alojamento de grupos para amostragem fecal individual repetida, não invasiva. Após a habituação e o treinamento, os camundongos entram voluntariamente nas caixas de amostragem em resposta a uma pequena recompensa alimentar. Assim, as amostras podem ser coletadas sem necessidade de perseguir, manusear ou transferir forçadamente para uma gaiola separada. O sistema não deve ser interpretado como comprovado para melhorar o bem-estar ou reduzir o estresse em um sentido estritamente experimental, pois medidas diretas de bem-estar não foram incluídas no presente estudo. No entanto, foi projetado para reduzir o grau de separação social durante a coleta da amostra e, portanto, pode ser menos disruptivo do que os métodos convencionais de coleta individual. Além disso, vários animais e várias gaiolas podem ser amostrados em paralelo, ajudando a padronizar a janela de amostragem, o que é importante porque as concentrações de FCM dependem do ritmo circadiano e refletem a secreção de glucocorticoides várias horas antes da^{amostragem 5,12}.

Os resultados representativos demonstram que o sistema é adequado para coletar amostras fecais que podem ser analisadas para concentrações de FCM. Concentrações mensuráveis de FCM foram obtidas entre grupos e pontos de tempo, e o método detectou a diferença clara esperada entre sexos, com concentrações maiores de FCM em mulheres do que em homens. O estudo também incluiu uma comparação interna com habitação convencional individual em homens. Nos domingos, os machos do grupo de reprodução intermitente eram em casa única, enquanto machos reproduzidos permanentemente eram amostrados usando o sistema de coleta recém-desenvolvido. As concentrações de FCM não diferiram significativamente entre esses grupos aos domingos. Isso sugere que a entrada voluntária na gaiola de amostragem e a estadia de curto prazo na caixa de coleta não aumentaram significativamente as concentrações de MCF em comparação com a coleta convencional de uma única caixa. No entanto, essa comparação foi limitada a homens e não foi projetada como um estudo dedicado de equivalência ou validação cruzada. Estudos adicionais devem, portanto, comparar o sistema com abordagens estabelecidas de alojamento individual ou gaiola metabólica sob condições experimentais equilibradas e incluir indicadores comportamentais de estresse agudo durante a amostragem.

Além da avaliação de metabólitos fecais da corticosterona, o sistema também pode ser útil para outras aplicações que exigem coleta de amostras fecais individuais de curto prazo. As aplicações potenciais incluem exames parasitológicos, análises de microbiota, estudos de digestão ou outros ensaios de biomarcadores fecais. Com pequenas modificações técnicas, o sistema poderia potencialmente ser adaptado para a coleta de urina, por exemplo, introduzindo um piso perfurado e uma bandeja adequada sob o animal. Para essas aplicações, a possibilidade de manter a proximidade dos companheiros de gaiola durante a coleta da amostra pode ser vantajosa em comparação com abordagens convencionais de alojamento individual ou gaiola metabólica. No entanto, a adequação do sistema precisará ser validada para cada tipo específico de amostra e análise a jusante, especialmente quando contaminação, volume de amostra, tempo de coleta ou condições de armazenamento são críticas.

Em geral, os animais devem estar habituados às caixas antes da primeira sessão de amostragem, as marcações individuais devem ser claramente visíveis sob as condições de iluminação usadas, e a amostragem deve ser realizada no mesmo horário do dia durante todo o estudo. As amostras devem ser excluídas se a identidade individual for incerta, se os pellets estiverem contaminados, se a duração da amostragem for substancialmente diferente da janela de tempo planejada ou se o material fecal for insuficiente para a análise¹³. Diversos fatores práticos podem influenciar a aplicabilidade do sistema de amostragem, incluindo hierarquias de dominância, interações agressivas, variabilidade na motivação alimentar, diferenças de cepa e mobilidade reduzida ou comportamento alterado em animais obesos, idosos, grávidos, pós-parto ou de outra forma comprometidos. No entanto, na coorte atual, a entrada voluntária e o sucesso da amostragem foram altos. Das 480 amostras regulares esperadas, duas estavam ausentes porque os camundongos não defecavam durante o confinamento, e três não puderam ser coletadas porque os animais estavam muito grávidos ou logo após o parto. Assim, foram coletadas 475 amostras, das quais 473 apresentaram resultados analisáveis. Esses dados indicam que a recusa em entrar nas caixas e a falha em obter amostras foram raras nas condições utilizadas neste estudo. No entanto, podem ser necessários ajustes adicionais de habituação ou protocolo para outras cepas, grupos maiores ou animais com mobilidade alterada, condição corporal, estado de saúde ou comportamento social alterados. Outras limitações são que o método requer treinamento e atualmente é projetado para pequenos grupos de três camundongos, além de que os componentes de vidro acrílico/plexiglass não são autoclaváveis a vapor.

A gaiola é barata, fácil de construir com material padrão e vidro acrílico, e não requer componentes eletrônicos. Seu design permite desmontagem, limpeza e integração em rotinas regulares de troca de gaiolas, tornando-o adequado para amostragens longitudinais repetidas. No geral, o sistema representa uma abordagem prática e compatível com alojamento de grupos para amostragem fecal não invasiva e individualmente atribuível em camundongos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Drill bit 5 mm	Craftomat	22380487	5mm diameter; Quantity 1
Drill bits 60 mm	Bosch	32064647	60 mm diameter; Quantity 1
Drill bits 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm diameter; Quantity 1
Drilling machine	Makita	25730054	Standard handheld or bench drill; Quantity 1
Hot glue gun	Einhell	29051207	For cage assembly; Quantity 1
Hot glue sticks	Einhell	29049664	Compatible with hot glue gun; Quantity 5-10
Makrolon cage	Animalab	31200129	Standard Type II cage; Quantity 1
Makrolon cage	Animalab	31200256	Standard Type III cage; Quantity 1
Plexiglass / acrylic glass	Bauhaus	29122352	Approx. 0.25 m² total; 5 mm thickness; Quantity  2DIN A3 sheets
Saw or milling device	Scheppach	32079641	Small band saw, jigsaw, or CNC mill; Quantity 1
Threaded screws	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Quantity 4
Wooden chopsticks / rods	Ikea	903.429.71	Round wooden rods; Quantity 3