Aqui, apresentamos um protocolo para o projeto, montagem e operação de um dispositivo microfluídico fechado e livre de bolhas para o cultivo de células endoteliais sob condições de fluxo fisiológico em microgravidade simulada.
Artigo de método
Uma Plataforma para a Cultura Contínua de Células Endoteliais Sob Condições de Fluxo Fisiológico em Microgravidade Simulada
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11 de setembro de 2026
Neste artigo
Resumo
Resumo
Sistemas microfisiológicos (MPS) são modelos in vitro valiosos que recriam a estrutura e a função de tecidos humanos. Especificamente, dispositivos de tecido ou órgão-em-chip que incorporam tecnologia microfluídica replicam o ambiente mecânico e bioquímico in vivo, ao mesmo tempo que permitem o monitoramento em tempo real do crescimento e desenvolvimento celular. Esses sistemas podem ser particularmente úteis para estudos de voos espaciais, pois podem ser enviados ao espaço, por exemplo à Estação Espacial Internacional (ISS), para investigar o impacto das viagens espaciais no corpo humano. Um dos principais obstáculos ao sucesso dos MPS é a formação de bolhas, que pode ser acentuada na microgravidade. Este artigo descreve o projeto, a montagem e o funcionamento de um sistema de cultura celular microfisiológico para uso em microgravidade simulada (por exemplo, operado em uma máquina de posicionamento aleatório ou clinostato). A incorporação de uma armadilha de bolhas independente de orientação no circuito fluídico mostrou-se altamente eficaz na remoção de bolhas de ar em microgravidade e na viabilização de culturas prolongadas de células endoteliais. Esse sistema microfluídico fechado e independente de orientação pode ser usado para operação livre de bolhas de chips de tecidos ou órgãos-em-chip, a fim de simular os efeitos combinados da microgravidade e do fluxo, ou para implantação em missões espaciais.
Introdução
Atualmente, é bem estabelecido, por meio de mecanismos em investigação, que forças mecânicas desempenham um papel crítico na função celular e na manutenção do delicado equilíbrio entre saúde e doença1. De todos os estresses ambientais, a força gravitacional é única e é corretamente considerada um vetor constante e intransigente na grande maioria das ciências biomédicas. No entanto, o voo espacial apresenta um ambiente de microgravidade único, no qual o comportamento dos organismos pode diferir daquele observado na Terra. Experimentos em voo espacial envolvendo animais e seres humanos mostram alterações significativas na fisiologia, destacando o papel da gravidade na homeostase celular e organizacional2.
Recentemente, a NASA e outras agências privadas demonstraram grande interesse em desenvolver chips de tecidos (ou órgãos-em-chips) para utilização em missões espaciais.3. Os chips de tecido são projetados para imitar o in vivo arquitetura, permitindo modelar, com alta fidelidade, o impacto fisiológico e mecanicista da microgravidade e da radiação espacial4Ao utilizar células derivadas de doadores, os chips de tecido também podem ser usados para investigar a sensibilidade do astronauta à microgravidade e à radiação espacial e desenvolver contramedidas preventivas.5. Nos últimos cinco anos, vários sistemas orgânicos, incluindo cérebro, fígado, intestino, vasos sanguíneos, coração, rim e pulmões, foram modelados utilizando chips de tecido e lançados a bordo da ISS6. in vivo, os órgãos são perfundidos pela vasculatura em graus variados, o que determina sua fisiologia – por exemplo, o fígado é altamente vascularizado, enquanto a cartilagem é muito menos vascularizada. Portanto, para recapitular com precisão a função orgânica in vitro, uma consideração importante no desenvolvimento de sistemas de órgãos-em-uma-placa é a incorporação de fluxo de fluido em tecidos e células.
A microfluídica tem sido usada para perfundir células e tecidos em sistemas de órgão-em-um-chip7,8. Níveis apropriados de fluxo de fluido não apenas sustentam o transporte de nutrientes para dentro do sistema e a remoção de produtos residuais, mas também mantêm a tensão de cisalhamento fisiológica experimentada pelas células. No entanto, em dimensões pequenas, bolhas representam um desafio persistente nas fronteiras de fase, levando a medições imprecisas, danos e obstruções9. Para mitigar esse problema, armadilhas de bolhas com designs ativos (por exemplo, desgaseificação a vácuo ou campos externos, como acústicos ou térmicos) e passivos (por exemplo, uma membrana semipermeável que depende de propriedades superficiais) têm sido utilizadas10,11. No entanto, esses designs de desaeradores microfluídicos aumentam a complexidade da fabricação do dispositivo, comprometem a integridade da amostra e levam a entupimentos e rupturas da barreira. Os problemas são agravados no espaço, onde a nucleação e a formação de bolhas são muito mais acentuadas, e as estratégias de mitigação de bolhas eficazes na Terra tornam-se amplamente ineficazes12. Análogos terrestres de microgravidade podem ser gerados usando dispositivos como um vaso de parede rotatória (RWV) ou uma máquina de posicionamento aleatório (RPM)13,14. De interesse, na RPM, o vetor gravitacional é continuamente reorientado, anulando quase completamente o estímulo gravitacional líquido médio no tempo sobre a amostra. Recentemente, relatamos o design, a fabricação e a aplicação de uma armadilha de bolhas independente de orientação para cultura com perfusão de células endoteliais sob microgravidade simulada usando uma RPM15. Neste artigo, descrevemos a montagem e operação passo a passo de um sistema de perfusão em circuito fechado utilizando a armadilha de bolhas independente de orientação e demonstramos sua aplicabilidade para a cultura de células endoteliais da veia umbilical humana como modelo para cultura celular contínua em microgravidade simulada.
O sistema de circuito fechado é composto por um microcontrolador com um driver de motor para operação da microbomba controlada por frequência e tensão, um sensor de fluxo de líquido, um captador de bolhas15 e um canal microfluídico contendo células endoteliais aderentes. Os componentes específicos são detalhados na Tabela de Materiais. Os protocolos a seguir descrevem a montagem da eletrônica do sistema (Etapa 1), a montagem da parte fluídica (Etapa 2), a esterilização e escorvamento (Etapas 3 e 4), a integração do cultivo celular microfluídico (Etapa 4), a montagem das microbombas e do controlador (Etapa 5) e a montagem de todo o sistema em uma caixa de proteção (Etapa 6). O sistema de fluxo de circuito fechado foi montado sobre o RPM para simular microgravidade utilizando uma caixa personalizada (Etapa 7).
Protocolo
1. Eletrônica do sistema
- Conecte o driver da bomba ao microcontrolador nos soquetes designados marcados como “mp-Highdriver4.”
- Conecte um cabo da bomba ao local designado no lado do driver da bomba marcado como “CH1 CH2.”
- Conecte uma microbomba a uma das portas do cabo da bomba. Certifique-se de que a porta de conexão branca seja suavemente puxada para longe dos fios coloridos para inserir completamente a microbomba. Após a microbomba ser totalmente inserida na porta de conexão, empurre suavemente a porta de conexão branca de volta em direção aos fios coloridos para fixar a microbomba no lugar.
- Utilize um cabo macro-para-mini-USB para conectar a placa Nano a um computador que tenha o aplicativo do microcontrolador instalado.
- Fixe dois conectores roscados com bico em ambas as extremidades de um sensor de fluxo de líquido. Utilize o sensor de fluxo de líquido para monitorar e registrar os dados da taxa de fluxo do líquido. O sistema montado é mostrado na Figura 1.
NOTA: Todos os componentes da Seção 1 precisam ser substituídos apenas quando necessário, por exemplo, quando estiverem danificados ou quando o desempenho começar a degradar.
2. Conexões de fluidos do sistema
- Preencha a cavidade do coletor de bolhas independente de orientação com o fluido de trabalho experimental até aproximadamente 80% da capacidade máxima durante o escorvamento.
NOTA: Esse nível de preenchimento permite taxas mais altas de retenção de bolhas, mantendo ainda as portas de entrada e saída submersas no fluido de trabalho. O coletor de bolhas independente de orientação possui duas portas laterais próximas ao seu centroide que servem como conexões diretas ao sistema de fluxo em circuito fechado, e uma porta superior compatível com Luer que permite o preenchimento adicional da cavidade quando aberta. Antes do início do experimento, é fundamental que a porta superior do coletor de bolhas independente de orientação seja completamente selada usando uma combinação de fita de teflon e um tampão Luer para garantir um sistema totalmente fechado. - Corte quatro comprimentos de tubo de PVC de 10 cm (1,59 mm de diâmetro interno × 3,18 mm de diâmetro externo) para conectar todos os componentes do circuito de fluxo.
- Conecte um dos pedaços de tubo de PVC à saída da microbomba (a marca de seta indica a direção do fluxo da entrada para a saída). Use um espaçador redondo de náilon preto de 3 mm (3,2 mm de diâmetro interno) ao redor do tubo de PVC para fixar completamente o tubo à microbomba. Conecte a outra extremidade do tubo de PVC a uma das portas laterais do coletor de bolhas independente de orientação.
- Use o segundo pedaço de tubo de PVC para conectar a outra porta lateral do coletor de bolhas independente de orientação ao adaptador de entrada do sensor de fluxo de líquido (a marca de seta indica a direção do fluxo da entrada para a saída).
- Use o terceiro pedaço de tubo de PVC para conectar o adaptador de saída do sensor de fluxo de líquido (ou seja, o lado para onde a seta aponta) a um conector Luer em cotovelo.
- Conecte o último pedaço de tubo de PVC à entrada da mesma microbomba (a marca de seta indica a direção do fluxo da entrada para a saída). Use um espaçador redondo de náilon preto de 3 mm (3,2 mm de diâmetro interno) ao redor do tubo de PVC para fixar completamente o tubo à microbomba. Conecte a outra extremidade do tubo de PVC a um conector Luer em cotovelo.
NOTA: Todos os tubos devem ser substituídos entre cada experimento.
3. Preparação Experimental e Esterilização do Sistema
- Prepare uma cabine de segurança biológica para o processo de esterilização, garantindo esterilidade e segurança completas para o cultivo celular.
- Prepare um tubo cônico autoportante de 50 mL com etanol a 70% e um tubo cônico autoportante de 50 mL com água estéril para cultivo celular.
- Coloque o microcontrolador em um saco plástico pequeno, mas deixe o Cabo da Bomba e a microbomba saírem do saco. Use um prendedor plástico para selar o saco plástico e proteger os componentes eletrônicos.
- Utilize um frasco com spray de etanol a 70% e toalhas de papel para esterilizar a parte externa de todos os componentes do circuito de fluxo e de todos os materiais experimentais diversos. NÃO utilize o spray de etanol a 70% em quaisquer conectores elétricos. Coloque cada componente e material na cabine de segurança biológica imediatamente após ser limpo com etanol a 70%.
- Conecte uma estação de computador móvel ao microcontrolador usando um cabo USB macro-para-mini e abra o aplicativo do microcontrolador no computador para ajustar a frequência e a tensão das duas microbombas para 100 Hz e 240 V, respectivamente. Mantenha a microbomba desligada.
- Submerja o conector Luer em cotovelo conectado à microbomba diretamente em um tubo cônico autoportante de 50 mL contendo etanol a 70%. Conecte uma seringa de 12 mL com um acoplador Luer fêmea-fêmea ao outro conector Luer em cotovelo no mesmo circuito de fluxo.
- Aperte manualmente o trecho do tubo de PVC que conecta a microbomba ao conector Luer em cotovelo e certifique-se de que a porta superior do separador de bolhas independente de orientação esteja vedada com fita de teflon e um tampão Luer. Use a outra mão para puxar a seringa de 12 mL aproximadamente 5 mL, criando um vácuo suficiente em todo o sistema.
- Ligue a microbomba e solte o prendedor do passo anterior. Deixe 5 mL de etanol a 70% passarem pela seringa para garantir a esterilização completa do sistema.
- Abra a porta superior do separador de bolhas independente de orientação para permitir que ele se encha com etanol a 70%. Quando o separador de bolhas independente de orientação atingir aproximadamente 80% da capacidade com etanol a 70%, desligue a bomba e feche completamente a porta superior com fita de teflon e um tampão Luer. Agite suavemente o separador de bolhas independente de orientação para garantir que seu interior esteja completamente esterilizado.
- Remova o conector Luer em cotovelo do tubo cônico com etanol a 70% e ligue a microbomba para esvaziar o sistema. Assim que todo o etanol a 70% for aspirado para dentro da seringa de 12 mL, desconecte o separador de bolhas independente de orientação do sistema, remova o tampão Luer e esvazie o separador de bolhas diretamente em um recipiente de resíduos para remover o etanol a 70%.
- Repita os passos 3.6–3.10 usando o tubo cônico autoportante de 50 mL com água estéril para cultivo celular em vez de etanol a 70% e permita que 15 mL de água estéril para cultivo celular passem por cada circuito de fluxo.
4. Preparação do sistema e integração do canal microfluídico para células
- Após a esterilização estar completa, mantenha o sistema dentro da cabine de segurança biológica para o escorvamento a vácuo com o fluido de trabalho.
- Submerja o conector Luer em cotovelo conectado à microbomba diretamente em um recipiente plástico (dimensões aproximadas de 80 mm × 50 mm × 25 mm) contendo 30 mL de meio de cultura celular. Conecte a seringa de 12 mL ao outro conector Luer em cotovelo no mesmo circuito de fluxo, utilizando um acoplador Luer fêmea-fêmea.
- Use o indicador e o polegar da mão esquerda para prender o trecho de PVC Tygon que conecta a microbomba ao conector Luer em cotovelo, e use a mão direita para puxar a seringa de 12 mL aproximadamente 5 mL, criando um vácuo suficiente em todo o sistema. Certifique-se de que a porta superior do coletor de bolhas independente de orientação esteja vedada com fita de teflon e um tampão Luer.
- Ligue a microbomba e solte o prendedor do passo anterior. Deixe passar 5 mL de meio de cultura celular até a seringa para garantir o escorvamento completo do sistema.
- Abra a porta superior do coletor de bolhas independente de orientação para permitir que ele se encha com meio de cultura celular. Quando o coletor de bolhas independente de orientação atingir aproximadamente 80% da capacidade com meio de cultura, desligue a bomba e vede completamente a porta superior com fita de teflon e um tampão Luer.
- Coloque o canal microfluídico com células cultivadas diretamente no recipiente plástico de 80 mm × 50 mm × 25 mm e posicione a barra magnética de agitação no centro do microcanal com células cultivadas para impedir que flutue. Encha o recipiente plástico com meio de cultura adicional até que toda a lâmina esteja completamente submersa.
NOTA: As células endoteliais foram cultivadas em ibidi µ-Slide VI0.4 até 80% de confluência utilizando protocolos padrão antes da integração no circuito de fluxo16. - Mantendo os conectores Luer em cotovelo de um circuito de fluxo submersos no meio de cultura celular, ligue a microbomba para esse circuito de fluxo. Conecte cuidadosamente os conectores Luer em cotovelo a um dos microcanais e certifique-se de que nenhuma bolha de ar se forme nos pontos de conexão. Após concluir isso, desligue a microbomba.
5. Invólucro para microcontrolador e microbombas (Opcional)
- Utilize dois parafusos M3 × 8 de aço inoxidável, duas arruelas M3 de aço inoxidável e duas porcas M3 de aço inoxidável para fixar o suporte transversal personalizado à placa de montagem inferior personalizada.
- Utilize quatro parafusos M3 × 12 de aço inoxidável, quatro arruelas M3 de aço inoxidável e quatro porcas M3 de aço inoxidável para fixar a base do invólucro de policarbonato à placa de montagem inferior personalizada. Utilize oito arruelas de náilon M3 (duas em cada parafuso M3 × 12) para deixar um pequeno espaço entre a base do invólucro e a placa de montagem inferior.
- Utilize quatro parafusos M3, quatro espaçadores hexagonais de náilon macho-fêmea e quatro porcas M3 de aço inoxidável para fixar o microcontrolador à placa de montagem interna acrílica personalizada. Posicione os espaçadores hexagonais de náilon entre a base do microcontrolador e a placa de montagem acrílica.
- Utilize dois parafusos M3 × 8 de aço inoxidável, duas arruelas M3 de aço inoxidável e duas porcas M3 de aço inoxidável para fixar o suporte personalizado da microbomba ao topo da placa de montagem interna acrílica.
- Coloque as microbombas no suporte personalizado de microbombas de modo que a seta nas microbombas aponte em direção ao driver da bomba.
- Utilize quatro parafusos cabeça chata M3 × 8 de aço inoxidável e quatro arruelas M3 de aço inoxidável para fixar a placa de montagem interna acrílica ao interior do invólucro de policarbonato.
- Insira quatro buchas de borracha em um lado do invólucro de policarbonato que possui quatro furos consecutivos. Repita para o lado oposto com quatro furos consecutivos.
- Utilize uma etiquetadora para numerar as buchas de 1 a 4 da esquerda para a direita em ambos os lados do invólucro de policarbonato.
- Prenda dois anéis em forma de O na parte roscada do cabo mini-USB macho-fêmea. Após isso, insira a extremidade fêmea do cabo mini-USB macho-fêmea através do furo no invólucro de policarbonato no mesmo lado das setas das microbombas. Fixe o lado fêmea do cabo mini-USB macho-fêmea prendendo outro anel em forma de O ao redor da parte roscada na parte externa do invólucro de policarbonato.
- Selar o furo restante no lado do invólucro de policarbonato com fita multiuso. O sistema montado é mostrado na Figura 2.
6. Placa de montagem do convés superior (Opcional)
- Utilize quatro parafusos M2 × 8 em aço inoxidável e quatro porcas M2 em aço inoxidável para fixar dois grampos de montagem do sensor de fluxo à placa de montagem superior acrílica personalizada.
- Utilize quatro parafusos M3 × 12 em aço inoxidável e quatro porcas M3 em aço inoxidável para fixar dois suportes personalizados para o separador de bolhas independente de orientação à placa de montagem superior acrílica personalizada.
- Utilize alicate para cortar uma haste roscada M4 em aço em quatro pedaços com aproximadamente 110 mm de comprimento. Utilize essas quatro peças como colunas verticais para fixar a placa de montagem superior acima do invólucro de policarbonato.
- Utilize tesoura para cortar quatro pedaços de tubo de poliuretano com 40 mm de comprimento (6,35 mm de diâmetro externo). Passe as hastes roscadas M4 em aço por esses trechos de tubo para garantir folga suficiente entre a placa de montagem superior e a tampa do invólucro de policarbonato.
- Com os suportes personalizados para o separador de bolhas independente de orientação e os grampos de montagem voltados para cima, passe uma das quatro hastes roscadas M4 pela metade de cada canto da placa de montagem superior acrílica personalizada. Na extremidade superior de cada haste roscada, fixe uma porca borboleta M4, uma porca M4 e uma arruela.
- Passe cada haste roscada M4 por um espaçador redondo preto em nylon de 6 mm (3,2 mm de diâmetro interno) e por um trecho de 40 mm de comprimento de tubo de poliuretano. Finalmente, fixe uma porca borboleta M4 na extremidade inferior de cada haste roscada M4. Organize os componentes na seguinte ordem: porca borboleta M4 em aço, porca M4 em aço inoxidável, arruela M4 em aço inoxidável, placa de montagem superior, espaçador redondo preto em nylon, tubo de poliuretano e outra porca borboleta M4 em aço.
- Utilize fita multiuso para colar dois retângulos acrílicos de 75 mm de comprimento × 25 mm de largura um ao outro, face a face, de modo que os comprimentos das placas acrílicas fiquem paralelos entre si.
- Utilize tesoura para cortar um trecho de 75 mm de fita dupla face de espuma (25 mm de largura × 1,6 mm de espessura). Cole um lado do trecho de 75 mm da fita dupla face de espuma ao retângulo acrílico de 75 mm de comprimento × 25 mm de largura, de modo que o comprimento da fita de espuma e o comprimento do retângulo acrílico fiquem paralelos entre si.
- Utilize este retângulo acrílico com fita de espuma como uma almofada que repousa sobre os conectores Luer em cotovelo da microplaca para impedir que se soltem durante experimentos de microgravidade simulada. Mantenha a almofada de retângulo acrílico com fita de espuma e a microplaca juntos com um suporte personalizado para microplaca.
7. Montagem na máquina de posicionamento aleatório (RPM)
- Use fita adesiva de espuma dupla face para fixar todos os componentes do sistema de fluxo na placa de montagem do RPM. Evite colar diretamente sob os microcanais de cultura celular para permitir a troca gasosa celular durante o experimento. Certifique-se de que a microplaca esteja fixada no centro da placa de montagem, de modo que permaneça sobre os eixos de rotação do RPM durante o experimento.
- Insira a placa de montagem na ranhura mais alta do quadro em U do RPM e fixe a placa ao quadro em U do RPM utilizando o parafuso e a arruela fornecidos com o RPM.
- Use um conector DB15 com breakout previamente ligado corretamente para conectar diretamente a estação de computador ao RPM, que então será conectado ao microcontrolador e aos sensores de fluxo de líquido por meio de um segundo conector DB15 com breakout previamente ligado.
NOTA: O anel coletores do RPM conecta os dois conectores DB15, vinculando efetivamente a estação de computador ao microcontrolador e ao sensor de fluxo. - Conecte os cabos de energia do microcontrolador e do sensor de fluxo e prenda os trechos soltos dos cabos com braçadeiras plásticas. Os cabos devem ser firmemente fixados, mas certifique-se de que as conexões elétricas não fiquem sob tensão. O sistema montado é mostrado na Figura 3.
8. Coleta de dados de fluxo
- Abra o software do sensor de fluxo na estação de computador para monitorar a taxa de fluxo.
- Utilize o aplicativo de computador do microcontrolador para ajustar a voltagem da bomba até que o sensor de fluxo indique a taxa de fluxo desejada.
- Uma vez definida a taxa de fluxo, comece a registrar os dados de fluxo por 24 h.
Resultados
Antes de coletar resultados sobre fluidos ou cultivo celular, conforme descrito abaixo, a integridade do sistema deve ser verificada em cada ponto principal do protocolo durante os processos de montagem e escorvamento. As conexões eletrônicas podem ser facilmente verificadas conectando o microcontrolador e o sensor de fluxo de líquido a um computador e comunicando-se com cada componente por meio do respectivo software aplicativo. As conexões de tubos em encaixes com rebarbas são consideradas suficientes quando o tubo é empurrado além da rebarba, e qualquer componente fluidico com qualquer número de rachaduras deve ser imediatamente substituído. O escorvamento do sistema deve resultar em um circuito de fluxo que seja não apenas estéril, mas também visivelmente livre de bolhas; remova quaisquer bolhas visíveis batendo suavemente na localização da bolha.
Após a montagem do experimento estar concluída, o sistema de fluxo deve funcionar e ser monitorado por 1 h antes do período de teste de 24 h, para garantir que não haja vazamentos no sistema e que nenhuma bolha de ar seja observada saindo do captador de bolhas. Além disso, se o sistema de fluxo estiver operando sob microgravidade simulada, o equipamento de microgravidade simulada deve ser capaz de girar livremente após a montagem do sistema de fluxo, o que pode ser testado simplesmente girando o equipamento manualmente e também observando o equipamento executando seu programa de microgravidade simulada por 1 h antes do período de teste de 24 h.
Desempenho do sistema de perfusão em circuito fechado
A saída dos sensores de fluxo registrada ao longo de um período de 24 h é apresentada na Figura 4. A figura compara a taxa de fluxo em gravidade normal ao longo de um período de 24 h em um circuito de fluxo com e sem um coletor de bolhas independente de orientação. As bolhas de ar são representadas por picos de alta intensidade. Os picos persistentes observados no circuito de fluxo sem o coletor de bolhas desaparecem com a introdução do coletor de bolhas independente de orientação no circuito de fluxo. Essa comparação demonstra não apenas a necessidade de um coletor de bolhas, mas também o desempenho robusto do coletor de bolhas independente de orientação.
Cultivo de células endoteliais sob condições de fluxo
Para avaliar completamente a viabilidade do sistema de fluxo livre de bolhas, foi realizado um experimento de 24 h em microgravidade com culturas de células endoteliais com e sem um coletor de bolhas. Ao final do experimento, o sistema foi desmontado, tomando-se cuidado para evitar que as células secassem. Imediatamente, as células foram fixadas com formaldeído a 4% e coradas com CF594 de faloidina para actina e Hoechst 33342 para núcleos, seguindo protocolos-padrão de imunomarcação15. As células foram visualizadas utilizando microscopia confocal (Zeiss LSM 700). Figura 5 mostra imagens representativas das células para cada condição de fluxo. As imagens demonstram que os coletores de bolhas (Figura 5B) recuperam completamente a viabilidade e o crescimento celular, enquanto as células se destacam no canal sem coletor de bolhas (Figura 5A). Os núcleos nas imagens podem ser quantificados quanto à orientação utilizando o ImageJ no caso com o coletor de bolhas, já que nenhuma célula estava presente na sua ausência15.
Figura 1. Componentes do sistema de fluxo em circuito fechado. O fluido que sai de uma microbomba entra primeiro no captador de bolhas para filtração de bolhas, depois passa por um sensor para registro de dados de fluxo antes de entrar no chip microfluídico. O sistema foi projetado para suportar dois circuitos de fluxo operando simultaneamente, sendo que apenas um circuito completo é mostrado aqui. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2. Subconjuntos do sistema de fluxo para montagem na máquina de posicionamento aleatório (RPM). As microbombas e a eletrônica são protegidas dentro de um invólucro. Após o escorvamento (ou seja, preenchimento com líquido), a plataforma superior é montada com hastes roscadas sobre o invólucro, com o chip microfluídico centralizado entre eles. Sensores de fluxo e captadores de bolhas são fixados na plataforma superior. O invólucro da eletrônica é preso a uma placa de montagem com uma barra transversal para fixação na RPM. Dois circuitos de fluxo independentes são mostrados. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3. Sistema de perfusão montado acoplado à máquina de posicionamento aleatório (RPM). O sistema de perfusão completo é fixado por meio da rosca da barra transversal da placa de montagem na RPM. Os cabos de alimentação dos componentes eletrônicos são organizados enrolando-os ao redor da periferia central, garantindo que todo o conjunto se encaixe dentro das limitações de espaço útil do compartimento de carga da RPM. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4. Comparação de gráficos representativos de vazão. Comparação dos gráficos de vazão entre (A) um circuito de fluxo sem o captador de bolhas independente de orientação e (B) um circuito de fluxo com o captador de bolhas independente de orientação. Este experimento foi realizado em condições normais de gravidade (ou seja, sem RPM), com o sensor de fluxo posicionado imediatamente antes da microplaca em ambos os circuitos de fluxo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5. Imagens representativas de células endoteliais cultivadas sob condições de fluxo com e sem um coletor de bolhas independente de orientação. (A) Fluxo sem coletor de bolhas mostrando baixa aderência celular; (B) Fluxo com coletor de bolhas mostrando alta aderência celular. A actina é mostrada em vermelho e os núcleos em azul. Barra de escala = 200 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Discussão
Foi desenvolvido um sistema microfluídico de circuito fechado e independente de orientação, capaz de operar na ausência de gravidade, demonstrando ser viável para o cultivo de células endoteliais sob condições fisiológicas de fluxo. Os componentes principais do sistema são um microcontrolador, uma microbomba, um sensor de fluxo de líquido, uma microplaca para cultivo celular e uma armadilha de bolhas personalizada, fabricada por impressão 3D e independente de orientação.
As armadilhas de bolhas utilizadas neste trabalho são fabricadas a partir de resina de estereolitografia15, que geralmente apresenta baixa citocompatibilidade quando usada sem a pré-lavagem dos monômeros não polimerizados, mesmo no caso de resinas de grau biomédico17,18. Assim, antes de implementar a armadilha de bolhas no sistema, é importante avaliar se lixiviados químicos do material da armadilha de bolhas fabricado sob medida podem comprometer a viabilidade celular.
Além da escolha de materiais citocompatíveis, os passos mais cruciais nos protocolos de montagem experimental são o selamento do captador de bolhas, a submersão da microplaca para escorvamento e a organização dos cabos ao utilizar um aparato de microgravidade simulada. Após observar que o sistema fluido escorvado está livre de bolhas, a porta superior do captador de bolhas deve ser selada hermeticamente com fita de teflon e um tampão luer para evitar vazamentos. A rugosidade superficial inerente às camadas da impressão estereolitográfica para fabricação personalizada faz com que o tampão luer sozinho não seja suficiente para um bom selamento. Descobriu-se que a submersão da microplaca em um reservatório de meio de cultura celular é o método mais eficaz para garantir um escorvamento livre de bolhas, especificamente na junção entre o conector em ângulo e a microplaca. Outros métodos de escorvamento testados, como a incorporação de torneiras de três vias no circuito de fluxo, tendiam a deixar um número significativo de bolhas após o escorvamento, que eram quase impossíveis de remover sem desacoplar o conector em ângulo da microplaca. Por fim, cabos eletrônicos desorganizados podem obstruir o aparato de microgravidade simulada, fazendo com que ele pare inadvertidamente. Mesmo após prender todos os cabos e verificar que o aparato pode girar livremente antes do experimento, o sistema e o aparato ainda devem ser monitorados a cada 3–4 horas de vigília para minimizar o risco de parada.
Esse sistema pode ser adaptado para culturas celulares mais complexas ou chips de tecidos tridimensionais (3D) e tem o potencial de ser uma ferramenta valiosa para o avanço de modelos in vitro destinados a compreender mecanismos de doenças, apoiar o desenvolvimento de fármacos, avaliar os efeitos de estressores do voo espacial e preparar contramedidas. Por exemplo, as plataformas de tecidos projetadas enviadas à ISS têm sido usadas para compreender os efeitos da microgravidade e da exposição à radiação5, e o ambiente extremo da microgravidade tem sido utilizado para imitar fenótipos de envelhecimento ou para gerar esferoides multicelulares grandes para o estudo do câncer19. Em todos esses casos, o coletor de bolhas independente de orientação e o sistema de fluxo podem ser utilizados para compreender o efeito do estresse cisalhante ou para ajustar o transporte de massa conforme os resultados desejados.
Em comparação com outras abordagens para cultivo celular, o sistema apresentado aqui possui duas vantagens principais: (1) fornecer fluxo contínuo em circuito fechado e (2) ser compacto e autossuficiente. Algumas abordagens de cultivo celular dependem de frascos ou poços estáticos, os quais não reproduzem o estresse cisalhante fisiologicamente relevante do fluxo de fluido. Alguns sistemas comerciais (por exemplo, ibidi Pump System, Gräfelfing, Alemanha) podem alcançar fluxo contínuo unidirecional por meio de válvulas de comutação entre seringas alternadas. No entanto, a operação de tal aparelho normalmente exige um sistema de controle de atuador com interface computadorizada separada, o que o torna nem compacto nem autossuficiente. Além disso, a integração do eficaz captador de bolhas descrito neste artigo facilita experimentos de longa duração sem supervisão.
Uma possível modificação no sistema em iterações futuras é a microbomba, especificamente para explorar os efeitos de tensões de cisalhamento mais elevadas sobre células endoteliais. As microbombas utilizadas nos dados representativos eram capazes de produzir apenas tensões de cisalhamento de até 7,5 dyn/cm2, enquanto células endoteliais in vivo normalmente são expostas a tensões de cisalhamento quase três vezes maiores20. Aplicações futuras potenciais desse sistema, além do cultivo celular contínuo em microgravidade simulada, incluem outras aplicações portáteis que exigem recirculação contínua de líquidos. Tais possibilidades incluem triagem de fármacos, ensaios de incrustação ou toxicidade, testes de corrosão, refrigeração líquida de eletrônicos e monitoramento ambiental de poluentes.
Divulgações
A armadilha de bolhas omnidirecional é protegida pelo pedido de patente US 18634723. Não há interesses concorrentes adicionais.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela concessão NASA Space Biology nº 80NSSC21K0272.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Etanol 100% | Fisher Scientific | A4094 | Utilizado para preparar uma solução de etanol 70% para esterilização do sistema (quantidade mínima necessária: 35 mL) |
| Espaçador redondo preto de nylon, 6 mm, diâmetro externo de 7 mm, diâmetro interno de 3,2 mm | Exqutoo | ZH-0050 | Fixa o suporte superior à caixa (quantidade mínima necessária: 4) |
| Placa de acrílico, 75 mm de comprimento × 25 mm de largura | Polymersan | ACRCS | Fixa os adaptadores Luer em cotovelo à lâmina de microcanal (quantidade mínima necessária: 1) |
| Cabo USB 2.0 macho A para mini-B | Ugreen Group Limited | 10355 | Para conectar o computador ao microcontrolador (quantidade mínima necessária: 1) |
| Trampa de bolhas | (Personalizado) | Para impedir a passagem de bolhas para a lâmina de microcanal (quantidade mínima necessária: 1) | |
| Suporte para trampa de bolhas | Personalizado | Suporte impresso em 3D para manter a trampa de bolhas no lugar (quantidade mínima necessária: 2) | |
| Água para cultura celular | Fisher Scientific | MT25055CI | Utilizada para remover todos os vestígios de etanol após a esterilização (quantidade mínima necessária: 30 mL) |
| Suporte para controlador, bomba e caixa (suporte interno) | Personalizado | Placa de montagem interna na caixa (quantidade mínima necessária: 1) | |
| Suporte para barra transversal | Personalizado | Barra transversal fixada à placa de montagem da caixa (quantidade mínima necessária: 1) | |
| Conectores macho e fêmea DB15 com breakout | ANMBEST | ANMBEST_MDDB15 | Para conectar o computador à máquina de posicionamento aleatório e, em seguida, ao microcontrolador (quantidade mínima necessária: 1) |
| Conector Luer em cotovelo com extremidade macho para barba | ibidi | 10802 | Conecta a lâmina de microcanal ao circuito de fluxo (quantidade mínima necessária: 2) |
| Fita dupla face de espuma | 3M | 4026 | Para compressão dos adaptadores Luer em cotovelo na lâmina de microcanal (quantidade mínima necessária: 1) |
| Caixa (60 mm × 140 mm × 140 mm) | Hammond | 1554Q2GYCL | Aloja o microcontrolador e as microbombas (quantidade mínima necessária: 1) |
| Suporte para caixa (suporte inferior) | Personalizado | Placa de montagem sob a caixa (quantidade mínima necessária: 1) | |
| Conector Luer fêmea-fêmea | Boao | Boao-Syringes-WAD2354 | Utilizado para conectar a seringa ao conector Luer em cotovelo para escorva do meio de cultura celular (quantidade mínima necessária: 1) |
| Meio de cultura celular Gibco RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875093 | Utilizado para cultivar as células endoteliais (quantidade mínima necessária: 50 mL) |
| Passa-cabos, diâmetro do orifício de 9/16", espessura de 1/8", diâmetro interno de 1/8" | McMaster-Carr | 9307K863 | Para passagem de tubos para dentro e para fora da caixa (quantidade mínima necessária: 8) |
| Conector adaptador IDEX P-646, barba 1/16" para 1/4-28 | IDEX | P-646 | Conecta o sensor de fluxo ao circuito de fluxo (quantidade mínima necessária: 2) |
| Sensor de fluxo de líquido | Sensirion | SLF3-1300F | Para coleta de dados de fluxo (quantidade mínima necessária: 1) |
| Grampo de montagem para sensor de fluxo de líquido | Sensirion | SLF3x Mounting Clamp | Suporte SLF3x (quantidade mínima necessária: 2) |
| Seringa com conexão Luer lock (12 mL) | McKesson | 414624 | Para escorva a vácuo (quantidade mínima necessária: 1) |
| Tampão Luer | Cole-Parmer | UX-50110-33 | Para vedar as trampas de bolhas independentes de orientação (quantidade mínima necessária: 1) |
| Porca de aço inoxidável M2 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixa os sensores de fluxo de líquido ao suporte superior (quantidade mínima necessária: 4) |
| Parafuso de aço inoxidável M2×8 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixa os sensores de fluxo de líquido ao suporte superior (quantidade mínima necessária: 4) |
| Espaçador hexagonal de nylon macho-fêmea M3 | Meijubol | B0GC6GN9S7 | Fixa a placa mp-Multiboard ao suporte interno (quantidade mínima necessária: 4) |
| Arruela de nylon M3 | Sutemribor | 7.81573E+11 | Fixa a caixa ao suporte inferior (quantidade mínima necessária: 16) |
| Porca de aço inoxidável M3 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixa a caixa ao suporte inferior, a barra transversal ao suporte inferior e o suporte da bomba ao suporte interno (quantidade mínima necessária: 16) |
| Arruela de aço inoxidável M3 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixa a barra transversal ao suporte inferior, a caixa ao suporte inferior e ao suporte interno, e o suporte interno ao suporte da bomba (quantidade mínima necessária: 12) |
| Parafuso cabeça redonda de aço inoxidável M3×12 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixa a caixa ao suporte inferior (quantidade mínima necessária: 4) |
| Parafuso cabeça cilíndrica de aço inoxidável M3×12 | Fgruh | FG001-3 | Fixa o suporte da trampa de bolhas ao suporte superior (quantidade mínima necessária: 2) |
| Parafuso cabeça plana Phillips M3×6 | Meijubol | B0GC6GN9S7 | Fixa a placa mp-Multiboard ao suporte interno (quantidade mínima necessária: 4) |
| Parafuso de aço inoxidável M3×8 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixa a barra transversal ao suporte inferior, a caixa ao suporte interno e o suporte da bomba ao suporte interno (quantidade mínima necessária: 8) |
| Porca de aço inoxidável M4 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixa o suporte superior à caixa (quantidade mínima necessária: 4) |
| Arruela de aço inoxidável M4 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixa o suporte superior à caixa (quantidade mínima necessária: 4) |
| Haste roscada de aço M4-0,7 | Arwnnklo | AR01 | Cortada em comprimentos de aproximadamente 6 polegadas (quantidade mínima necessária: 4) |
| Cabo USB mini macho para fêmea | Plinkwirekb | PCM-0725-L | Para conectar o computador ao microcontrolador (quantidade mínima necessária: 1) |
| Conector USB mini macho para fêmea com ângulo reto | UCEC | 4326453558 | Para conectar o computador ao microcontrolador (opcional) (quantidade mínima necessária: 1) |
| Suporte para microcanal | Personalizado | Suporte impresso em 3D para manter o microcanal centralizado (quantidade mínima necessária: 1) | |
| Lâmina de microcanal, µ-slide VI 0,4 | ibidi | 80606 | Para ensaios celulares sob fluxo (quantidade mínima necessária: 1) |
| Microbomba | Bartels | MP6-HYB | Para gerar fluxo (quantidade mínima necessária: 1) |
| Suporte para microbomba | Personalizado | Fixação para segurar a microbomba (quantidade mínima necessária: 1) | |
| Placa mp-Multiboard com mp-Highdriver4 | Bartels | BM-E-0005 | Para controlar as configurações de frequência e tensão das microbombas (quantidade mínima necessária: 1) |
| Cabo mp-pump | Bartels | BM-A-0055 | Utilizado para conectar eletricamente a placa mp-Multiboard às microbombas (quantidade mínima necessária: 1) |
| Espaçador redondo de nylon, diâmetro externo de 7 mm, diâmetro interno de 3,2 mm | Harfington | 2037015 | Para fixar o tubo à microbomba (quantidade mínima necessária: 2) |
| O-ring | ZDBB | 7.17327E+11 | Fixa o cabo USB mini macho-fêmea à caixa (opcional) (quantidade mínima necessária: 3) |
| Recipiente plástico | Herdusa | HDS10 PLASTIC BOX | Utilizado como reservatório aberto para o meio de cultura celular (quantidade mínima necessária: 1) |
| Tubo de poliuretano, diâmetro interno de 1/8", diâmetro externo de 1/4" | PARKER | 95U-4-062-BLU-0100 | Fixa o suporte superior à caixa (quantidade mínima necessária: 1,6 cm) |
| Máquina de posicionamento aleatório | AIRBUS | Máquina de Posicionamento Aleatório 2.0 (quantidade mínima necessária: 1) | |
| Cabo SCC1-USB | Sensirion | SCC1-USB 2M | Conecta os sensores de fluxo de líquido ao computador (quantidade mínima necessária: 1) |
| Tubo cônico autossustentável para centrífuga | PEKYBIO | B0C13GZVD6 | Utilizado para armazenar água para cultura celular/etanol 70% (quantidade mínima necessária: 2) |
| Espaçador de alumínio, diâmetro externo de 8 mm, 20 mm de comprimento | McMaster-Carr | 94669A062 | Quantidade mínima necessária: 4 |
| Tubo Tygon PVC, diâmetro interno de 1/16", diâmetro externo de 1/8" | Saint-Gobain | B-44-3 | Conecta todos os componentes do circuito de fluxo (quantidade mínima necessária: 40 cm) |
| Suporte superior | Personalizado | Placa de montagem conectada aos sensores de fluxo de líquido e à trampa de bolhas (quantidade mínima necessária: 1) | |
| Porca borboleta, M4 × 0,7 mm, aço zincado | Siptenk | S-TH-DLM-002 | Fixa o suporte superior à caixa (quantidade mínima necessária: 4) |
| Abraçadeira plástica (zip-tie) | HAVE ME TD | 7.32073E+11 | Fixa os cabos ao montar o sistema na RPM (quantidade mínima necessária: 4) |
Referências
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