O miR-488-3p pode atuar como um novo marcador diagnóstico não invasivo para AR. O miR-488-3p modula a função biológica das sinoviócitos por meio de ROCK1. Ele exibiu uma correlação negativa significativa com a gravidade da doença em pacientes com AR.
Artigo de investigação
A Expressão Sérica de Mir-488-3p Serve como um Biomarcador Diagnóstico Não Invasivo em Pacientes com Artrite Reumatoide
Neste artigo
Resumo
Resumo
O diagnóstico da artrite reumatoide (AR) permanece desafiador devido às limitações dos biomarcadores existentes. O objetivo do estudo foi investigar o potencial do miR-488-3p no soro como biomarcador para AR e revelar seu mecanismo de ação potencial. O estudo incluiu 135 pacientes com AR, 130 pacientes com osteoartrite (OA) e 125 controles saudáveis. Os níveis de expressão do miR-488-3p foram examinados por RT-qPCR. O mecanismo de ação foi analisado por testes funcionais (CCK-8, citometria de fluxo, ELISA) e experimentos de validação de alvo (gene repórter de luciferase, RIP). Os níveis séricos de expressão do miR-488-3p foram significativamente mais baixos em pacientes com AR do que em pacientes com osteoartrite (OA) e controles saudáveis (p < 0,001). A análise da curva ROC mostrou que o miR-488-3p apresentou alta precisão diagnóstica para distinguir AR de controles saudáveis e pacientes com OA. O miR-488-3p apresentou correlação negativa com a taxa de sedimentação eritrocitária (VHS), proteína C-reativa (PCR), fator reumatoide (FR) e escores DAS28. A validação funcional revelou que a superexpressão do miR-488-3p inibiu a proliferação e a resposta inflamatória de sinoviócitos, ao mesmo tempo que induziu apoptose. Estudos mecanicistas mostraram que o miR-488-3p pode direcionar diretamente a proteína quinase 1 associada à Rho com domínio em coil-coil (ROCK1), que media seus efeitos protetores. O miR-488-3p sérico é promissor como um novo marcador diagnóstico não invasivo para AR e protege os sinoviócitos contra lesões.
Introdução
A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune comum caracterizada por inflamação sinovial, erosão articular e destruição1,2. A prevalência global da AR é de cerca de 0,5%–1%3, o que afeta seriamente a qualidade de vida dos pacientes e sua capacidade de trabalhar. A doença tem início insidioso, e os sintomas iniciais são frequentemente atípicos, podendo ser facilmente mal diagnosticados ou ignorados4. Conforme a doença progride, pode levar a deformidades articulares, perda de função e até aumentar o risco de complicações, como doenças cardiovasculares5, impondo um peso substancial aos pacientes, suas famílias e aos sistemas de saúde.
Atualmente, é necessário um conjunto de sintomas clínicos, sinais, exames laboratoriais e avaliação por imagem para o diagnóstico da AR6. Os indicadores laboratoriais mais utilizados incluem a taxa de sedimentação eritrocítica (VHS) e a proteína C-reativa (PCR), que são marcadores inespecíficos de inflamação sistêmica, além do fator reumatoide (FR) e os anticorpos anti-peptídeo citrulinado cíclico (anti-CCP), que são importantes biomarcadores sorológicos para a AR7,8. No entanto, esses biomarcadores tradicionais apresentam limitações: o FR pode ser positivo em algumas pessoas saudáveis e em pacientes com outras doenças autoimunes (taxa de falso-positivo de cerca de 5%); o anti-CCP, embora altamente específico (>95%), possui sensibilidade limitada nos estágios iniciais da doença (cerca de 60–70%)4,9, e alguns pacientes com AR permanecem soronegativos10. Portanto, é importante identificar biomarcadores mais sensíveis e específicos para o diagnóstico precoce, monitoramento da doença e avaliação do prognóstico da AR11.
MicroRNAs (miRNAs) são um grupo de moléculas de RNA reguladoras não codificantes endógenas com aproximadamente 22–25 bases de comprimento12,13. Verificou-se que os miRNAs atuam como reguladores-chave no desenvolvimento de diversas doenças, e sua expressão aberrante está estreitamente relacionada à patogênese dessas doenças13,14,15, tornando os miRNAs biomarcadores promissores para o diagnóstico de doenças e monitoramento terapêutico. Nos últimos anos, o papel dos miRNAs na artrite reumatoide (RA) tem recebido crescente atenção16. Estudos demonstraram que múltiplos miRNAs estão associados à expressão desregulada (por exemplo, miR-146a, miR-155, etc.) no soro, tecidos sinoviais e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes com RA17,18,19. Esses miRNAs contribuem para a patogênese da RA ao regular a produção de citocinas inflamatórias, promover a proliferação e invasão de células sinoviais e influenciar a diferenciação de osteoclastos20. Dentre eles, o miR-488 está localizado na região 1q25.2 do cromossomo humano21, e estudos anteriores confirmaram seus efeitos neuroprotetores: ele exerce um papel regulador na progressão de gliomas22 e neuroblastomas23, e, notavelmente, o miR-488-3p promove a apoptose de condrocitos osteoartríticos na osteoartrite (OA)24. Embora OA e RA sejam doenças articulares diferentes, compartilham mecanismos comuns nos processos patológicos de inflamação sinovial e destruição da cartilagem25. Nós formulamos a hipótese de que o miR-488-3p possa desempenhar um papel na RA ao regular vias-alvo semelhantes. No entanto, o papel específico e os mecanismos potenciais do miR-488-3p na RA ainda não foram elucidados.
O estudo investigou as alterações nos níveis de expressão sérica de miR-488-3p em pacientes com AR e sua relação com a atividade da doença e indicadores clínicos, com o objetivo de avaliar seu valor potencial como marcador diagnóstico não invasivo para AR. Este estudo fornece uma nova perspectiva sobre o rastreamento precoce e a predição da progressão da doença na AR, melhorando, assim, o prognóstico dos pacientes com AR.
Protocolo
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Hefei BOE (número de aprovação 2021–1), e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da inscrição.
Pacientes e espécimes
Este estudo recrutou 135 pacientes com AR (diagnosticada de acordo com os critérios de classificação ACR/EULAR de 2010) do Departamento de Reumatologia e Imunologia do Hospital Hefei BOE, 130 pacientes com OA do Departamento de Ortopedia (diagnosticados de acordo com os critérios diagnósticos de OA da Associação Médica Chinesa de 2018) e 125 controles saudáveis pareados por idade e sexo do centro de exames médicos do mesmo hospital. Os participantes tinham idade entre 30 e 80 anos. Os controles saudáveis foram confirmados como livres de doenças autoimunes, distúrbios articulares e infecções agudas mediante revisão abrangente do histórico clínico, exame físico e testes laboratoriais. Foram excluídos participantes com doenças autoimunes concomitantes, histórico de infecção ou trauma nos últimos 3 meses, neoplasias ou que estivessem grávidas ou em período de lactação.
Coleta e preparação
Sangue venoso em jejum foi coletado de todos os participantes do estudo. Após a coagulação à temperatura ambiente por 30 min, as amostras de soro foram isoladas por centrifugação a 1500 × g por 15 min. O soro foi armazenado a -80°C até a análise posterior.
Detecção de marcadores clínicos e sorológicos
Para avaliar de forma abrangente o estado da doença e a atividade inflamatória, biomarcadores clínicos e sorológicos foram medidos utilizando métodos laboratoriais clínicos padronizados. A VHS foi medida pelo método de Westergren para avaliar a inflamação sistêmica inespecífica. A PCR foi quantificada por meio de um ensaio imunoturbidimétrico (valor de referência normal: <10 mg/L) para avaliar a resposta inflamatória de fase aguda. O FR foi medido por ensaio imunoenzimático (ELISA), com valor de referência normal de ≤20 UI/mL. Os anticorpos anti-CCP foram medidos por meio de um ELISA de segunda geração para fornecer evidência sorológica para o diagnóstico de AR.
Linhas celulares e cultivo
As células de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos humanos afetados por AR (HFLS-RA) foram cultivadas em meio mínimo essencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram mantidas em incubadora a 37 °C com 5% de CO₂, e foram utilizadas células entre a terceira e a sexta passagem para todos os experimentos.
Extração de RNA e RT-PCR quantitativa em tempo real
O RNA total foi extraído de amostras de soro utilizando um reagente de extração de RNA. A transcrição reversa foi realizada utilizando um kit de síntese de primeira fita para miRNAs e um kit de transcrição reversa para genes-alvo de RNA mensageiro (mRNA), conforme as instruções do fabricante. A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) foi realizada utilizando um sistema de PCR em tempo real com uma mistura mestra de PCR baseada em SYBR Green. O programa termociclante foi definido para desnaturação prévia a 95 °C por 30 s; seguido por 40 ciclos de amplificação (desnaturação a 95 °C por 5 s e pareamento/alongamento a 60 °C por 30 s). Cada amostra foi analisada em triplicata. O RNA nuclear pequeno U6 (U6 snRNA) e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foram utilizados como genes de referência endógenos para normalização de miRNA e mRNA, respectivamente. As sequências dos iniciadores foram resumidas na Tabela Suplementar 1. Os níveis relativos de expressão de miR-488-3p e seus genes-alvo foram calculados utilizando o método 2−ΔΔCt. As alterações nos níveis de mRNA dos genes-alvo após superexpressão ou inibição de miR-488-3p também foram analisadas para verificar suas relações regulatórias.
Transfeção de células
Células HFLS-RA foram semeadas em placas de 6 poços com uma densidade de 5 × 105 células/poço. As células foram transfectadas utilizando um reagente de transfeção baseado em lipossomos, conforme as instruções do fabricante. Os grupos de transfeção incluíram grupos de transfeção única e de co-transfeção. Os grupos de transfeção única foram: 1) controle—células não transfectadas; 2) controle negativo do miR (NC)—células transfectadas com o controle negativo do miR-488-3p; 3) miR-488-3p—células transfectadas com o miR-488-3p; 4) controle negativo do inibidor (inibidor NC)—células transfectadas com o controle negativo do inibidor de miR-488-3p; 5) inibidor de miR-488-3p—células transfectadas com o inibidor de miR-488-3p. Os grupos de co-transfeção foram: 1) miR-488-3p + controle de superexpressão (oe-NC)—células co-transfectadas com o miR-488-3p e o controle negativo dos vetores de superexpressão de ROCK1; 2) miR-488-3p + oe-ROCK1—células co-transfectadas com o miR-488-3p e vetores de superexpressão de ROCK1. Todas as sequências de transfeção foram resumidas na Tabela Suplementar 1. O vetor de superexpressão de ROCK1 foi construído pela clonagem da região de sequência codificante (CDS) no plasmídeo pcDNA 3.1. As células transfectadas estiveram disponíveis para os experimentos subsequentes após 48 h de transfeção celular.
Ensaio de função celular
Ensaio de proliferação celular (Kit de contagem de células-8 [CCK-8]): Células HFLS-RA transfectadas foram inoculadas em placas de 96 poços a 5 × 103 células/poço, com três poços replicados por grupo. Após 0, 24, 48 e 72 h da transfeção, adicionou-se 10 µL da solução CCK-8 a cada poço, seguido de incubação a 37 °C por 2 h. A absorbância foi medida a 450 nm (comprimento de onda de detecção) e 630 nm (comprimento de onda de referência) utilizando um leitor de microplacas. A taxa relativa de proliferação foi calculada utilizando o tempo de 0 h como linha de base.
Detecção de apoptose (citometria de fluxo): A apoptose foi avaliada por meio de análise com o ensaio de apoptose Annexina V-fluoresceína isotiocianato (FITC)/iodeto de propídio (PI). As células foram transfectadas com os plasmídeos apropriados e, em seguida, coletadas após a tripsinização. A taxa de apoptose foi determinada por citometria de fluxo.
Dosagem de fator inflamatório (ensaio imunoenzimático [ELISA]): Células HFLS-RA foram semeadas em placas de 24 poços e transfectadas com o mimetizador de miR-488-3p, inibidor de miR-488-3p ou seus controles negativos correspondentes por 48 h. As concentrações de interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β) nos sobrenadantes do cultivo celular foram quantificadas utilizando kits de ELISA.
Validação do alvo
Previsão de alvo: previu-se que ROCK1 fosse um alvo a jusante do miR-488-3p utilizando o banco de dados TargetScan26. Também foram identificados os sítios de ligação previstos entre o miR-488-3p e a região não traduzida 3′ (3′UTR) de ROCK1.
Ensaio de Gene Repórter Dual-Luciferase: A região 3′UTR selvagem ou mutante de ROCK1 foi clonada no plasmídeo pGL3. Os locais de ligação previstos e os locais mutantes são mostrados na Figura 4. Células HEK-293T foram co-transfectadas com o análogo de miR-488-3p ou com inibidor juntamente com os vetores construídos27. A atividade de luciferase foi medida 48 h após a transfeção com o análogo ou inibidor de miR-488-3p.
Imunoprecipitação de RNA (RIP): Células HFLS-RA foram incubadas com um anticorpo anti-Argonauta 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, diluição 1:200) ou com um anticorpo controle de imunoglobulina G (IgG) (RRID: AB_2819160, diluição 1:5000), seguido pela extração de RNA e PCR quantitativa (qPCR) para enriquecimento de mRNA de ROCK1 conforme descrito acima.
Análise estatística
O estudo foi analisado estatisticamente utilizando o SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) e o GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Todos os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas, e cada réplica biológica foi analisada em triplicata. Os dados brutos foram anexados no material suplementar. Os dados foram avaliados por meio de um gráfico de probabilidade normal (P-P) antes dos testes estatísticos paramétricos. O teste t para amostras independentes foi utilizado para comparar as variáveis contínuas de linha de base (por exemplo, idade, índice de massa corporal [IMC], etc.) e o teste qui-quadrado foi utilizado para as variáveis categóricas (por exemplo, sexo, etc.). Os níveis de expressão gênica foram comparados utilizando o teste t para amostras independentes. As alterações na proliferação celular em diferentes momentos foram analisadas por meio de análise de variância de medidas repetidas (ANOVA), enquanto a ANOVA de um fator foi utilizada para comparar as taxas de apoptose determinadas por citometria de fluxo. A análise de correlação foi realizada utilizando o coeficiente de Spearman (para variáveis que não seguem distribuição normal) e o coeficiente de Pearson (para variáveis que seguem distribuição normal). O desempenho diagnóstico foi avaliado por meio da análise da curva característica de operação do receptor (ROC). O valor de corte ótimo, sensibilidade e especificidade foram determinados utilizando o índice de Youden máximo. Todos os testes estatísticos foram bicaudais, e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Características básicas dos participantes do estudo
Este estudo incluiu 125 controles saudáveis, 130 pacientes com OA e 135 pacientes com RA para análise sistemática (Tabela 1). Não houve diferenças significativas nas características basais dos três grupos quanto à idade (p = 0,191), razão entre os sexos (p = 0,203) e IMC (p = 0,562), o que garantiu a comparabilidade da população estudada. Em relação às características da doença, a VHS (82,63 ± 40,32 versus 18,39 ± 6,38 mm/h, p < 0,001) e os níveis de PCR (56,33 ± 38,07 versus 10,54 ± 4,98 mg/L, p < 0,001) no grupo com RA foram significativamente mais altos do que no grupo com OA, refletindo o nível de inflamação sistêmica. Enquanto isso, o FR, um marcador sorológico associado à RA, foi positivo em 70,37% (95/135), com concentração sérica significativamente maior (144,13 ± 81,05 versus 5,10 ± 1,37 UI/mL, p < 0,001); e a taxa de positividade para anti-CCP em pacientes com RA foi de 56,30% (76/135), com escore DAS28 de 4,12 ± 1,36.
Características de expressão e valor diagnóstico do miR-488-3p em pacientes com AR
Os níveis séricos de expressão de miR-488-3p foram significativamente reduzidos em pacientes com AR em comparação com pacientes com OA e controles saudáveis (p < 0,0001, Figura 1A). A análise da curva ROC mostrou que o miR-488-3p apresentou alta precisão diagnóstica para distinguir AR de OA e controles saudáveis: ao distinguir AR de controles saudáveis, obteve um valor de AUC de 0,931 (IC 95%: 0,896–0,967), sensibilidade de 96,15% (IC 95%: 91,31%–98,35%) e especificidade de 80,95% (IC 95%: 73,22%–86,85%, p < 0,001, Figura 1B); e ao distinguir AR de pacientes com OA, o valor de AUC foi de 0,800 (IC 95%: 0,747–0,854), com sensibilidade de 85,93% (IC 95%: 79,06%–90,80%) e especificidade de 66,15% (IC 95%: 57,66%–73,72%, p < 0,001, Figura 1C). A análise de regressão logística multivariável identificou o miR-488-3p como um fator independente associado ao risco de AR (OR = 0,166, IC 95%: 0,097–0,284; Tabela 2).
Análise de correlação de miR-488-3p com indicadores clínicos de AR
Os níveis de expressão sérica de miR-488-3p apresentaram correlação negativa significativa com indicadores clínicos-chave da AR, incluindo VHS, PCR, FR e DAS28 (todos p < 0,001; Tabela 3). Especificamente, o miR-488-3p apresentou correlação negativa com VHS (r = −0,718), PCR (r = −0,726), FR (r = −0,805) e escore DAS28 (r = −0,836) (Tabela 3).
A superexpressão de miR-488-3p inibe a proliferação celular e as respostas inflamatórias e induz a apoptose em células HFLS-RA
Para investigar o efeito do miR-488-3p na função de HFLS-RA, modulamos sua expressão por meio de transfeção com mimetizadores e inibidores. A análise de RT-qPCR confirmou que o nível de expressão do miR-488-3p foi significativamente maior no grupo com mimetizador de miR-488-3p em comparação com o grupo controle (p = 0,0001), enquanto o nível de expressão no grupo com inibidor de miR-488-3p foi significativamente menor (p = 0,0003, Figura 2A). O ensaio CCK-8 mostrou que a superexpressão do miR-488-3p inibiu a proliferação celular, que foi significativamente menor do que no grupo controle em 24 h, 48 h e 72 h (p = 0,0208, p < 0,0001, p = 0,0036), e que a inibição da expressão do miR-488-3p aumentou significativamente a proliferação celular (Figura 2B). A citometria de fluxo mostrou que a superexpressão do miR-488-3p promoveu significativamente a apoptose (p = 0,0033, Figura 2C).
Em seguida, realizamos um ELISA para investigar o efeito do aumento da expressão de miR-488-3p sobre os níveis de citocinas inflamatórias. Os resultados mostraram que, quando o miR-488-3p foi superexpresso, os níveis de citocinas inflamatórias (IL-6, TNF-α e IL-1β) foram significativamente reduzidos (p < 0,0001, Figura 3A-C), enquanto a inibição da expressão de miR-488-3p produziu o efeito oposto. Esses efeitos regulatórios significativos foram verificados em todos os três experimentos biológicos independentes, e os controles negativos não mostraram alterações significativas (p > 0,05).
MiR-488-3p regula a expressão de moléculas ROCK1
Para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes ao papel do miR-488-3p na progressão da doença RA, exploramos os alvos downstream do miR-488-3p. Análises bioinformáticas mostraram que o miR-488-3p foi predito para se ligar à região 3'UTR do ROCK1 (Figura 4A). O ensaio de repórter de luciferase dual confirmou que a atividade de luciferase foi significativamente reduzida quando a 3'UTR selvagem do ROCK1 foi co-transfectada com miméticos do miR-488-3p (p < 0,0001), e a atividade de luciferase foi significativamente aumentada quando a expressão do miR-488-3p foi inibida (p < 0,0001); enquanto não houve alteração significativa nesse efeito regulatório após a mutação do sítio de ligação (Figura 4B). Experimentos de RIP confirmaram ainda mais essa relação regulatória, mostrando que o nível de expressão do mRNA do ROCK1 foi significativamente elevado nos complexos enriquecidos com anticorpo Ago2 em comparação aos controles IgG (p < 0,0001, Figura 4C).
Além disso, em amostras clínicas, o ROCK1 apresentou um padrão de expressão oposto ao do miR-488-3p, no qual observou-se uma superexpressão significativa do ROCK1 em relação aos pacientes com OA e aos controles saudáveis (Figura 4D). Em células HFLS-RA, a RT-qPCR revelou que a superexpressão do miR-488-3p resultou em uma diminuição significativa da expressão do ROCK1 (p = 0,0093), enquanto a inibição do miR-488-3p aumentou significativamente a expressão do ROCK1 (p = 0,0003, Figura 4E).
ROCK1 media os efeitos regulatórios do miR-488-3p em células HFLS-RA
Em células HFLS-RA, a supressão da expressão de ROCK1 pela superexpressão de miR-488-3p foi revertida pela transfeção com vetores de superexpressão de ROCK1 (Figura 5A). Da mesma forma, o efeito inibitório da superexpressão de miR-488-3p sobre a proliferação celular foi atenuado pela superexpressão de ROCK1 (Figura 5B). Além disso, a superexpressão de ROCK1 também reverteu o aumento da apoptose induzido por miR-488-3p (Figura 5C) e restaurou os níveis de citocinas inflamatórias que haviam sido suprimidos pela superexpressão de miR-488-3p (Figura 5D).
Figura 1. Níveis de expressão e desempenho diagnóstico do miR-488-3p em pacientes com artrite reumatoide (AR), osteoartrite (OA) e controles saudáveis. (A) Comparação dos níveis relativos de expressão do miR-488-3p em pacientes com AR, pacientes com OA e controles saudáveis. (B) Análise da curva característica de operação do receptor (ROC) do miR-488-3p para distinguir AR de controles saudáveis. (C) Análise da curva ROC do miR-488-3p para distinguir AR de pacientes com OA. AUC, área sob a curva; CI, intervalo de confiança. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2. Efeitos funcionais do miR-488-3p em células HFLS-RA. (A) Expressão relativa do miR-488-3p em células HFLS-RA transfectadas determinada por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR). (B) Efeitos da superexpressão e inibição do miR-488-3p na proliferação celular. (C) Efeitos da superexpressão e inibição do miR-488-3p na apoptose. Os dados são apresentados como média ± DP. Todas as medições foram realizadas com três réplicas biológicas, cada uma com três réplicas técnicas. p < 0,05 indica uma diferença estatisticamente significativa entre os grupos indicados. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3. Efeito do miR-488-3p na secreção de citocinas inflamatórias. (A) Interleucina-6 (IL-6). (B) Fator de necrose tumoral-α (TNF-α). (C) Interleucina-1β (IL-1β). As concentrações de citocinas foram medidas por ensaio imunoenzimático (ELISA). Os dados são apresentados como média ± DP. Todas as medições foram realizadas com três repetições biológicas, cada uma com três repetições técnicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4. Validação do mecanismo molecular subjacente à regulação direcionada do ROCK1 pelo miR-488-3p. (A) Local de ligação previsto do miR-488-3p dentro da região não traduzida 3′ (3′UTR) do ROCK1. (B) Ensaio de repórter de dupla luciferase demonstrando a interação entre o miR-488-3p e a 3′UTR selvagem ou mutante do ROCK1. (C) Ensaio de imunoprecipitação de RNA (RIP) mostrando o enriquecimento de RNA mensageiro (mRNA) do ROCK1 em complexos enriquecidos com anticorpo contra Argonauta 2 (Ago2). (D) Níveis relativos de expressão do ROCK1 em pacientes com AR, pacientes com OA e controles saudáveis. (E) Expressão relativa do ROCK1 em células HFLS-RA transfectadas determinada por reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR). Os dados são apresentados como média ± DP. Todas as medições foram realizadas com três réplicas biológicas, cada uma com três réplicas técnicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5. Envolvimento de ROCK1 na regulação de células HFLS-RA por miR-488-3p. (A) Regulação da expressão de ROCK1 em células HFLS-RA após transfeção celular. (B) Efeitos da superexpressão de ROCK1 na proliferação celular sob superexpressão de miR-488-3p. (C) Efeitos da superexpressão de ROCK1 na apoptose sob superexpressão de miR-488-3p. (D) Efeitos da superexpressão de ROCK1 na produção de citocinas inflamatórias sob superexpressão de miR-488-3p. Os dados são apresentados como média ± DP. Todas as medições foram realizadas com três réplicas biológicas, cada uma com três réplicas técnicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Variável | Controle (n = 125) | OA (n = 130) | RA (n = 135) | p-valor |
| Idade (anos) | 55,10 ± 9,30 | 57,21 ± 10,27 | 55,22 ± 11,61 | 0,191 |
| Sexo (masculino/feminino) | 74/51 | 63/67 | 69/66 | 0,203 |
| IMC (kg/m2) | 22,79 ± 1,73 | 22,98 ± 1,98 | 23,04 ± 2,05 | 0,562 |
| Duração da doença (anos) | - | 7,96 ± 4,00 | 8,03 ± 3,83 | 0,882 |
| Anti-CCP positivo (n/%) | - | - | 76 (56,30) | - |
| VS (mm/h) | 18,39 ± 6,38 | 82,63 ± 40,32 | <0,001 | |
| PCR (mg/L) | 10,54 ± 4,98 | 56,33 ± 38,07 | <0,001 | |
| Fator reumatoide positivo | - | - | 95 (70,37) | |
| FR (UI/mL) | - | 5,10 ± 1,37 | 144,13 ± 81,05 | <0,001 |
| DAS28 | - | - | 4,12 ± 1,36 | - |
Tabela 1: Características basais dos participantes do estudo. Os três grupos do estudo foram comparáveis em relação às características demográficas. Pacientes com AR apresentaram marcadores inflamatórios e níveis de FR elevados.
| Variável | OR | 95%CI | p-valor |
| Idade (anos) | 1.411 | 0.822–2.422 | 0.211 |
| Sexo (masculino/feminino) | 1.209 | 0.707–2.067 | 0.489 |
| IMC (kg/m2) | 1.336 | 0.778–2.295 | 0.293 |
| Duração da doença (anos) | 1.13 | 0.663–1.929 | 0.653 |
| MiR-483-3p | 0.166 | 0.097–0.284 | <0.001 |
Tabela 2: Fatores independentes derivados por regressão logística multivariável associados à progressão da osteoartrite para artrite reumatoide. Identificou-se que o miR-488-3p está associado ao risco de desenvolvimento de AR em pacientes com OA.
| Itens | MiR-488-3p (artrite reumatoide) | p-valor |
| Correlação (r) | ||
| VES (mm/h) | -0,718 | <0,001 |
| PCR (mg/L) | -0,726 | <0,001 |
| FR (UI/mL) | -0,805 | <0,001 |
| DAS28 | -0,836 | <0,001 |
Tabela 3: Correlações entre miR-488-3p e características clínico-patológicas de pacientes com AR. O miR-488-3p apresentou correlação negativa significativa com VHS, PCR, FR e escore DAS28 em pacientes com AR.
Tabela Suplementar 1. Informações de sequência para transfeção celular e ensaio de PCR. São apresentadas as sequências dos iniciadores e os reagentes de transfeção utilizados no estudo.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Como enfatizado por Smolen et al1 nas últimas diretrizes para o diagnóstico e tratamento da AR, o desenvolvimento de novos biomarcadores possui grande valor clínico. Neste estudo, confirmamos que o miR-488-3p sérico estava significativamente subregulado em pacientes com AR e apresentou desempenho diagnóstico promissor, com sensibilidade e especificidade relativamente satisfatórias. O diagnóstico precoce da AR sempre foi uma dificuldade clínica, e os biomarcadores existentes não são suficientemente sensíveis para o diagnóstico da AR, enquanto o potencial diagnóstico significativo do miR-488-3p pode preencher essa lacuna, especialmente para a identificação de pacientes com AR soronegativa. Em comparação com indivíduos saudáveis, pacientes com AR exibiram inflamação sistêmica mais acentuada. Embora pacientes com OA apresentem predominantemente um distúrbio articular degenerativo local, frequentemente observa-se inflamação sistêmica de baixo grau. Assim, a eficiência discriminatória do miR-488-3p é muito maior quando comparada com indivíduos saudáveis do que em comparação com pacientes com OA. O desempenho diagnóstico do miR-488-3p não foi comparado diretamente com o de biomarcadores clínicos estabelecidos. Os pacientes incluídos neste estudo foram diagnosticados de acordo com o padrão-ouro clínico atual para AR, que incorpora biomarcadores estabelecidos, como anticorpos anti-CCP, FR, VHS e PCR. Foram observadas diferenças significativas nestes marcadores entre pacientes com OA e AR (Tabela 1). Portanto, esta coorte não foi adequada para comparar diretamente o desempenho diagnóstico do miR-488-3p com esses biomarcadores estabelecidos. Tais comparações exigem uma coorte de validação independente.
Além disso, observou-se que os níveis de expressão de miR-488-3p apresentam correlação negativa significativa com diversos indicadores clínicos da AR, incluindo marcadores inflamatórios sistêmicos (ESR, PCR)28 e autoanticorpos (RF)6. De particular relevância clínica, miR-488-3p mostrou forte correlação negativa com o Índice de Atividade da Doença (DAS28). O DAS28 é um índice composto que reflete a atividade da doença com base em inchaço articular, sensibilidade, inflamação e estado clínico dos pacientes. Portanto, esses achados sugerem que miR-488-3p pode atuar como um biomarcador potencial da atividade da doença na AR. Isso também reforça seu papel regulador na patogênese da AR e indica que pode influenciar a progressão da doença por meio da inibição de vias de sinalização inflamatórias ou respostas autoimunes29.
Em experimentos funcionais, descobrimos que o miR-488-3p suprimiu a proliferação e promoveu a apoptose de células HFLS-RA de pacientes com AR e reduziu significativamente a produção de citocinas inflamatórias (IL-6, TNF-α e IL-1β). As células HFLS-RA desempenham um papel fundamental no processo patológico da AR30, e sua proliferação anormal e crescimento invasivo podem levar à hiperplasia sinovial e destruição articular, enquanto a superprodução de fatores inflamatórios agrava ainda mais as respostas inflamatórias locais e sistêmicas31. Portanto, a regulação da função das células HFLS-RA pelo miR-488-3p pode inibir diretamente a invasão sinovial e a erosão óssea na AR, fornecendo uma base teórica para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas direcionadas. Estudos anteriores demonstraram que outros miRNAs, como o miR-155, podem afetar a progressão da AR ao regular a função dos sinoviócitos19, o que reforça ainda mais nossas descobertas.
Estudos mecanicistas demonstraram que o miR-488-3p pode direcionar diretamente o ROCK1 e inibir sua expressão ao se ligar à sua região 3'UTR. O ROCK1 é uma molécula efetora chave da via de sinalização Rho/ROCK, que está envolvida na reorganização do citoesqueleto, na resposta inflamatória e na fibrose32. Estudos anteriores mostraram que o ROCK1 é altamente expresso em sinoviócitos de AR e promove sua migração e invasão33. Como esperado, a superexpressão do ROCK1 reverteu significativamente os efeitos do miR-488-3p em células HFLS-RA, indicando seu envolvimento no papel regulador do miR-488-3p na progressão da AR.
No entanto, ainda há muito trabalho a ser realizado em pesquisas futuras. A expressão de miR-488-3p nas amostras clínicas foi avaliada por meio de RT-qPCR utilizando U6 como referência interna. Estudos anteriores relataram achados conflitantes sobre a estabilidade de U6, especialmente em amostras circulantes, como soro. Embora experimentos preliminares tenham sido realizados no presente estudo para garantir a estabilidade de U6, a possível volatilidade de U6 ainda representa uma limitação, aumentando assim o risco de diagnóstico incorreto. É necessário um maior validação utilizando genes de referência interna mais estáveis. Por outro lado, a avaliação clínica de miR-488-3p baseou-se em uma coorte de centro único, sem validação externa. O tamanho da amostra foi relativamente pequeno, limitado à escala hospitalar. Além disso, houve falta de acompanhamento longitudinal para avaliar o valor prognóstico de miR-488-3p. Essas limitações devem ser abordadas em estudos futuros. Além disso, alguns estudos mostram que in vivo a entrega de miRNAs continua sendo um grande desafio para a translação clínica34Estudos futuros poderiam validar o potencial terapêutico do miR-488-3p in vivo por meio da construção de camundongos com mutação condicional ou utilizando sistemas de entrega direcionada, como nanocarreadores.35.
Em conclusão, este estudo revelou o valor potencial do miR-488-3p no diagnóstico e no possível direcionamento terapêutico da AR. O miR-488-3p demonstrou alto desempenho diagnóstico e inibiu a proliferação e as respostas inflamatórias de células HFLS-RA, ao mesmo tempo que promoveu a apoptose. Isso sugere que ele pode representar um alvo promissor para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a AR. Pesquisas futuras devem focar em 1) validar a estabilidade diagnóstica do miR-488-3p em grandes coortes multicêntricas, 2) explorar seus efeitos sinérgicos com agentes terapêuticos existentes, como inibidores de JAK ou biológicos28, e 3) otimizar os sistemas de entrega de miRNA para melhorar sua viabilidade de translação clínica36.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os dados brutos que sustentam as descobertas deste estudo estão disponíveis nos materiais suplementares enviados com este manuscrito.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Detecção de Apoptose por Anexina V-FITC | BD Bioscience | 556547 | apoptose celular |
| anticorpo anti-Ago2 | Proteintech | 66720-1-Ig | Imunoprecipitação de RNA |
| Solução CCK-8 | Dojindo | CK04 | proliferação celular |
| Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) | Thermo Fisher | 121000146 | cultura celular |
| Soro bovino fetal | Thermo Fisher | 10437028 | cultura celular |
| Citômetro de fluxo | BD Bioscience | FACSCalibur | apoptose celular |
| Kit ELISA para anticorpo anti-CCP humano | Cusabio | CSB-E09077h | detecção de anti-CCP |
| Kit ELISA para RF-IgA humano | Feien Biotechnology | EH4270 | detecção de RF |
| Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos de artrite reumatoide humano (HFLS-RA) | Cell Applications | HFLS-RA-200 | validação in vitro da função do miR-488-3p |
| anticorpo controle IgG | Abcam | ab205718 | Imunoprecipitação de RNA |
| Kit ELISA para Interleucina-1β (IL-1β) | R&D Systems | DY201-05 | concentração celular de IL-1β |
| Kit ELISA para Interleucina-6 (IL-6) | R&D Systems | D6050B | concentração celular de IL-6 |
| Reagente de transfeção por lipossoma 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | transfeção celular |
| Leitor de microplacas | BioTek | ELx808 | ensaio ELISA |
| Kit Mir-X™ para Síntese da Primeira Fita de miRNA | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | transcrição reversa |
| Meio Opti-MEM | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | transfeção celular |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | sobreexpressão de ROCK1 |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | cultura celular |
| Sistema Laboratorial Phadia 250 | Thermo Fisher | Phadia 250 | análise sanguínea |
| Kit PrimeScript™ de Transcrição Reversa | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | transcrição reversa |
| Iodeto de propídio (PI)/ribonuclease (RNase) | BD Bioscience | 550825 | apoptose celular |
| Sistema QuantStudio 5 | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | ensaio de PCR |
| Reagente RNAiso Plus | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | isolamento de RNA |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | amplificação de PCR |
| Banco de dados TargetScan | TargetScan | N/A | previsão de sítios de ligação, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant Proteína C-Reativa IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | detecção de PCR |
| Kit ELISA para Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) | R&D Systems | DY210-05 | concentração celular de TNF-α |
Referências
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