A Expressão Sérica de Mir-488-3p Serve como um Biomarcador Diagnóstico Não Invasivo em Pacientes com Artrite Reumatoide

Resumo

O miR-488-3p pode atuar como um novo marcador diagnóstico não invasivo para AR. O miR-488-3p modula a função biológica das sinoviócitos por meio de ROCK1. Ele exibiu uma correlação negativa significativa com a gravidade da doença em pacientes com AR.

Resumo

O diagnóstico da artrite reumatoide (AR) permanece desafiador devido às limitações dos biomarcadores existentes. O objetivo do estudo foi investigar o potencial do miR-488-3p no soro como biomarcador para AR e revelar seu mecanismo de ação potencial. O estudo incluiu 135 pacientes com AR, 130 pacientes com osteoartrite (OA) e 125 controles saudáveis. Os níveis de expressão do miR-488-3p foram examinados por RT-qPCR. O mecanismo de ação foi analisado por testes funcionais (CCK-8, citometria de fluxo, ELISA) e experimentos de validação de alvo (gene repórter de luciferase, RIP). Os níveis séricos de expressão do miR-488-3p foram significativamente mais baixos em pacientes com AR do que em pacientes com osteoartrite (OA) e controles saudáveis (p < 0,001). A análise da curva ROC mostrou que o miR-488-3p apresentou alta precisão diagnóstica para distinguir AR de controles saudáveis e pacientes com OA. O miR-488-3p apresentou correlação negativa com a taxa de sedimentação eritrocitária (VHS), proteína C-reativa (PCR), fator reumatoide (FR) e escores DAS28. A validação funcional revelou que a superexpressão do miR-488-3p inibiu a proliferação e a resposta inflamatória de sinoviócitos, ao mesmo tempo que induziu apoptose. Estudos mecanicistas mostraram que o miR-488-3p pode direcionar diretamente a proteína quinase 1 associada à Rho com domínio em coil-coil (ROCK1), que media seus efeitos protetores. O miR-488-3p sérico é promissor como um novo marcador diagnóstico não invasivo para AR e protege os sinoviócitos contra lesões.

Introdução

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune comum caracterizada por inflamação sinovial, erosão articular e destruição^1,2. A prevalência global da AR é de cerca de 0,5%–1%³, o que afeta seriamente a qualidade de vida dos pacientes e sua capacidade de trabalhar. A doença tem início insidioso, e os sintomas iniciais são frequentemente atípicos, podendo ser facilmente mal diagnosticados ou ignorados⁴. Conforme a doença progride, pode levar a deformidades articulares, perda de função e até aumentar o risco de complicações, como doenças cardiovasculares⁵, impondo um peso substancial aos pacientes, suas famílias e aos sistemas de saúde.

Atualmente, é necessário um conjunto de sintomas clínicos, sinais, exames laboratoriais e avaliação por imagem para o diagnóstico da AR⁶. Os indicadores laboratoriais mais utilizados incluem a taxa de sedimentação eritrocítica (VHS) e a proteína C-reativa (PCR), que são marcadores inespecíficos de inflamação sistêmica, além do fator reumatoide (FR) e os anticorpos anti-peptídeo citrulinado cíclico (anti-CCP), que são importantes biomarcadores sorológicos para a AR^7,8. No entanto, esses biomarcadores tradicionais apresentam limitações: o FR pode ser positivo em algumas pessoas saudáveis e em pacientes com outras doenças autoimunes (taxa de falso-positivo de cerca de 5%); o anti-CCP, embora altamente específico (>95%), possui sensibilidade limitada nos estágios iniciais da doença (cerca de 60–70%)^4,9, e alguns pacientes com AR permanecem soronegativos¹⁰. Portanto, é importante identificar biomarcadores mais sensíveis e específicos para o diagnóstico precoce, monitoramento da doença e avaliação do prognóstico da AR¹¹.

MicroRNAs (miRNAs) são um grupo de moléculas de RNA reguladoras não codificantes endógenas com aproximadamente 22–25 bases de comprimento^12,13. Verificou-se que os miRNAs atuam como reguladores-chave no desenvolvimento de diversas doenças, e sua expressão aberrante está estreitamente relacionada à patogênese dessas doenças^13,14,15, tornando os miRNAs biomarcadores promissores para o diagnóstico de doenças e monitoramento terapêutico. Nos últimos anos, o papel dos miRNAs na artrite reumatoide (RA) tem recebido crescente atenção¹⁶. Estudos demonstraram que múltiplos miRNAs estão associados à expressão desregulada (por exemplo, miR-146a, miR-155, etc.) no soro, tecidos sinoviais e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes com RA^17,18,19. Esses miRNAs contribuem para a patogênese da RA ao regular a produção de citocinas inflamatórias, promover a proliferação e invasão de células sinoviais e influenciar a diferenciação de osteoclastos²⁰. Dentre eles, o miR-488 está localizado na região 1q25.2 do cromossomo humano²¹, e estudos anteriores confirmaram seus efeitos neuroprotetores: ele exerce um papel regulador na progressão de gliomas²² e neuroblastomas²³, e, notavelmente, o miR-488-3p promove a apoptose de condrocitos osteoartríticos na osteoartrite (OA)²⁴. Embora OA e RA sejam doenças articulares diferentes, compartilham mecanismos comuns nos processos patológicos de inflamação sinovial e destruição da cartilagem²⁵. Nós formulamos a hipótese de que o miR-488-3p possa desempenhar um papel na RA ao regular vias-alvo semelhantes. No entanto, o papel específico e os mecanismos potenciais do miR-488-3p na RA ainda não foram elucidados.

O estudo investigou as alterações nos níveis de expressão sérica de miR-488-3p em pacientes com AR e sua relação com a atividade da doença e indicadores clínicos, com o objetivo de avaliar seu valor potencial como marcador diagnóstico não invasivo para AR. Este estudo fornece uma nova perspectiva sobre o rastreamento precoce e a predição da progressão da doença na AR, melhorando, assim, o prognóstico dos pacientes com AR.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Hefei BOE (número de aprovação 2021–1), e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da inscrição.

Pacientes e espécimes

Este estudo recrutou 135 pacientes com AR (diagnosticada de acordo com os critérios de classificação ACR/EULAR de 2010) do Departamento de Reumatologia e Imunologia do Hospital Hefei BOE, 130 pacientes com OA do Departamento de Ortopedia (diagnosticados de acordo com os critérios diagnósticos de OA da Associação Médica Chinesa de 2018) e 125 controles saudáveis pareados por idade e sexo do centro de exames médicos do mesmo hospital. Os participantes tinham idade entre 30 e 80 anos. Os controles saudáveis foram confirmados como livres de doenças autoimunes, distúrbios articulares e infecções agudas mediante revisão abrangente do histórico clínico, exame físico e testes laboratoriais. Foram excluídos participantes com doenças autoimunes concomitantes, histórico de infecção ou trauma nos últimos 3 meses, neoplasias ou que estivessem grávidas ou em período de lactação.

Coleta e preparação

Sangue venoso em jejum foi coletado de todos os participantes do estudo. Após a coagulação à temperatura ambiente por 30 min, as amostras de soro foram isoladas por centrifugação a 1500 × g por 15 min. O soro foi armazenado a -80°C até a análise posterior.

Detecção de marcadores clínicos e sorológicos

Para avaliar de forma abrangente o estado da doença e a atividade inflamatória, biomarcadores clínicos e sorológicos foram medidos utilizando métodos laboratoriais clínicos padronizados. A VHS foi medida pelo método de Westergren para avaliar a inflamação sistêmica inespecífica. A PCR foi quantificada por meio de um ensaio imunoturbidimétrico (valor de referência normal: <10 mg/L) para avaliar a resposta inflamatória de fase aguda. O FR foi medido por ensaio imunoenzimático (ELISA), com valor de referência normal de ≤20 UI/mL. Os anticorpos anti-CCP foram medidos por meio de um ELISA de segunda geração para fornecer evidência sorológica para o diagnóstico de AR.

Linhas celulares e cultivo

As células de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos humanos afetados por AR (HFLS-RA) foram cultivadas em meio mínimo essencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram mantidas em incubadora a 37 °C com 5% de CO₂, e foram utilizadas células entre a terceira e a sexta passagem para todos os experimentos.

Extração de RNA e RT-PCR quantitativa em tempo real

O RNA total foi extraído de amostras de soro utilizando um reagente de extração de RNA. A transcrição reversa foi realizada utilizando um kit de síntese de primeira fita para miRNAs e um kit de transcrição reversa para genes-alvo de RNA mensageiro (mRNA), conforme as instruções do fabricante. A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) foi realizada utilizando um sistema de PCR em tempo real com uma mistura mestra de PCR baseada em SYBR Green. O programa termociclante foi definido para desnaturação prévia a 95 °C por 30 s; seguido por 40 ciclos de amplificação (desnaturação a 95 °C por 5 s e pareamento/alongamento a 60 °C por 30 s). Cada amostra foi analisada em triplicata. O RNA nuclear pequeno U6 (U6 snRNA) e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foram utilizados como genes de referência endógenos para normalização de miRNA e mRNA, respectivamente. As sequências dos iniciadores foram resumidas na Tabela Suplementar 1. Os níveis relativos de expressão de miR-488-3p e seus genes-alvo foram calculados utilizando o método 2^−ΔΔCt. As alterações nos níveis de mRNA dos genes-alvo após superexpressão ou inibição de miR-488-3p também foram analisadas para verificar suas relações regulatórias.

Transfeção de células

Células HFLS-RA foram semeadas em placas de 6 poços com uma densidade de 5 × 10⁵ células/poço. As células foram transfectadas utilizando um reagente de transfeção baseado em lipossomos, conforme as instruções do fabricante. Os grupos de transfeção incluíram grupos de transfeção única e de co-transfeção. Os grupos de transfeção única foram: 1) controle—células não transfectadas; 2) controle negativo do miR (NC)—células transfectadas com o controle negativo do miR-488-3p; 3) miR-488-3p—células transfectadas com o miR-488-3p; 4) controle negativo do inibidor (inibidor NC)—células transfectadas com o controle negativo do inibidor de miR-488-3p; 5) inibidor de miR-488-3p—células transfectadas com o inibidor de miR-488-3p. Os grupos de co-transfeção foram: 1) miR-488-3p + controle de superexpressão (oe-NC)—células co-transfectadas com o miR-488-3p e o controle negativo dos vetores de superexpressão de ROCK1; 2) miR-488-3p + oe-ROCK1—células co-transfectadas com o miR-488-3p e vetores de superexpressão de ROCK1. Todas as sequências de transfeção foram resumidas na Tabela Suplementar 1. O vetor de superexpressão de ROCK1 foi construído pela clonagem da região de sequência codificante (CDS) no plasmídeo pcDNA 3.1. As células transfectadas estiveram disponíveis para os experimentos subsequentes após 48 h de transfeção celular.

Ensaio de função celular

Ensaio de proliferação celular (Kit de contagem de células-8 [CCK-8]): Células HFLS-RA transfectadas foram inoculadas em placas de 96 poços a 5 × 10³ células/poço, com três poços replicados por grupo. Após 0, 24, 48 e 72 h da transfeção, adicionou-se 10 µL da solução CCK-8 a cada poço, seguido de incubação a 37 °C por 2 h. A absorbância foi medida a 450 nm (comprimento de onda de detecção) e 630 nm (comprimento de onda de referência) utilizando um leitor de microplacas. A taxa relativa de proliferação foi calculada utilizando o tempo de 0 h como linha de base.

Detecção de apoptose (citometria de fluxo): A apoptose foi avaliada por meio de análise com o ensaio de apoptose Annexina V-fluoresceína isotiocianato (FITC)/iodeto de propídio (PI). As células foram transfectadas com os plasmídeos apropriados e, em seguida, coletadas após a tripsinização. A taxa de apoptose foi determinada por citometria de fluxo.

Dosagem de fator inflamatório (ensaio imunoenzimático [ELISA]): Células HFLS-RA foram semeadas em placas de 24 poços e transfectadas com o mimetizador de miR-488-3p, inibidor de miR-488-3p ou seus controles negativos correspondentes por 48 h. As concentrações de interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β) nos sobrenadantes do cultivo celular foram quantificadas utilizando kits de ELISA.

Validação do alvo

Previsão de alvo: previu-se que ROCK1 fosse um alvo a jusante do miR-488-3p utilizando o banco de dados TargetScan²⁶. Também foram identificados os sítios de ligação previstos entre o miR-488-3p e a região não traduzida 3′ (3′UTR) de ROCK1.

Ensaio de Gene Repórter Dual-Luciferase: A região 3′UTR selvagem ou mutante de ROCK1 foi clonada no plasmídeo pGL3. Os locais de ligação previstos e os locais mutantes são mostrados na Figura 4. Células HEK-293T foram co-transfectadas com o análogo de miR-488-3p ou com inibidor juntamente com os vetores construídos²⁷. A atividade de luciferase foi medida 48 h após a transfeção com o análogo ou inibidor de miR-488-3p.

Imunoprecipitação de RNA (RIP): Células HFLS-RA foram incubadas com um anticorpo anti-Argonauta 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, diluição 1:200) ou com um anticorpo controle de imunoglobulina G (IgG) (RRID: AB_2819160, diluição 1:5000), seguido pela extração de RNA e PCR quantitativa (qPCR) para enriquecimento de mRNA de ROCK1 conforme descrito acima.

Análise estatística

O estudo foi analisado estatisticamente utilizando o SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) e o GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Todos os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas, e cada réplica biológica foi analisada em triplicata. Os dados brutos foram anexados no material suplementar. Os dados foram avaliados por meio de um gráfico de probabilidade normal (P-P) antes dos testes estatísticos paramétricos. O teste t para amostras independentes foi utilizado para comparar as variáveis contínuas de linha de base (por exemplo, idade, índice de massa corporal [IMC], etc.) e o teste qui-quadrado foi utilizado para as variáveis categóricas (por exemplo, sexo, etc.). Os níveis de expressão gênica foram comparados utilizando o teste t para amostras independentes. As alterações na proliferação celular em diferentes momentos foram analisadas por meio de análise de variância de medidas repetidas (ANOVA), enquanto a ANOVA de um fator foi utilizada para comparar as taxas de apoptose determinadas por citometria de fluxo. A análise de correlação foi realizada utilizando o coeficiente de Spearman (para variáveis que não seguem distribuição normal) e o coeficiente de Pearson (para variáveis que seguem distribuição normal). O desempenho diagnóstico foi avaliado por meio da análise da curva característica de operação do receptor (ROC). O valor de corte ótimo, sensibilidade e especificidade foram determinados utilizando o índice de Youden máximo. Todos os testes estatísticos foram bicaudais, e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Características básicas dos participantes do estudo

Este estudo incluiu 125 controles saudáveis, 130 pacientes com OA e 135 pacientes com RA para análise sistemática (Tabela 1). Não houve diferenças significativas nas características basais dos três grupos quanto à idade (p = 0,191), razão entre os sexos (p = 0,203) e IMC (p = 0,562), o que garantiu a comparabilidade da população estudada. Em relação às características da doença, a V...

Discussão

Como enfatizado por Smolen et al¹ nas últimas diretrizes para o diagnóstico e tratamento da AR, o desenvolvimento de novos biomarcadores possui grande valor clínico. Neste estudo, confirmamos que o miR-488-3p sérico estava significativamente subregulado em pacientes com AR e apresentou desempenho diagnóstico promissor, com sensibilidade e especificidade relativamente satisfatórias. O diagnóstico precoce da AR sempre foi uma dificuldade clínica, e os biomarcadores existentes não são suficientemente...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Detecção de Apoptose por Anexina V-FITC	BD Bioscience	556547	apoptose celular
anticorpo anti-Ago2	Proteintech	66720-1-Ig	Imunoprecipitação de RNA
Solução CCK-8	Dojindo	CK04	proliferação celular
Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)	Thermo Fisher	121000146	cultura celular
Soro bovino fetal	Thermo Fisher	10437028	cultura celular
Citômetro de fluxo	BD Bioscience	FACSCalibur	apoptose celular
Kit ELISA para anticorpo anti-CCP humano	Cusabio	CSB-E09077h	detecção de anti-CCP
Kit ELISA para RF-IgA humano	Feien Biotechnology	EH4270	detecção de RF
Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos de artrite reumatoide humano (HFLS-RA)	Cell Applications	HFLS-RA-200	validação in vitro da função do miR-488-3p
anticorpo controle IgG	Abcam	ab205718	Imunoprecipitação de RNA
Kit ELISA para Interleucina-1β (IL-1β)	R&D Systems	DY201-05	concentração celular de IL-1β
Kit ELISA para Interleucina-6 (IL-6)	R&D Systems	D6050B	concentração celular de IL-6
Reagente de transfeção por lipossoma 3000	Ingenuity Life Technologies	L3000015	transfeção celular
Leitor de microplacas	BioTek	ELx808	ensaio ELISA
Kit Mir-X™ para Síntese da Primeira Fita de miRNA	Nihonbao Bioengineering Co., Ltd.	638313	transcrição reversa
Meio Opti-MEM	Ingenuity Life Technologies, Inc	31985070	transfeção celular
pcDNA 3.1	Invitrogen	V790-20	sobreexpressão de ROCK1
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher	15140122	cultura celular
Sistema Laboratorial Phadia 250	Thermo Fisher	Phadia 250	análise sanguínea
Kit PrimeScript™ de Transcrição Reversa	Nihonbao Bioengineering Co., Ltd.	RR037A	transcrição reversa
Iodeto de propídio (PI)/ribonuclease (RNase)	BD Bioscience	550825	apoptose celular
Sistema QuantStudio 5	Applied Biosystems, Inc.	A28138	ensaio de PCR
Reagente RNAiso Plus	Nihonbao Bioengineering Co., Ltd.	9108	isolamento de RNA
SYBR Green Premix Ex Taq	Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd.	RR420A	amplificação de PCR
Banco de dados TargetScan	TargetScan	N/A	previsão de sítios de ligação, (https://www.targetscan.org/)
Tina-quant Proteína C-Reativa IV	Roche Diagnostics	7876033190	detecção de PCR
Kit ELISA para Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α)	R&D Systems	DY210-05	concentração celular de TNF-α