Coleta Voluntária de Amostras Fezes Compatível com Abrigo em Grupo em Camundongos Usando Sistema de Gaula Personalizado

Resumo

Este protocolo descreve um sistema de gaiolas personalizado para coleta voluntária, favorável ao bem-estar social, simultânea e individual de amostras fecais de camundongos alojados em grupo.

Resumo

A medição confiável dos metabólitos fecais da corticosterona requer amostras fecais que possam ser atribuídas a animais individuais e coletadas dentro de uma janela de tempo definida. Isso é desafiador em camundongos alojados em grupo, onde amostras agrupadas em gaiolas caseiras não permitem a atribuição individual, e a separação temporária pode interferir no bem-estar animal e nos resultados dos estudos. O objetivo deste protocolo é apresentar um sistema de gaiolas simples e barato que permita a coleta voluntária, simultânea e individual de amostras fecais de camundongos alojados em grupo. O sistema consiste em uma gaiola doméstica de policarbonato com tampa de arame, conectada a três caixas de coleta individuais. Após a habituação e o treinamento, os camundongos entram voluntariamente nas caixas para receber uma pequena recompensa alimentar. As portas podem então ser fechadas sem perseguição, manuseio ou transferência forçada. Pellets fecais são coletados de cada caixa separadamente, permitindo que amostras sejam atribuídas a animais individuais enquanto se mantém habitação social fora do período de amostragem. Este protocolo apoia amostragem longitudinal não invasiva e é adequado para estudos que mediam metabólitos da corticosterona fecal ou outros biomarcadores fecais. O design é fácil de construir com material padrão para gaiolas e vidro acrílico, pode ser desmontado para limpeza e permite que várias gaiolas sejam amostradas em paralelo. Ao reduzir distúrbios relacionados ao manuseio e melhorar a padronização da janela de amostragem, o método oferece um aprimoramento prático para o monitoramento endócrino em camundongos alojados em grupo.

Introdução

Um grande desafio na avaliação das concentrações plasmáticas de corticosterona é que o próprio procedimento de amostragem pode induzir um aumento agudo da corticosterona, confundindo a medição e potencialmente afetando a interpretação dos resultados^{do estudo 1,2,3}. Medir metabólitos da corticosterona fecal (MCF) oferece uma alternativa não invasiva, já que as concentrações de MCF refletem níveis circulantes de glucocorticoides várias horas antes da amostragem, dependendo da espécie, cepa, sexo e tempo de passagem intestinal ^4,5. No entanto, a análise confiável de FCM em camundongos alojados em grupo continua sendo desafiadora. Amostras fecais agrupadas coletadas da gaiola doméstica não podem ser atribuídas a animais individuais e podem apresentar alta variabilidade devido a diferenças interindividuais na secreção de glicocorticoides e à incerteza na janela exata de amostragem. Separar animais por períodos prolongados pode interferir nos objetivos do estudo, enquanto a separação de curto prazo para coleta individual de amostras é trabalhosa, limita o fluxo de produção e pode induzir^{estresse 2}.

Para possibilitar a coleta individual de amostras fecais de camundongos alojados em grupo com manuseio mínimo, foi desenvolvida uma gaiola personalizada para a coleta fecal (Figura 1A-E). O design foi adaptado de uma gaiola de coleta fecal previamente descrita para camundongos^{espinhosos 6} e modificado para uso com camundongos de laboratório. O sistema consiste em uma gaiola padrão de policarbonato tipo III conectada a três caixas individuais de coleta, que os animais podem acessar voluntariamente e fechar usando portas deslizantes. Esse sistema permite coletar amostras fecais de camundongos individuais sem manuseio direto durante o período de amostragem e possibilita amostragem simultânea de múltiplos animais. Portanto, a gaiola oferece uma abordagem prática para amostragem de MCF não invasiva e atribuível individualmente em camundongos alojados em grupo.

O protocolo a seguir descreve um sistema de amostragem fecal que permite a coleta e identificação de amostras fecais de camundongos individuais, mantendo um ambiente de abrigo em grupo, utilizando gaiolas personalizadas para amostragem de fezes sem contato.

Protocolo

O comitê responsável de ética animal da Universidade Médica de Viena foi consultado antes da realização do estudo e informou que não era necessária licença formal para experimentos com animais; portanto, não há número de aprovação ou protocolo disponível. O estudo envolveu apenas práticas estabelecidas de reprodução e criação de plantas, juntamente com coleta de amostras fecais não invasivas. Nenhum procedimento invasivo foi realizado. De acordo com a Diretiva 2010/63/UE, a carga esperada para os animais foi avaliada como estando abaixo do limiar de dor, sofrimento, sofrimento ou dano duradouro, equivalente ou superior ao causado pela introdução de uma agulha, de acordo com boas práticas veterinárias. Todos os animais eram alojados e cuidados de acordo com os padrões institucionais de bem-estar animal.

1. Construção das gaiolas (veja a lista de materiais)

1. Corte as partes 1-4 de plexiglass/vidro acrílico de 5 mm de acordo com os modelos mostrados na Figura 2A-C.
   NOTA: Modelos com dimensões exatas podem ser impressos no formato DIN A3 (Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2).
2. Corte a parte inferior da gaiola de policarbonato tipo II (PTII) conforme indicado na Figura 2D. Essa parte servirá posteriormente como a cobertura superior das caixas de coleta de fezes.
3. Perfure os furos e ranhuras na antiga parte inferior da gaiola PTII, conforme indicado na Figura 2D.
   NOTA: As dimensões exatas são fornecidas na Figura Suplementar 3.
4. Fure furos na frente e no lado curto da gaiola PTIII, conforme indicado na Figura 2E.
   NOTA: As dimensões exatas são fornecidas na Figura Suplementar 4.
5. Use a parte 2 como modelo para marcar os furos correspondentes no lado curto da gaiola PTIII e no lado longo da gaiola PTII.
6. Fure os furos marcados e fixe a gaiola PTIII, a gaiola PTII e a parte 2 usando os parafusos roscados, como mostrado na Figura 2F.
7. Insira a parte 1 como a parte inferior da gaiola PTII. Posicione as partes 4a e 4b para que segurem a parte 1 no lugar e divida a gaiola de amostragem em caixas de coleta separadas. Use a pistola de cola quente para fixá-las no lugar.
8. Deslize as saliências inferiores das partes 4a e 4b nos slots da parte 1. Essas saliências formam as pernas das caixas de coleta.
9. Deslize as saliências superiores das partes 4a e 4b pela tampa superior, a antiga parte inferior da gaiola PTII, para mantê-la no lugar.
10. Passe os hashis ou varas de madeira pelos furos das saliências, usando uma haste no topo e duas varas na parte inferior, para estabilizar e fixar a construção.
    NOTA: Materiais de madeira só devem ser usados no vivário se forem descartáveis, pois não são limpáveis. Se isso não for o caso, bastões de composição alternativa devem ser usados.
11. Feche as lacunas restantes ou pequenas imprecisões usando uma pistola de cola quente. Use as partes 3a, 3b e 3c (Figura 2B) como portas deslizantes entre a gaiola da casa e as caixas coletoras.
    NOTA: Certifique-se de que não haja bordas afiadas, resíduos de cola ou material saliente acessível aos animais. Os componentes de vidro acrílico/plexiglass usados neste protótipo não são adequados para esterilização por autoclave a vapor. Portanto, se o sistema for usado em instalações de FPS que exijam material esterilizado relacionado a gaiolas, deve ser utilizado um procedimento de desinfecção não autoclave aprovado institucionalmente, ou os componentes acrílicos devem ser substituídos por material autoclavável, mantendo as mesmas dimensões.

2. Preparação e hospedagem de animais

1. Obtenha o número necessário de camundongos da(s) cepa(s) apropriada(s) para o estudo.
   NOTA: Os dados representativos foram obtidos de 30 camundongos C57BL/6J de oito semanas, compreendendo 20 fêmeas e 10 machos. Os camundongos estavam livres de patógenos específicos segundo os padrões da FELASA e foram obtidos dos Laboratórios Charles River, em Sulzfeld, Alemanha.
2. Animais domésticos em condições convencionais em gaiolas adaptadas de policarbonato tipo III, com no máximo três camundongos adultos por gaiola.
   NOTA: Machos separados foram alojados em gaiolas padrão de policarbonato tipo II para este estudo.
3. Mantenha a sala dos animais em 22 ± 2 °C e 55 ± 10% de umidade relativa sob um ciclo de 12 horas luz/escuro com as luzes acesas às 6h.
4. Forneça uma dieta padrão de manutenção e água à vontade.
5. Adicione roupas de cama de madeira de álamo, papel higiênico, uma casa de plástico transparente vermelho e papel toalha como material de ninho em cada gaiola.
6. Identifique camundongos principalmente pelas marcas naturais da cauda. Aplique temporariamente marcas de curral em animais com marcas semelhantes na cauda durante a pesagem, se necessário.

3. Habituação e treinamento dos animais

NOTA: A gaiola completa consiste em uma gaiola doméstica, PTIII, conectada a uma gaiola de amostragem com três caixas de coleta separadas, PTII. As gaiolas domésticas podem ser usadas como as tradicionais, com cama, enriquecimento de gaiolas, tampa de arame sem fixadores externos e fornecendo comida e água. O sistema pode ser desmontado para lavagem e pode ser usado apenas durante as semanas de amostragem. Durante semanas sem amostragem, os animais podem ser alojados em gaiolas padrão PTIII.

1. Coloque os animais no sistema de gaiolas pelo menos duas semanas antes da primeira sessão de amostragem planejada.
2. Habitue os animais às caixas de coleta removendo as portas deslizantes por uma noite, permitindo que explorem livremente as caixas.
3. Realize três sessões de treinamento antes da primeira sessão de amostragem. Realizar treinamento sob as mesmas condições de luz e no mesmo horário do dia planejado para amostragem posterior, idealmente sob luz vermelha logo após o início da fase escura.
4. Aplique uma pequena quantidade de recompensa, como creme de avelã, manteiga de amendoim, pasta de malte ou um alimento semelhante palatável, na parede oposta à entrada de cada caixa de coleta.
5. No primeiro dia de treinamento, deixe as portas abertas e permita que os animais descubram e consumam a recompensa voluntariamente.
6. No segundo dia de treinamento, espere até que um animal entre em uma caixa de coleta e comece a lamber a recompensa. Feche cuidadosamente a porta deslizante atrás do animal e solte-a após 10 minutos.
7. No terceiro dia de treinamento, repita o procedimento e aumente gradualmente o tempo que os animais permanecem nas caixas de coleta.
   NOTA: O treinamento deve ser calmo e consistente. Evite correr atrás dos animais para dentro das caixas, pois isso pode aumentar o estresse e reduzir a participação voluntária em sessões futuras de amostragem.

4. Coleta de amostras fecais

1. Momento da coleta da amostra
   1. Planeje o tempo de amostragem de acordo com a questão biológica e o atraso esperado entre a excreção plasmática da corticosterona e do metabólito da corticosterona fecal. Em camundongos, os metabólitos da corticosterona fecal normalmente refletem os níveis circulantes de glucocorticoides aproximadamente 8-10 horas antes da amostragem.
      NOTA: Se o tempo preciso for crítico, realize um estudo piloto para determinar o curso temporal da excreção de FCM na cepa, sexo e condições experimentais específicas. Esse piloto pode ser combinado com as sessões de treinamento.
   2. Programe amostragem durante um período de alta produção fecal. A amostragem geralmente é mais eficiente no início da fase escura e ativa.
   3. Realize todas as sessões de amostragem no mesmo horário do dia durante todo o estudo para reduzir a variação causada pelo ritmo diurno dos níveis de FCM.
      NOTA: Em nossa experiência, eventos que ocorrem pela manhã por volta das 10h00 são bem refletidos quando a amostragem é agendada entre 18h e 20h, dependendo do horário de luz da sala dos animais.
2. Procedimento de amostragem e conselhos práticos
   1. Marque os animais individualmente antes de amostrar. Use marcas nas orelhas ou marcas individuais na cauda.
      NOTA: Marcas nos dedos dos pés e códigos de cores podem ser difíceis de reconhecer dentro das caixas sob luz vermelha.
   2. Prepare as caixas de coleta durante a fase de luz, aplicando a recompensa na parede de trás de cada caixa.
      NOTA: Preparar as caixas durante o dia melhora a visibilidade para o experimentador e permite que os animais sintam o cheiro da recompensa antes da amostra.
   3. No horário planejado da amostra, abra as caixas de coleta e espere até que os animais entrem voluntariamente.
   4. Assim que um rato entrar em uma caixa de coleta, feche cuidadosamente a porta deslizante atrás dele.
   5. Depois que todos os animais entrarem em uma caixa, registre a identidade e a posição de cada camundongo em uma folha de amostragem preparada.
   6. Se mais de 10 gaiolas forem amostradas em uma sessão, envolva um segundo experimentador para apoiar a identificação dos animais, manuseio de portas e documentação.
   7. Mantenha os animais nas caixas de coleta durante a duração planejada da amostragem, tipicamente de 30 minutos a 2 horas, dependendo da produção fecal esperada e do desenho do estudo.
      NOTA: Exclua amostras se a identidade individual não puder ser atribuída com certeza, se os pellets fecais estiverem contaminados com urina, cama ou fezes de outro animal, se a duração da amostragem se desviar substancialmente da janela de tempo planejada, ou se a quantidade de material fecal for insuficiente para análise de MCF.
      NOTA: O uso de 50 mg é nosso protocolo padrão, e essa quantidade foi usada em todas as validações e em todos os outros artigos ^5,7,8. Normalmente, pode ser facilmente obtida.
   8. Ao final do período de amostragem, abra as portas deslizantes e permita que os camundongos retornem à gaiola.
   9. Feche as caixas de coleta imediatamente após a saída dos camundongos para evitar a reentrada e a contaminação cruzada das amostras.
   10. Remova os pellets fecais de cada caixa de coleta usando pinças longas e transfira-os para tubos de coleta rotulados individualmente.
   11. Armazene as amostras a -20 °C até a preparação adicional do ensaio FCM.
       NOTA: Se as caixas estiverem bem fechadas e não puderem ser reabertas pelos camundongos, a coleta de pellets fecais pode ser adiada até a próxima fase de luz. No entanto, isso deve ser feito de forma consistente dentro de um estudo.
   12. Mantenha os animais na parte da gaiola em casa (PTIII) até a próxima troca de gaiola. Depois, podem ser desmontados e lavados em uma arruela de gaiola comum.

Resultados

Metabólitos da corticosterona fecal (MCF) foram quantificados com sucesso a partir de amostras coletadas com gaiolas de amostragem fecal feitas sob medida, em um estudo longitudinal comparando camundongos reproduzidos de forma permanente e intermitente. A análise representativa da FCM incluiu 30 animais: grupo de reprodução permanente, n = 15 animais em 5 gaiolas; Grupo de reprodução intermitente, n = 10 animais em 5 gaiolas, com 5 machos hospedados individualmente, exceto em 3 eventos r...

Discussão

Este protocolo descreve um sistema simples de gaiolas para coletar amostras fecais individualmente atribuídas de camundongos alojados em grupo. A principal vantagem do método é que ele combina a atribuição individual de amostras com a manutenção de aspectos-chave da habitação social, especialmente o contato visual e olfatório com companheiros de gaiola. Isso é relevante porque a moradia em grupo é frequentemente exigida para o bem-estar animal e pode também fazer parte do desenho

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Drill bit 5 mm	Craftomat	22380487	5mm diameter; Quantity 1
Drill bits 60 mm	Bosch	32064647	60 mm diameter; Quantity 1
Drill bits 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm diameter; Quantity 1
Drilling machine	Makita	25730054	Standard handheld or bench drill; Quantity 1
Hot glue gun	Einhell	29051207	For cage assembly; Quantity 1
Hot glue sticks	Einhell	29049664	Compatible with hot glue gun; Quantity 5-10
Makrolon cage	Animalab	31200129	Standard Type II cage; Quantity 1
Makrolon cage	Animalab	31200256	Standard Type III cage; Quantity 1
Plexiglass / acrylic glass	Bauhaus	29122352	Approx. 0.25 m² total; 5 mm thickness; Quantity  2DIN A3 sheets
Saw or milling device	Scheppach	32079641	Small band saw, jigsaw, or CNC mill; Quantity 1
Threaded screws	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Quantity 4
Wooden chopsticks / rods	Ikea	903.429.71	Round wooden rods; Quantity 3