Este protocolo descreve um modelo de ferida excisional na pele de ratos que incorpora uma câmara úmida. O sistema permite a avaliação de formulações líquidas tópicas, suspensões celulares, biomateriais e outros terapêuticos para feridas.
Artigo de método
Um Modelo de Ferida por Excisão em Ratos para Investigar Terapêuticas em Feridas Cutâneas de Tamanho Crítico
Neste artigo
Resumo
Resumo
Lesões cutâneas representam um grande desafio global para a saúde, gerando significativa morbidade e ônus econômico. Modelos animais confiáveis e clinicamente relevantes são essenciais para investigar os mecanismos de reparação tecidual e avaliar estratégias terapêuticas emergentes. No entanto, os modelos convencionais de feridas excisionais em roedores são limitados pela rápida contração da ferida devido ao panniculus carnosus, o que difere significativamente da cicatrização humana. Esta última ocorre predominantemente por meio da formação de tecido de granulação e reepitelização. Este estudo descreve um modelo de ferida excisional em rato projetado para limitar a contração da ferida, ao mesmo tempo que fornece um ambiente protegido para testar intervenções terapêuticas sensíveis. Feridas excisionais dorsais de 10 mm em espessura total foram criadas em ratos Sprague Dawley e estabilizadas com um anel O de borracha de nitrila e butadieno (NBR) fixado com suturas interrompidas. Para manter um ambiente úmido na ferida, foi aplicado um selante coesivo Eakin e uma película adesiva transparente, formando uma câmara adequada para administração tópica de células, biomateriais ou compostos farmacêuticos. Camadas protetoras adicionais, compostas por um curativo de espuma, fita adesiva, uma bandagem tubular e um sistema de fixação de duplo ombro, foram utilizadas para impedir que os animais removessem o curativo. A cicatrização foi monitorada ao longo de 14 dias por planimetria digital e avaliação histológica com coloração de hematoxilina e eosina. O procedimento exigiu aproximadamente 30 minutos por animal e resultou em desfechos consistentes de cicatrização. O anel O de NBR foi usado como uma tala para limitar a contração da ferida. A cicatrização ocorreu principalmente por formação de tecido de granulação e reepitelização. Os curativos permaneceram intactos por até sete dias, sem evidência de infecção. A análise histológica demonstrou reparação tecidual ativa, caracterizada por regeneração epidérmica e infiltração de células inflamatórias. Este modelo fornece uma plataforma para avaliação pré-clínica de terapêuticas para feridas e tratamentos regenerativos avançados.
Introdução
Lesões cutâneas, incluindo feridas de difícil cicatrização, afetam mais de 40 milhões de pacientes em todo o mundo e impõem um ônus substancial aos sistemas de saúde, com custos anuais de 22 bilhões de dólares até 2024. Somente na Europa, 4 milhões de pacientes sofrem com feridas de difícil cicatrização anualmente, ocupando até metade das admissões agudas disponíveis1. Apesar dos avanços nas técnicas cirúrgicas, práticas intraoperatórias e disponibilidade de curativos avançados para feridas, algumas lesões são refratárias, enquanto complicações acabarão por se desenvolver. Portanto, é essencial desenvolver novas abordagens terapêuticas que exijam um modelo experimental em animais de lesões cutâneas para testar uma ampla gama de materiais tópicos.
Entre os modelos experimentais de feridas cutâneas em animais, a excisão da pele é a técnica mais aplicável para criar um modelo de cicatrização2. Tal modelo pode ajudar a investigar hemorragia, reações inflamatórias, granulação, reepitelialização, angiogênese e remodelação tecidual3. Feridas excisionais são criadas principalmente no dorso do animal mediante remoção cirúrgica de uma área cutânea definida. A ferida deve ter tamanho crítico para evitar a cicatrização espontânea. Essa ferida excisional de tamanho crítico fornece acesso direto para investigar a aplicação tópica de diferentes substâncias químicas, células ou biomateriais e seu envolvimento no processo de cicatrização4,5.
Roedores e a pele humana compartilham semelhanças na fases celular e molecular da cicatrização de feridas, incluindo hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação. Ratos e camundongos são as espécies mais amplamente utilizadas em modelos de feridas devido à sua disponibilidade, tamanho pequeno, relativa facilidade de manipulação genética e manuseio simples. Os ratos apresentam várias vantagens práticas em comparação com os camundongos, incluindo um tamanho corporal maior e pele mais espessa, composta por mais camadas de queratinócitos do que a dos camundongos. As feridas em camundongos geralmente cicatrizam em 7 dias, enquanto nos ratos o processo de cicatrização pode ser avaliado ao longo de aproximadamente 12 a 14 dias.6.
Um grande desafio associado ao uso de roedores com pele solta é a contração da ferida3. A pele dos roedores possui uma camada de panniculus carnosus, que se contrai após lesão para reduzir a área exposta. Em contraste, as feridas humanas têm capacidade limitada de contração e dependem da granulação e reepitelização para a reparação7. Uma abordagem para superar as limitações dos modelos animais é realizar a fixação física ou imobilização da pele ao redor da área da ferida8. As câmaras de ferida de titânio foram alguns dos dispositivos desenvolvidos com sucesso para prevenir a contração da ferida9, mas apresentavam desvantagens, incluindo alto estresse nos animais devido ao peso da câmara, colocação cirúrgica complexa, risco de deslocamento do dispositivo, possibilidade de infecção e alto custo. O conceito do modelo de ferida imobilizada foi introduzido por Galiano et al.10 em 2004, por meio da sutura de um anel rígido de silicone ao redor da borda da ferida. Essa abordagem reduz significativamente a contração da ferida11, mas apresenta várias desvantagens e limitações, principalmente relacionadas ao risco de lesão nos tecidos moles, alta taxa de deslocamento da tala e cicatrização inconsistente da ferida. As talas (como anéis rígidos de silicone) podem causar pressão excessiva na pele circundante, levando a isquemia, irritação e necrose, especialmente se aplicadas incorretamente. As talas de silicone são frequentemente mutiladas, quebradas ou deslocadas devido ao movimento ou ao comportamento de higiene dos animais8,11. Suturas irregulares muitas vezes criam tensão desigual ao redor da ferida, resultando em cicatrização inconsistente. No modelo apresentado aqui, um anel O de borracha de nitrila e butadieno (NBR) é suturado na borda da ferida de pele por meio da colocação de 8 a 12 suturas simples interrompidas de poliamida distribuídas uniformemente ao redor do anel. Espera-se que essa abordagem minimize os riscos mencionados anteriormente e restrinja suficientemente a contração da ferida, permitindo que a lesão cicatrize por meio da formação de tecido de granulação e reepitelização, semelhante ao processo de cicatrização de feridas humanas. Esse mecanismo de cicatrização facilitaria a transposição dos achados obtidos em modelos animais para aplicações clínicas.
A teoria da cicatrização úmida foi introduzida por George D. Winter em 1962 como um conceito para o desenvolvimento de produtos para o tratamento de feridas12. Com base nessa teoria, diversos curativos para feridas foram desenvolvidos nas últimas décadas, como gazes, filmes transparentes, espumas e hidrogéis13. Por outro lado, um anel selante moldável de barreira hidrocoloide para estomia foi projetado e desenvolvido em 1974 para prevenir e proteger contra vazamentos. Eles podem ser facilmente moldados e adaptados ao contorno da ferida, especialmente em aplicações de cuidados com estomas. Nesse modelo, um selante coeso é aplicado na parte externa da ferida e, juntamente com filmes estéreis e transparentes, cria uma câmara úmida que simula a situação clínica de pacientes com feridas cutâneas em tratamento, promovendo a epitelialização da ferida e protegendo agentes tópicos (por exemplo, células, biomateriais, compostos) contra vazamentos.
O curativo é essencial para proteger o leito da ferida contra traumas físicos e infecções microbianas. O curativo em ratos sempre foi desafiador devido à baixa tolerância desses animais a ele. Os ratos frequentemente removem ou destroem os curativos mordendo e rasgando-os logo após se recuperarem da anestesia. Isso torna muito difícil a retenção de agentes tópicos, como células e fármacos, e impossível a proteção das feridas contra patógenos e contaminantes externos. Esse é outro desafio a ser enfrentado no modelo de roedor, especialmente em estudos que exigem um ambiente estéril, como testes de biológicos, terapias baseadas em células e produtos medicinais avançados. No modelo apresentado aqui, um curativo de espuma e fita adesiva foram utilizados para cobrir a câmara úmida. Em seguida, utilizou-se uma bandagem tubular elástica, uma bandagem de fixação e fita cirúrgica microporosa para aplicar um curativo duplo cruzado nos ombros, evitando que os ratos removessem ou danificassem os curativos.
O modelo descrito aqui combina diversos elementos de diferentes protocolos e foi desenvolvido ao longo de vários anos. O objetivo foi estabelecer um modelo de ferida excisional em ratos utilizando uma câmara úmida bem tolerada pelo animal, facilitando a avaliação de materiais tópicos sensíveis, especialmente na forma líquida.
Protocolo
Todos os procedimentos com animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Ético de Linköping (Dnr 5163-2023), Suécia. Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Experianimais mentais
- Utilize ratos adultos machos da linhagem Sprague Dawley com idade entre 8 e 14 semanas.
- Antes do experimento, aclimatize os ratos por pelo menos 1 semana em ciclo de luz/escuridão de 12 horas com uma dieta padrão.
2. Preparação pré-cirúrgica
- Anestesie o animal usando 1,5%–2,5% de isoflurano (4,5% para indução) misturado com 1,0–1,5 L/min de oxigênio. Posicione o animal em posição prona sobre uma placa aquecida para mantê-lo aquecido. Aplique um lubrificante oftálmico para proteger os olhos e administre 0,05 mg/kg de peso corporal de buprenorfina diluída em solução salina por via subcutânea nas costas do animal para alívio da dor pós-operatória.
NOTA: É importante ter uma camada fina de isolamento descartável entre o animal e a placa.
ATENÇÃO: O isoflurano é um depressor do sistema nervoso central e um irritante respiratório. Utilize um vaporizador calibrado com um sistema ativo de captura de gases residuais para evitar exposição ao vapor. - Depile a região do dorso com uma tesoura elétrica, da base do pescoço até aproximadamente 10 cm abaixo. Limpe completamente a área depilada duas vezes com clorexidina e etanol 70%, depois cubra o animal com um campo cirúrgico fenestrado que exponha apenas a área limpa.
3. Criação de uma ferida excisional
- Utilize instrumentos cirúrgicos esterilizados apropriados, como tesouras e pinças.
- Desenhe um círculo de 10 mm de diâmetro usando um molde com uma caneta cirúrgica permanente, aproximadamente 4 cm caudal à base do pescoço.
- Segure o centro da pele marcada com pinça e excise o tecido cutâneo marcado com tesoura. A profundidade do ferimento deve atingir a fáscia superficial. Isso pode ser identificado ao soltar completamente a espessura da pele e visualizar a fáscia semitransparente que recobre o músculo.
- Aplique uma argola de NBR à borda da ferida cutânea e fixe-a no lugar com 8 a 12 pontos. O objetivo da fixação com argola é impedir a contração da pele. Certifique-se de que os pontos principais estejam nas posições 12 horas, seguidos pelas 6 horas, 3 horas e depois 9 horas. No caso de 8 pontos, posicione cada ponto no meio do espaço entre dois pontos principais (Figura 1A).
- Aplique um selante coesivo na parte externa da argola de NBR, aproveitando suas propriedades adesivas, para formar uma câmara úmida juntamente com uma película estéril, transparente e adesiva (Figura 1B). Nesta etapa, a ferida é imobilizada pela argola de NBR, e as paredes laterais da câmara são formadas pela borda da pele e pelo selante coesivo; o piso é formado pela superfície crua da ferida, enquanto o teto é formado pela película transparente.
- Cubra a ferida com uma camada da película e, em seguida, administre a solução de tratamento (solução celular ou solução do composto) através da película até a superfície da ferida. A câmara do tamanho descrito acomodará facilmente 100 µL.
- Cubra o local da injeção com outra camada da película para evitar vazamento do tratamento (Figura 1C).
- Cubra a película com uma bandagem de silicone macia para protegê-la (Figura 1D).
- Aplique fitas adesivas (Figura 1E), seguidas por uma bandagem tubular elástica, em uma configuração de duplo ombro ao redor do rato, com bandagem de fixação e fitas cirúrgicas microporosas (Figura 1F–H).
- Recorte as unhas dos ratos para impedir que eles arranquem o curativo.
- Administre carprofeno (5 mg/kg de peso corporal), diluído em solução salina, por via subcutânea ao animal antes de desconectá-lo da anestesia.
4. Procedimentos pós-operatórios
- Mantenha o animal sobre a placa aquecida, coberto com um cobertor, até que desperte da anestesia. Coloque os animais em gaiolas separadas ou em uma única gaiola com divisória para evitar que mordam uns aos outros e removam o curativo.
- Administre carprofeno, 5 mg/kg de peso corporal diluído em solução salina, por via subcutânea na manhã seguinte para controle da dor pós-operatória. Os ratos devem ser monitorados diariamente quanto à dor pós-operatória ou perda de peso, e uma dose adicional de analgesia pode ser administrada, se necessário.
5. Medidas das feridas e trocas de curativos
- Examine cada animal diariamente na primeira semana após a cirurgia do ferimento. O curativo deve ser inspecionado e corrigido caso os animais tenham dificuldade para se movimentar ou apresentem desconforto.
- Troque o curativo no dia 7 enquanto o animal estiver sob anestesia, conforme descrito na etapa 2.1.
- Remova cuidadosamente a cobertura do curativo da pele. São tiradas fotografias do ferimento com uma régua para indicar a escala. As imagens foram analisadas usando o software Fiji/ImageJ para avaliar a área superficial da ferida.
- Realize medições ou outros procedimentos conforme necessário ao pesquisador.
- Aplicar um curativo limpo conforme as etapas 3.8–3.11 e permitir que o animal se recupere conforme descrito na etapa 4.1.
6. Coleta da ferida e eutanásia
- Aplicar anestesia conforme mencionado no ponto 2.1 no dia 14, ou conforme o plano experimental específico. Remover o curativo e tirar fotos dos locais das feridas.
- Remover o curativo e tirar fotos dos locais das feridas.
- Coletar tecido da pele da ferida. Usando um bisturi, excisar a pele ao redor da ferida, incluindo algum tecido saudável.
- Colocar a excisão em um tubo de 2 mL e congelar rapidamente em nitrogênio líquido para análise molecular posterior, ou armazenar em formaldeído tamponado a 4% à temperatura ambiente para histologia. Alternativamente, cortar a excisão em dois pedaços para realizar ambos os ensaios.
- Após a remoção do tecido da ferida, eutanasiar o animal por inalação de CO2 ou por outro método conforme a aprovação ética.
CAUTION: O CO2 causa dor, sofrimento e acidificação rápida das membranas mucosas antes da perda de consciência. Utilizar um medidor de fluxo regulado para deslocar o ar da câmara.
7. Coloração histoquímica: Fixação da ferida, inclusão e corte histológico
- Fixe as biópsias de tecido da ferida em solução de formaldeído a 4% durante 3 h à temperatura ambiente, depois mantenha-as a 4 °C durante a noite.
CAUTION: O formaldeído é tóxico, um potente sensibilizante e um carcinógeno humano conhecido. Manipule a solução em uma capela de exaustão química, utilizando equipamento de proteção individual. - Lave as biópsias duas vezes com PBS, por 30 min cada.
- Substitua o PBS por etanol (70%) e armazene a 4 °C.
- Mantenha as biópsias por no máximo 24–48 h antes do processamento para evitar perda de antígenos, ou por 1–2 semanas para caracterização histológica simples.
- Lave as biópsias cuidadosamente com água corrente da torneira para remover o formaldeído residual.
- Desidrate o tecido em banhos de etanol na seguinte ordem: etanol a 70% por 20 min; 2 mudanças de etanol a 95% por 20 min cada; 2 mudanças de etanol a 100% por 20 min cada.
- Mantenha as biópsias a 65 °C no banho de parafina.
- Despeje a parafina fundida na forma designada, colocando as biópsias no centro, e deixe esfriar e solidificar. As biópsias devem ser orientadas perpendicularmente à superfície da forma para permitir a visualização de todas as camadas da pele durante o corte.
- Corte o bloco de tecido emblocado em parafina com micrótomo em espessura de 5 μm e flutue os cortes em um banho de água a 39 °C contendo água desionizada.
- Transfira os cortes para as lâminas e seque-os, permitindo que o tecido adere à superfície da lâmina. As lâminas podem ser armazenadas a 4 °C para uso posterior ou processadas imediatamente para coloração histoquímica.
8. Coloração com hematoxilina e eosina (HE)
- Desparafine as lâminas em placas aquecidas a 60 °C por 30 min, depois em 3 mudanças de xilol (ou qualquer substituto) por 5 min cada, seguido por 1 mudança de PBS por 2 min.
CAUTION: O xilol é tóxico e altamente inflamável. Manipule a solução em capela, aplicando as medidas padrão de proteção individual. - Realize a reidratação em etanol a 100%, etanol a 96% e, em seguida, água dH2O, por 5 min cada.
- Aplicar a coloração com hematoxilina por 5 min, depois lavar em água corrente por 5 min.
- Diferencie com álcool ácido a 0,3% (ácido clorídrico a 0,3% em etanol a 70%) por alguns mergulhos, depois lave com água corrente por 5 min.
- Colore com Eosina Y (0,2%) por 30 s, depois lave com água corrente por 5 min.
- Desidrate em etanol a 96% por 1 min, etanol a 100% por 1 min.
- Adicione algumas gotas de meio de montagem, depois coloque a lamínula.
- Observe as lâminas ao microscópio óptico e capture fotografias digitais.
Resultados
A cirurgia do modelo de ferida excisional em ratos levou aproximadamente 30 min por animal quando realizada com eficiência. Os diferentes passos da criação do modelo, fixação do anel O e curativo são mostrados na Figura 1.
Figura 2 mostra o progresso da cicatrização das feridas nos dias 7 e 14. O raio da ferida foi medido em mm, e a área da superfície foi calculada com a fórmula (área = πr2), onde r = 5 mm no dia 0. O progresso do fechamento da ferida foi representado como uma porcentagem da área não coberta em relação à área da ferida induzida no dia 14. Utilizando o software Fiji/ImageJ, uma imagem digital da área da ferida foi analisada, com a escala calibrada para 10 mm usando uma régua incluída na imagem (Figura 2D). Após a delimitação e medição da área da ferida, o valor foi apresentado em mm2. A área remanescente da ferida no dia 14 (29,4% ± 10,1%; n = 7) é apresentada na Figura 3.
A coloração HE da ferida cutânea no dia 14 é apresentada na Figura 4. As seções mostraram que as biópsias seguiram a cicatrização natural das feridas cutâneas, da periferia para o centro. A cicatrização permaneceu incompleta, com o centro desprovido do arranjo multilamelar clássico normal e com uma camada epidérmica fina. A derme apresentou abundante infiltração de células inflamatórias, o que é importante para o processo de cicatrização fisiológica. De modo geral, o modelo foi bem tolerado pelos animais, com impedimento da contração da pele e cicatrização incompleta, porém fisiológica.
Figura 1: Criação da ferida excisional e procedimento de curativo. (A) Ferida excisional criada na superfície dorsal do rato, com um anel em forma de O costurado ao redor da margem da ferida. (B) Anel moldável de barreira hidrocoloide aplicado ao redor do anel em forma de O. (C) Duas camadas de curativo adesivo transparente aplicadas sobre o anel de barreira hidrocoloide. (D) Curativo de espuma colocado sobre o curativo adesivo transparente. (E) Fita adesiva elástica aplicada para fixar o curativo. (F–H) Uma bandagem tubular de retenção aplicada ao redor do rato, seguida por uma bandagem de fixação e fita cirúrgica disposta em configuração de duplo ombro para fixar o curativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas da cicatrização de feridas. (A) Imagem representativa da ferida obtida no dia 7. (B–D) Imagens representativas da ferida obtidas no dia 14, mostrando a ferida com o anel O posicionado (B) e após a remoção do anel O (C,D). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação da área da ferida no dia 14. Porcentagem da área da ferida remanescente no dia 14, demonstrando a redução do tamanho da ferida. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP) (n = 7). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação histológica da cicatrização da ferida no dia 14. Cortes representativos corados com hematoxilina e eosina (HE) de tecido da ferida com aumento de 10×, 20× e 40×. O centro da ferida exibia reepitelização incompleta, enquanto as margens da ferida mostravam cicatrização epidérmica fisiológica. A derme continha abundantes células inflamatórias compatíveis com a resposta normal de cicatrização da ferida. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Discussão
Lesões cutâneas de difícil cicatrização são feridas que não progridem pelas fases normais de cicatrização dentro do período esperado e podem ser consequência de procedimentos cirúrgicos, traumas e reações alérgicas, além de serem secundárias a muitos outros problemas de saúde, incluindo insuficiência vascular, diabetes e obesidade14. Apesar da disponibilidade de várias modalidades de tratamento, muitos pacientes não cicatrizam adequadamente. A investigação de novas abordagens terapêuticas, como terapias baseadas em células, substâncias químicas, extratos vegetais e compostos recém-descobertos, é fundamental para identificar novas estratégias de manejo. O modelo pode ser aplicado a uma ampla variedade de estudos sobre cicatrização de feridas. O estabelecimento de um protocolo padronizado para testar medicamentos, células e tratamentos biológicos pode facilitar a pesquisa pré-clínica em cicatrização de feridas. O modelo de ferida excisional e o protocolo descrito aqui abordam as principais limitações do modelo de lesão cutânea em ratos na pesquisa: ou seja, a contração da pele e a cura da ferida.
As talas de titânio são comumente usadas para reduzir a contração da ferida em modelos de ferida excisional em camundongos; sua aplicação não está isenta de limitações. A rigidez da tala altera o ambiente mecânico da ferida e do tecido circundante, o que pode afetar as respostas celulares, a inflamação e a remodelação da matriz. Como resultado, a cicatrização ocorre em condições diferentes daquelas presentes na pele de roedores não tratada. Embora a limitação da contração melhore a comparabilidade com o fechamento de feridas humanas, as restrições mecânicas impostas pela tala também podem introduzir artefatos que influenciam o processo de cicatrização e devem ser consideradas ao interpretar os achados experimentais15.
Para esse fim, anéis de borracha NBR foram utilizados no modelo para limitar a contração da pele e foram fixados na borda original da ferida. Os anéis foram bem tolerados pelos animais e mantidos fixos durante os 14 dias do experimento. Embora não tenha sido observada qualitativamente contração apreciável da ferida em nenhum animal, a tatuagem da borda da ferida ou outros métodos quantitativos poderiam reforçar a avaliação da contração da ferida em estudos futuros. Assim, a tatuagem pode ser considerada um passo opcional neste protocolo.
A aplicação de curativos protege as feridas contra contaminação e infecção, ao mesmo tempo que mantém o tratamento no local da lesão, o que é crucial para modelos de cicatrização de feridas cutâneas. No entanto, não é incomum que alguns animais removam diferentes tipos de curativos. Ratos frequentemente realizam alisamento e manipulação da área da ferida, o que pode levar ao deslocamento ou remoção completa do curativo, mesmo com o uso de películas adesivas ou métodos secundários de fixação. A perda da cobertura do curativo pode alterar o ambiente da ferida, afetar a administração do tratamento e aumentar a variabilidade entre os animais16. No modelo aqui apresentado, o curativo permaneceu intacto por até 7 dias, sem ser removido ou danificado pelos animais. Não houve sinal de infecção na ferida cutânea em nenhum dos animais experimentais. É aconselhável substituir os curativos semanalmente, pois o ajuste torna-se mais apertado conforme os animais crescem e ganham peso. Deve-se ter cuidado para equilibrar uma fixação segura com a mobilidade do animal, garantindo ao mesmo tempo que o curativo não fique muito solto e possa ser removido pelos animais.
O protocolo é flexível e personalizável. Embora recomendemos a inalação de isoflurano por sua rápida recuperação e alta segurança, os pesquisadores podem usar alternativamente anestesia injetável, como cetamina/xilazina, se um vaporizador de isoflurano não estiver disponível. Embora apenas ratos machos tenham sido utilizados neste estudo, o protocolo é igualmente aplicável a ratas fêmeas.
Recomendamos a administração analgésica de buprenorfina em conjunto com carprofeno, o que potencializa o alívio da dor. A buprenorfina isoladamente também pode proporcionar analgesia pós-operatória adequada devido à sua duração relativamente longa de ação. Este fármaco tem efeito mínimo sobre a função imunológica, em comparação com outros opioides, o que representa uma vantagem para a cicatrização de feridas de acordo com o processo inflamatório17. Deve-se evitar o uso de anti-inflamatórios não esteroides, que suprimem a inflamação e reduzem a dor, quando se estuda a inflamação. Embora neste estudo tenha sido criada uma única ferida por animal, os pesquisadores poderiam criar feridas adicionais utilizando o mesmo protocolo, conforme a aprovação ética e o delineamento experimental. As considerações sobre o bem-estar animal e os princípios dos 3Rs devem ser cuidadosamente avaliadas. Os pesquisadores devem cumprir os princípios dos 3Rs (substituição, redução e refinamento) e respeitar o bem-estar animal ao utilizar modelos animais. Os procedimentos cirúrgicos devem estar alinhados com as diretrizes e seguir rigorosamente o protocolo animal aprovado. Neste estudo, a cicatrização da ferida foi avaliada por meio de medições da área da ferida e avaliação histológica, sendo a reepitelização um dos componentes da resposta de cicatrização. A presença dos pontos em relação à fixação do anel pode interferir na cicatrização local. O número de pontos deve ser consistente entre os animais. A avaliação da área da ferida deve incluir todas as áreas expostas, incluindo os locais de sutura18. Este modelo pode ser adaptado para incluir diversas condições subjacentes associadas a feridas cutâneas, como isquemia, diabetes e envelhecimento. As principais limitações deste estudo foram a ausência de um grupo controle sem suporte (não imobilizado), a falta de avaliação quantitativa da contração da ferida e a escassez de medidas biológicas quantitativas além da avaliação da área da ferida e da histologia descritiva. Vários desafios técnicos e problemas operacionais foram evidentes durante o desenvolvimento deste modelo. O ajuste adequado do colete protetor ou curativo é essencial para o bem-estar animal e para uma cicatrização bem-sucedida. Um curativo solto pode ser removido pelo animal após a recuperação da anestesia, enquanto um curativo excessivamente apertado pode restringir os movimentos, prejudicar a circulação ou afetar a respiração. O curativo deve permitir espaço suficiente para um dedo (ou o dedinho, em ratos menores) entre o curativo e a pele. Os animais devem ser monitorados diariamente, e o curativo deve ser ajustado caso se observem sinais de desconforto, mobilidade prejudicada ou postura anormal. O manejo da dor pós-operatória pode variar entre animais individuais devido a diferenças na sensibilidade aos analgésicos. Os animais devem ser avaliados regularmente quanto a sinais relacionados à dor, incluindo postura arqueada, atividade reduzida, apetite diminuído e perda de peso. Analgesia adicional deve ser fornecida quando necessário, conforme as diretrizes institucionais. A fixação consistente do anel é fundamental para prevenir a contração da ferida. Os 8–12 pontos simples interrompidos devem ser espaçados uniformemente ao redor do anel para distribuir a tensão de maneira homogênea e evitar levantamento ou deformação. Cada ponto deve ser fixado com um nó cirúrgico para minimizar o afrouxamento durante a recuperação. Por fim, recomendamos o uso de ratos da mesma linhagem, idade, peso corporal e sexo dentro de um mesmo estudo, a fim de minimizar a variação. Além disso, o mesmo pesquisador experiente pode realizar todos os procedimentos cirúrgicos. Para evitar viés, recomendamos o uso de dupla cegueira nas análises histológicas e moleculares.
Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à Região de Östergötland pelo financiamento desta pesquisa. Os autores agradecem ao Sr. Anders Delleskog, do CBR, Universidade de Linköping, pelas sugestões, apoio e assistência no estabelecimento do modelo animal. Os autores também agradecem à Dra. Maria Ntzouni, da Instalação Central, Universidade de Linköping, pelo apoio e orientação no inclusão, corte e coloração HE de tecidos cutâneos. Agradecimentos especiais a Sallam Abdallah, da unidade de P&D para pele e células cultivadas, Universidade de Linköping, pela preparação das amostras de pele e coloração HE.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Salfarm Scandinavia | 451790 | Conc. 0,3 mg/mL |
| Carprofeno | Zoetis Animal Health | 191380 | Rimadyl 50 mg/mL |
| Selante Eakin | Swemed | 2076152 | Espessura 3 mm |
| Estação de inclusão | Leica Biosystems | EG1150 H&C | |
| Eosina | Histolab | 1650 | Solução corante 0,2% |
| Etanol absoluto | Solveco | 1015 | Grau analítico |
| Curativo de fixação | Swemed | 2048934 | 4 cm x 4 m PA/viscose |
| Formaldeído | Histolab | 2176 | 4% em PBS, pH 7,2-7,4 |
| Tosquiadeira | Swevet | F95000 | Comprimento de corte: 0,5 mm |
| Hematoxilina | Histolab | 1800 | Harris HTX |
| Histolab-Clear | Histolab | 14250 | Substituto de xilol |
| Isflurano | VM Pharma | 448210 | Attane vet 1000 mg/g |
| Lekotape | Swemed | 2056774 | |
| Mepilex | Swemed | 2059125 | 7,5 x 8,5 cm |
| Filme Mepore | Swemed | 2057753 | 6 x 7 cm com moldura |
| Fita cirúrgica Micropore | Swemed | 2063856 | 1,2 cm x 9,1 m |
| Micrótomo | Thermo Fisher Scientific | 387861 | Microm HM355S |
| Meio de montagem | Histolab | 00840-05 | Pertex |
| O-ring | Ruilogod | B0B1TRQBRT | 11 mm de diâmetro interno, 1 mm de largura |
| Sutura (ethilon 4-0) | Scandivet | 21274-A | Poliamida não absorvível |
| Desidratação de tecidos | Leica Biosystems | Leica TP1020 | |
| Tubifast com elasticidade bidirecional | Swemed | 2069292 | 7,5 cm x 10 m PES/PA |
Referências
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