O miR-93-5p tem como alvo direto o receptor tipo Toll 4 (TLR4) na pneumonia pediátrica por Mycoplasma pneumoniae (MPP). Sua subregulação pode contribuir para a progressão da doença e para as lesões associadas no sistema digestivo. Esses achados sugerem que o miR-93-5p pode atuar como um biomarcador diagnóstico potencial para MPP e para MPP com lesão do sistema digestivo.
Artigo de investigação
Avaliação do Papel do miR-93-5p em Crianças Infectadas por Mycoplasma pneumoniae com Lesão no Sistema Digestório
Neste artigo
Resumo
Resumo
O miR-93-5p tem sido implicado na modulação da lesão pulmonar aguda, mas seu papel e valor diagnóstico na pneumonia por Mycoplasma pneumoniae (MPP) pediátrica com lesão do sistema digestivo permanecem pouco claros. Este estudo avaliou o papel do miR-93-5p como biomarcador diagnóstico potencial para MPP e complicações digestivas associadas em crianças. Amostras clínicas foram coletadas de pacientes pediátricos com MPP e controles saudáveis. A expressão do miR-93-5p foi quantificada por PCR quantitativa com transcrição reversa. Células A549 infectadas por Mycoplasma pneumoniae (MP) foram utilizadas para estabelecer um modelo celular de MPP, a fim de avaliar alterações na viabilidade celular e nas citocinas pró-inflamatórias. O direcionamento do receptor tipo Toll 4 (TLR4) pelo miR-93-5p foi avaliado utilizando um ensaio de repórter de luciferase. O desempenho diagnóstico foi avaliado por meio de análise da curva característica de operação do receptor (ROC). Os níveis de miR-93-5p foram significativamente reduzidos em pacientes com MPP em comparação com controles saudáveis (P < 0,001) e foram ainda mais reduzidos em pacientes com MPP e lesão do sistema digestivo em comparação com aqueles com MPP isolada. A infecção por MP reduziu a viabilidade celular e aumentou os níveis de IL-6 e TNF-α, enquanto a superexpressão do miR-93-5p atenuou esses efeitos. A expressão de TLR4 aumentou após a infecção por MP e foi negativamente regulada pelo miR-93-5p. Clinicamente, a lesão do sistema digestivo em pacientes com MPP esteve associada a níveis mais baixos de miR-93-5p. As análises das curvas ROC mostraram bom desempenho diagnóstico para distinguir pacientes com MPP de controles saudáveis e pacientes com MPP e lesão do sistema digestivo daqueles com MPP isolada. O miR-93-5p direciona diretamente o TLR4 na MPP pediátrica, e sua subregulação pode contribuir para a progressão da doença e para a lesão associada do sistema digestivo. Esses achados sugerem que o miR-93-5p pode atuar como um biomarcador diagnóstico potencial para MPP e para MPP com lesão do sistema digestivo.
Introdução
Mycoplasma pneumoniae (MP) é um patógeno predominante responsável pela pneumonia em crianças1, muitas vezes levando a uma morbidade respiratória significativa em todo o mundo. Embora o MP cause principalmente infecção pulmonar, também pode provocar complicações extrapulmonares envolvendo múltiplos sistemas orgânicos.2Durante a infecção por M. pneumoniae, os sintomas gastrointestinais mais frequentemente relatados incluem náusea, vômito, diarreia e dor abdominal.3. Uma variedade de condições e manifestações gastrointestinais também foi identificada como parte de M. pneumoniae-doenças extrapulmonares relacionadas (DEREPs)2. Pacientes pediátricos com pneumonia por M. pneumoniae (MPP) complicada por lesão do sistema digestivo apresenta desafios clínicos que podem agravar a gravidade da doença e dificultar o manejo4. Evidências emergentes indicam uma interação entre infecção pulmonar e disfunção intestinal, que pode estar na base dessa associação5,6. A desregulação das respostas imunes durante a infecção por MP também pode estar associada a lesões do sistema digestório7.
Apesar dos avanços nas modalidades diagnósticas8, a identificação precoce e precisa da PPM permanece desafiadora devido à sobreposição de manifestações clínicas com outras infecções respiratórias e ao envolvimento extrapulmonar variável9. O pulmão e o intestino são componentes-chave do sistema imunológico mucoso comum, e esses órgãos podem influenciar a função um do outro, como refletido por distúrbios intestinais durante doenças pulmonares e efeitos recíprocos, um fenômeno conhecido como comunicação pulmão-intestino10. Além disso, os cuidados de enfermagem pediátricos concentram-se principalmente no manejo dos sintomas respiratórios11, enquanto as manifestações gastrointestinais podem ser subestimadas ou atribuídas a efeitos colaterais do tratamento. Essa lacuna ressalta a necessidade de uma avaliação abrangente que integre a avaliação pulmonar e gastrointestinal para otimizar as intervenções de enfermagem de suporte12. Estudos moleculares recentes destacaram reguladores das vias de sinalização inflamatória envolvidas tanto na patologia pulmonar quanto na inflamação intestinal na PPM12,13.
Acredita-se que o miR-93-5p esteja envolvido na patogênese da lesão pulmonar aguda, na qual sua subexpressão está correlacionada com função pulmonar prejudicada e respostas inflamatórias agravadas14,15. Com base nesses achados, hipotetizou-se que o miR-93-5p também estivesse subexpressão no soro de crianças com PPM. A análise bioinformática utilizando o banco de dados TargetScan identificou o receptor tipo Toll 4 (TLR4) como um possível alvo direto do miR-93-5p. Relatou-se que o TLR4 desempenha um papel importante na modulação do eixo pulmão-intestino16,17 e, portanto, foi considerado potencialmente associado a complicações gastrointestinais na PPM. Assim, este estudo investigou o envolvimento do miR-93-5p em pacientes pediátricos com PPM complicada por lesão do sistema digestivo.
Protocolo
Este estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Afiliado da Universidade de Yangzhou (Número de Aprovação: 2023-YKL01-(16); 17 de janeiro de 2023). Amostras de sangue venoso periférico foram coletadas de cada participante para os ensaios laboratoriais relevantes. Antes da participação, o consentimento informado foi obtido dos responsáveis legais de todos os participantes. Os reagentes, equipamentos e ferramentas utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Coleta de amostras clínicas
Um total de 108 crianças com idades entre 2 e 14 anos foram recrutadas no Hospital Afiliado da Universidade de Yangzhou entre fevereiro de 2023 e dezembro de 2024. Todas as 108 crianças foram diagnosticadas com PPM, confirmado por imagens de tórax e teste de reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de DNA de MP em amostras nasofaríngeas. O DNA de MP em swabs nasofaríngeos foi detectado por PCR quantitativa em tempo real direcionada ao gene da adesina P1 específico de MP.
Os pacientes foram classificados de acordo com o estado da doença em dois grupos: MPP sem IDS (n = 60) e MPP com IDS (n = 48). O IDS foi definido pela presença de pelo menos um sintoma gastrointestinal, incluindo diarreia (≥3 evacuações moles ou aquosas por dia com duração de >24 h), náusea, vômito ou dor abdominal persistente com ou sem dor à descompressão, acompanhado por pelo menos um parâmetro laboratorial anormal e/ou achado confirmatório em exame de imagem abdominal. Parâmetros laboratoriais anormais incluíam aumento das transaminases séricas, amilase ou lipase e/ou aumento de marcadores de permeabilidade intestinal, como D-lactato e endotoxina. Achados confirmatórios em exames de imagem abdominal incluíam espessamento da parede intestinal, linfonodos mesentéricos aumentados de tamanho ou efusão peritoneal detectados por ultrassonografia ou tomografia computadorizada. Além disso, 60 crianças saudáveis submetidas a exames de rotina serviram como controles.
- Critérios de inclusão
Pacientes que apresentavam sintomas gastrointestinais juntamente com anormalidades laboratoriais ou de imagem foram classificados no grupo DSI. - Critérios de exclusão
Os critérios de exclusão incluíram pneumonia viral ou bacteriana, tuberculose, histórico de alergia medicamentosa aos medicamentos do estudo, distúrbios imunológicos, desnutrição, disfunção renal, malformações gastrointestinais e tratamento prévio com antibióticos antes da admissão.
2. Cultura celular e modelo MPP
Mycoplasma pneumoniae da cepa padrão ATCC 15531 foi cultivada em caldo PPLO. Células epiteliais alveolares humanas A549 foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal, em condições úmidas a 37 °C com 5% de CO₂.
Para estabelecer um modelo in vitro de MPP, células A549 foram infectadas com suspensões de M. pneumoniae numa razão de infecção (MOI) de 1:10018. Após a infecção, as bactérias não ligadas foram removidas pela troca do meio de cultura. A eficiência da infecção foi confirmada pela detecção por qPCR de DNA de MP nos sobrenadantes culturais após a infecção.
3. Construção do plasmídeo e transfeção
Mímicos de miR-93-5p, plasmídeos de superexpressão de TLR4 (oe-TLR4) e seus controles negativos correspondentes foram sintetizados comercialmente. Células A549 infectadas com MP foram transfectadas utilizando um reagente de transfeção baseado em lipídios. A eficiência de transfeção foi avaliada 48 h após a transfeção por meio de PCR quantitativa em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR).
4. Análise de RT-qPCR
O RNA total foi extraído de células A549 coletadas ao final dos experimentos. As células foram lisadas e homogeneizadas usando solução salina tamponada com fosfato (PBS). O RNA total foi purificado utilizando um reagente de extração de RNA baseado em fenol. Um kit de transcrição reversa foi utilizado para a transcrição reversa do miR-93-5p, enquanto o DNA complementar para análise de mRNA foi sintetizado usando um reagente de transcrição reversa comercialmente disponível. A análise de RT-qPCR foi realizada utilizando química SYBR Green.
5. Ensaio MTT
As células A549 transfectadas de cada grupo experimental foram coletadas e semeadas em placas de 96 poços numa densidade de 2 × 103 células por poço. Posteriormente, adicionaram-se 20 µL do reagente brometo de metiltiazolildifenil-tetrazólio (MTT) a cada poço. Após incubação adicional de 2 h a 37 °C, os sobrenadantes foram cuidadosamente removidos. Os cristais de formazano resultantes, formados por células metabolicamente ativas, foram solubilizados conforme as instruções do ensaio. A viabilidade celular foi quantificada indiretamente pela medição da densidade óptica (DO) a 490 nm utilizando um leitor de microplacas.
6. Ensaio imunoenzimático
Kits comerciais de ensaio imunoenzimático (ELISA) foram utilizados para medir os níveis de interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-α (TNF-α). Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. As medições foram feitas em triplicata em dois experimentos independentes para garantir precisão e reprodutibilidade.
7. Ensaio de repórter dual-luciferase
Os sítios de ligação do miR-93-5p na região não traduzida 3′ (UTR) do TLR4 foram previstos utilizando o banco de dados TargetScan. Fragmentos contendo as sequências selvagem (WT) ou mutadas (MUT) foram clonados em um vetor repórter de luciferase. Células A549 foram co-transfectadas com 500 ng de cada construto WT ou MUT juntamente com mimetizadores do miR-93-5p ou controles, utilizando um reagente de transfeção baseado em lipídeos. Após 48 h, a atividade da luciferase foi medida utilizando um ensaio repórter de dupla luciferase. A atividade da luciferase de Photinus pyralis foi normalizada pela atividade da luciferase de Renilla para levar em conta a eficiência de transfeção.
8. Ensaio de Western blotting
Para o Western blot, os lisados celulares foram misturados com tampão de carga e centrifugados a 10.000 × g durante 3 min. Os sobrenadantes foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio e as proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno. As membranas foram bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) a 5% durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) e inibidor kappa B alfa (IκBα) na diluição de 1:1000 em solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 e BSA a 5%. Após três lavagens, as membranas foram incubadas com IgG de cabra anti-coelho conjugada à HRP (1:500) durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagens adicionais, as bandas proteicas foram visualizadas utilizando um substrato de quimioluminescência aprimorado e imagens foram obtidas com um sistema de detecção de quimioluminescência. As intensidades das bandas das proteínas-alvo e da GAPDH foram quantificadas a partir de três experimentos independentes utilizando software de análise de imagens.
9. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando software de análise estatística. A normalidade dos dados de medição foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk. Os dados com distribuição normal são apresentados como média ± desvio padrão e foram comparados utilizando testes t para amostras independentes para dois grupos ou análise de variância unidirecional (ANOVA) para múltiplos grupos. Quando a ANOVA indicou uma diferença geral significativa, o teste post hoc de Tukey foi utilizado para comparações aos pares. Os dados sem distribuição normal foram analisados utilizando o teste de Mann-Whitney U. As variáveis categóricas foram expressas como contagens e porcentagens e comparadas utilizando testes qui-quadrado. A análise da curva característica de operação do receptor (ROC) foi utilizada para avaliar o potencial diagnóstico do miR-93-5p na predição de MPP ou MPP com DSI. Para identificar fatores preditivos associados ao MPP com DSI, foi realizada regressão logística multivariável. As variáveis incluídas no modelo foram: idade, sexo, duração da febre, duração do uso de antibióticos e expressão do miR-93-5p dicotomizada na mediana. Um valor de P bicaudal <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
miR-93-5p está reduzido na MPP pediátrica
O desempenho diagnóstico do miR-93-5p foi avaliado para explorar seu potencial como biomarcador na MPP pediátrica. Conforme mostrado na Figura 1A, a expressão de miR-93-5p foi significativamente reduzida em pacientes pediátricos com MPP em comparação com controles saudáveis. As características demográficas e hematológicas dos dois grupos estão resumidas na Tabela 1. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na distribuição por idade ou sexo entre os grupos (P > 0,05). No entanto, a contagem periférica de leucócitos (WBC), a porcentagem de neutrófilos (Net%) e os níveis de proteína C-reativa (PCR) foram significativamente elevados no grupo com MPP em comparação com os controles saudáveis (P < 0,001).
A análise da curva de característica de operação do receptor (ROC) foi realizada para avaliar mais detalhadamente o desempenho diagnóstico do miR-93-5p na distinção entre pacientes com MPP e crianças saudáveis (Figura 1B). A área sob a curva (AUC) foi de 0,9009 [intervalo de confiança (IC) de 95%: 0,8537–0,9482], com sensibilidade de 80,56% e especificidade de 88,33%. Esses achados indicam que níveis séricos reduzidos de miR-93-5p estão associados ao MPP pediátrico.
Efeito do miR-93-5p em modelos celulares de MPP
Uma série de experimentos in vitro foi realizada para avaliar o efeito do miR-93-5p no modelo celular de MPP. Em comparação com as células controle, a expressão do miR-93-5p foi reduzida no modelo celular de MPP (Figura 2A). A infecção por MP também esteve associada à diminuição da viabilidade das células A549 (Figura 2B). Além disso, os níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α foram elevados no modelo de MPP em comparação com os controles (Figura 2C).
Para avaliar mais amplamente o efeito funcional do miR-93-5p, foi estabelecido um modelo de superexpressão de miR-93-5p em células A549 infectadas por MP (Figura 2D). A superexpressão de miR-93-5p aumentou significativamente a viabilidade celular em comparação com o modelo MPP sem superexpressão de miR-93-5p (Figura 2E). De acordo com esses achados, o aumento da expressão de miR-93-5p foi acompanhado pela redução na produção de IL-6 e TNF-α (Figura 2F). Esses resultados indicam que a diminuição da expressão de miR-93-5p esteve associada à redução da viabilidade celular e ao aumento das respostas inflamatórias durante a infecção por MP, enquanto a superexpressão de miR-93-5p atenuou essas alterações.
MiR-93-5p direciona o TLR4
Para elucidar a relação regulatória entre o miR-93-5p e o TLR4, uma análise bioinformática identificou um sítio de ligação predito para o miR-93-5p dentro da região não traduzida 3′ (UTR) do mRNA do TLR4 (Figura 3A). A expressão do TLR4 estava aumentada no modelo celular MP em comparação com os controles (Figura 3B). A interação predita foi posteriormente avaliada utilizando um ensaio de repórter de luciferase. A co-transfecção com análogos do miR-93-5p reduziu a atividade de luciferase do construto selvagem, indicando ligação específica ao sítio predito (Figura 3C).
A superexpressão de miR-93-5p em células infectadas por MP reduziu a expressão de TLR4 em comparação com os controles infectados sem tratamento com mimetizadores (Figura 3D). Para investigar mais a fundo os efeitos downstream associados à modulação de TLR4, foram estabelecidos modelos de células A549 com superexpressão de TLR4 (Figura 3E). A análise por Western blot mostrou níveis aumentados de IκBα após a superexpressão de TLR4 (Figura 3F).
A superexpressão de TLR4 diminuiu acentuadamente a viabilidade celular após infecção por MP em relação às células controle, enquanto a superexpressão simultânea de miR-93-5p reverteu essa redução (Figura 3G). A medição de citocinas inflamatórias mostrou ainda que a superexpressão de TLR4 aumentou os níveis de mediadores pró-inflamatórios, enquanto a superexpressão de miR-93-5p atenuou essas alterações, mesmo na presença de superexpressão de TLR4 (Figura 3H). Esses achados indicam que o miR-93-5p regula negativamente a expressão de TLR4 e atenua as alterações celulares associadas à infecção por MP.
Valor diagnóstico do miR-93-5p na MPP e na MPP com DSI
Relatos anteriores descreveram o envolvimento do TLR4 em tecidos pulmonar e colônico16. A associação potencial entre o miR-93-5p e a lesão do sistema digestivo na MPP foi, portanto, avaliada clinicamente. Conforme mostrado na Figura 4A, a expressão do miR-93-5p foi reduzida no grupo MPP+DSI em comparação com o grupo MPP.
As características demográficas e hematológicas são resumidas na Tabela 2. Não foram observadas diferenças significativas em idade ou sexo entre os grupos. No entanto, a duração da febre e o uso de antibióticos foram significativamente maiores em pacientes com DSI concomitante (P < 0,05).
O valor diagnóstico do miR-93-5p para distinguir casos de MPP com DSI daqueles sem DSI foi avaliado utilizando análise de curva ROC. A AUC foi de 0,7866 (IC 95%: 0,6889–0,8843) (Figura 4B), com sensibilidade de 85,71% e especificidade de 57,45%.
A análise de regressão logística multivariável identificou baixa expressão de miR-93-5p, duração prolongada da febre e uso prolongado de antibióticos como fatores associados a lesão do sistema digestivo durante a infecção por MP (Tabela 3; P < 0,05).
Figura 1: Expressão e valor diagnóstico de miR-93-5p em controles saudáveis (n = 60) e pacientes com MPP (n = 108). (A) A expressão de miR-93-5p estava reduzida em pacientes com MPP. (B) Análise da curva ROC de miR-93-5p. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos funcionais do miR-93-5p no modelo celular infectado com MP. (A) A expressão de miR-93-5p foi reduzida no modelo infectado com MP. (B) A viabilidade celular foi reduzida no modelo infectado com MP. (C) Os níveis de TNF-α e IL-6 foram aumentados no modelo infectado com MP. (D) Eficiência de transfeção do mimetizador de miR-93-5p. (E) A viabilidade celular foi aumentada após a superexpressão de miR-93-5p. (F) Os níveis de TNF-α e IL-6 foram reduzidos após a superexpressão de miR-93-5p. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: O miR-93-5p direciona diretamente o TLR4. (A) Local de ligação previsto entre o miR-93-5p e o TLR4. (B) Expressão do TLR4 no modelo infectado com MP. (C) Ensaio de repórter de dupla luciferase. (D) Regulação negativa do TLR4 pelo miR-93-5p. (E) Eficiência da superexpressão do TLR4. (F) Análise por Western blot da IκBα. (G) Viabilidade celular. (H) Níveis de TNF-α e IL-6. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Expressão e valor diagnóstico do miR-93-5p em pacientes com MPP (n = 60) e pacientes com MPP com DSI (n = 48). (A) Expressão do miR-93-5p no grupo MPP+DSI. (B) Análise por curva ROC do miR-93-5p. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Variável | Saudável (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| idade (anos) | 6,81 ± 3,14 | 7,12 ± 3,55 | 0,559 |
| sexo (masculino/feminino) | 28/32 | 49/59 | 0,872 |
| GB (× 109/L) | 7,27 ± 0,89 | 9,86 ± 1,36 | <0,001 |
| PCR (mg/L) | 2,35 ± 0,17 | 11,53 ± 2,01 | <0,001 |
| Neutrófilos (%) | 42,55 ± 5,62 | 56,51 ± 15,40 | <0,001 |
Tabela 1: Comparação das características demográficas e parâmetros sanguíneos de rotina entre controles saudáveis e pacientes com PPM. Esta tabela resume as características demográficas e os parâmetros hematológicos de rotina de controles saudáveis e pacientes com PPM, incluindo idade, sexo, VCM, porcentagem de neutrófilos, porcentagem de eosinófilos, porcentagem de basófilos e PCR. As comparações entre grupos e os valores de P correspondentes são apresentados.
| Variável | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| idade (anos) | 6,88 ± 3,87 | 7,42 ± 3,11 | 0,441 |
| sexo (masculino/feminino) | 31/29 | 28/20 | 0,494 |
| GB (× 10⁹/L) | 8,9 ± 0,89 | 11,05 ± 0,76 | <0,001 |
| PCR (mg/L) | 10,94 ± 1,62 | 12,27 ± 2,22 | <0,001 |
| Neutrófilos (%) | 55,87 ± 14,75 | 57,32 ± 16,29 | 0,629 |
| Duração da febre (dia) | 4,60 ± 1,83 | 7,26 ± 1,04 | <0,001 |
| Tempo de uso de antibiótico (dia) | 4,65 ± 1,147 | 6,29 ± 0,771 | <0,001 |
Tabela 2: Comparação das características demográficas e parâmetros sanguíneos de rotina entre pacientes com MPP e pacientes com MPP+DSI. Esta tabela compara as características demográficas, parâmetros hematológicos de rotina e características clínicas relevantes entre pacientes com MPP isolado e aqueles com MPP complicado por DSI. As comparações entre grupos e os valores de P correspondentes são apresentados.
| Variável | OR | IC 95% | Valor P | |
| inferior | superior | |||
| miR-93-5p (Baixo vs Alto) | 6,702 | 1,487 | 30,211 | 0,013 |
| idade | 1,126 | 0,286 | 4,437 | 0,866 |
| sexo | 1,071 | 0,27 | 4,248 | 0,923 |
| Duração da febre | 73,416 | 15,018 | 358,895 | <0,001 |
| Tempo de uso de antibiótico | 7,921 | 1,877 | 33,421 | 0,005 |
Tabela 3: Análise de regressão logística de crianças com infecção por MP complicada por lesão do sistema digestivo. Esta tabela apresenta os resultados da análise de regressão logística que avalia os fatores associados à lesão do sistema digestivo em crianças com infecção por MP. A análise inclui a OR, o IC 95% e o valor de P para cada variável.
Abreviações: Baso%, porcentagem de basófilos; CI, intervalo de confiança; PCR, proteína C reativa; LST, lesão do sistema digestivo; Eos%, porcentagem de eosinófilos; IκBα, inibidor kappa B alfa; IL-6, interleucina-6; MP, Mycoplasma pneumoniae; MPP, pneumonia por Mycoplasma pneumoniae; NC, controle negativo; Net%, porcentagem de neutrófilos; oe-TLR4, superexpressão de TLR4; OR, razão de chances; ROC, característica operacional do receptor; TLR4, receptor tipo Toll 4; TNF-α, fator de necrose tumoral-α; VCM, contagem de glóbulos brancos.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os dados numéricos brutos que sustentam as figuras e tabelas são fornecidos como Tabela Suplementar 1.
Tabela Suplementar 1: Dados numéricos brutos para as figuras e tabelas. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Embora seja considerado principalmente um patógeno pulmonar, a infecção por MP pode causar diversas complicações extrapulmonares que afetam múltiplos sistemas orgânicos além dos pulmões19,20. Evidências emergentes sugerem uma interação ao longo do eixo pulmão-intestino, no qual mediadores inflamatórios liberados durante a patologia pulmonar desequilibram a flora intestinal21 e a função intestinal22. Essa interação bidirecional destaca a importância de uma avaliação abrangente do paciente, abordando tanto os sintomas respiratórios quanto a saúde gastrointestinal. Biomarcadores séricos circulantes têm, portanto, atraído atenção crescente como ferramentas minimamente invasivas com valor potencial diagnóstico ou prognóstico23,24. As miRNAs surgiram como candidatas promissoras devido à sua estabilidade e aos seus papéis na regulação de vias de sinalização relacionadas à inflamação envolvidas na patogênese do MP25,26,27. Este estudo explorou de forma sistemática o papel e a importância clínica da miR-93-5p na MPP pediátrica, especialmente quando complicada por lesão do sistema digestivo. Os níveis de miR-93-5p estavam reduzidos em crianças com MPP em comparação com controles saudáveis e foram ainda mais reduzidos naqueles com lesão do sistema digestivo. Esses achados indicam um possível papel da desregulação da miR-93-5p na patologia pulmonar e como um biomarcador potencial para manifestações extrapulmonares.
As miRNAs demonstraram valor diagnóstico na pneumonia grave, com sensibilidade, especificidade e precisão diagnóstica geral promissoras28,29. Clinicamente, crianças com PPM complicada por ISD apresentaram duração prolongada da febre e tratamento com antibióticos mais prolongado em comparação com aquelas sem complicações digestivas. Níveis mais baixos de miR-93-5p estiveram independentemente associados ao envolvimento do sistema digestivo, juntamente com esses parâmetros clínicos, em análise de regressão logística multivariável. Além disso, a análise da curva ROC mostrou um desempenho diagnóstico favorável do miR-93-5p sérico para distinguir pacientes com PPM com ISD daqueles sem ISD. Assim, a medição do miR-93-5p pode fornecer valor adicional para a identificação precoce e estratificação de risco na infecção por MP pediátrica.
Em relação ao desempenho diagnóstico do miR-93-5p circulante em comparação com marcadores inflamatórios clínicos de rotina, os resultados sugerem que o miR-93-5p pode oferecer valor complementar, em vez de substituir indicadores convencionais. A proteína C-reativa (PCR) e a procalcitonina (PCT) continuam sendo biomarcadores amplamente utilizados na prática clínica para avaliar a gravidade da infecção e orientar a terapia antibiótica, com meta-análises demonstrando que a PCT apresenta precisão diagnóstica ligeiramente superior à da PCR na pneumonia bacteriana30. No entanto, esses reagentes de fase aguda são amplamente inespecíficos, pois respondem a diversos estímulos inflamatórios e não conseguem distinguir de forma confiável a infecção por MP de outros patógenos respiratórios ou refletir especificamente o risco de complicações extrapulmonares. Em contraste, o miR-93-5p, como molécula reguladora associada à sinalização TLR4/fator nuclear kappa B (NF-κB), pode fornecer informações fisiopatológicas distintas que complementam os marcadores convencionais. Relatou-se que a correlação entre miR-93-5p e PCR é relativamente fraca (r de Pearson = 0,2698), sugerindo que o miR-93-5p pode refletir um aspecto diferente da resposta inflamatória em comparação com a resposta sistêmica de fase aguda.
Evidências emergentes de modelos animais demonstraram que a infecção por Mycoplasma pneumoniae pode induzir não apenas patologia respiratória, mas também lesão no sistema digestivo por meio do eixo pulmão-intestino mediado pela flora intestinal31. Em camundongos infectados com MP, observou-se lesão patológica tanto nos pulmões quanto no cólon, juntamente com alterações na composição da microbiota intestinal, incluindo a diminuição da abundância de bactérias benéficas como Corynebacterium glutamicum e o aumento da abundância de patógenos potenciais como Lachnospiraceae NK4A136 group e Escherichia-Shigella, acompanhadas por níveis elevados de lipopolissacarídeo (LPS) no conteúdo colônico e no sangue32. Relatou-se também que a baicalina atenua a inflamação pulmonar e regula a flora intestinal em camundongos com MPP por meio da via TLR4/NF-κB, reforçando o envolvimento dessa cascata de sinalização na comunicação cruzada entre pulmão e intestino33. Esses achados são compatíveis com um possível envolvimento da sinalização NF-κB no eixo miR-93-5p/TLR4 analisado no presente estudo.
No nível mecanicista, a TLR4, uma mediadora-chave da imunidade inata associada a respostas pró-inflamatórias34,35,36,37, foi superexpressa durante a infecção por MP. A expressão elevada de TLR4 foi acompanhada por níveis aumentados das citocinas inflamatórias IL-6 e TNF-α e redução da viabilidade das células epiteliais. A superexpressão de miR-93-5p suprimiu a expressão de TLR4, atenuou a liberação de citocinas inflamatórias e melhorou a sobrevivência celular em condições infecciosas. Portanto, a subexpressão de miR-93-5p em pacientes com MPP, especialmente naqueles com lesão do sistema digestório, pode estar associada a um aumento da sinalização inflamatória mediada por TLR4 e a respostas inflamatórias sistêmicas mais amplas. Os achados atuais não comprovam a ativação da via downstream NF-κB, pois não foram avaliadas as formas fosforiladas de IκBα e p65.
Várias limitações deste estudo devem ser reconhecidas. Primeiramente, este foi um estudo unicêntrico com um tamanho amostral relativamente pequeno, especialmente para o subgrupo DSI, o que pode limitar o poder estatístico e a generalização dos resultados. É necessária uma validação externa em coortes maiores e multicêntricas para confirmar essas descobertas e estabelecer valores clínicos de corte confiáveis. Em segundo lugar, embora a IκBα tenha sido detectada por Western blot, não foi realizada uma validação abrangente de outros componentes downstream da via TLR4/NF-κB, incluindo MyD88, p-IκBα e p65. A validação em nível proteico desses componentes de sinalização fortaleceria a interpretação mecanicista. Em terceiro lugar, o delineamento observacional impede inferências causais; experimentos de perda e ganho de função, incluindo mimetizadores ou inibidores de miRNA in vitro ou in vivo, são necessários para determinar se o miR-93-5p contribui diretamente para lesões digestivas associadas à MPP. Em quarto lugar, os experimentos in vitro foram realizados em células epiteliais pulmonares A549. Embora este modelo seja adequado para avaliar os efeitos anti-inflamatórios do miR-93-5p em um contexto pulmonar, ele não pode modelar diretamente a patologia gastrointestinal. A associação proposta entre a sinalização pulmonar de miR-93-5p/TLR4 e as manifestações digestivas, possivelmente mediada pelo eixo pulmão-intestino, exige validação direta em modelos de células epiteliais intestinais, como as células Caco-2, e em modelos animais in vivo de infecção por MP. Por fim, desafios técnicos associados à detecção de miRNA, incluindo a estabilidade do RNA e estratégias de normalização, continuam sendo barreiras para a implementação clínica rotineira. Apesar dessas limitações, os resultados fornecem uma base para futuros estudos mecanicistas e esforços de validação em larga escala.
Em conclusão, a superexpressão de miR-93-5p atenuou a inflamação induzida por MP em células epiteliais pulmonares por meio da supressão de TLR4. Clinicamente, níveis reduzidos de miR-93-5p circulante estiveram associados a lesão do sistema digestivo em crianças com MPP, sugerindo potencial utilidade como biomarcador complementar para identificar pacientes com risco de complicações gastrointestinais.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células epiteliais alveolares humanas A549 | ATCC, EUA | Cat# CCL-185; RRID: CVCL_0023 | Linhagem celular de epitélio alveolar humano utilizada para o modelo in vitro de MPP |
| Anticorpo anti-GAPDH | Hangzhou XianZhi Biological Technology, China | Cat# AB-P-R001; RRID: AB_3096355 | Anticorpo primário utilizado para detecção de GAPDH como controle de carga no Western blot |
| Anticorpo anti-IκBα | Beyotime, China | Cat# AG2741; RRID: AB_3731391 | Anticorpo primário utilizado para detecção de IκBα por Western blot |
| Albumina sérica bovina (BSA) | Solarbio, China | Cat# A8012 | Reagente bloqueador utilizado durante o Western blot |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific, EUA | Multifuge X4 Pro; Cat# 75016066; RRID: SCR_020726 | Centrífuga utilizada durante o cultivo celular e preparação de amostras |
| Sistema de imagem por quimioluminescência | Tanon, China | 5200Multi; RRID: SCR_027114 | Sistema de imagem utilizado para visualizar sinais quimioluminescentes de Western blot |
| Sistema de Ensaio com Repórter Duplo-Luciferase | Promega, EUA | Cat# E1910 | Utilizado para medir as atividades de luciferase de firefly e Renilla |
| Soro bovino fetal (FBS) | Gibco, EUA | Cat# A5256701 | Suplemento sérico para meio de cultivo celular |
| Anticorpo secundário conjugado à HRP, anti-IgG de cabra | Cell Signaling Technology, EUA | Cat# 7074; RRID: AB_2099233 | Anticorpo secundário conjugado à HRP utilizado para Western blot |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Versão 10.1.2; URL: https://www.graphpad.com | Software utilizado para análise estatística e apresentação gráfica |
| Kit ELISA para Interleucina-6 (IL-6) | Elabscience, China | Cat# E-EL-H6156; RRID: AB_3665145 | Kit ELISA utilizado para quantificar IL-6 |
| Reagente de Transfecção Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | Reagente baseado em lipídeos utilizado para transfeção de células A549 |
| Leitor de microplacas | Tecan, Suíça | Infinite M Plex; RRID: SCR_026522 | Leitor de microplacas utilizado para medir a densidade óptica a 490 nm |
| miméticos de miR-93-5p | Ribobio, China | Cat# miR10000093-1-5 | Mimético sintético de miR-93-5p utilizado para superexpressão de miR-93-5p |
| controle negativo de miR-93-5p | Ribobio, China | Cat# miR1N0000001-1-5 | Controle negativo para transfeção com mimético de miR-93-5p |
| Kit de Ensaio de Proliferação Celular e Citotoxicidade MTT | Beyotime, China | Cat# C0009S | Utilizado para avaliar a viabilidade celular |
| Estirpe padrão de Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 | ATCC, EUA | Cat# 15531 | Estirpe padrão de M. pneumoniae utilizada para estabelecer o modelo de infecção |
| Vetor repórter de luciferase pGL3-Basic | Promega, EUA | Cat# E1751 | Vetor repórter utilizado no ensaio de repórter duplo-luciferase |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Solarbio, China | Cat# IP9212 | Tampão utilizado para lavagem celular e preparação de amostras |
| Substrato Western Pierce ECL | Thermo Scientific, EUA | Cat# 32209 | Substrato quimioluminescente utilizado para detecção em Western blot |
| Meio Pleuropneumonia-like organism (PPLO) | BD, EUA | Cat# 255420 | Meio de cultura utilizado para M. pneumoniae |
| Membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Membrana utilizada para transferência proteica durante o Western blot |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Japão | Cat# RR036A | Mistura mestra de transcrição reversa utilizada para síntese de cDNA |
| Kit de Reagentes PrimeScript RT | Takara Bio Inc., Japão | Cat# RR037A | Kit de reagentes utilizado para transcrição reversa |
| Sistema de PCR em tempo real | Applied Biosystems, EUA | QuantStudio 3 Real-Time PCR System; RRID: SCR_020238 | Instrumento de PCR em tempo real utilizado para análise de qPCR |
| Meio RPMI-1640 | Gibco, EUA | Cat# 11875135 | Meio de cultivo celular utilizado para células A549 |
| SPSS | IBM | Versão 27.0; RRID: SCR_016479 | Software utilizado para análise estatística |
| Controle negativo para superexpressão de TLR4 | Ribobio, China | NA | Controle negativo para experimentos de superexpressão de TLR4 |
| Plasmídeo de superexpressão de TLR4 (oe-TLR4) | Ribobio, China | NA | Plasmídeo utilizado para superexpressão de TLR4 |
| Reagente TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | Reagente utilizado para extração de RNA total |
| Kit ELISA para Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) | Elabscience, China | Cat# E-EL-H0109; RRID: AB_3665144 | Kit ELISA utilizado para quantificar TNF-α |
| Universal SYBR qPCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japão | Cat# BL697A | Mistura mestra utilizada para PCR quantitativa |
| Sistema de eletroforese em gel para Western blot | Bio-Rad, EUA | Mini-PROTEAN Tetra Cell; Cat# 1658004 | Sistema de eletroforese utilizado para separação de proteínas |
Referências
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