Ligação de Precisão da Artéria Coronária Descendente Anterior Esquerda Utilizando Marcos Anatômicos em um Modelo Murino de Infarto do Miocárdio

Linshen Mao; Houping Xu; Yan Wei; Li Dong; Jinhui Jiang; Qingyu Zhang; Ping Liu; Zhenzhou Li; Mengnan Liu; Gang Luo

doi:10.3791/72336

Artigo de método

Ligação de Precisão da Artéria Coronária Descendente Anterior Esquerda Utilizando Marcos Anatômicos em um Modelo Murino de Infarto do Miocárdio

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DOI:

10.3791/72336

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18 de agosto de 2026

Linshen Mao^*¹^,² , Houping Xu^*¹^,² , Yan Wei^*³ , Li Dong¹^,² , Jinhui Jiang¹^,⁴ , Qingyu Zhang¹^,⁴ , Ping Liu¹^,⁴ , Zhenzhou Li¹^,⁴ , Mengnan Liu¹^,² , Gang Luo¹^,²

¹Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, ²National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, ³Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education & Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province (Collaborative Innovation Center for Prevention of Cardiovascular Diseases), ⁴School of Integrated Traditional and Western Medicine, Southwest Medical University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo induz infarto do miocárdio em camundongos por ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda, utilizando o sulco interventricular anterior como marco superficial reprodutível para posicionamento preciso do ponto de sutura. O infarto é validado por eletrocardiografia, ecocardiografia, coloração histológica e análise de biomarcadores séricos.

Resumo

A ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) é a abordagem mais amplamente utilizada para estabelecer modelos murinos de infarto do miocárdio (IM) na pesquisa cardiovascular pré-clínica. Nos protocolos convencionais, no entanto, o local da ligadura é geralmente posicionado 1–2 mm abaixo do apêndice do átrio esquerdo, um marco anatômico que frequentemente é difícil de identificar com confiabilidade durante a cirurgia. Combinado com a considerável variabilidade interindividual na anatomia coronária murina, isso frequentemente resulta em localização imprecisa da LAD, locais de ligadura inconsistentes e menor reprodutibilidade entre operadores. Para superar essas limitações, este protocolo introduz o sulco interventricular anterior (AIS) como marco orientador para a ligadura da LAD. O AIS é um sulco superficial na superfície do coração diretamente visível ao microscópio, com a LAD correndo imediatamente abaixo dele. Diferentemente das abordagens convencionais, ele fornece uma referência anatômica estável que permite uma seleção mais consistente do local de ligadura e é mais fácil de identificar por operadores menos experientes. O protocolo combina anestesia inalatória padronizada com isoflurano, intubação traqueal não invasiva e valida o IM por meio de eletrocardiografia, ecocardiografia, ensaio imunoenzimático (ELISA), coloração histopatológica e imagem tridimensional das artérias coronárias. Este protocolo fornece um método experimental confiável e reprodutível para induzir IM em camundongos, a fim de investigar as alterações fisiopatológicas e imunológicas após o infarto do miocárdio.

Introdução

O infarto do miocárdio (IM), uma das principais causas de morbidade e mortalidade cardiovascular em todo o mundo, representa uma ameaça substancial à saúde humana¹. Caracterizado por um início súbito, um curso clínico crítico e uma alta taxa de letalidade, o IM é causado principalmente pela oclusão trombótica das artérias coronárias e pode levar a uma isquemia miocárdica profunda, necrose subsequente de cardiomiócitos e uma cascata de complicações, incluindo arritmias, insuficiência cardíaca e morte súbita cardíaca². Apesar dos notáveis avanços na cardiologia clínica, o acesso limitado ao tecido miocárdico humano continua a dificultar a investigação dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes ao IM e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes³. Consequentemente, modelos animais in vivo confiáveis, reprodutíveis e clinicamente relevantes que reproduzam fielmente as características clínicas e a progressão do IM permanecem essenciais para estudos mecanicistas e avaliação terapêutica pré-clínica.

Desde que Johns e Olson estabeleceram pela primeira vez um modelo de IAM murino em 1954, as metodologias para induzir IAM em camundongos passaram por aperfeiçoamentos contínuos⁴. A ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE) sob visualização microscópica direta tornou-se a técnica mais amplamente adotada, pois reproduz características patológicas essenciais do IAM humano, incluindo isquemia miocárdica localizada, necrose miocárdica e remodelação ventricular pós-infarto⁵. No entanto, a ligadura convencional da DAE exige considerável expertise em microcirurgia, que normalmente é adquirida apenas após treinamento extenso, limitando a consistência e reprodutibilidade do procedimento entre diferentes operadores e laboratórios⁶. Além disso, complicações intraoperatórias e pós-operatórias — como hemorragia, lesão ou colapso pulmonar, posicionamento incorreto da ligadura e dano tecidual mecânico decorrente de ventilação inadequada — contribuem para uma mortalidade perioperatória relativamente alta, restringindo ainda mais a aplicação generalizada desse modelo⁷. Em resposta a essas limitações, Gao et al. introduziram uma técnica modificada que envolve a ligadura da DAE por eversão cardíaca, a qual simplifica o procedimento cirúrgico e reduz a barreira técnica para o estabelecimento do modelo⁸. Outras abordagens experimentais, incluindo criolesão coronariana e indução farmacológica de lesão miocárdica, também foram desenvolvidas para aplicações de pesquisa específicas⁹^,¹⁰. Apesar disso, a ligadura permanente da DAE sob visualização direta permanece o método preferido, pois reproduz mais fielmente as principais características fisiopatológicas do IAM humano, ao mesmo tempo que permite o controle sobre o tamanho e a localização do infarto.

Apesar de seu amplo uso, a ligadura convencional da ADA permanece limitada pela identificação variável do local de ligadura, inconsistência do procedimento, mortalidade perioperatória relativamente alta e variabilidade entre laboratórios quanto à reprodutibilidade, fatores que podem afetar a confiabilidade e a comparabilidade dos resultados experimentais¹¹. O objetivo geral do presente protocolo é estabelecer um método mais padronizado e reprodutível para a ligadura permanente da ADA em camundongos, utilizando o sulco interventricular anterior (SIA) como referência anatômica externa para a localização do vaso. Em vez de estimar o local de ligadura a uma distância fixa abaixo da aurícula esquerda, este protocolo identifica o SIA — um sulco superficial na superfície que é diretamente visível sob visualização microscópica e que sobrepõe a ADA — como uma referência anatômica estável para orientar a ligadura. Em comparação com a estimativa baseada em marcos anatômicos convencionais, esta abordagem tem como objetivo facilitar uma seleção mais consistente do local de ligadura, reduzir a variabilidade dependente do operador e melhorar o acesso para cirurgiões menos experientes, mantendo a compatibilidade com procedimentos padrão de IAM em camundongos. Portanto, este protocolo é adequado para pesquisadores que buscam um método cirúrgico reprodutível para gerar modelos de IAM permanente para estudos sobre lesão miocárdica, remodelamento ventricular, inflamação e mecanismos relacionados às doenças cardiovasculares.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados com aprovação do Comitê de Ética do Centro de Experimentação Animal da Universidade Médica do Sudoeste (número de aprovação: SWMU20240146). Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6J (livres de patógenos específicos [SPF]), com idade entre 8 e 10 semanas e peso de 20,0 ± 3,0 g. Adapte os camundongos às condições laboratoriais padrão (22 °C ± 2 °C; ciclo claro/escuro de 12 h/12 h) por 1 semana antes de iniciar os experimentos.

1. Preparação pré-cirúrgica

Prepare e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos no dia da cirurgia, incluindo pinças, tesouras oftálmicas, porta-agulhas, hemostato micro-mosquito, afastador de pálpebras em forma de V, suturas de náilon 7-0 em círculo de 3/8 com agulha, suturas de náilon 6-0 e suturas de náilon 5-0. Autoclave todos os instrumentos metálicos a 121°C por 20 min antes do procedimento e reesterilize-os entre os animais utilizando um esterilizador de contas de vidro (250°C por 15 s), seguido de resfriamento em um campo estéril. Utilize suturas provenientes de embalagens estéreis lacradas.
Monte duas áreas de trabalho separadas para manter a técnica asséptica. Prepare uma área com pinças, um kit de intubação traqueal para roedores e uma máquina de anestesia, e prepare uma segunda área cirúrgica estéril com instrumentos esterilizados, cotonetes, poviodine-iodo e gaze estéril.
Aplique creme depilatório na região torácica por 1 min. Remova o creme e os pelos suavemente usando gaze estéril umedecida com água estéril ou solução salina.
1. A remoção dos pelos isoladamente não constitui preparo cirúrgico da pele. Realize a desinfecção cutânea asséptica definitiva e a colocação de campos estéreis somente após anestesiar, intubar e fixar o camundongo na plataforma cirúrgica, imediatamente antes da incisão cutânea (Passo 2.6).
Administre cefazolina (300 mg/kg) por injeção intraperitoneal 1 h antes da cirurgia. Reconstitua o cefazolina sódica para injeção em solução salina estéril a 0,9%, obtendo uma concentração de trabalho de 30 mg/mL, e administre aproximadamente 0,2 mL por 20 g de peso corporal para atingir a dose desejada. Continue a administração uma vez ao dia por 5 dias consecutivos após a cirurgia.
NOTA: Não administre agentes hemostáticos farmacológicos sistêmicos ou tópicos neste protocolo. Alcance a hemostasia intraoperatória aplicando pressão suave e contínua com um cotonete estéril por 10–30 s, ou até que o sangramento cesse.

2. Indução da Anestesia e Intubação Traqueal

Coloque o camundongo na câmara de indução (16 × 10 × 11 cm) conectada à máquina de anestesia. Ajuste a vazão do gás carrier para 0,5 L/min e induza a anestesia com 3,5%–4,0% de isoflurano.
NOTA: Confirme anestesia adequada pela ausência do reflexo de retirada plantar. Nessas condições, o camundongo geralmente atinge um plano cirúrgico de anestesia dentro de 2–4 min.
Posicione o camundongo anestesiado em decúbito dorsal sobre a plataforma de intubação traqueal para roedores. Suspenda o animal prendendo os incisivos superiores na faixa de borracha da plataforma, de modo que a cabeça e o pescoço fiquem estendidos em um ângulo de aproximadamente 45°. Alinhe os eixos oral, faríngeo e laríngeo para colocar a glote diretamente à vista.
Realize a intubação orotraqueal
1. Realize a intubação orotraqueal sob laringoscopia direta, sem traqueotomia, para estabelecer ventilação mecânica controlada. Utilize um cateter intravenoso de 20 G (diâmetro externo, aproximadamente 0,9 mm; comprimento, aproximadamente 15 mm) como tubo endotraqueal.
2. Abra a boca e desloque suavemente a língua para um dos lados usando pinça. Insira a lâmina de um laringoscópio para pequenos animais ao longo do dorso da língua e pressione a base da língua.
3. Avance o laringoscópio até que a epiglote fique visível. Levante o laringoscópio para cima e para frente ao longo do eixo do cabo para elevar a epiglote e expor a abertura glótica em forma de V e as pregas vocais pálidas.
4. Avance o cateter através da glote aberta durante a inspiração, mantendo a visualização direta das pregas vocais. Remova o laringoscópio após o cateter passar pela glote.
5. Avance o cateter a uma profundidade de aproximadamente 5–7 mm. Retire o fio guia e conecte o cateter ao ventilador.
  NOTA: Confirme o posicionamento correto do tubo endotraqueal observando o movimento simétrico bilateral da parede torácica sincronizado com o ventilador. Se o movimento da parede torácica for mínimo e ocorrer movimento abdominal rítmico em seu lugar, acompanhado de progressiva clareza da anestesia, remova o cateter do esôfago e repita a intubação.
6. Se a glote não puder ser visualizada, retire o laringoscópio e reposicione o camundongo na plataforma de intubação com a cabeça e o pescoço estendidos em aproximadamente 45°. Realinhe os eixos oral, faríngeo e laríngeo, remova eventuais secreções orofaríngeas com um cotonete estéril e repita a laringoscopia. Se o camundongo apresentar sinais de despertar da anestesia, retorne-o à câmara de indução, aumente a profundidade da anestesia e, em seguida, repita a tentativa de intubação.
7. Interrompa o procedimento se o camundongo desenvolver cianose, sangramento laríngeo ou apneia persistente. Interrompa a administração de isoflurano e coloque o camundongo sobre uma placa aquecedora com controle térmico (37°C) até que se recupere completamente.
8. Não prossiga com toracotomia se a intubação traqueal for mal-sucedida. Reagende o procedimento para uma sessão posterior ou exclua o animal do estudo, registrando-o como falha do procedimento.
  NOTA: Tentativas repetidas de intubação podem causar edema laríngeo, aumentando o risco de desconforto respiratório pós-operatório. Na maioria dos casos, a intubação bem-sucedida é alcançada nas duas primeiras tentativas após a visualização direta da glote. A proficiência na intubação orotraqueal exige prática e familiaridade com a técnica.
Administre ar como gás carrier com uma vazão de 0,5 L/min e mantenha a anestesia com 1,5%–2,0% de isoflurano. Ajuste o ventilador para uma frequência respiratória de 130 respirações/min, volume corrente de 2 mL e razão inspiração:expiração de 5:4.
NOTA: O volume corrente definido no ventilador excede o valor teórico estimado a partir do peso corporal, pois compensa o volume compressível do circuito do ventilador e o espaço morto do tubo endotraqueal. Avalie a ventilação durante todo o procedimento monitorando o animal quanto à cianose e sinais de barotrauma, incluindo pneumotórax e enfisema subcutâneo.
1. Monitore continuamente a profundidade da anestesia durante todo o procedimento. Avalie o padrão respiratório e o reflexo de retirada plantar a cada 2 min. Monitore continuamente a frequência cardíaca utilizando o eletrocardiograma (ECG) e ajuste a concentração de isoflurano para manter uma frequência cardíaca de 400–500 batimentos/min; uma concentração de isoflurano de 1,5%–2,0% geralmente é suficiente. Durante o procedimento, observe esforço respiratório espontâneo contra o ventilador, movimento dos bigodes e alterações na cor da mucosa.
2. Aumente a concentração de isoflurano em incrementos de 0,5%, até um máximo de 3,0%, se o reflexo de retirada plantar reaparecer, se for observado movimento dos bigodes ou se ocorrer esforço respiratório espontâneo contra o ventilador. Reduza a concentração de isoflurano em decrementos de 0,5%, até um mínimo de 1,0%, se a frequência cardíaca cair abaixo de 350 batimentos/min. Interrompa o procedimento cirúrgico sempre que esses sinais forem observados, continue monitorando a frequência cardíaca, o padrão respiratório, a cor da mucosa e o movimento dos bigodes, e retome o procedimento apenas após a estabilização dos parâmetros fisiológicos.
Incline o camundongo para o lado direito, com o lado esquerdo voltado para cima, para expor a parede torácica esquerda. Fixe os quatro membros e a cauda na plataforma utilizando fita adesiva.
Desinfete o local cirúrgico com três aplicações sucessivas de poviodine-iodo. Para cada aplicação, utilize um cotonete estéril novo, iniciando no local planejado para a incisão e movendo-se para fora em espiral concêntrica até aproximadamente 1 cm além da incisão prevista em todas as direções. Descarte o cotonete após cada aplicação e não retorne um cotonete usado ao centro do campo cirúrgico. Deixe a última aplicação secar completamente ao ar, depois aplique um campo cirúrgico estéril, expondo apenas a área operatória antes de realizar a incisão na pele.

3. Toracotomia e Exposição do Coração

OBSERVAÇÃO: O fluxo de trabalho cirúrgico geral, incluindo posicionamento do animal, toracotomia, exposição do coração, ligadura da artéria coronária descendente anterior (LAD), fechamento torácico e recuperação pós-operatória, está ilustrado nas Figura 1 e Figura 2.

Diagrama da anatomia do coração com ponto de ligadura e artérias coronárias; imagens do local cirúrgico.
Figura 1: Localização anatômica do ponto de ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda utilizando o sulco interventricular anterior. (A) Vista ventral do coração murino exposto antes da ligadura, mostrando o sulco interventricular anterior (SIA). (B) Vista da mesma região após a ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAS); a região destacada por círculo indica o ponto de ligadura. (C) Esquema mostrando a relação espacial entre o SIA e as artérias coronárias. A DAS percorre ao longo do SIA, e o ponto de ligadura localiza-se no terço superior do sulco. RCA, artéria coronária direita; LCA, artéria coronária esquerda; LCX, artéria circunflexa esquerda. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Sequência do procedimento cirúrgico em um camundongo, exposição do coração, pesquisa experimental, diagrama passo a passo.
Figura 2: Procedimento cirúrgico para ligadura guiada pelo sulco interventricular anterior da artéria coronária descendente anterior esquerda em camundongos. (A) Posicione e fixe o camundongo anestesiado com a região torácica esquerda despelida. (B) Faça uma incisão na pele sobre a parede torácica esquerda. (C) Separe os músculos peitorais e identifique o espaço intercostal apropriado para toracotomia. (D,E) Insira e posicione o afastador torácico para expandir o espaço intercostal e expor o campo operatório. (F) Visualize o coração exposto e identifique o sulco interventricular anterior (SIA). (G) Passe um fio de náilon 7-0 através do SIA e sob a artéria coronária descendente anterior esquerda (ADAE). (H) Amarre o fio para realizar a ligadura permanente da ADAE. (I) Remova o afastador torácico e feche a parede torácica. (J,K) Feche sequencialmente as camadas muscular e cutânea. (L) Permita que o camundongo se recupere sob aquecimento após a cirurgia. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Com tesoura oftálmica, faça uma incisão longitudinal de 1 cm na parede torácica esquerda, paralela ao eixo longo do esterno e aproximadamente 2 mm lateral à borda esternal esquerda. Exponha os músculos peitorais subjacentes.
Usando pinça fina, separe rombicamente os músculos peitoral maior e peitoral menor no sentido de suas fibras. Retraia os músculos lateralmente para expor as costelas e os espaços intercostais, evitando cortar os músculos para minimizar o sangramento.
Identifique o espaço intercostal apropriado antes de abrir a cavidade torácica. Localize a artéria intercostal anterior, ramo da artéria torácica interna que percorre um espaço intercostal paralelamente às costelas, e identifique o terceiro espaço intercostal imediatamente cranial à artéria mais visível no quarto espaço intercostal.
Se a artéria intercostal anterior não estiver claramente visível, palpe a primeira costela e conte caudalmente para identificar o espaço entre a terceira e a quarta costelas. Confirme que o espaço intercostal selecionado oferece uma visualização direta e desobstruída da aurícula esquerda e da parede livre anterior do ventrículo esquerdo antes de prosseguir.
NOTA: A identificação precisa do terceiro espaço intercostal é essencial, pois um local incorreto de toracotomia pode reduzir a visualização do coração e comprometer o procedimento.
Realize uma toracotomia pelo terceiro espaço intercostal esquerdo. Alargue suavemente o espaço intercostal usando um retrator em forma de V para pálpebra até que a aurícula esquerda e o terço superior do ventrículo esquerdo sejam claramente expostos no campo cirúrgico.
NOTA: Nesta fase, o coração ainda está coberto pelo pericárdio; portanto, a AIS não pode ser identificada com confiança. Identifique a AIS somente após abrir o pericárdio (Etapa 3.6), conforme descrito nas Etapas 4.2–4.3.
Segure o pericárdio suavemente com um par de pinças finas e levante-o afastando-o do miocárdio. Use um segundo par de pinças finas para rasgar lentamente o pericárdio e expor completamente o coração.

4. Ligadura Guiada por Pontos Anatômicos da Artéria Coronária Descendente Anterior Esquerda

Passe uma sutura de náilon 6-0 através da parede torácica e aplique tração suave para ampliar o campo operatório. Exponha completamente a AIS antes de identificar o local de ligadura (Figura 1A).
Identifique a AIS como o sulco raso que percorre obliquamente da base cardíaca em direção ao ápice, marcando o limite superficial entre os ventrículos esquerdo e direito (Figura 1C). Sob o microscópio, identifique-a como uma depressão quase circular localizada aproximadamente 1–2 mm abaixo da margem inferior da aurícula esquerda.
Se for difícil identificar a AIS, limpe suavemente a superfície epicárdica com uma haste de algodão umedecida com solução salina morna. Reexamine o campo operatório sob o microscópio para identificar o sulco com mais clareza.
NOTA: Sob o microscópio de dissecação, a AIS é um sulco raso facilmente identificável que delimita anatomicamente o limite interventricular, com a artéria coronária descendente anterior (AD) correndo imediatamente abaixo dela. Se a AIS permanecer indistinta após a limpeza, primeiramente confirme se a toracotomia proporciona exposição adequada. Em seguida, identifique diretamente a AD conforme métodos previamente descritos: em relação à veia cardíaca acompanhante, a artéria é mais rosada, de menor calibre e nitidamente pulsátil¹².
1. Se a AIS ou a artéria coronária AD não puderem ser identificadas, verifique primeiramente se a toracotomia foi realizada pelo terceiro espaço intercostal esquerdo. Se necessário, reposicione a toracotomia conforme descrito nas Etapas 3.3–3.5 e repita a identificação da AIS e da AD conforme descrito nas Etapas 4.1–4.3.
2. Interrompa o procedimento se a AIS ou a AD não puderem ser identificadas após 10 minutos de inspeção cuidadosa, se ocorrer sangramento incontrolável, se o procedimento total com tórax aberto exceder 20 minutos ou se a frequência cardíaca permanecer abaixo de 300 batimentos/min, apesar do ajuste da profundidade anestésica. Anestesie profundamente o camundongo com 5% de isoflurano, eutanazie-o por dislocação cervical e registre o animal como falha do procedimento para inclusão na análise dos resultados cirúrgicos.
Passe uma sutura de náilon 7-0 através do sulco no terço superior da AIS (Figura 1B). Insira a agulha perpendicularmente à superfície epicárdica até uma profundidade de aproximadamente 0,5–1 mm, com os pontos de entrada e saída posicionados em lados opostos do sulco e abrangendo aproximadamente sua largura máxima.
Fixe a ligadura utilizando um nó cirúrgico. Ajuste a ligadura até que ocorra branqueamento imediato do miocárdio distal ao local de ligadura após o primeiro laço, sem afundamento tecidual local apreciável.
NOTA: Apenas aperte a sutura o suficiente para ocluir o fluxo sanguíneo coronariano. Tensão excessiva pode lesar o miocárdio adjacente ou fazer com que a sutura corte o vaso e os tecidos circundantes.
Confirme oclusão coronariana bem-sucedida dentro de 1 minuto após a ligadura, observando o branqueamento isquêmico irregular do miocárdio distal ao local de ligadura¹². Confirme ainda mais a oclusão identificando elevação do segmento ST no ECG.
Se a área isquêmica for excessivamente pequena ou se o branqueamento estiver ausente, solte a ligadura e repita o procedimento de ligadura.

5. Fechamento e Recuperação Pós-operatória

Remova cuidadosamente o retractor palpebral em forma de V. Feche a toracotomia com um ponto único interrompido de fio de náilon 5-0, passando a agulha ao redor das terceira e quarta costelas adjacentes para reaproximar o terceiro espaço intercostal. Mantenha a agulha próxima à superfície da costela para evitar lesar o feixe neurovascular intercostal. Antes de amarrar o ponto, comprima suavemente o tórax ao final da expiração para eliminar o ar intratorácico residual, e mantenha a compressão enquanto fixa o ponto com um nó cirúrgico.
Feche a incisão cutânea em camadas utilizando pontos de náilon 5-0. Assegure a completa aposição das bordas da ferida antes de prosseguir.
Coloque o camundongo sobre uma placa aquecida com controle de temperatura (37°C), interrompa a administração de isoflurano e continue a ventilação mecânica até que a respiração espontânea retorne. Observe o animal durante a recuperação da anestesia, incluindo movimentos da cauda ou dos bigodes e o restabelecimento de um padrão respiratório regular de aproximadamente 150 respirações/min.
Confirme a prontidão para extubação verificando respiração espontânea regular, movimento visível da parede torácica sincronizado com o ciclo do ventilador e movimentos intencionais dos membros ou bigodes. Retire o tubo endotraqueal lentamente durante a fase expiratória e continue monitorando o camundongo na placa aquecida por 3–5 min para confirmar a ausência de desconforto respiratório.
OBSERVAÇÃO: O desconforto respiratório após a extubação é mais comumente causado por pneumotórax decorrente do fechamento incompleto do espaço intercostal. Caso ocorra desconforto respiratório, reaplique anestesia temporariamente e ventile o camundongo, reabra os pontos cutâneos, inspecione o fechamento intercostal e aplique pontos adicionais em qualquer local com vazamento de ar antes de repetir o procedimento de extubação.
Retorne o camundongo à sua gaiola de origem após a recuperação da anestesia. Administre buprenorfina (0,1 mg/kg, via subcutânea) imediatamente após a cirurgia e a cada 4–6 h nas primeiras 48 h.
Monitore cada camundongo pelo menos duas vezes ao dia nos primeiros 3 dias pós-operatórios e uma vez ao dia posteriormente. Avalie o peso corporal, postura, atividade, padrão respiratório e o local da incisão cirúrgica, e eutanazie qualquer animal que atinja os critérios pré-definidos de bem-estar, incluindo dificuldade respiratória persistente, incapacidade de acessar alimento ou água, ou postura encurvada e imóvel que não responda a estímulos.

6. Avaliação Eletrocardiográfica (ECG)

Registre sinais eletrocardiográficos utilizando um sistema de gravação fisiológica multicanal equipado com um amplificador de ECG. Insira três eletrodos subcutâneos de membros no camundongo, conectando a entrada positiva (VIN+) à pata traseira esquerda, a entrada negativa (VIN−) à pata dianteira direita e o terra (GND) à pata traseira direita.
Conecte o módulo amplificador de ECG à unidade de aquisição de dados. Ajuste o filtro rejeita-faixa para 50 Hz (ou 60 Hz, conforme a frequência local da rede elétrica), abra o software de aquisição e adicione um novo módulo amplificador de ECG nas configurações do canal analógico.
1. Configure o amplificador com os seguintes parâmetros: ganho = 2000, modo = normal, filtro passa-baixa = 150 Hz e filtro passa-alta = 0,05 Hz. Abra as configurações de aquisição, defina a taxa de amostragem para 1 kHz e feche a janela de configuração.
2. Após posicionar os eletrodos, clique em Iniciar para começar a gravação. Ajuste a base de tempo da exibição para 0,5 s por divisão principal e a escala vertical para 0,25 mV por divisão principal, então grave o ECG continuamente por pelo menos 30 s. Selecione um segmento estável, livre de artefatos, para análise e apresentação representativa.
Registre o ECG imediatamente após a ligadura, mantendo o camundongo sob anestesia com isoflurano a 1,5% e normotermia sobre uma placa aquecida. Grave ECGs tanto do grupo de infarto do miocárdio (MI) quanto do grupo controle normal (NC) no mesmo ponto temporal e sob condições anestésicas comparáveis.

7. Ecocardiografia

Remova os pelos da região torácica anterior utilizando creme depilatório 1 dia antes da aquisição de imagens. Anestesie o camundongo com 1,5% de isoflurano durante todo o exame.
Coloque o camundongo em posição supina sobre uma plataforma aquecida, fixe os quatro membros aos eletrodos do ECG e aplique gel ultrassônico na região precordial. Ajuste a concentração de isoflurano conforme necessário para manter uma frequência cardíaca superior a 400 batimentos/min.
Posicione a sonda de ultrassom no terceiro ao quarto espaço intercostal ao longo da borda esternal esquerda. Direcione o marcador da sonda em direção ao membro anterior direito em um ângulo de aproximadamente 30° e alinhar a sonda com o eixo longo do coração.
Realize todas as imagens usando um transdutor com arranjo linear e uma frequência de transmissão central de 30 MHz, largura de banda de 20–46 MHz e resolução axial de 50 μm. Ajuste a potência de transmissão para 100%, a profundidade da imagem para 13 mm, a largura da imagem para 11 mm, a faixa dinâmica para 60 dB e o ganho bidimensional para 40 dB. Adquira loops de cine em modo B com uma taxa de quadros de 210 quadros/s.
Salve esses parâmetros de aquisição como um predefinido do sistema. Utilize o mesmo transdutor, predefinido, potência de transmissão, alcance dinâmico, profundidade de imagem e largura de imagem para todos os animais e todas as sessões de imagem, e não modifique a profundidade de imagem entre os grupos NC e MI.
Na mesma visão de eixo longo, posicione a linha de amostragem do modo-M no nível midventricular, perpendicular ao septo interventricular e à parede posterior do ventrículo esquerdo, com a porta de amostragem abrangendo todo o diâmetro anteroposterior do ventrículo esquerdo. Registre o traçado do modo-M para análise subsequente.
Adquira imagens no modo B em que o ventrículo esquerdo, átrio esquerdo e raiz da aorta sejam claramente visualizados, e registre loops cinematográficos para análise subsequente. Adquira imagens correspondentes no modo M no mesmo plano de imagem.
Meça o diâmetro interno final diastólico do ventrículo esquerdo (D_d), diâmetro interno final sistólico do ventrículo esquerdo (Ds) e espessura da septo interventricular a partir das imagens adquiridas. Adquira cinco ciclos cardíacos consecutivos e informe os valores médios.
OBSERVAÇÃO: Calcule automaticamente o volume diastólico final do ventrículo esquerdo (VDFVE) e o volume sistólico final do ventrículo esquerdo (VSFVE) utilizando o software de imagem. Calcule a fração de encurtamento (FE) como FE = (D_d − D_s) / D_d × 100% e fração de ejeção (FE) como FE = (VDFVE − VSFVE) / VDFVE × 100%.

8. Coleta de Tecidos, Coloração Histológica e ELISA

Coleta de tecidos
1. No dia 7 após a indução do infarto do miocárdio (IM), realize ecocardiografia em cada camundongo. Anestesie o camundongo com 4% de isoflurano, colete aproximadamente 1,5 mL de sangue por punção retro-orbital, eutanazie o camundongo por dislocação cervical e remova o coração.
2. Permita que as amostras de sangue coagulem durante a noite a 4°C. Centrifugue as amostras a 2000 × g por 10 min a 4°C, colete o soro e armazene-o a −80°C até a análise.
Ensaio imunoenzimático (ELISA)
1. Quantifique o peptídeo natriurético tipo B (BNP), interleucina-1β (IL-1β), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e fator nuclear-κB p65 (NF-κB p65) no soro utilizando kits de ensaio imunoenzimático (ELISA).
  1. Traga todos os reagentes e amostras de soro à temperatura ambiente e prepare as soluções de trabalho conforme as instruções do kit. Dilua as amostras de soro na proporção de 1:5 em solução salina tamponada com fosfato (PBS), ou seja, um volume de soro mais quatro volumes de PBS.
  2. Adicione 50 μL de padrões, PBS e amostras de soro diluídas nas poços de padrão, zero e amostra, respectivamente, mantendo o poço em branco vazio. Adicione 100 μL de anticorpo de detecção conjugado com peroxidase de rábano (HRP) a todos os poços, exceto ao em branco, feche a placa e incube-a a 37°C por 60 min no escuro.
  3. Descarte o conteúdo de cada poço e lave a placa cinco vezes com tampão de lavagem, mantendo o tampão em cada poço por 20 s durante cada ciclo de lavagem. Seque a placa em papel sem fiapos.
  4. Adicione 100 μL de substrato recém-preparado (Soluções A e B misturadas na proporção volumétrica de 1:1) a cada poço. Incube a placa fechada a 37°C por 15 min no escuro, adicione 50 μL de solução de parada e meça a densidade óptica a 450 nm.
2. Subtraia a densidade óptica do em branco de cada medição e gere uma curva padrão utilizando um modelo de regressão logística de quatro parâmetros (4PL). Calcule a concentração de cada amostra a partir da curva ajustada, multiplique o valor pelo fator de diluição de 5 e reporte o valor médio obtido em poços duplicados.
Processamento, inclusão e corte de tecidos
1. Lave brevemente cada coração removido em solução salina tamponada com fosfato gelada para remover o sangue residual. Fixe o tecido em paraformaldeído a 4% por pelo menos 24 h à temperatura ambiente.
2. Seccione cada coração para expor uma superfície plana no eixo curto e coloque-o em um cassete de tecido identificado. Desidrate o tecido por meio de uma série graduada de etanol (75% de etanol por 4 h, 85% de etanol por 2 h, 90% de etanol por 2 h, 95% de etanol por 1 h e duas trocas de etanol absoluto por 30 min cada). Transfira o tecido por meio de uma mistura de etanol–xilol por 5–10 min, clarifique-o em duas trocas de xilol por 10 min cada e infiltre-o com três trocas de parafina fundida por 1 h cada.
3. Incorpore cada coração com o eixo curto voltado para a superfície do bloco. Corte seções seriadas de 3 μm no nível médio papilar, flutue as seções em banho-maria a 40°C, monte-as em lâminas de vidro e seque-as a 60°C.
4. Desparafinize as seções em duas trocas de xilol (15 min cada), seguidas por três trocas de etanol absoluto (5 min cada), etanol a 75% (5 min) e água por osmose reversa (RO) (5 min).
  AVISO: O paraformaldeído é um provável carcinógeno e irritante respiratório e dérmico, e o xilol é inflamável e neurotóxico. Manipule esses reagentes em capela química, utilizando luvas médicas assépticas, jaleco de laboratório e proteção ocular, e descarte os resíduos conforme os procedimentos institucionais para resíduos perigosos. Etanol e n-butanol são inflamáveis; mantenha-os afastados de fontes de ignição.
Coloração histológica
1. Coloração com hematoxilina e eosina
  1. Imersão das seções desparafinizadas e reidratadas em hematoxilina por 3–5 min. Enxágue as seções em água.
  2. Diferencie as seções em álcool ácido a 1%, e enxágue-as em água. Blue as seções em amônia aquosa a 0,5% e enxágue-as novamente.
  3. Transfira as seções sequencialmente para etanol a 85%, etanol a 95% e etanol absoluto por 5 min cada. Contracolore as seções em eosina por 3–5 min.
  4. Desidrate as seções em três trocas de etanol absoluto por 5 min cada e, em seguida, em n-butanol por 5 min. Clarifique as seções em três trocas de xilol por 5 min cada e monte-as com resina neutra.
    OBSERVAÇÃO: Os núcleos aparecem azuis, enquanto o citoplasma e a matriz extracelular aparecem vermelhos.
2. Coloração com tricrômio de Masson
  1. Mordencie as seções desparafinizadas e reidratadas em solução de dicromato de potássio a 2,5% durante a noite por aproximadamente 15 h à temperatura ambiente. Enxágue as seções sob água corrente por aproximadamente 30 s até o desaparecimento da coloração amarelada.
  2. Colore as seções em solução de Ponceau–fucsina ácida por 6 min até que o tecido apareça vermelho brilhante. Prolongue o tempo de coloração se a cor permanecer fraca e enxágue as seções sob água corrente até que a água de lavagem fique incolor.
  3. Remova o excesso de água sem permitir que as seções sequem. Diferencie as seções em ácido fosfomolibdico aquoso por 1–2 min até que o colágeno apareça pálido e as fibras musculares permaneçam vermelhas.
  4. Transfira as seções diretamente para solução de azul de anilina sem enxaguar. Incube as seções por 6–30 s.
  5. Diferencie as seções em três a cinco trocas de ácido acético a 1% por aproximadamente 8 s por troca. Desidrate rapidamente em três trocas de etanol absoluto por aproximadamente 3, 5 e 5 s, respectivamente.
  6. Clarifique as seções em n-butanol por 5 min e, em seguida, em xilol por 5 min. Monte as seções com resina neutra.
    OBSERVAÇÃO: As fibras de colágeno aparecem azuis, enquanto as fibras musculares, fibrina e eritrócitos aparecem vermelhos.
3. Coloração com Sirius Red
  1. Incube as seções desparafinizadas e reidratadas em solução A de Sirius Red em estufa a 65°C por 30 min. Lave as seções sob água corrente até o desaparecimento da coloração amarelada.
  2. Remova o excesso de líquido com papel absorvente e imerja as seções em solução B de Sirius Red por 2 min. Lave brevemente e remova o excesso de líquido.
  3. Imersão das seções em solução C de Sirius Red por 30 min. Enxágue brevemente por 1–2 s.
  4. Desidrate as seções em três trocas de etanol absoluto por aproximadamente 3 s cada. Clarifique-as em três trocas de xilol por 5 min cada e monte-as com resina neutra.
    OBSERVAÇÃO: Sob iluminação em campo claro, as fibras de colágeno aparecem vermelhas sobre um fundo amarelo.
Aquisição e quantificação de imagens
1. Adquira todas as imagens histológicas utilizando um escâner digital de lâminas. Utilize configurações idênticas de iluminação, balanço de branco, exposição e aumento para todas as seções de todos os grupos e inclua uma barra de escala de calibração em cada imagem.
2. Calibre a escala espacial antes da análise de imagem. Carregue uma imagem de referência contendo a barra de escala adquirida na mesma resolução e dimensões de pixel das imagens do estudo. Em Medida > Calibração > Definir Sistema, crie uma nova calibração espacial, defina a unidade como μm, defina a conversão pixel-micrômetro alinhando os pontos de calibração com a barra de escala, salve a calibração e aplique-a a todas as imagens.
3. Carregue uma seção corada com tricrômio de Masson e delimite o ventrículo esquerdo utilizando a ferramenta de área de interesse (AOI) irregular. Exclua a cavidade ventricular, o ventrículo direito e artefatos de processamento do tecido, e registre a área total do ventrículo esquerdo.
4. Abra Medida > Contagem/Tamanho e selecione Selecionar Cores para abrir a janela de segmentação. Escolha a segmentação baseada em cubo de cor e defina os parâmetros da seguinte forma: sensibilidade = 4, expandir seleção em 1 índice de cor, tamanho mínimo de cor = 1 pixel e tamanho do kernel = 3 × 3. Aplique as mesmas configurações de segmentação a todas as seções.
5. Selecione os pixels positivos para colágeno azul utilizando a ferramenta conta-gotas como pontos iniciais. Amostre apenas regiões claramente positivas para colágeno, gere uma imagem de pré-visualização e confirme que a máscara inclui as áreas positivas para colágeno, excluindo o miocárdio corado em vermelho, a cavidade ventricular e o fundo. Ajuste os pontos iniciais se necessário antes de aplicar a máscara.
  OBSERVAÇÃO: Re-selecione os pixels iniciais para cada seção para compensar pequenas diferenças de intensidade de coloração entre as seções. Mantenha parâmetros idênticos de segmentação (sensibilidade, grau de expansão, tamanho mínimo de cor e tamanho do kernel) para todas as imagens e aceite a segmentação apenas quando a pré-visualização demonstrar cobertura completa das áreas positivas para colágeno com exclusão de estruturas não colágenas.
6. Aplique a máscara de segmentação e feche a janela. Em Medida > Selecionar Medidas, selecione Área, clique em Contar, abra Visualizar > Estatísticas e registre a área total positiva para colágeno.
7. Calcule a fração volumétrica de colágeno (CVF) dividindo a área positiva para colágeno pela área total do ventrículo esquerdo e expresse o resultado como uma porcentagem.

9. Clareamento de Tecidos e Imagem Tridimensional da Artéria Coronária

Marcação por Fluorescência da Vasculatura Coronariana
1. Inject 200 µL de solução a 2% de Azul de Evans na veia lateral da cauda para marcar a vasculatura coronariana. Retorne o camundongo à sua gaiola por 60 min para permitir a circulação sistêmica do corante.
2. Coloque o camundongo na câmara de indução (16 × 10 × 11 cm) conectada à máquina de anestesia e induza anestesia com 4% de isoflurano. Eutanazie o camundongo por dislocação cervical, abra a cavidade torácica, excise o coração intacto, lave-o em PBS e fixe em paraformaldeído a 4% (PFA) por 24 h a 4°C.
  ATENÇÃO: O PFA é provavelmente carcinogênico e irritante respiratório e dérmico. Manipule o PFA em capela de exaustão química utilizando luvas médicas assépticas, jaleco de laboratório e proteção ocular, e descarte os resíduos conforme os procedimentos institucionais de resíduos perigosos.
3. Prepare uma solução a 3% de agarose em água RO e incorpore o coração fixado com o local da ligadura adequadamente orientado para a imagem. Injete 1 µL de solução de DAPI em cada um dos oito pontos ao redor da área de ligadura utilizando uma seringa de microlitro e incube a amostra à temperatura ambiente por 2 dias.
Clareamento tecidual
1. Realize o clareamento tecidual utilizando um kit de clareamento tecidual FDISCO (imagem tridimensional de órgãos clarificados por solvente com capacidade superior de preservação da fluorescência), conforme as instruções do fabricante. O kit contém seis reagentes (A–F): os reagentes A, B, C, D e E contêm respectivamente 50%, 70%, 80%, 100% e 100% de tetra-hidrofuran (THF) em água, e o reagente F é éter dibenzílico.
  ATENÇÃO: O THF é altamente inflamável, forma peróxidos explosivos durante o armazenamento e é irritante respiratório e dérmico. O éter dibenzílico é irritante para a pele e os olhos. Manipule todos os reagentes em capela de exaustão química utilizando equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas médicas assépticas, jaleco de laboratório e proteção ocular. Descarte os resíduos conforme os procedimentos institucionais de resíduos perigosos.
2. Incube cada coração sequencialmente nos reagentes A, B, C, D e E por 6 h por reagente. Utilize 10 mL de cada reagente por coração, correspondendo a uma razão mínima entre volume da amostra e do reagente de 1:5.
3. Transfira a amostra para o reagente F e continue a incubação até que o tecido fique opticamente transparente, geralmente por aproximadamente 1 h.
4. Realize todos os passos de clareamento a 6°C–8°C com agitação suave. Coloque a amostra em um recipiente de vidro envolto em folha de alumínio e proteja-a da luz durante todo o procedimento para preservar a fluorescência.
Imagem de fluorescência por folha de luz
1. Monte a amostra clarificada no suporte de amostras. Utilize um microscópio de folha de luz equipado com uma objetiva de 4× (abertura numérica = 0,28; distância de trabalho = 20,0 mm).
2. Imersa a amostra montada em éter dibenzílico dentro da câmara de imagem. Ilumine o espécime por ambos os lados e excite sequencialmente o DAPI em 405 nm e o Azul de Evans em 647 nm.
3. Defina os parâmetros de aquisição da seguinte forma: para o canal de 405 nm, utilize uma intensidade de laser de 3.000 unidades arbitrárias e um tempo de exposição de 30 ms; para o canal de 647 nm, utilize uma intensidade de laser de 4.000 unidades arbitrárias e um tempo de exposição de 30 ms. Adquira todas as imagens utilizando um tamanho de passo z de 6 μm e uma resolução de imagem de 1.024 × 1.024 pixels.
4. Defina o modo de aquisição da câmera para XYCZT, no qual imagens laterais (XY) são adquiridas primeiro, seguidas pela aquisição sequencial de canais (C), passos axiais (Z) e aquisição de pontos temporais (T), conforme configurado pelo software de imagem.
Processamento de dados de imagem e reconstrução tridimensional
1. Una os arquivos de imagem TIFF brutos utilizando o software de processamento de imagem fornecido com o microscópio. Converta os arquivos de imagem unidos para o formato IMS selecionando Arquivo > Converter para Imaris.
2. Importe os arquivos IMS convertidos para o software de análise tridimensional. Gere reconstruções renderizadas em volume utilizando as configurações padrão de renderização e exporte imagens representativas utilizando o módulo Snapshot.
  NOTA: As reconstruções tridimensionais são geradas utilizando o pipeline padrão de renderização do software, sem modificações. Nenhuma segmentação de imagem, limiarização, redução de ruído, subtração de fundo ou outro pré-processamento é aplicado. As imagens reconstruídas são utilizadas para visualização qualitativa da vasculatura coronariana e não são destinadas à análise quantitativa.

10. Análise Estatística

Expresse todos os dados como média ± erro padrão da média (EPM). Realize as análises estatísticas utilizando o software GraphPad Prism (versão 5.0).
Defina a unidade experimental como o animal individual. Analise n = 8 camundongos por grupo para todos os desfechos funcionais, de biomarcadores e histomorfométricos.
Realize a coleta e análise de dados utilizando identificadores codificados das amostras, mantendo o mascaramento do pesquisador em relação à alocação dos grupos. Revele as atribuições dos grupos somente após a conclusão de todas as análises quantitativas.
Avalie a normalidade dos dados utilizando o teste de Shapiro–Wilk e a homogeneidade da variância utilizando o teste de Levene no GraphPad Prism (versão 5.0) antes de selecionar o teste estatístico apropriado.
Compare dois grupos utilizando um teste t de Student não pareado bicaudal t-teste quando as premissas de normalidade e variância igual forem satisfeitas. Caso contrário, realize um teste de Mann–Whitney U teste.
Considere P < 0,05 estatisticamente significativo. Indique a significância estatística como P < 0,05, P < 0,01, e P < 0.001.

Resultados

A SAI serviu como referência anatômica para a localização da artéria coronária descendente anterior (ADA) e identificação do local de ligadura (Figura 1A–C). Após a identificação da SAI, o fluxo cirúrgico sequencial para indução de IAM, incluindo toracotomia, exposição do coração, ligadura da ADA, fechamento torácico e recuperação pós-operatória, foi realizado conforme ilustrado na Figura 2A–L. O protocolo simplificado permitiu a indução rápida e reprodutível de IAM em camundongos. Esse protocolo exige um período prolongado de treinamento prático antes que possa ser realizado com confiabilidade; intubação traqueal e ligadura guiada pela SAI são as duas etapas com curva de aprendizado mais acentuada. Durante o início do treinamento, a mortalidade perioperatória nos primeiros 7 dias pós-operatórios pode atingir 50% ou mais, e a taxa de sucesso na indução do modelo pode cair para 30% ou menos. Uma vez dominadas essas técnicas, a taxa de sucesso cirúrgico ultrapassa consistentemente 90%. No presente estudo, não ocorreram mortes perioperatórias nos primeiros 7 dias pós-operatórios. Todos os procedimentos de treinamento foram realizados sob o mesmo protocolo institucional aprovado para uso de animais.

Após a ligadura da ADA, foram observadas anormalidades eletrocardiográficas características, incluindo acentuado aprofundamento da onda Q, elevação do segmento ST com morfologia convexa para cima, ponta aguda da onda T (que geralmente evolui para inversão da onda T durante a fase subaguda), aumento da voltagem do complexo QRS com amplitude alargada e acentuada taquicardia (Figura 3A). O exame macroscópico demonstrou palidez miocárdica localizada e dilatação ventricular distal ao local da ligadura no grupo com IAM, em comparação com o grupo NC (Figura 3B). O exame histopatológico revelou fibras miocárdicas desorganizadas, espaços intercelulares alargados, infiltração de células inflamatórias, deposição de colágeno e ruptura da estrutura miocárdica no grupo com IAM, conforme demonstrado pelas colorações com hematoxilina e eosina (H&E), tricrômio de Masson e vermelho de Sirius (Figura 3C). A análise quantitativa de cortes corados com tricrômio de Masson demonstrou uma fração volumétrica colagênica (CVF) significativamente maior no grupo com IAM do que no grupo NC (18,24% ± 1,67% vs. 0,05% ± 0,01%; P < 0,001; Figura 3D).

Análise da fibrose cardíaca: gráfico de ECG, imagens do tecido cardíaco, lâminas histológicas, gráfico de quantificação da fibrose.
Figura 3: Alterações eletrocardiográficas, anatômicas macroscópicas e histopatológicas após a ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda em camundongos. (A) Eletrocardiogramas representativos (ECGs) registrados imediatamente após a cirurgia nos grupos controle normal (NC) e infarto do miocárdio (MI). (B) Imagens macroscópicas representativas de corações dos grupos NC e MI. Barras de escala = 1 mm. (C) Cortes transversais cardíacos representativos dos grupos NC e MI corados com hematoxilina e eosina (H&E; esquerda), tricrômio de Masson (meio) e vermelho de Sirius (direita). Nas lâminas coradas com tricrômio de Masson, o colágeno aparece azul e o miocárdio vermelho; nas lâminas coradas com vermelho de Sirius, o colágeno aparece vermelho sobre um fundo amarelo. Barras de escala = 1.000 µm. (D) Fração volumétrica de colágeno (CVF), calculada como a área positiva para colágeno dividida pela área total do ventrículo esquerdo e expressa como porcentagem, nos grupos NC e MI. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM); n = 8 camundongos por grupo. A significância estatística em relação ao grupo NC é indicada como **P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

A disfunção funcional cardíaca foi confirmada por ecocardiografia. Imagens representativas em modo M demonstraram redução da contratilidade do ventrículo esquerdo no grupo com infarto do miocárdio (MI) (Figura 4A). A análise quantitativa mostrou fração de ejeção (EF) e fração de encurtamento (FS) significativamente reduzidas no ventrículo esquerdo no grupo MI em comparação com o grupo controle negativo (NC) (Figura 4B,C). O ensaio imunoenzimático (ELISA) demonstrou concentrações séricas significativamente aumentadas de BNP, TNF-α, NF-κB p65 e IL-1β no grupo MI (Figura 4D–G), compatíveis com disfunção cardíaca e resposta inflamatória.

Imagens de ultrassonografia cardíaca com gráficos de barras; níveis de EF, FS, BNP, TNFα, p65, IL-1β nos grupos NC e MI.
Figura 4: Alterações funcionais cardíacas e níveis séricos de biomarcadores após a ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda. (A) Imagens ecocardiográficas representativas no modo M dos grupos controle normal (NC) e infarto do miocárdio (MI). (B) Fração de ejeção do ventrículo esquerdo (EF). (C) Fração de encurtamento do ventrículo esquerdo (FS). (D–G) Concentrações séricas de (D) peptídeo natriurético tipo B (BNP), (E) fator de necrose tumoral-α (TNF-α), (F) fator nuclear-κB p65 (NF-κB p65) e (G) interleucina-1β (IL-1β), medidas por ensaio imunoenzimático (ELISA). EF e FS são expressas em porcentagem; BNP, TNF-α e IL-1β são expressos em pg/mL; e NF-κB p65 é expresso em ng/mL. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM); n = 8 camundongos por grupo. A significância estatística em relação ao grupo NC é indicada como *P < 0,01 e **P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

A imagem de fluorescência tridimensional de corações transparentizados demonstrou o trajeto da ADA abaixo do AIS e mostrou que a ligadura no local anatomicamente definido produziu oclusão coronariana (Figura 5A–F). Em conjunto, esses achados demonstram a indução bem-sucedida de um fenótipo de IM nesta série inicial de oito animais por grupo, caracterizado por disfunção do ventrículo esquerdo, fibrose miocárdica e inflamação sistêmica. O presente estudo foi planejado para estabelecer e demonstrar a viabilidade do modelo de IM guiado pelo AIS, e não para fornecer uma validação abrangente do tamanho da amostra, da estabilidade prolongada do modelo ou da concordância anatômica entre o AIS e a ADA. Assim, esses aspectos são reconhecidos como limitações do presente estudo e são discutidos na seção de Discussão. Especificamente, as avaliações funcionais e bioquímicas foram limitadas à fase aguda após o infarto, e a relação entre o AIS e a ADA foi demonstrada qualitativamente, mas ainda não foi quantificada em uma coorte suficientemente grande.

Imagem de fluorescência da anatomia cardíaca; coloração com DAPI, Azul de Evans; microscopia, análise de estrutura celular.
Figura 5: Imagem de fluorescência tridimensional da vasculatura coronariana murina clareada. Corações inteiros clareados foram marcados com Azul de Evans para visualizar a vasculatura coronariana e com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar os núcleos, seguidos por imagem de fluorescência em folha de luz e reconstrução tridimensional. (A–C) Reconstruções de todo o coração mostrando os canais (A) DAPI, (B) Azul de Evans e (C) canais sobrepostos. Barras de escala = 1.000 µm. (D–F) Ampliações da região da vasculatura coronariana mostrando os canais (D) DAPI, (E) Azul de Evans e (F) canais sobrepostos. Barras de escala = 400 µm. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Nem todo procedimento resulta em um modelo ideal, e o reconhecimento de resultados subótimos é importante para a resolução de problemas. A ligadura posicionada muito proximalmente ou a passagem da agulha muito profundamente pode produzir um infarto excessivamente grande, acompanhado de insuficiência cardíaca grave, arritmia ou ruptura ventricular, levando à mortalidade precoce. Por outro lado, a ligadura posicionada muito distalmente ou de forma muito superficial pode produzir apenas um pequeno infarto ou falhar em induzir a infecção. A indução bem-sucedida do modelo deve, portanto, ser avaliada por meio de múltiplos critérios. Durante a cirurgia, o embranquecimento do miocárdio distal ao local da ligadura fornece um indicador imediato de oclusão coronariana, embora esse achado nem sempre seja facilmente visível. A ecocardiografia pós-operatória e o exame histopatológico fornecem confirmação adicional do estabelecimento bem-sucedido do modelo. Suplementar Figura 1 mostra um modelo representativo mal-sucedido no qual o exame histopatológico demonstra ausência de infiltração evidente por células inflamatórias ou fibrose.

Figura Suplementar 1. Achados histológicos representativos de um modelo de infarto do miocárdio sem sucesso. Cortes transversais representativos do coração de um camundongo no qual a indução do infarto do miocárdio foi sem sucesso, corados com (A) hematoxilina e eosina (H&E), (B) tricrômio de Masson e (C) vermelho de Sirius. Em comparação com a indução bem-sucedida de infarto do miocárdio, esses cortes não mostram infiltração evidente de células inflamatórias nem remodelação fibrotica no miocárdio do ventrículo esquerdo, o que é compatível com oclusão coronariana sem sucesso. Barras de escala = 1.000 µm.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Nos últimos anos, modelos clínicos e experimentais de IM tornaram-se cada vez mais importantes na pesquisa cardiovascular, embora muitas questões sobre a patogênese do IM e estratégias para seu tratamento permaneçam não resolvidas. Este artigo descreve um método aperfeiçoado para estabelecer um modelo murino de IM, no qual várias etapas críticas do procedimento exigem atenção especial. O primeiro passo crítico é a intubação traqueal. Alguns protocolos anteriores estabelecem a via aérea por traqueostomia, o que exige incisão da pele cervical e dissecação dos tecidos para expor a traqueia antes da intubação¹³; outros mantêm a intubação orotraqueal, mas recomendam uma incisão mediana cervical para melhorar a visualização durante o procedimento¹⁴. Em contraste com ambas as abordagens, o presente protocolo utiliza um laringoscópio para iluminar a orofaringe e realiza a intubação orotraqueal com visualização direta da glote, sem incisão cervical. Embora esta abordagem exija maior habilidade técnica do operador, ela evita trauma nos tecidos cervicais, reduz o risco de infecção e dor pós-operatória e encurta o tempo cirúrgico. O erro mais comum durante a intubação é a colocação acidental do tubo no esôfago. Se o tórax não se elevar durante a ventilação e o tubo endotraqueal não apresentar condensação durante a expiração, retire imediatamente o tubo e repita a intubação. Conecte o ventilador somente após confirmar movimento simétrico bilateral da parede torácica.

O segundo e mais crítico passo é a identificação da artéria coronária descendente anterior (LAD) e a colocação precisa da ligadura. Os métodos convencionais enfrentam diversos desafios nesta etapa. A frequência cardíaca em repouso do camundongo é de aproximadamente 500–600 batimentos/min, e a LAD situa-se adjacente a várias veias coronárias acompanhantes, tornando a identificação intraoperatória em tempo real da artéria inerentemente difícil. Além disso, mesmo sob condições ideais, uma proporção considerável das LADs não pode ser claramente visualizada ao microscópio estereoscópico¹⁵. Nesse contexto, protocolos anteriores que estimam o local da ligadura como um ponto 1–2 mm abaixo do apêndice do átrio esquerdo são limitados pela identificação intraoperatória inconsistente dessa referência anatômica¹²^,¹⁴, enquanto o padrão complexo de ramificação da artéria coronária esquerda pode comprometer ainda mais a reprodutibilidade¹⁶. Para superar esses desafios, o presente protocolo utiliza o sulco interventricular anterior (AIS) como marco anatômico para posicionar a ligadura. Ao microscópio estereoscópico, o AIS aparece como um sulco raso na superfície ventral do coração, com a LAD correndo imediatamente abaixo dele. Assim, fornece uma referência anatômica relativamente estável, menos dependente da experiência do operador. Posicionar a ligadura no terço superior do AIS oferece um alvo anatômico consistente para a oclusão coronariana. Os resultados representativos demonstram que essa abordagem produziu com sucesso o fenótipo esperado de infarto agudo do miocárdio nos animais examinados.

O marco anatômico do SAI nem sempre é confiável em todas as circunstâncias. Quando a exposição torácica é limitada ou quando há sangramento epicárdico que obscurece a superfície cardíaca e dificulta a identificação do SAI, limpe suavemente o campo cirúrgico com um cotonete umedecido em solução salina e reavalie o sulco antes da ligadura. Se ainda assim não for possível identificar o SAI com segurança, identifique diretamente a AD como descrito no protocolo e realize a ligadura com visualização direta, em vez de confiar no SAI. Se necessário, confirme o espaço intercostal correto contando caudalmente a partir da primeira costela, para garantir exposição adequada da aurícula esquerda e da parede anterior do ventrículo esquerdo.

Entre as complicações pós-operatórias, o pneumotórax é a mais comum e geralmente se apresenta como desconforto respiratório após a extubação. A chave para prevenir o pneumotórax é a evacuação completa do ar residual da cavidade torácica antes do fechamento do espaço intercostal. Se houver suspeita de pneumotórax, reanestesie brevemente e ventile o camundongo, reabra os pontos da pele e inspecione o fechamento intercostal. Se um ou mais locais de fechamento incompleto forem identificados, aplique pontos adicionais no local do vazamento de ar antes de repetir o procedimento de extubação. Outra complicação potencial é o sangramento intraoperatório, que ocorre mais comumente quando a agulha perfura um pequeno vaso epicárdico ou uma veia coronária adjacente durante a ligadura. O sangramento é geralmente limitado e pode ser controlado aplicando-se leve pressão com um cotonete umedecido em solução salina por alguns segundos. Antes de fechar a cavidade torácica, confirme que não há sangramento ativo no campo cirúrgico para minimizar complicações pós-operatórias. Além disso, os camundongos podem desenvolver arritmias, incluindo contrações ventriculares prematuras ou fibrilação ventricular transitória, durante ou imediatamente após o procedimento. Essas arritmias são frequentemente aliviadas pela manutenção da temperatura corporal, estabilização da profundidade da anestesia e pausa temporária do procedimento para permitir a recuperação espontânea do ritmo cardíaco. Por fim, complicações anestésicas ocorrem mais comumente quando não se reduz imediatamente a concentração de isoflurano após a intubação traqueal bem-sucedida. Reduza a concentração de isoflurano ao nível de manutenção imediatamente após conectar o tubo endotraqueal ao ventilador e monitore continuamente a respiração e a frequência cardíaca durante todo o procedimento.

No geral, este método exige habilidade microcirúrgica substancial e, como outros modelos de ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior (LAD), permanece sujeito à variabilidade decorrente de diferenças anatômicas coronarianas e da experiência do operador. Contudo, com treinamento adequado e técnica cirúrgica consistente, os pesquisadores podem estabelecer o modelo de infarto do miocárdio com razoável consistência, ao mesmo tempo que melhoram a reprodutibilidade do procedimento e a sobrevida pós-operatória.

Várias limitações deste método devem ser reconhecidas. Primeiramente, as avaliações funcionais e bioquímicas foram realizadas dentro de uma semana após a indução do infarto do miocárdio (MI) e, portanto, refletem apenas a fase aguda do MI, sem avaliação sistemática dos desfechos de longo prazo, como o remodelamento ventricular entre 4 e 8 semanas após a cirurgia. Em segundo lugar, como em outros modelos de infarto por ligadura permanente que utilizam suturas não absorvíveis, este protocolo pode resultar em aderências pericárdicas crônicas. Isso representa uma característica inerente ao modelo de ligadura, e não uma limitação específica da abordagem guiada pelo AIS. Contudo, a gravidade dessas aderências e seus efeitos na função cardíaca de longo prazo não foram quantificados no presente estudo. Estudos futuros poderiam investigar o uso de suturas absorvíveis e avaliar seus efeitos na formação de aderências e no desempenho do modelo. Terceiro, embora a imagem coronariana tridimensional tenha demonstrado qualitativamente que a artéria interventricular anterior (LAD) percorre abaixo do AIS, a concordância anatômica entre essas estruturas ainda não foi quantificada em uma coorte suficientemente grande. Quarto, este estudo incluiu apenas camundongos machos da linhagem C57BL/6J. Embora se espere que o AIS represente um marco anatômico consistente, sua aplicabilidade em camundongos fêmeas, em outras linhagens de camundongos e em outras espécies requer validação adicional. Por fim, as vantagens potenciais deste protocolo em relação à consistência do local de ligadura e à reprodutibilidade do procedimento baseiam-se na experiência de um único laboratório e não foram avaliadas em comparação direta com métodos convencionais de ligadura da LAD ou entre múltiplos operadores e instituições. Assim, estudos adicionais de validação serão necessários para estabelecer a generalização mais ampla do método.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (números 2026NSFSC1823 e 2022YFS0618), do Projeto da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan (Escritório da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan número 7 [2024]), do Projeto da Sociedade de Sichuan de Medicina Integrada Chinesa e Ocidental (número ZXY2025019) e do Projeto da Universidade Médica do Sudoeste (números do subsídio 2023ZYYQ04 e 2023ZYYQ17).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina estéril a 0,9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	-	Reconstituição da cefazolina
Agarose a 3%	Sigma-Aldrich	A0169	Embutimento de amostras
Paraformaldeído a 4%	Sigma-Aldrich	158127	Fixação de tecidos
Etanol absoluto	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0170A	Desidratação de tecidos; inflamável
Fucsina ácida	Aladdin	A104916-100g	Preparação da solução de Ponceau–fucsina ácida para coloração tricrômica de Masson
Software AcqKnowledge	BIOPAC Systems	AcqKnowledge 4.0	Aquisição e análise de eletrocardiograma
Solução de amônia, aquosa a 0,5%	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.2528A	Reação de azularização durante a coloração com hematoxilina e eosina
Alizarina azul, solúvel em ácido	Aladdin	A111200-100g	Preparação da solução de alizarina azul para coloração tricrômica de Masson
Luvas médicas assépticas	Nanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.	-	Proteção química e biológica
Buprenorfina	Qinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.	H10940181	Analgesia pós-operatória
Cefazolina sódica para injeção	CSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.	-	Profilaxia antibiótica perioperatória
Cotonetes	Shijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.	-	Limpeza epicárdica e preparo asséptico
Solução corante DAPI	Thermo Fisher	D1306	Marcação nuclear
Creme depilatório	Veet	-	Remoção de pelos torácicos
Scanner digital de lâminas	3DHISTECH	Pannoramic MIDI II	Imagem de lâmina inteira
Amplificador de ECG	BIOPAC Systems	ECG100C	Amplificação de eletrocardiograma
Sistema de registro de eletrocardiograma	BIOPAC Systems	MP160	Registro de eletrocardiograma
Kit ELISA, peptídeo natriurético tipo B de camundongo	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RXW202726M	Quantificação sérica de BNP
Kit ELISA, interleucina-1β de camundongo	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX203063M	Quantificação sérica de IL-1β
Kit ELISA, fator nuclear-κB p65 de camundongo	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX201879M	Quantificação sérica de NF-κB p65
Kit ELISA, fator de necrose tumoral-α de camundongo	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX202412M	Quantificação sérica de TNF-α
Cassetes de embutimento	Jiangsu Shitai	22022	Embutimento de tecidos
Cateter endotraqueal, 20 G	Shenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.	B11103	Intubação oral; diâmetro externo aproximadamente 0,9–1,0 mm; cortado para aproximadamente 15 mm antes do uso
Eosina Y, solúvel em álcool	Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.	Y0310-100G	Contracoloração citoplasmática durante a coloração com hematoxilina e eosina
Azul de Evans	Jarvisbio	A312001	Marcação da vasculatura coronariana
Pinça fina	RWD Life Science	F12011-10	Manuseio de tecidos e abertura do pericárdio
Pinça fina microcirúrgica	RWD Life Science	FC12002T-08	Manuseio microcirúrgico de tecidos
Tesoura fina	RWD Life Science	S12000-09	Tesoura oftálmica para incisão e dissecação da pele
Ácido acético glacial	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	-	Preparação de ácido acético a 1% para diferenciação na coloração tricrômica de Masson
Lâminas de vidro	Jiangsu Shitai	80312/80302	Montagem de cortes
Esterilizador de contas de vidro	RWD Life Science	RS3002	Esterilização de instrumentos entre animais
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	Versão 5.0	Análise estatística
Manta térmica	RWD Life Science	69020	Termorregulação pós-operatória
Solução corante de hematoxilina	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Coloração nuclear durante a coloração com hematoxilina e eosina
Anticorpo de detecção conjugado à peroxidase do rabanete	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluso nos kits ELISA	Detecção em ELISA
Ácido clorídrico	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.1337A	Preparação de álcool ácido para diferenciação da hematoxilina
Software Image-Pro Plus	Media Cybernetics	Versão 6.0	Quantificação da fração de volume de colágeno
Software Imaris	Bitplane	Versão 7.2.3	Reconstrução e análise tridimensionais
Isóflurano	RWD Life Science	R510-22-10	Anestésico inalatório
Sistema de anestesia com isóflurano	RWD Life Science	TAIJI-IE	Administração de isóflurano
Laringoscópio para pequenos animais	Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.	SR310-MR	Visualização direta durante a intubação
Microscópio de folha de luz com fluorescência	Light Innovation Technology	LiToneXL	Imagem de fluorescência tridimensional
Software LitScan	Light Innovation Technology	Versão 3.31	Empalhamento e conversão de imagens
Respirador mecânico	Chengdu Taimeng Software Co., Ltd.	HX-101E	Ventilação mecânica; 130 respirações/min; volume corrente de 2 mL
Hemostato microcirúrgico tipo mosquito	RWD Life Science	FC21001R-12	Fixação da agulha durante ligadura e fechamento
Seringa microlitro	Shanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.	-	Injeção localizada de DAPI
Leitor de microplacas	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax iD5	Medição da densidade óptica em 450 nm
Microscópio estereoscópico	Maishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.	MSD204	Visualização intraoperatória
Microscópio de luz ereto	Leica	DM500	Imagem histológica
Lâminas de micrótomo	Epredia	MX35 ULTRA	Corte de parafina
Kit de coloração com Sirius Red modificado	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1078	Coloração de colágeno; inclui as Soluções A, B e C
n-Butanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0886A	Desidratação e clarificação histológica; inflamável
Resina de montagem neutra	Shanghai Yiyang	YSQN41-91	Montagem de lâminas
Sutura de náilon, 3/8 de círculo 7-0 com agulha	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda
Sutura de náilon, 5-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Fechamento torácico e da pele
Sutura de náilon, 6-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Exposição e tração da parede torácica
Estação de embutimento em parafina	Wuhan Junjie Electronics	JB-L5	Embutimento de tecidos
Parafina	NA	NA	Infiltração e embutimento de tecidos
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich	P3813	Lavagem de tecidos e diluição de reagentes
Ácido fosfomolíbdico	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.	-	Diferenciação na coloração tricrômica de Masson
Ponceau 2R	Aladdin	P104989-25g	Preparação da solução de Ponceau–fucsina ácida para coloração tricrômica de Masson
Dicromato de potássio	Zhengzhou Paini Chemical Reagent Factory	7778-50-9	Mordente na coloração tricrômica de Masson
Povidona–iode	SingleLady	GB26368-2010	Desinfecção da pele
Água de osmose reversa	Purificada em laboratório	Não aplicável	Preparação de soluções
Micrótomo rotativo	Leica Instruments (Shanghai)	RM2016	Corte de parafina
Adaptador do suporte de amostras	Light Innovation Technology	Fornecido com LiToneXL	Montagem de amostras clarificadas para imagem de folha de luz
Fita adesiva para pele	Qingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.	-	Fixação de membros e cauda
Cobrelâminas	Jiangsu Shitai	80340-1630	Aplicação de cobrelâminas
Estufa para lâminas	Shaoxing Luyue	101-3B	Secagem de lâminas
Solução de parada	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluso nos kits ELISA	Encerramento da reação em ELISA
Soluções substrato A e B	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluso nos kits ELISA	Desenvolvimento da cor em ELISA
Banho flutuador de tecidos	Wuhan Junjie Electronics	JK-5/6	Flutuação de cortes
Processador de tecidos	Wuhan Junjie Electronics	JT-12S	Processamento automatizado de tecidos
Kit de clarificação de tecidos, Reagentes A–F	Jarvisbio	JA11012	Clarificação de tecidos baseada em solvente
Plataforma para intubação traqueal	RWD Life Science	Re20-M	Posicionamento para intubação oral
Software de análise de ultrassom	Fujifilm VisualSonics	VevoLAB 3.2.6	Análise de dados de ecocardiografia
Gel de ultrassom	Tianjin Jinya Electronics Co., Ltd.	TM-100	Acoplamento ecocardiográfico
Sistema de imagem por ultrassom	Fujifilm VisualSonics	Vevo 3100	Ecocardiografia
Retrador palpebral em forma de V	Suqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.	SS5009G	Retração intercostal e das costelas
Tampão de lavagem	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluso nos kits ELISA	Lavagem de placas em ELISA
Sistema de purificação de água	Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.	UPT-II-20T	Produção de água de osmose reversa
Xilol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0586A	Clarificação de tecidos e desparafinização; inflamável e neurotóxico

Referências

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