Este estudo demonstrou que a USP e o miR-486-3p sérico estavam elevados em neonatos com síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). A avaliação combinada desses marcadores melhorou a predição da gravidade da doença e do prognóstico, e descobriu-se que o miR-486-3p regula a função celular em modelos de SDRA por meio do direcionamento da Delta-Like Canonical Notch Ligand 4.
Artigo de investigação
Valor Prognóstico do Escore de Ultrassonografia Pulmonar e do miR-486-3p Sérico na Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo Neonatal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este estudo teve como objetivo avaliar o valor prognóstico do escore de ultrassonografia pulmonar (LUS) e do miR-486-3p sérico na síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) neonatal e explorar o mecanismo subjacente. Um total de 112 neonatos com SDRA e 100 lactentes saudáveis nascidos no mesmo período foram incluídos nos grupos de estudo e controle saudável, respectivamente. Cada neonato foi submetido à ultrassonografia pulmonar nas primeiras 6 h após a admissão na unidade de terapia intensiva e foi avaliado quanto ao LUS. A PCR quantitativa em tempo real foi utilizada para quantificar a expressão gênica, enquanto análises de curva ROC (característica de operação do receptor) e de correlação de Pearson foram realizadas para avaliar o desempenho prognóstico e as correlações. Além disso, um modelo in vitro de SDRA foi estabelecido utilizando células endoteliais microvasculares pulmonares humanas (HPMECs) para investigar o mecanismo subjacente do miR-486-3p. Um ensaio de repórter de dupla luciferase foi realizado para verificar a relação alvo entre o miR-486-3p e o ligante 4 da notcha tipo delta (DLL4). Os resultados revelaram que o LUS e o miR-486-3p sérico estavam significativamente aumentados em neonatos com SDRA. A análise da curva ROC mostrou que tanto o miR-486-3p quanto o LUS podiam prever o prognóstico neonatal da SDRA (AUC = 0,883 e 0,873, sensibilidade: 96,4% e 89,3%, especificidade: 77,4% e 73,8%, respectivamente), e a combinação de miR-486-3p com LUS apresentou um efeito preditivo melhor (AUC = 0,929, sensibilidade: 92,9%, especificidade: 84,5%). Mecanicamente, o miR-486-3p direcionou o DLL4 para regular as funções biológicas das células do modelo de SDRA. Em conjunto, a avaliação combinada do LUS e do miR-486-3p sérico pode servir como uma abordagem promissora para avaliar a gravidade da doença e prever o prognóstico em neonatos com SDRA. Ainda é necessária validação multicêntrica adicional para confirmar sua aplicabilidade geral.
Introdução
A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) neonatal é uma desordem respiratória crítica e potencialmente fatal, caracterizada principalmente por disfunção do surfactante alveolar, o que representa grandes riscos à sobrevivência neonatal1,2. Apesar do desenvolvimento de diversas modalidades de tratamento, o prognóstico geral para os neonatos afetados permanece insatisfatório3. Assim, a identificação precoce da gravidade da doença e a avaliação prognóstica precisa são essenciais para otimizar as intervenções clínicas e melhorar os desfechos dos pacientes. Uma vez desenvolvida a SDRA, a função pulmonar neonatal é severamente comprometida, acompanhada por ventilação prejudicada e trocas gasosas alteradas4. A ultrassonografia pulmonar pode ser considerada o método de imagem primário para monitorar a ventilação na SDRA5. Tornou-se uma ferramenta de imagem preferencial à beira do leito para monitorar lesões pulmonares na SDRA, e o escore de ultrassonografia pulmonar (EUP) tem sido amplamente utilizado para diagnosticar doenças respiratórias agudas neonatais e avaliar a gravidade e o prognóstico da doença em ambientes de terapia intensiva6. No entanto, exames de imagem ou testes laboratoriais isolados apresentam defeitos inerentes e não conseguem atender plenamente às demandas de avaliação clínica7. Portanto, explorar novos biomarcadores para estabelecer um sistema combinado de avaliação possui grande significado clínico.
O microRNA (miRNA) representa uma nova classe de fatores reguladores gênicos que desempenham um papel fundamental na patogênese da SDRA8. Por exemplo, o miR-141-3p desregulado negativamente está fortemente associado à gravidade da doença na fibrose pulmonar e lesão pulmonar9. O miR-124-3p é um fator protetor para a SDRA ao direcionar a p6510. Estudos prévios de sequenciamento de alto rendimento confirmaram que o miR-486-3p está significativamente superexpresso em pacientes com SDRA11. Pesquisas recentes destacaram o eixo hsa_circ_0006892/miR-486-3p como um possível mecanismo molecular implicado no desenvolvimento da SDRA12. Esses achados sugerem que o miR-486-3p está estreitamente ligado à SDRA. No entanto, o valor prognóstico e preditivo do miR-486-3p em relação à gravidade e ao desfecho da SDRA neonatal ainda precisa ser plenamente elucidado.
Atualmente, a radiografia de tórax, a análise de gases sanguíneos e a detecção de biomarcadores únicos são os métodos convencionais para avaliar a SDRA neonatal. A imagem de tórax envolve exposição à radiação e não permite monitoramento repetido em tempo real. A análise de gases sanguíneos reflete apenas a função respiratória aguda e possui valor preditivo limitado para o prognóstico a longo prazo. A detecção isolada de microRNAs fornece resultados quantitativos objetivos, mas não consegue refletir alterações morfológicas em tempo real no tecido pulmonar. Em comparação com essas abordagens convencionais, a combinação de ultrassonografia pulmonar (LUS) e miR-486-3p sérico integra as vantagens da imagem à beira do leito e da detecção molecular.
Este estudo concentrou-se em neonatos que preencheram os critérios de SDRA, em vez da DRSP clássica por deficiência de surfactante. Assim, este estudo busca avaliar se a LUS de linha de base e o miR-486-3p sérico predizem a mortalidade em curto prazo na SDRA neonatal. Esta pesquisa tem como objetivo fornecer dados valiosos para aprimorar a avaliação clínica das condições da doença e as avaliações prognósticas em curto prazo na SDRA neonatal.
Protocolo
Este estudo recebeu aprovação ética do Comitê de Ética Médica do Primeiro Hospital Popular de Yongkang, em estrita aderência à Declaração de Helsinque.
Assuntos
Este estudo de coorte observacional unicêntrico, com um componente experimental in vitro, foi conduzido entre janeiro de 2022 e dezembro de 2023. Um total de 112 neonatos consecutivos diagnosticados com SDRA foram incluídos no Primeiro Hospital Popular de Yongkang. Para fins comparativos, lactentes saudáveis nascidos no mesmo período, sem histórico de asfixia ou sofrimento intrauterino, foram recrutados como sujeitos de controle.
Critérios de inclusão:
Todos os participantes preencheram os critérios diagnósticos para a síndrome do desconforto respiratório agudo neonatal conforme descrito nas diretrizes de Montreux (edição de 2017). O diagnóstico foi confirmado por meio de avaliações clínicas e de imagem: exames radiográficos revelaram opacidades difusas em ambos os pulmões, compatíveis com edema pulmonar, e a ecocardiografia não mostrou evidência de hipertensão atrial esquerda, excluindo assim o edema pulmonar cardiogênico. Critérios adicionais incluíram início agudo dos sintomas e necessidade de ventilação mecânica por mais de 3 dias, sem infecções extrapulmonares graves. O consentimento informado foi devidamente obtido dos familiares dos neonatos.
Critérios de exclusão:
Foram excluídos recém-nascidos com deficiência primária de surfactante alveolar, cardiopatia congênita, distúrbios metabólicos ou outras condições subjacentes significativas. Além disso, foram excluídos lactentes com malformações pulmonares ou da parede torácica ou outras anomalias congênitas graves. A DRN neonatal foi excluída.
Dados clínicos
A idade gestacional, o sexo, o peso ao nascer na admissão e as características maternas foram documentados para todos os participantes. Cada neonato foi submetido à ultrassonografia pulmonar nas primeiras 6 horas após a admissão na unidade de terapia intensiva e avaliado quanto ao LUS. O LUS foi pontuado em uma escala com máximo de 36 pontos, em que uma pontuação mais alta indicava maior gravidade dos sintomas pulmonares. Amostras de sangue foram coletadas imediatamente após a admissão, como parte da avaliação clínica inicial e antes de qualquer intervenção terapêutica significativa (por exemplo, redose de surfactante, intensificação do modo de ventilação ou início de agentes vasoativos). Amostras de sangue de neonatos saudáveis foram obtidas no momento da inclusão. Para o isolamento do soro, o sangue total foi colocado em tubos separadores de soro e mantido em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos para permitir a formação completa do coágulo. As amostras foram então centrifugadas a 1500 x g durante 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante sérico claro superior foi cuidadosamente aspirado, fracionado em frascos criogênicos estéreis e imediatamente armazenado em um congelador de ultra-baixa temperatura a -80 °C para experimentos posteriores. Apenas amostras de soro claras e não hemolisadas foram utilizadas nos experimentos subsequentes. Os tubos de coleta de sangue usados e o sangue residual foram descartados como resíduo biológico médico, conforme as regulamentações institucionais.
Agrupamento
Todos os neonatos foram categorizados em dois grupos distintos: o grupo leve (graus I–II) e o grupo grave (graus III–IV), com base nos achados iniciais do raio X de tórax e na gravidade da condição avaliada 24 h após a admissão. A interpretação dos raios X de tórax revelou o grau I, caracterizado por diminuição da transparência pulmonar bilateral, com pequenas partículas e sombras reticulares no parênquima pulmonar. O grau II indicava que as lesões se estendiam até as zonas média e periférica dos pulmões, com evidência do sinal do broncograma aéreo. No grau III, havia uma redução acentuada da transparência em ambos os pulmões, resultando em margens do coração e do diafragma obscurecidas. O grau IV era marcado por sinais pronunciados de broncograma aéreo, culminando em uma opacificação quase total, semelhante à aparência de pulmão branco.
Recém-nascidos diagnosticados com SDRA receberam um regime abrangente de manejo após sua admissão na unidade de terapia intensiva neonatal. Esse regime incluiu ventilação mecânica, sedação, administração de surfactante pulmonar, terapias anti-inflamatórias, suporte nutricional, assistência à expectoração e medidas de reposição hídrica. O diagnóstico neonatal de SDRA serviu como ponto inicial do estudo. Os pontos terminais foram definidos como recuperação bem-sucedida do paciente e alta ou óbito do paciente decorrente de tratamento ineficaz. Com base nos desfechos clínicos, os participantes foram classificados em dois grupos: o grupo de sobrevivência e o grupo de óbito.
Cultura celular e tratamento
Células endoteliais microvasculares pulmonares humanas (HPMECs) foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina. As células foram mantidas a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO₂. Para estabelecer um modelo celular de SDRA, as células foram tratadas com lipopolissacarídeo (LPS) na concentração de 1 mg/L13,14. A confirmação do sucesso no estabelecimento do modelo foi realizada mediante a observação de leve retração celular em microscópio invertido após o tratamento com LPS. Após a conclusão dos experimentos, o meio de cultura usado, as células mortas e os materiais descartáveis de cultura foram descartados como resíduos biologicamente perigosos.
Transfeção celular e agrupamento
As HPMECs foram semeadas em placas de cultura e incubadas até atingirem 70% de confluência antes da transfeção. Os complexos de transfeção foram preparados de acordo com as instruções do fabricante. As células foram divididas em grupos: controle em branco, miR-486-3p mimic, controle negativo do mimic, inibidor de miR-486-3p, controle negativo do inibidor, miR-486-3p mimic + plasmídeo de superexpressão de DLL4 (OE-DLL4) e miR-486-3p mimic + plasmídeo de superexpressão vazio (OE-NC). Os complexos de transfeção foram adicionados aos poços correspondentes e incubados por 4–6 h. O meio foi substituído por meio completo fresco, e a cultura foi continuada por 24–48 h para experimentos subsequentes. A transfeção bem-sucedida foi indicada pela confluência estável das células sem morte celular excessiva.
PCR quantitativa em tempo real
O RNA total foi extraído de amostras de soro e células cultivadas utilizando um reagente de extração de RNA. A concentração e a pureza do RNA foram medidas usando um espectrofotômetro, e as amostras com uma razão A260/A280 entre 1,8 e 2,1 foram consideradas adequadas para análises posteriores. O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando um kit de transcrição reversa. A PCR quantitativa foi subsequentemente realizada usando um sistema de PCR em tempo real com as seguintes condições de ciclagem: uma desnaturação inicial a 95 °C por 3 min, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s. Para a detecção de microRNA, a expressão relativa de miR-486-3p foi calculada utilizando o método 2-ΔΔCt, com o snRNA U6 servindo como referência interna. Para a quantificação de mRNA, a expressão de DLL4 foi normalizada em relação ao mRNA de GAPDH utilizando o mesmo algoritmo 2-ΔΔCt. As sequências dos iniciadores foram as seguintes: miR-486-3p sentido: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' e miR-486-3p antissentido: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3', U6 sentido: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' e U6 antissentido: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. DLL4 sentido: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' e DLL4 antissentido: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3', GAPDH sentido: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' e GAPDH antissentido: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
Ensaio de proliferação celular CCK-8
As células transfectadas foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 103 células por poço e incubadas por 24, 48 e 72 h. O meio de cultura foi então aspirado e as células foram lavadas duas vezes com PBS 1×. Em seguida, foram adicionados 100 µL de PBS 1× fresco e 10 µL de solução CCK-8 a cada poço, e as placas foram incubadas a 37 °C por 2 h. A absorbância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas, e a proliferação celular foi avaliada com base nos valores de absorbância. O desempenho bem-sucedido do ensaio foi indicado por alterações dependentes do tempo na absorbância entre os grupos experimentais.
Ensaio de apoptose por citometria de fluxo
As células foram digeridas com tripsina a 0,25%, e a suspensão celular resultante foi coletada e centrifugada a 1500 × g durante 5 min a 4 °C. O sobrenadante foi descartado, e os pellets celulares foram lavados três vezes com PBS 1× pré-resfriado. As células foram então ressuspendidas em 500 µL de Tampão de Ligação 1x, seguido pela adição de 5 µL de Anexina V-FITC e 5 µL de iodeto de propídio (PI). Após mistura suave, as amostras foram incubadas por 40 min à temperatura ambiente no escuro. A apoptose celular foi medida por citometria de fluxo, e os dados foram analisados com o software apropriado de análise de citometria de fluxo. O desempenho bem-sucedido do ensaio foi indicado por uma baixa taxa de apoptose no grupo controle normal e um aumento acentuado na apoptose no grupo modelo de SDRA.
Ensaio de repórter luciferase
Genes alvo potenciais do miR-486-3p foram identificados utilizando o banco de dados online TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/). Após a identificação dos sítios de ligação previstos, plasmídeos repórter de luciferase do tipo selvagem (DLL4-WT) e mutantes (DLL4-MUT) contendo as sequências de ligação correspondentes foram construídos. Os vetores DLL4-WT e DLL4-MUT foram cotransfectados em HPMECs juntamente com mimetizadores ou inibidores do miR-486-3p, respectivamente. A atividade relativa de luciferase foi posteriormente medida utilizando um kit de ensaio repórter de dupla luciferase. Os sinais de bioluminescência foram detectados com um luminômetro de acordo com as instruções do fabricante. A validação bem-sucedida do alvo foi indicada por uma redução significativa na atividade de luciferase no grupo DLL4-WT após a superexpressão do miR-486-3p.
Informações detalhadas sobre todos os reagentes, consumíveis e equipamentos de laboratório utilizados neste estudo foram fornecidas na Tabela de Materiais acompanhante.
Métodos estatísticos
As análises estatísticas e visualizações de dados foram realizadas utilizando o SPSS versão 26.0 e o GraphPad Prism versão 9.0. Os dados de medição foram apresentados como média ± desvio padrão, sendo as comparações entre as médias de duas amostras independentes avaliadas por meio do teste t independente. Para comparações entre três ou mais grupos, foram utilizadas a análise de variância unifatorial (ANOVA) e a ANOVA de medidas repetidas, seguidas pelo teste post hoc de Tukey para identificar as diferenças entre grupos. Dados categóricos foram expressos como contagens (porcentagens), e as comparações entre grupos foram analisadas empregando o teste qui-quadrado. O teste de Wilcoxon-Mann-Whitney foi aplicado para dados não paramétricos. Adicionalmente, a curva ROC foi construída para avaliar o valor preditivo dos níveis séricos de expressão de miR-486-3p e de LUS na determinação da mortalidade em pacientes pediátricos com SDRA. A análise de correlação de Pearson foi utilizada para examinar as correlações. Todos os grupos experimentais incluíram três réplicas biológicas independentes e réplicas técnicas. A unidade estatística foi definida como um experimento independente, sendo cada réplica biológica representante de um lote distinto de cultura celular derivado de diferentes passagens, e as réplicas técnicas foram utilizadas para reduzir a variação intra-experimental. Os dados das réplicas técnicas foram primeiramente médios, e então a análise estatística foi realizada com base nos valores médios das réplicas biológicas. A significância estatística foi estabelecida em p < 0,05.
Resultados
Dados basais comparáveis entre grupos
As características gerais dos lactentes incluídos no estudo são apresentadas na Tabela 1. Não houve diferenças significativas nas características demográficas basais entre os dois grupos: idade gestacional (36,07 ± 2,71 versus 35,72 ± 2,64 semanas, p = 0,347), proporção do sexo masculino (59,0% versus 66,1%, p = 0,290), peso ao nascer (3,39 ± 0,57 versus 3,33 ± 0,55 kg, p = 0,437), idade materna (29,18 ± 4,00 versus 29,66 ± 4,05 anos, p = 0,387) e método de parto (vaginal: 54,0% versus 58,0%; cesariana: 46,0% versus 42,0%, p = 0,554), indicando que esses grupos eram comparáveis. Com base na avaliação por radiografia de tórax, no grupo com SDRA, 72 casos (64,3%) foram classificados como leves (grau I-II), enquanto 40 casos (35,7%) foram classificados como graves (grau III-IV).
A gravidade da SDRA correlaciona-se com o prognóstico do paciente
A análise comparativa dos desfechos de sobrevida entre o grupo de crianças com SDRA que sobreviveram e aquelas que vieram a óbito é apresentada na Tabela 2. Dentre os 112 neonatos diagnosticados com SDRA, 84 casos (75%) sobreviveram, enquanto 28 casos (25%) evoluíram para mortalidade. Notavelmente, não houve diferenças estatisticamente significativas quanto à idade do lactente, sexo, peso ao nascer, idade materna, modo de parto, características do líquido amniótico, etiologia ou outras variáveis entre os dois grupos (p > 0,05). No entanto, observou-se uma diferença significativa na gravidade do SDRA (p < 0,01), destacando um fator prognóstico crítico.
miR-486-3p e LUS estão elevados na SDRA. A análise por RT-qPCR revelou que os níveis séricos de miR-486-3p estavam significativamente elevados em neonatos com SDRA em comparação com controles saudáveis. Além disso, dentro do grupo com SDRA, o grupo grave apresentou níveis acentuadamente mais altos do que o grupo leve (P < 0,001) (Figura 1A). Ademais, o LUS foi maior no grupo com SDRA grave do que no grupo com SDRA leve (p < 0,001) (Figura 1B). Ao dividir os pacientes com SDRA conforme o desfecho clínico, o grupo de óbito apresentou níveis marcadamente mais elevados de LUS e miR-486-3p do que o grupo de sobrevivência (Figura 1C,D). Foi observada uma forte correlação positiva entre LUS e miR-486-3p sérico nos pacientes não sobreviventes (r = 0,832, p < 0,001) (Figura 1E).
A detecção combinada melhora a predição prognóstica
Com base no protocolo de análise ROC, avaliamos o desempenho prognóstico de indicadores individuais e combinados. Os valores de AUC de LUS e miR-486-3p para predizer mortalidade em curto prazo foram 0,873 (IC 95%: 0,809-0,936) e 0,883 (IC 95%: 0,822-0,944), respectivamente. Os valores de sensibilidade foram 89,3% e 96,4%, enquanto os valores de especificidade foram 73,8% e 77,4%, respectivamente. Os valores de corte ótimos para LUS e miR-486-3p foram 15,500 e 1,465, respectivamente. Além disso, a AUC para o modelo preditivo combinado foi 0,929 (IC 95%: 0,883-0,975), demonstrando uma sensibilidade de 92,9% e uma especificidade de 84,5% com o valor de corte ótimo de 1,659 (Figura 1F).
A superexpressão de miR-486-3p prejudica a função celular
Após o protocolo de cultura celular e intervenção com LPS, construímos um modelo celular in vitro de SDRA utilizando HPMECs. Os resultados de qPCR mostraram que a expressão de miR-486-3p aumentou gradualmente ao longo do tempo após a estimulação com LPS (Figura 2A). O miR-486-3p foi superexpresso ou silenciado para investigar seus efeitos em células modelo de SDRA (Figura 2B). De acordo com os protocolos dos ensaios de CCK-8 e citometria de fluxo, foram detectadas a proliferação e a apoptose celular. A superexpressão de miR-486-3p suprimiu significativamente a proliferação celular e promoveu a apoptose. Por outro lado, o silenciamento de miR-486-3p atenuou os danos celulares induzidos pelo LPS (Figura 2C,D).
miR-486-3p reduz a expressão de DLL4
De acordo com o protocolo de construção do plasmídeo e ensaio do repórter dual-luciferase, verificamos a interação entre miR-486-3p e DLL4. A predição bioinformática confirmou um sítio de ligação conservado entre miR-486-3p e a região 3’UTR de DLL4 (Figura 3A). A atividade de luciferase do grupo selvagem de DLL4 foi significativamente reduzida após a superexpressão de miR-486-3p, enquanto nenhuma alteração evidente foi observada no grupo mutante (Figura 3B), comprovando que DLL4 é um gene-alvo direto de miR-486-3p. Em modelos celulares, a expressão de DLL4 diminuiu de maneira dependente do tempo após tratamento com LPS (Figura 3C). A manipulação da expressão de miR-486-3p também regulou negativamente os níveis de DLL4 (Figura 3D).
Em amostras clínicas, a expressão de DLL4 foi menor em neonatos com SDRA do que em controles saudáveis, e diminuiu ainda mais no grupo de óbito (Figura 3E–F). Uma correlação negativa entre miR-486-3p e DLL4 foi observada em pacientes não sobreviventes (r = -0,795, P < 0,001) (Figura 3G). Todos os ensaios de qPCR para DLL4 foram realizados com três réplicas técnicas, e os resultados foram estáveis.
DLL4 reverte a lesão celular mediada por miR-486-3p
Após o protocolo de co-transfecção utilizando o mimetizador de miR-486-3p e o plasmídeo de superexpressão de DLL4, realizamos experimentos de resgate. A PCR em tempo real confirmou que a expressão de DLL4 foi efetivamente restaurada após a transfeção com OE-DLL4 (Figura 4A). Testes funcionais mostraram que a superexpressão de DLL4 reverteu parcialmente o efeito inibitório do miR-486-3p sobre a proliferação celular e seu efeito pró-apoptótico (Figura 4B,C). Esses resultados indicaram que o miR-486-3p modula parcialmente a atividade celular por meio do direcionamento de DLL4.
Disponibilidade de Dados:
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo são fornecidos como Arquivo Suplementar 1.
Figura 1: Comparação dos níveis de LUS e miR-486-3p sérica entre grupos. (A) Níveis séricos de miR-486-3p em neonatos saudáveis e neonatos com SDRA. (B) Valores de LUS em neonatos saudáveis e neonatos com SDRA. (C) Níveis séricos de miR-486-3p no grupo de sobreviventes e no grupo de óbitos. (D) Valores de LUS no grupo de sobreviventes e no grupo de óbitos. (E) Análise de correlação entre miR-486-3p sérica e LUS em neonatos com SDRA não sobreviventes. (F) Curvas ROC de LUS isolada, miR-486-3p isolada e detecção combinada para predição do prognóstico da SDRA neonatal. Todos os dados quantitativos são apresentados como média ± desvio padrão; as barras de erro representam o desvio padrão. *** = p <0,001, comparado com o grupo saudável; ### = p <0,001, comparado com o grupo de SDRA leve. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito do miR-486-3p em células modelo de SDRA. (A) Alterações dependentes do tempo na expressão de miR-486-3p em HPMECs após tratamento com LPS. (B) Expressão relativa de miR-486-3p após intervenção de superexpressão e silenciamento. (C) Atividade de proliferação celular detectada pelo ensaio CCK-8 após alteração da expressão de miR-486-3p. (D) Taxa de apoptose celular detectada por citometria de fluxo após alteração da expressão de miR-486-3p. Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão; as barras de erro representam o desvio padrão. Marcadores estatísticos: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Verificação da relação de direcionamento entre miR-486-3p e DLL4. (A) Diagrama esquemático do sítio de ligação previsto entre miR-486-3p e a região 3’UTR de DLL4. (B) O ensaio de gene repórter de luciferase dual confirmou a relação de direcionamento entre miR-486-3p e DLL4. (C) Alterações dinâmicas da expressão de DLL4 em HPMECs após tratamento com LPS. (D) Expressão de DLL4 após superexpressão ou silenciamento de miR-486-3p. (E) Níveis séricos de DLL4 em neonatos saudáveis e neonatos com SDRA. (F) Níveis de DLL4 nos grupos de sobreviventes e de óbito entre neonatos com SDRA. (G) Análise de correlação entre miR-486-3p sérico e DLL4 em neonatos com SDRA não sobreviventes. Todos os dados quantitativos são apresentados como média ± desvio padrão; as barras de erro representam o desvio padrão. Marcadores estatísticos: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001 em comparação com o grupo saudável, ### = p <0,001 em comparação com o grupo com SDRA leve. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito do miR-486-3p direcionado à DLL4 em células modelo de SDRA. (A) Detecção da expressão de DLL4 após co-transfecção do mimetizador de miR-486-3p e do plasmídeo de superexpressão de DLL4. (B) Alterações na atividade de proliferação celular após recuperação de DLL4. (C) Alterações na taxa de apoptose celular após recuperação de DLL4. Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão; as barras de erro representam o desvio padrão. Marcadores estatísticos: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Variável | Saudável (n=100) | SDRA neonatal (n=112) | p-valor |
| Idade gestacional (semanas) | 36,07 ± 2,71 | 35,72 ± 2,64 | 0,347 |
| Sexo (masculino, %) | 59 (59,0 %) | 74 (66,1 %) | 0,29 |
| Peso ao nascer (kg) | 3,39 ± 0,57 | 3,33 ± 0,55 | 0,437 |
| Idade materna (anos) | 29,18 ± 4,00 | 29,66 ± 4,05 | 0,387 |
| Método de parto | 0,439 | ||
| Vaginal | 54 (54,0 %) | 65 (58,0 %) | |
| Cesariana | 46 (46,0 %) | 47 (42,0 %) | |
| Grades de SDRA | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64,3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35,7 %) |
Tabela 1: Características basais dos lactentes incluídos. Esta tabela resume as informações demográficas basais de neonatos saudáveis e de neonatos com SDRA. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão para variáveis contínuas e número (porcentagem) para variáveis categóricas. Os valores de P indicam diferenças estatísticas entre os grupos. Abreviações: ARDS = síndrome do desconforto respiratório agudo.
| Variável | Sobrevivência (n=84) | Óbito (n=28) | valor de p |
| Idade gestacional (semanas) | 35,95 ± 2,58 | 35,04 ± 2,76 | 0,112 |
| Sexo (masculino, %) | 53 (63,1 %) | 21 (75,0 %) | 0,253 |
| Peso ao nascer (kg) | 3,37 ± 0,58 | 3,23 ± 0,42 | 0,248 |
| Idade materna (anos) | 29,49 ± 3,82 | 30,18 ± 4,74 | 0,438 |
| Método de parto | 0,444 | ||
| Vaginal | 47 (56,0 %) | 18 (64,3 %) | |
| Cesárea | 37 (44,0 %) | 10 (35,7 %) | |
| Líquido amniótico anormal | 6 (9,5 %) | 4 (14,3 %) | 0,485 |
| Grades de SDRA | 0,001** | ||
| I-II | 61 (72,6 %) | 11 (39,3 %) | |
| III-IV | 23 (27,4 %) | 17 (60,7 %) | |
| Etiologia | 0,827 | ||
| Engasgamento | 33 (39,3 %) | 12 (42,9 %) | |
| Pneumonia | 17 (20,2 %) | 6 (21,4 %) | |
| Septicemia | 12 (14,3 %) | 2 (7,1 %) | |
| Síndrome de aspiração de mecônio | 22 (26,2 %) | 8 (28,6 %) |
Tabela 2: Comparação de dados clínicos entre o grupo de sobrevivência e o grupo de óbito em neonatos com SDRA. Esta tabela compara indicadores clínicos entre neonatos com SDRA que sobreviveram e os que não sobreviveram. Os dados contínuos são apresentados como média ± desvio padrão, e os dados categóricos são expressos como número (porcentagem). Os valores de p indicam significância estatística entre os dois grupos. ** = p<0,01. Abreviações: SDRA = síndrome da angústia respiratória aguda.
Arquivo Suplementar 1: Conjuntos de dados clínicos e experimentais brutos que apoiam as descobertas deste estudo, incluindo medições em nível individual para o escore de ultrassom pulmonar (LUS), expressão sérica de miR-486-3p, expressão de DLL4 e resultados dos ensaios baseados em células.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
A SDRA neonatal é uma das principais causas de insuficiência respiratória e mortalidade precoce entre neonatos gravemente doentes15. A avaliação precoce e precisa da gravidade da doença e do prognóstico é um pré-requisito para intervenções individualizadas e redução da mortalidade. Um número crescente de evidências confirma que os microRNAs participam da progressão patológica da SDRA e atuam como biomarcadores circulantes promissores16. Pesquisas indicam que o miR-155 está significativamente elevado em pacientes sépticos com lesão pulmonar aguda/SDRA17. Além disso, estudos revelaram um aumento nos níveis séricos de miR-629-5p em crianças diagnosticadas com SDRA18. O miR-34a sérico está estreitamente relacionado à gravidade e ao prognóstico da DRN neonatal19. Novos estudos demonstram o miR-375 como biomarcador diagnóstico e prognóstico para a SDRA neonatal20. Semelhante a essas moléculas relatadas, o miR-486-3p sérico pode ser detectado de forma estável no sangue periférico por meio de PCR quantitativa e é adequado para triagem rápida nas unidades de terapia intensiva neonatal (UTINs). Em comparação com o miR-375 e o miR-34a, que refletem principalmente o início precoce da doença, a expressão do miR-486-3p correlaciona-se mais estreitamente com a gravidade das lesões pulmonares e altera-se dinamicamente conforme a progressão da lesão pulmonar. Quando combinado com a ultrassonografia pulmonar (LUS), alcança maior precisão prognóstica para mortalidade em curto prazo. No entanto, o miR-486-3p apresenta especificidade relativamente baixa para a doença, e as evidências clínicas relevantes ainda são limitadas em comparação com as de biomarcadores de miRNA bem estabelecidos. Em conjunto, o miR-486-3p tem potencial para atuar como marcador para diagnóstico auxiliar ou predição prognóstica da SDRA neonatal.
A LUS é um indicador maduro de imagem à beira do leito que avalia a aeração pulmonar com base nas características ultrassônicas do tecido pulmonar21. Notavelmente, a LUS atua como uma métrica quantitativa eficaz para mensurar a extensão da ventilação alveolar22. Estudos confirmaram sua utilidade na avaliação da gravidade e do prognóstico da SDRA neonatal23. Em consonância com pesquisas anteriores, nosso estudo clínico revelou que as medidas de LUS em neonatos com SDRA foram significativamente mais elevadas em comparação com aquelas observadas em neonatos saudáveis. Além disso, entre os neonatos afetados, o subgrupo grave apresentou valores de LUS marcadamente superiores ao subgrupo leve, destacando uma relação direta entre leituras elevadas de LUS e a gravidade de atelectasia, edema pulmonar e consolidação pulmonar24. Nossos achados indicaram ainda que os pacientes que vieram a óbito também apresentaram LUS notavelmente mais alta do que os sobreviventes. Foi observada uma forte correlação positiva entre a LUS e o miR-486-3p sérico em neonatos não sobreviventes, reforçando o valor sinérgico desses dois indicadores. Cada método possui características inerentes: a LUS é livre de radiação, portátil e adequada para monitoramento contínuo à beira do leito, embora sua interpretação dependa fortemente da experiência do operador e esteja sujeita a viés subjetivo. A detecção do miR-486-3p sérico fornece resultados quantitativos objetivos e repetíveis, mas não consegue refletir alterações morfológicas em tempo real no tecido pulmonar. Na prática clínica, recomenda-se o uso rotineiro dessa abordagem combinada nas unidades de terapia intensiva neonatal. É adequada para estratificação precoce de risco em neonatos com SDRA suspeita ou confirmada, avaliação dinâmica regular da progressão da doença e julgamento auxiliar do prognóstico clínico a curto prazo. Contudo, esse método não tem a intenção de substituir exames de imagem definitivos ou investigações etiológicas; apresenta especificidade limitada quando aplicado a neonatos com outras doenças pulmonares inflamatórias associadas. Além disso, como nossa pesquisa foi conduzida em centro único, sua aplicabilidade a populações de diferentes regiões ainda precisa ser verificada.
Clinicamente, observamos que valores elevados de LUS, combinados com altos níveis séricos de miR-486-3p, estavam associados a um prognóstico desfavorável na SDRA neonatal, sugerindo que o miR-486-3p pode estar estreitamente ligado a lesão vascular pulmonar grave e à capacidade prejudicada de reparo vascular no pulmão imaturo. Nossos experimentos celulares in vitro complementaram essa observação clínica ao demonstrar que o miR-486-3p modula diretamente a proliferação e a apoptose de células endoteliais, processos centrais que governam a integridade vascular e o reparo no pulmão neonatal. Além disso, pesquisas demonstraram que os miRNAs desempenham papéis cruciais em diversos processos celulares25,26. É bem estabelecido que os miRNAs exercem seus efeitos principalmente por meio da regulação pós-transcricional de genes-alvo, envolvendo predominantemente o splicing do miRNA e a repressão da tradução proteica27. O gene DLL4 desempenha um papel importante no desenvolvimento vascular e na angiogênese28. Pesquisas indicaram que a família do microRNA-30 tem como alvo o DLL4 para modular o comportamento das células endoteliais durante a angiogênese29. Esses achados sugerem que a modulação do DLL4 endotelial pode estar associada à lesão vascular pulmonar na SDRA neonatal. Em nossa investigação, identificamos e validamos a relação de direcionamento entre o miR-486-3p e o DLL4. Análises subsequentes revelaram que a expressão elevada de miR-486-3p inibiu significativamente a proliferação de HPMECs induzidos por LPS, ao mesmo tempo que promoveu a apoptose. Importante, a expressão de DLL4 pôde reverter parcialmente os efeitos mediados pelo miR-486-3p. Isso sugere que o miR-486-3p tem como alvo o DLL4 para afetar a função das HPMECs e regular a progressão da SDRA neonatal. No entanto, se ele afeta diretamente a disfunção vascular pulmonar e contribui para a SDRA ainda precisa ser mais verificado. Notavelmente, o DLL4 reverteu apenas parcialmente as alterações celulares induzidas pelo miR-486-3p. Como um miRNA típico, o miR-486-3p modula múltiplos genes-alvo downstream. Estudos futuros focarão na identificação de mais genes-alvo para esclarecer o mecanismo completo do miR-486-3p na SDRA neonatal.
Por fim, vale ressaltar que a padronização rigorosa das etapas-chave do protocolo garante dados confiáveis e reproduzíveis. Unificamos os procedimentos de coleta de amostras, adotamos protocolos padronizados de cultura celular e transfeção, e incluímos réplicas independentes para minimizar erros experimentais. Os problemas operacionais comuns e suas soluções são resumidos a seguir: Para a avaliação por LUS, padronize o protocolo de varredura de 12 regiões e as regras unificadas de pontuação, e ajuste a postura do recém-nascido para obter imagens nítidas. Para a detecção de miRNA sérico, evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento, verifique a pureza do RNA (A260/A280 = 1,8–2,1) e inclua réplicas técnicas. Para modelos celulares induzidos por LPS, utilize LPS recém-preparado a 1 mg/L e condições de cultura estáveis. Otimize a confluência celular e a proporção dos reagentes durante a transfeção, e troque o meio para reduzir a citotoxicidade. Garanta a lise celular completa e a operação padronizada para ensaios de dupla luciferase.
Coletivamente, em comparação com métodos convencionais, incluindo imagem torácica, análise de gases sanguíneos e testes de biomarcadores únicos, a estratégia combinada de LUS/miR-486-3p é livre de radiação, de baixo custo e fácil de realizar, com desempenho preditivo aprimorado. Atua como uma ferramenta prognóstica complementar confiável para a SDRA neonatal. Clinicamente, este método pode ser aplicado para estratificação precoce de risco e monitoramento dinâmico do estado clínico em unidades de terapia intensiva neonatal. Também pode servir como um índice unificado de avaliação para estudos multicêntricos. Mecanicamente, o eixo validado miR-486-3p/DLL4 fornece novas direções para a exploração de mecanismos patológicos e terapias direcionadas. No entanto, essa abordagem combinada também apresenta limitações técnicas inerentes. Os resultados do LUS variam entre operadores, e o miR-486-3p carece de especificidade para doenças inflamatórias pulmonares. Este método permite apenas detecção em um único ponto temporal e não pode substituir exames definitivos de imagem ou exames etiológicos.
Apesar dos resultados promissores, várias limitações merecem atenção. Primeiramente, o delineamento com base em uma única instituição restringe a generalização de nossas conclusões. Em segundo lugar, não contamos com uma coorte de validação externa para verificar a robustez do desempenho preditivo do painel LUS/miR-486-3p. Terceiro, o miR-486-3p sérico foi medido em apenas um único ponto temporal, não capturando sua associação dinâmica com a progressão da doença. Quarto, a ausência de análises complementares de proteínas e de validação in vitro/in vivo limita a robustez de nossas inferências mecanicistas. Por fim, o papel específico do miR-486-3p na fisiopatologia da SDRA neonatal permanece incompletamente elucidado e exige investigação adicional. Em conclusão, o aumento do LUS e os níveis séricos elevados de miR-486-3p em neonatos diagnosticados com SDRA atuam como pontos de referência significativos na prática clínica. A avaliação sinérgica desses dois biomarcadores pode facilitar a predição precisa da gravidade e do prognóstico da SDRA neonatal, demonstrando, assim, certo valor de aplicação clínica.
Divulgações
O Grammarly foi utilizado para otimização da expressão em inglês, verificação gramatical e padronização de formato. Todas as ideias de pesquisa, experimentos, dados e conclusões são trabalhos originais dos autores.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos PCR de 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Solução de Tripsina-EDTA a 0,25% | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| Tubos Microcentrífugos de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Incubadora de Cultivo Celular com 5% de CO2 e Umidade Controlada | Thermo Fisher | 3111 | |
| Placas de Cultivo Celular de 6 Poços | Corning | 3516 | |
| Placas de Cultivo Celular de 96 Poços | Corning | 3599 | |
| Etanol Absoluto | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Kit de Detecção de Apoptose por Anexina V-FITC | BD Biosciences | 556547 | |
| Centrífuga de Bancada | Eppendorf | 5810R | |
| Capa de Segurança Biológica | Thermo Fisher | 1300 Series A2 | |
| Kit de Contagem Celular CCK-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| Tubos Descartáveis Estéreis para Coleta de Sangue | BD Vacutainer | 367815 | |
| Plasmídeo de Superexpressão de DLL4 (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| Plasmídeo Repórter de Luciferase DLL4-MUT | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| Plasmídeo Repórter de Luciferase DLL4-WT | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| Meio DMEM com Alta Concentração de Glicose | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| Kit de Ensaio Repórter Dual-Luciferase | Biolab | BL101A | |
| Leitor de Ensaio Imunoenzimático (ELISA) | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 10099141C | |
| Pontas de Pipeta com Filtro (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-200-R-S, TF-1000-R-S | |
| Citômetro de Fluxo | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Tubos para Citometria de Fluxo | BD Biosciences | 352054 | |
| Centrífuga Refrigerada de Alta Velocidade | Eppendorf | 5424R | |
| Lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Sistema de Ultrassom Pulmonar | Mindray | M9 | |
| Espetrofotômetro de Microvolume | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | |
| Inibidor de miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486-AS | |
| Mimético de miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486 | |
| Conjunto de Primers para qPCR de miR-486-3p | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| Inibidor Controle Negativo (NC) | RiboBio | HmiR0001-AS | |
| Mimético Controle Negativo (NC) | RiboBio | HmiR0001 | |
| Plasmídeo de Superexpressão Controle Negativo (OE-NC) | GenePharma | EX-NEG | |
| Solução de Penicilina-Estreptomicina (100×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| Conjunto de Pipetas (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | Research Plus | |
| Solução de Coloração com Iodeto de Propídio (PI) | BD Biosciences | 556463 | |
| Sistema de PCR Quantitativo em Tempo Real | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 7500 Fast | |
| Água Livre de RNase | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| RT-PCR Quick Master Mix | Toyobo | FSQ-101 | |
| Pipetas Descartáveis Estéreis | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| SYBR Green Real-time PCR Master Mix | Toyobo | QPK-201 | |
| Reagente Trizol | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| Conjunto de Primers para qPCR de U6 snRNA | RiboBio | HmiRQP0001 | |
| Misturador Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Referências
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