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Preparação de Amostras de Medula Óssea Fixadas em Formalina e Embebidas em Parafina para Transcriptômica Espacial Utilizando Descalcificação Baseada em EDTA

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DOI:

10.3791/72474

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28 de agosto de 2026

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Neste artigo

Resumo

Um fluxo de trabalho padronizado para o preparo de amostras ósseas fixadas em formalina e emblocadas em parafina para a análise de transcriptômica espacial inclui uma etapa de descalcificação com EDTA de 10 dias para preservar a integridade do RNA. Pontos-chave de controle de qualidade ajudam a determinar se as amostras atendem aos requisitos para análises downstream de expressão gênica espacial.

Resumo

A medula óssea (MO) é uma estrutura complexa e dinâmica na qual as relações espaciais influenciam o comportamento celular, a sinalização e a função. Por esse motivo, compreender completamente a dinâmica das interações celulares exige técnicas espaciais complementares que preservem e mapeiem a arquitetura das populações celulares in situ. Apesar dos avanços significativos nas tecnologias de célula única que contribuíram para a compreensão da heterogeneidade transcricional de tecidos da MO saudáveis e doentes, a organização espacial de diferentes tipos celulares, os programas regulatórios específicos de nicho e suas interações ainda precisam ser mais estudados. Desenvolvimentos recentes na transcriptômica espacial permitiram a análise imparcial da expressão gênica com contexto espacial em diferentes tecidos, tornando essas tecnologias complementares aos métodos de célula única, que carecem de resolução espacial. Embora a transcriptômica espacial tenha sido amplamente utilizada em tecidos moles, seu uso em tecidos mineralizados, como a MO, permanece limitado devido aos desafios associados ao processamento de tecido ósseo. O protocolo apresentado aqui foi utilizado para preparar amostras fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE) de tecidos de camundongo e humano saudáveis e doentes. Um passo de descalcificação com ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) de 10 dias é incluído para preservar a integridade do RNA e viabilizar o uso da transcriptômica espacial em amostras de ossos longos. Este protocolo descreve o preparo de amostras de MO para análise transcriptômica espacial, incluindo o processamento, preservação e corte de tecidos, bem como etapas essenciais de avaliação da qualidade, como a avaliação da integridade do corte, da morfologia tecidual e da qualidade do RNA. O fluxo de trabalho também permite a identificação de tipos celulares e a integração com dados transcriptômicos de célula única para caracterizar a composição celular, definir interações célula-célula e visualizar a distribuição espacial de células heterogêneas transcricionalmente em estados saudáveis e doentes. De modo geral, este fluxo de trabalho prepara tecidos saudáveis e malignos totalmente mineralizados para análise transcriptômica espacial, preservando ao mesmo tempo a arquitetura da medula óssea.

Introdução

A medula óssea (BM) é um órgão altamente complexo e compartimentalizado que atua como o local primário para a hematopoiese e a maturação de células imunes1,2. Este tecido heterogêneo compreende uma ampla variedade de linhagens celulares hematopoiéticas, mesenquimais, endoteliais e imunes que coexistem em um nicho tridimensional altamente especializado e organizado3,4. Dentro desse nicho, cada população celular ocupa territórios anatômicos distintos, e o contexto espacial desempenha um papel fundamental na regulação do comportamento, sinalização e função celulares4,5. A proximidade física com estruturas específicas, como osso trabecular ou redes vasculares, regula processos fisiológicos essenciais, incluindo a manutenção da quiescência de células-tronco hematopoiéticas (HSC) e a remodelação óssea6,7. Consequentemente, esse microambiente dinâmico e as interações rigorosamente reguladas entre seus componentes celulares e estromais moldam as redes regulatórias que mantêm a homeostase e influenciam a progressão de malignidades hematológicas8,9,10,11,12,13.

Os avanços no sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) revolucionaram nossa compreensão da diversidade celular da medula óssea (BM), permitindo a descoberta de subtipos celulares previamente não reconhecidos e suas interações previstas dentro do nicho3,10,11,12,14,15,16. No entanto, a transcriptômica de célula única, embora forneça informações de alta resolução sobre os componentes individuais do nicho hematopoético, é inerentemente limitada pelo processo de digestão tecidual, que dissocia as células de seu ambiente nativo e potencialmente altera seu estado original17, e pela ausência de contexto espacial que define a organização do tecido ósseo4,18. Essa perda de contexto posicional torna impossível mapear definitivamente onde populações específicas, distintas em seu perfil transcricional, estão localizadas ou como interagem com células vizinhas19. Além disso, o tecido ósseo denso muitas vezes é apenas parcialmente dissociado, resultando na sub-representação de populações celulares-chave, como osteócitos e adipócitos, nos conjuntos de dados de scRNA-seq e em uma representação enviesada da heterogeneidade tecidual20,21. A transcriptômica espacial permite o estudo da expressão gênica in situ, em seções de tecido com preservação espacial, recuperando assim informações contextuais e superando as limitações das tecnologias de célula única8,19,22,23,24,25,26. Essa tecnologia representa um avanço essencial na área, pois permite a localização espacial precisa e a organização estrutural das diferentes populações celulares que compõem a BM, o que é indispensável para compreender suas interações e papéis funcionais dentro de seu microambiente nativo8,26. Além disso, no contexto de doenças, a transcriptômica espacial permite que pesquisadores e clínicos fechem a lacuna entre a patologia tradicional e a genômica de alto rendimento, possibilitando sobrepor dados moleculares a imagens morfológicas1,8. As tecnologias de transcriptômica espacial podem ser classificadas em dois grandes grupos: métodos baseados em sequenciamento e métodos baseados em imagem17,24. Plataformas baseadas em sequenciamento, como Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) e a plataforma de código aberto Open-ST, capturam mRNA em matrizes ou microesferas espacialmente codificadas antes do sequenciamento de nova geração. Métodos baseados em imagem, incluindo Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX e Xenium, visualizam diretamente os transcritos in situ por meio de hibridização multiplexada ou química de sondas padlock27,28. Alternativamente, as plataformas podem ser categorizadas como direcionadas ou não direcionadas, dependendo se exigem detecção baseada em sondas17,24.

Os métodos de transcriptômica espacial têm sido amplamente aplicados em tecidos moles, como cérebro, coração e fígado, onde a obtenção de cortes histológicos intactos é simples29,30,31. Em contraste, a aplicação da transcriptômica espacial em tecido ósseo é consideravelmente mais desafiadora devido à sua natureza mineralizada, a qual exige um processo de descalcificação32,33, ou seja, a remoção controlada de fosfato de cálcio, tornando o tecido suficientemente macio para o corte e para análises histológicas ou moleculares subsequentes8,20,23,34. Os métodos tradicionais de descalcificação comumente utilizados na prática clínica normalmente dependem de soluções ácidas fortes, como ácido clorídrico, nítrico, fórmico ou fosfórico, que degradam severamente a integridade do RNA e alteram a morfologia celular35,36. Essa degradação molecular reduz a relação sinal-ruído nos ensaios espaciais, frequentemente resultando em taxas de detecção gênica inaceitavelmente baixas em comparação com tecidos moles8,10. Essa limitação ressalta a necessidade de fluxos de trabalho padronizados de descalcificação que preservem de forma confiável a integridade do mRNA em amostras mineralizadas para análises espaciais baseadas em sequenciamento8,20.

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho padronizado para o preparo de amostras de medula óssea (BM) fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE) para transcriptômica espacial, previamente aplicado por Muiños-Lopez et al.8. O fluxo de trabalho inclui uma etapa de descalcificação de 10 dias utilizando ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) em pH controlado. Diferentemente dos ácidos agressivos, o EDTA atua como um quelante suave que preserva a estrutura microscópica e mantém a qualidade dos ácidos nucleicos, favorecendo seu uso em aplicações moleculares8,20,33,36,37. Como prova de conceito, o protocolo foi implementado em amostras de tecido ósseo de modelos murinos saudáveis e com mieloma múltiplo (MM), bem como em espécimes de medula óssea humanos provenientes de indivíduos saudáveis e doentes, sendo as amostras subsequentemente sequenciadas na plataforma Visium Spatial Gene Expression38. O fluxo de trabalho inclui procedimentos padronizados para aquisição de tecido a partir de amostras ósseas humanas e murinas, fixação, descalcificação, desidratação, inclusão em parafina e corte em micrótomo, seguidos por um pipeline abrangente de controle de qualidade que abrange avaliação da integridade dos cortes, coloração com hematoxilina e eosina (H&E), avaliação da qualidade do RNA (DV200) e imunofluorescência (IF) opcional para verificação do tipo celular. Essas etapas preparatórias garantem que apenas cortes de alta qualidade prossigam para os fluxos de trabalho downstream de transcriptômica espacial, incluindo pré-processamento dos cortes de tecido, construção de biblioteca, sequenciamento e análise subsequente com controle de qualidade dos dados.

Este procedimento padronizado auxilia na preparação e na avaliação da qualidade de amostras de MO humanas e murinas para análise de transcriptômica espacial. Tem como objetivo facilitar investigações de programas regulatórios específicos de nicho em distúrbios hematológicos e esqueléticos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a Diretiva Europeia 2010/63/UE sobre a proteção de animais utilizados para fins científicos e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Navarra (Comité de Ética para la Experimentación Animal; protocolos CEEA082-20 e CEEA039-20). O cuidado, manejo e eutanásia dos animais foram realizados em conformidade com a legislação espanhola para minimizar dor e sofrimento.

O estudo com seres humanos foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de Medicina da Universidade de Navarra (Comisión de Ética de Investigación, CEI; projetos 2022.100mod1 e 2023.172) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Serviço de Saúde de Navarra (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1). Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram conduzidos de acordo com os princípios éticos da Declaração de Helsinque. Os dados pessoais foram tratados de forma confidencial, em conformidade com a Lei Orgânica espanhola 3/2018 sobre Proteção de Dados Pessoais e Garantia dos Direitos Digitais e com a Lei espanhola 14/2007 sobre Pesquisa Biomédica.

NOTA: Uma lista detalhada dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo encontra-se fornecida na Tabela de Materiais. O pipeline experimental abrangente para a implementação de transcriptômica espacial em tecidos ósseos é ilustrado esquematicamente em Figura 1 e organizadas em três fases operacionais: aquisição de amostras, controle de qualidade (CQ) e perfilamento transcriptômico espacial. A aquisição de amostras inclui a coleta de fragmentos ósseos humanos ou murinos, seguida por fixação, descalcificação com EDTA, desidratação, inclusão em parafina, corte e preparação de lâminas. A fase de CQ avalia a integridade histológica e a preservação do RNA. Seções ósseas validadas são então submetidas à permeabilização tecidual em lâmina, preparação de biblioteca, sequenciamento e análise de dados.

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Figura 1: Fluxo de coleta de amostras e preparação baseado em EDTA para tecidos ósseos murinos e humanos. Fêmures de camundongos e amostras ósseas humanas são coletados, fixados, descalcificados em EDTA, desidratados, emblocados em parafina e seccionados. A qualidade das amostras é avaliada por coloração com H&E e avaliação da integridade do RNA (DV200), seguida pelo pré-processamento do tecido para transcriptômica espacial, preparação de biblioteca, sequenciamento e controle de qualidade dos dados. Abreviações: BM = medula óssea; DV200 = porcentagem de fragmentos de RNA com mais de 200 nucleotídeos; EDTA = ácido etilenodiaminotetraacético; H&E = hematoxilina e eosina; QC = controle de qualidade. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

1. Aquisição e processamento de amostras de tecido ósseo

  1. Coleta de osso de camundongo
    1. Anestesiar os animais com 5% de isoflurano e confirmar a perda de reflexos.
    2. Uma vez completamente anestesiados, realizar eutanásia por dislocação cervical seguindo as diretrizes institucionais e regulamentares.
      ​NOTA: A eutanásia deve ser realizada por pessoal treinado, e a morte deve ser confirmada antes de prosseguir com a coleta de tecido.
    3. Desinfetar a pele borrifando etanol a 70% na superfície dorsal do camundongo e, com tesoura cirúrgica, fazer uma pequena incisão para remover cuidadosamente a pele e expor os membros posteriores.
    4. Dissecar os membros posteriores cortando acima da articulação do quadril e transferi-los para um tubo de 50 mL contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) fria . Colocar o tubo no gelo.
    5. Remover o músculo e o tecido conjuntivo aderidos utilizando pinça estéril e bisturi.
    6. Transferir os ossos para um recipiente estéril de 50 mL previamente preenchido com DPBS limpa e fria, em seguida colocar o recipiente no gelo.
    7. Prosseguir imediatamente com a fixação do tecido da amostra para preservar a integridade tecidual.
  2. Manuseio de amostras ósseas humanas
    1. Receber biópsias de núcleo ósseo ou fragmentos ósseos cirúrgicos em recipientes estéreis de 100 mL.
    2. Transferir os fragmentos ósseos para um recipiente limpo e estéril de 100 mL previamente preenchido com DPBS fria, em seguida colocá-lo no gelo.
    3. Prosseguir imediatamente com a fixação da amostra para preservar a integridade tecidual.
      ATENÇÃO: As amostras humanas devem ser manipuladas sob condições BSL 2.
  3. Fixação do tecido ósseo
    1. Retirar o recipiente de 50 mL ou 100 mL contendo a amostra óssea e descartar o DPBS.
    2. Rotular as cassete plásticas e introduzir as amostras ósseas em cassete individuais. Fechar as tampas com segurança para evitar perda tecidual durante o processamento subsequente.
      ​NOTA: Para amostras de camundongo, colocar um osso por cassete. Para amostras ósseas humanas, se necessário, usar um bisturi estéril para cortar o tecido em fragmentos pequenos o suficiente para caber em cassete padrão, colocando um fragmento por cassete. Se as amostras ósseas humanas estiverem muito duras para seccionamento nesta etapa, podem ser deixadas intactas e transferidas para a solução de descalcificação; uma vez descalcificadas, o tecido amolecido pode então ser cortado em fragmentos de tamanho apropriado e colocados em cassete rotuladas.
    3. Adicionar solução de formaldeído tamponada a 4% na proporção de 1:20 (amostra:solução fixadora) e incubar a amostra por 24 h a 4 °C.
      ATENÇÃO: Manipular a solução fixadora dentro de uma cabine de exaustão química devido à sua toxicidade e vapores voláteis.
      NOTA: Evitar superfixação (>48 h), que reduz a integridade do RNA em fluxos de trabalho FFPE39.
  4. Descalcificação do tecido ósseo mineralizado
    1. Descartar o formalina e lavar a amostra óssea com água ultrapura. Enxaguar com água, agitar brevemente e descartar para eliminar qualquer resíduo remanescente de formalina.
    2. Preparar uma solução de EDTA 0,25 M em água ultrapura e ajustar o pH para 6,95.
      NOTA: Embora o EDTA seja frequentemente ajustado a pH 8,0 em protocolos tradicionais de descalcificação, este fluxo de trabalho utiliza EDTA em aproximadamente pH 6,95 para promover uma quelatização eficiente, preservando ao mesmo tempo a morfologia tecidual e a qualidade do RNA8.
    3. Adicionar a solução de EDTA ao recipiente contendo a amostra óssea e incubar por 10 dias a 4 °C com agitação suave.
      ​NOTA: Para amostras de camundongo, aproximadamente 50 mL de solução de EDTA geralmente é suficiente. Para amostras ósseas humanas, aproximadamente 100 mL é normalmente utilizado. No entanto, este volume pode ser ajustado com base no tamanho do osso para garantir imersão completa e descalcificação eficaz.
    4. Após 5 dias de descalcificação, descartar a solução de EDTA e substituí-la pelo mesmo volume de EDTA fresco, já que a capacidade quelante se satura ao longo do tempo. Continuar a incubação nas mesmas condições.
    5. Após 10 dias de incubação, descartar a solução de EDTA e avaliar se a descalcificação está completa.
      1. Fazer um pequeno corte com um bisturi estéril ou inserir uma agulha fina e estéril em um canto ou região periférica do tecido, sempre escolhendo uma área de baixa relevância analítica para evitar alterar regiões de interesse. Colocar o osso em uma placa de Petri estéril para estabilizar a amostra durante o corte ou inserção da agulha. Se o tecido puder ser cortado facilmente ou a agulha passar com mínima resistência, a amostra está adequadamente descalcificada.
      2. No caso de fêmures de camundongo, dobrar suavemente o osso com pinça para avaliar a flexibilidade, um indicador confiável da remoção completa do mineral.
        NOTA: A duração da etapa de descalcificação depende do tamanho e espessura da amostra óssea, bem como do volume de EDTA utilizado. Se o osso permanecer firme após o período inicial de incubação, continuar a descalcificação até que o tecido esteja suficientemente macio para ser cortado facilmente. A prolongação excessiva pode comprometer a qualidade tecidual e a integridade do RNA, portanto a extensão deve ser limitada ao tempo mínimo necessário para alcançar amolecimento adequado20.
  5. Desidratação
    1. Lavar adicionando água ultrapura ao recipiente contendo a amostra óssea, em seguida incubar por 5 min a 4 °C com agitação.
    2. Descartar a água e substituí-la por solução de etanol a 70%. Incubar por 1 h a 4 °C.
      NOTA: Esta etapa pode servir como ponto de parada. As amostras podem ser armazenadas em etanol a 70% a 4 °C antes de prosseguir para as etapas seguintes. A duração máxima de armazenamento não foi validada experimentalmente neste protocolo, portanto os usuários devem proceder de acordo com as práticas padrão de seu laboratório.
    3. Desidratar sequencialmente a amostra em concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 96%; 1 h cada a 4 °C), seguido por etanol a 100% durante a noite a 4 °C.
    4. Descartar o etanol a 100% e substituí-lo por xilol. Incubar por 4 h à temperatura ambiente (RT).
    5. Descartar o xilol e colocar a cassete da amostra em um recipiente de vidro contendo parafina derretida e limpa. Incubar na parafina derretida durante a noite a 60 °C.
      NOTA: Tempos de infiltração mais curtos podem ser utilizados quando sistemas de processamento assistidos a vácuo estiverem disponíveis, pois esses dispositivos facilitam uma penetração mais eficiente da parafina40,41,42.
      ATENÇÃO: Todas as etapas envolvendo xilol e soluções de etanol em gradiente devem ser realizadas dentro de uma cabine de exaustão química para garantir ventilação adequada e minimizar a exposição a vapores tóxicos e inflamáveis.
  6. Inclusão em parafina
    ​NOTA: Limpar as superfícies da estação de inclusão com uma solução de descontaminação de RNase para prevenir a degradação do RNA.
    1. Ligar a estação de inclusão e pré-aquecer o reservatório de parafina, o banho de parafina para cassete, o banho de parafina para moldes e a placa de aquecimento de moldes a 60 °C. Ativar a placa fria para que esfrie antes da inclusão.
    2. Deixar a parafina derreter completamente e, somente então, colocar as cassete contendo as amostras infiltradas com parafina no banho de parafina para cassete. Incubar por 2 h para garantir a eliminação completa do xilol antes da inclusão.
    3. Colocar todos os moldes necessários no banho de parafina para moldes.
      NOTA: Para amostras humanas, usar moldes metálicos padrão de inclusão. Para amostras de camundongo, usar moldes plásticos de inclusão compatíveis com a plataforma Visium que incluam uma cavidade quadrada com dimensões adequadas para o posicionamento correto dos cortes em lâminas Visium. Como ossos inteiros de camundongo não cabem totalmente dentro da cavidade quadrada desses moldes, cortar os ossos imediatamente antes da inclusão usando um bisturi estéril para obter fragmentos de tamanho apropriado. Um ou dois fragmentos ósseos podem ser incluídos por molde, dependendo de suas dimensões.
    4. Adicionar uma camada fina de base de parafina fresca dispensando parafina derretida da saída central da estação de inclusão.
    5. Abrir a cassete e transferir suavemente o tecido da cassete para o molde usando pinça aquecida.
    6. Colocar o molde cheio de parafina na placa de aquecimento de moldes e, enquanto a parafina ainda estiver líquida, orientar o tecido no plano de corte desejado com pinça aquecida.
    7. Colocar o molde na superfície fria da estação de inclusão para fixar brevemente a posição do fragmento ósseo.
    8. Encher completamente o molde com parafina derretida do dispensador, garantindo que o tecido esteja totalmente coberto e que não permaneçam bolhas grandes.
    9. Posicionar a cassete rotulada na parte superior do molde para que ela forme a base do bloco de parafina.
    10. Transferir o molde com a cassete acoplada para a placa fria da estação de inclusão. Deixar a parafina solidificar completamente por 10 min, até que o bloco esteja opaco e firme.
    11. Uma vez solidificado, remover o bloco de parafina do molde e armazená-lo a 4 °C até o seccionamento.
      NOTA: Esta etapa pode servir como ponto de parada. O bloco de parafina pode ser armazenado a 4 °C; no entanto, sempre que possível, o seccionamento do tecido e as análises espaciais transcriptômicas subsequentes devem ser realizados o mais rápido possível após a inclusão para minimizar a degradação do RNA durante o armazenamento43,44.
  7. Seccionamento e preparação de lâminas
    NOTA: Limpar o micrótomo e o banho-maria com uma solução de descontaminação de RNase para prevenir a degradação do RNA.
    1. Encher o banho-maria com água destilada e pré-aquecê-lo a 42 °C. Ligar o micrótomo e instalar uma lâmina nova. Rotular lâminas de microscópio com lápis.
    2. Montar o bloco de parafina no porta-espécime, garantindo que a cassete esteja orientada de acordo com o plano de corte longitudinal desejado.
      ​NOTA: Preparar um saco plástico cheio de gelo e, quando o corte se tornar difícil devido à parafina mole, colocar o saco de gelo diretamente sobre o bloco enquanto ele permanece montado no micrótomo, fixando-o com um elástico por vários minutos para firmar a parafina e melhorar a qualidade do corte.
    3. Definir a espessura do micrótomo para 20 µm e realizar os cortes de desbaste.
    4. Alterar a configuração do micrótomo para 5 µm. Coletar quatro cortes de 5 µm em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL rotulado e livre de RNase. Manter o tubo em gelo seco e armazenar a -80 °C.
    5. Continuar o seccionamento a 5 µm e flutuar as fitas no banho-maria. Uma vez que o corte esteja totalmente expandido e sem rugas, recolhê-lo com a lâmina rotulada.
      1. A cada conjunto definido de cortes (por exemplo, a cada 5-10 fitas, dependendo do tamanho do tecido), coletar quatro cortes adicionais de 5 µm em um novo tubo de 1,5 mL rotulado. Repetir este processo até obter um total de três tubos de 1,5 mL contendo cortes de 5 µm.
        NOTA: Se o tecido rachar, quebrar ou não puder ser obtido em um corte contínuo, a amostra não está completamente descalcificada e requer tempo adicional de descalcificação. Recuperar a amostra revertendo as etapas do fluxo de trabalho até a fase de descalcificação. Para isso, derreter o bloco de parafina a 60 °C por aproximadamente 2 h e transferir o espécime para xilol (2 h). Reidratar a amostra através de soluções de etanol em gradiente (100%, 96%, 80%, 70%) seguido por água destilada. Retornar a amostra reidratada para EDTA 0,25 M fresco (pH 6,95) e estender o período de descalcificação conforme necessário antes de prosseguir com desidratação, re-inclusão e seccionamento. Este procedimento de recuperação deve ser usado estritamente como último recurso, pois reverter o processamento FFPE pode comprometer a integridade do RNA.
    6. Colocar as lâminas em uma estufa a 37 °C durante a noite para evaporar qualquer água residual, em seguida armazená-las a 4 °C.
    7. Para melhorar a adesão do tecido, opcionalmente assar as lâminas por 3 h a 42 °C antes de incubá-las durante a noite a 37 °C.
      NOTA: Esta etapa geralmente não é necessária ao usar as lâminas de vidro listadas na Tabela de Materiais, pois essas lâminas proporcionam forte adesão e o tecido normalmente permanece firmemente aderido durante todo o processamento. Esta etapa pode servir como ponto de parada. As lâminas podem ser armazenadas a 4 °C; no entanto, sempre que possível, as análises espaciais transcriptômicas subsequentes devem ser realizadas o mais rápido possível após a inclusão para minimizar a degradação do RNA durante o armazenamento43,44.

2. Avaliação da qualidade da amostra

  1. Avaliação da qualidade das seções
    1. Examine todas as seções uma a uma sob um microscópio de luz padrão (4×–10×). Inspecione cada lâmina para garantir que as seções não estejam fragmentadas e registre a qualidade de cada seção.
      ​NOTA: Verifique a presença de dobras, rugas, compressão ou marcas de vibração, o que pode indicar problemas com a dureza da parafina, afiação da lâmina ou descalcificação incompleta. Confirme que nenhuma área do tecido esteja ausente devido à descolagem durante o corte ou transferência para o banho de água.
    2. Selecione as seções com a melhor preservação para a transcriptômica espacial (as mais completas, com melhor morfologia).
    3. Identifique as seções consecutivas adjacentes às selecionadas e reserve-as para coloração H&E e IF, garantindo que a imagem corada corresponda o mais fielmente possível ao tecido que será sequenciado.
  2. Coloração H&E para integridade tecidual
    1. Coloque as lâminas em uma grade de vidro para coloração e incube-as por 15 min a 60 °C.
    2. Transfira a grade para frascos de vidro contendo xilol por 15 min.
    3. Reidrate as seções movendo a grade por frascos de coloração contendo etanol a 100%, 96%, 80% e 70%, incubando por 5 min em cada solução.
      ​ATENÇÃO: Todos os passos envolvendo xilol e soluções de etanol em gradiente devem ser realizados dentro de uma câmara de exaustão química para garantir ventilação adequada e minimizar a exposição a vapores tóxicos e inflamáveis.
    4. Lave as lâminas por 5 min em um frasco de coloração cheio de água.
    5. Imersão da grade em hematoxilina por 10 min, seguida de lavagem sob água corrente até que a água de enxágue fique transparente.
    6. Imersão da grade em água contendo cinco gotas de ácido clorídrico concentrado, agitando suavemente até aparecer um tom avermelhado.
    7. Transfira a grade para água saturada com carbonato de lítio até que uma coloração azul estável se desenvolva, depois enxágue brevemente em água.
    8. Colore as seções em eosina a 1% (p/v) por 5 min, depois enxágue novamente em água.
    9. Desidrate as lâminas movendo a grade por frascos de coloração contendo água, etanol a 70%, 80%, 96% e 100%, incubando por 5 min em cada solução.
    10. Limpe as lâminas com xilol por 15 min.
    11. Seque suavemente o verso de cada lâmina, aplique meio de montagem sobre uma lamínula e monte as seções. Deixe as lâminas secarem em RT por 24 h antes da obtenção de imagens.
    12. Realize a imagem do tecido utilizando um microscópio de alta resolução com aumento de 20x.
      NOTA: Realize a coloração H&E em seções adjacentes primeiro como etapa de controle de qualidade para avaliar a adequação da amostra para a transcriptômica espacial. Após a seleção, realize uma segunda coloração H&E diretamente na seção destinada à transcriptômica espacial, seguindo as orientações do fabricante para preparação de tecidos na plataforma de expressão gênica espacial listada na Tabela de Materiais.
  3. Avaliação da integridade do RNA (DV200)
    ​NOTA: Para o protocolo de expressão gênica espacial, o número tradicional de integridade do RNA (RIN) é ineficaz porque os picos do RNA ribossomal 18S e 28S geralmente estão ausentes em tecidos fixados. Portanto, a métrica DV200, definida como a porcentagem de fragmentos de RNA maiores que 200 nucleotídeos, é comumente utilizada como parâmetro de qualidade mais informativo do que o RIN para amostras clínicas degradadas. Para o Visium v2, a 10x Genomics recomenda o uso de blocos FFPE com valor DV200 ≥ 30% para garantir hibridização eficiente das sondas e desempenho ideal do ensaio. A seleção de blocos de tecido com os valores DV200 mais altos disponíveis ajuda a prevenir falhas no sequenciamento e maximiza a sensibilidade dos spots.
    1. Recupere os tubos de 1,5 mL contendo as seções de 5 µm coletadas durante o passo de corte de tecido e coloque-os no gelo para extração de RNA.
    2. Extraia o RNA total. Este procedimento padronizado inclui desparafinização da amostra, digestão com proteinase K para reverter as ligações cruzadas de formalina, remoção do DNA genômico por tratamento com DNase I e eluição final do RNA purificado em água livre de RNase.
    3. Avalie a integridade do RNA utilizando um sistema baseado em eletroforese capilar com ensaio de RNA de alta sensibilidade. Um resumo do fluxo de trabalho é fornecido no Arquivo Suplementar 142,45,46,47,48.
  4. IF opcional para verificação do tipo celular
    1. Coloque a lâmina FFPE em uma grade de vidro para coloração e incube-a por 15 min a 60 °C.
    2. Transfira a grade para frascos de vidro contendo xilol por 15 min.
    3. Reidrate a seção movendo a grade por etanol a 100%, 96%, 80% e 70% por 2 min cada, seguido de 5 min em água e 5 min em PBS-Tween (1x PBS suplementado com 0,1% de Tween-20).
      ATENÇÃO: Todos os passos envolvendo xilol e etanol devem ser realizados dentro de uma câmara de exaustão química.
    4. Realize a recuperação de antígenos de acordo com as recomendações do fabricante para o anticorpo primário, garantindo que o tampão de recuperação, pH e condições de aquecimento correspondam à ficha técnica do anticorpo. NOTA: Neste fluxo de trabalho, a recuperação de antígenos é realizada com Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH 9,0, em um sistema de aquecimento tipo panela por 30 min a 95 °C, seguido de resfriamento por 20 min em RT.
    5. Lave a lâmina duas vezes por 10 min cada em PBS-Tween.
    6. Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor do tecido usando uma caneta hidrofóbica e bloqueie ligações inespecíficas aplicando BSA a 5% em DPBS 1x nas seções de tecido por pelo menos 40 min em RT em uma câmara umidificada.
      NOTA: A câmara úmida é preparada colocando-se uma folha de papel filtro em uma caixa plástica para coloração de lâminas e umedecendo-a completamente com água destilada para manter um ambiente úmido estável durante a incubação com o anticorpo.
    7. Prepare a solução de anticorpo primário em DPBS 1x na diluição recomendada para cada anticorpo.
      NOTA: Neste fluxo de trabalho, anticorpos primários contra Emcn (V.7C7) e Cd271 (ME20.4) foram utilizados para identificar EC e MSC murinos, respectivamente, enquanto anticorpos contra CD31 (JC70A) ou PRRX1 (policlonal) foram usados para identificar seus equivalentes humanos, conforme protocolo do fabricante.
    8. Remova a solução de bloqueio batendo suavemente na borda da lâmina em papel absorvente para remover gotículas residuais, depois aplique a mistura de anticorpo primário e incube a lâmina durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada.
    9. Lave a lâmina duas vezes por 5 min em PBS-Tween e prepare a solução de anticorpo secundário na diluição recomendada pelo fabricante, garantindo que os fluoróforos sejam espectralmente compatíveis e não se sobreponham.
      NOTA: Neste fluxo de trabalho, foi utilizado anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor em diluição 1:200.
    10. Aplique a mistura de anticorpo secundário e incube por 30 min em RT, protegido da luz em uma câmara umidificada.
    11. Lave a lâmina duas vezes por 5 min em PBS-Tween.
    12. Aplique uma diluição 1:10 do meio de montagem contendo DAPI (ver Tabela de Materiais), preparado em uma solução de PBS–glicerol 1:1, e incube a amostra por 5 min.
    13. Monte a seção com uma lamínula e selar as bordas com esmalte para evitar secagem.
    14. Visualize o tecido corado utilizando uma plataforma de imagem multiespectral.

Arquivo Suplementar 1: Resumo das Etapas do Protocolo para Avaliação da Integridade do RNA e Fluxo de Trabalho da Transcriptômica Espacial Visium. Este arquivo suplementar fornece um resumo detalhado das etapas procedimentais realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Ele inclui: (i) o ensaio High Sensitivity RNA ScreenTape utilizado para avaliar a integridade do RNA (DV200), conforme descrito na etapa 2.3.3 do protocolo principal, e (ii) uma visão geral do fluxo de trabalho Visium CytAssist de Expressão Gênica Espacial, abrangendo pré-processamento do tecido, preparação da biblioteca e sequenciamento (etapas 3.1–3.3 do protocolo principal).Clique aqui para baixar este arquivo.

3. Transcriptômica espacial

OBSERVAÇÃO: Realize o fluxo de trabalho de transcriptômica espacial utilizando a plataforma e os reagentes listados na Tabela de Materiais, seguindo os guias do usuário correspondentes42,45,46. O Arquivo Suplementar 1 resume as principais etapas de pré-processamento do tecido, preparação da biblioteca e sequenciamento.

  1. Controle de qualidade dos dados de transcriptômica espacial
    1. Demultiplexar os dados de transcriptômica espacial utilizando o pipeline padrão para conjuntos de dados Visium (consulte Tabela de Materiais).
    2. Mapear as leituras para o genoma de referência Ensembl 105 apropriado.
      NOTA: GRCh38 foi utilizado para amostras humanas e mm10 para amostras de camundongo.
    3. Gerar as matrizes filtradas de características-barcode utilizando o mesmo pipeline e importá-las para o ambiente de análise espacial/única célula subsequente (consulte Tabela de Materiais).
    4. Inspecionar as imagens de H&E na interface de visualização fornecida pelo pipeline de transcriptômica espacial (consulte Tabela de Materiais) e remover manualmente os pontos que sobrepõem a região do osso cortical ou do tecido ósseo, conforme o conjunto de dados.
    5. Normalizar os conjuntos de dados utilizando um método de transformação estabilizadora da variância comumente aplicado em fluxos de trabalho de análise de única célula (consulte Tabela de Materiais).

Resultados

Para avaliar a aplicabilidade deste fluxo de trabalho baseado em EDTA entre espécies e contextos de doenças, o protocolo foi aplicado a quatro amostras de medula óssea: dois fêmures murinos e dois espécimes ósseos humanos representando condições saudáveis e mieloma múltiplo (MM) (Tabela 1 e Figura 1).

Identificação da amostraEspécieSexoIdadeDoença
YFPcγ1MouseFêmea210 diasSaudável
mMMMouseMacho314 diasMM
hHBMHumanoMacho76 anosSaudável
hMMHumanoFêmea50 anosMM

Tabela 1: Amostras de osso murino e humano incluídas no estudo. Espécie, sexo, idade e estado de saúde são fornecidos para cada amostra. Abreviações: hHBM = medula óssea humana saudável; hMM = mieloma múltiplo humano; mMM = mieloma múltiplo murino; MM = mieloma múltiplo; YFPcγ1 = camundongo controle saudável.

As amostras utilizadas neste estudo foram previamente caracterizadas e relatadas em publicações anteriores do grupo de pesquisa, especificamente nos trabalhos de Muiños-Lopez et al. e Cenzano et al., exceto pela amostra de camundongo MM. Para os espécimes previamente relatados, os dados e resultados de transcriptômica espacial são apresentados nesses estudos8,10. Portanto, o material incluído aqui é utilizado para avaliar a adequação técnica do protocolo para transcriptômica espacial, e não para apresentar descobertas biológicas inéditas.

Amostras de fêmures de camundongos foram obtidas a partir do modelo de camundongo com mieloma múltiplo geneticamente modificado BIC (BIcγ1), que recapitula as características clínicas e imunológicas de pacientes com mieloma múltiplo, e de camundongos saudáveis correspondentes utilizados como controle (YFPcγ1)8,49. Um único fêmur de cada animal foi coletado, limpo e processado de acordo com o protocolo padronizado (Figura 2A). Os fêmures foram especificamente utilizados para essas análises porque oferecem medula abundante, qualidade superior do nicho e facilidade de processamento reprodutível, tornando-os particularmente adequados para uma plataforma de transcriptômica espacial baseada em sequenciamento8,10. A descalcificação bem-sucedida do fêmur do camundongo controle foi confirmada macroscopicamente pelo aumento acentuado da flexibilidade do tecido durante manipulação manual com pinça (Figura 2B). Posteriormente, esse fragmento ósseo foi eficientemente embutido em parafina utilizando um molde especializado compatível com transcriptômica espacial, a fim de preservar a integridade do RNA e a arquitetura tecidual para análises moleculares posteriores (Figura 2C).

Duas amostras de MO humana com históricos de processamento contrastantes também foram analisadas8,10. Uma amostra fresca de MO humana hematologicamente saudável foi obtida a partir de resíduo cirúrgico durante uma substituição articular do quadril no Hospital Universitario de Navarra (Figura 2D–F). Para demonstrar a utilidade translacional do protocolo, esta amostra foi processada da mesma forma que as amostras murinas. Conforme os resultados observados em tecido de camundongo, a descalcificação bem-sucedida do osso humano com EDTA foi confirmada macroscopicamente pelo amolecimento completo do tecido, evidenciado pela penetração fácil da agulha (Figura 2E). O fragmento ósseo humano descalcificado foi incorporado com sucesso em parafina utilizando um molde metálico padrão para processamento posterior (Figura 2F). A segunda amostra humana consistia em biópsias de MO em FFPE arquivadas da crista ilíaca de um paciente com MM, provenientes do Departamento de Patologia da Clínica Universidad de Navarra (CUN). Notavelmente, esta amostra arquivada de MM havia sido previamente descalcificada utilizando um protocolo clínico padrão que envolve ácidos fortes36. Esta amostra fornece um contraste qualitativo com os espécimes processados com EDTA; no entanto, as diferenças na origem do tecido, histórico de fixação, armazenamento e descalcificação indicam que as diferenças observadas não podem ser atribuídas exclusivamente ao agente descalcificante.

figure-results-1
Figura 2: Amostras de ossos de camundongo e humano durante o preparo baseado em EDTA. (A) Fêmures de camundongo controle intactos antes da descalcificação. (B) Fêmur de camundongo controle descalcificado mostrando aumento da flexibilidade. (C) Fragmentos de osso de camundongo controle embutidos em parafina. (D) Fragmentos de osso humano saudável provenientes de cirurgia de quadril antes da descalcificação. (E) O mesmo fragmento após descalcificação com EDTA, mostrando penetração de agulha. (F) Osso humano saudável descalcificado com EDTA embutido em parafina. Barras de escala: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Abreviação: EDTA = ácido etilenodiaminotetraacético. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Para analisar a arquitetura geral do tecido, foi realizada a coloração com H&E (Figura 3). A melhor preservação morfológica observada nos cortes murinos pode refletir diferenças no manuseio e processamento das amostras, e não características inerentes específicas da espécie. Os fêmures de camundongo foram coletados especificamente para a transcriptômica espacial e processados imediatamente como ossos intactos, preservando assim sua arquitetura (Figura 3A, B). Em contraste, as amostras humanas provêm de material residual obtido durante cirurgias de substituição do quadril (Figura 3C) ou de biópsias ósseas diagnósticas de mieloma múltiplo (MM) (Figura 3D), ambas podendo apresentar qualidade tecidual pré-analítica variável. Como resultado, as diferenças morfológicas entre a amostra humana descalcificada com EDTA e a biópsia de MM descalcificada com ácido são sutis, já que ambos os espécimes humanos já exibem limitações estruturais básicas introduzidas não apenas pela descalcificação, mas também pelo processamento geral do tecido (Figura 3C, D). Consequentemente, a avaliação abrangente da qualidade da amostra para a transcriptômica espacial exige a análise de múltiplos parâmetros distintos. Primeiro, a integridade do tecido deve ser cuidadosamente monitorada, pois a preservação estrutural pode variar significativamente de acordo com o tipo específico de amostra, e não apenas com o ácido descalcificante utilizado. Segundo, a qualidade do RNA também deve ser avaliada, pois as condições de descalcificação podem afetá-la20,35,36.

figure-results-2
Figura 3: Cortes corados com H&E utilizados para avaliação da qualidade do tecido. Cortes consecutivos de FFPE correspondem a (A) um camundongo controle saudável10, (B) um camundongo com MM, (C) osso humano saudável8,10 e (D) uma biópsia humana de MM8. Barras de escala = 500 µm. Abreviações: FFPE = fixado em formalina e emblocado em parafina; H&E = hematoxilina e eosina; MM = mieloma múltiplo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Para complementar a análise histológica, a qualidade do RNA foi avaliada. Embora a coloração H&E tenha apresentado diferenças ambíguas, a integridade do RNA diferenciou claramente os efeitos dos dois métodos de descalcificação (Tabela 2). Os valores de DV200 de ambas as amostras murinas e do espécime ósseo humano saudável ultrapassaram o limite recomendado para ensaios Visium FFPE, indicando distribuição adequada do comprimento dos fragmentos de RNA para hibridização de sondas e construção de bibliotecas. A amostra de camundongo saudável com YFP apresenta um DV200 de 82,55%, e a amostra de osso humano saudável (hHBM) atinge 58%, ambas bem acima do limite de aceitabilidade de 30% definido pela 10x Genomics. A amostra de camundongo com mieloma múltiplo (mMM) apresenta um DV200 de 31,3%, próximo ao limite inferior de aceitabilidade, o que pode refletir o armazenamento prolongado do bloco de parafina a 4 °C antes do corte, entre outros fatores específicos da amostra. Em contraste, a biópsia humana de mieloma múltiplo submetida à descalcificação ácida (hMM) exibe um DV200 de apenas 8%, o que esteve associado a integridade de RNA marcadamente reduzida, mesmo quando a deterioração morfológica é menos acentuada. Em resumo, realizar avaliações estruturais e moleculares é importante para avaliar a adequação da amostra para análises espaciais subsequentes.

Identificação da AmostraDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200: Porcentagem de fragmentos de RNA total > 200 nucleotídeos.
2Esta amostra foi descalcificada utilizando um protocolo clínico padrão que envolve ácidos fortes.

Tabela 2: Qualidade do RNA das amostras do estudo. DV200 é a porcentagem de fragmentos de RNA com mais de 200 nucleotídeos; valores de pelo menos 30% foram considerados adequados para a transcriptômica espacial subsequente. Abreviações: hHBM = medula óssea humana saudável; hMM = mieloma múltiplo humano; mMM = mieloma múltiplo murino.

Avaliações adicionais de qualidade também podem ser realizadas. Para validar ainda mais a integridade do tecido e confirmar a preservação de compartimentos celulares específicos após a descalcificação com EDTA, foi realizada coloração opcional por IF em cortes FFPE adjacentes de tecidos de camundongo e humano. Os anticorpos contra endomucina (Emcn) e Cd271 foram utilizados para visualizar células endoteliais (CE) e células mesenquimais (MSC), respectivamente, na amostra de camundongo com MM (Figura 4A). Essa coloração mostrou que os tecidos processados com EDTA exibiam estruturas vasculares bem definidas com coloração contínua de Emcn e redes estromais preservadas, demonstrando que os marcadores testados permaneceram detectáveis após o processamento. Além disso, a imagem de alta resolução obtida por meio de um sistema automatizado de imagem multiespectral forneceu evidências adicionais de que os antígenos testados permaneceram detectáveis para a verificação do tipo celular, proporcionando uma camada adicional de controle de qualidade antes da análise de transcriptômica espacial. Além disso, essas descobertas também foram observadas em espécimes humanos idosos saudáveis, nos quais a expressão de CE foi detectada por anticorpos contra CD31 e de MSC por anticorpos contra PRRX1 (Paired Related Homeobox 1), mostrando que os marcadores de nicho testados permaneceram identificáveis após a descalcificação com EDTA (Figura 4B). Em contraste, essas descobertas não puderam ser replicadas em biópsias humanas de MM submetidas a diversos protocolos de descalcificação à base de ácido. Como mencionado anteriormente, a integridade do RNA nessas amostras era baixa, limitando a análise transcriptômica subsequente. Devido à natureza degradada desses espécimes humanos, sua utilidade posterior foi limitada ao perfilamento transcriptômico basal8 e à avaliação imuno-histoquímica (IHC) de células plasmáticas malignas (PC) (Figura 4C).

figure-results-3
Figura 4: Imunofluorescência e imuno-histoquímica opcionais para verificação do tipo celular. (A) Tecido de MM de camundongo mostrando núcleos marcados com DAPI (azul), MSC positivas para CD271 (verde) e EC positivas para EMCN (vermelho). (B) Osso humano saudável mostrando núcleos marcados com DAPI (azul), MSC positivas para PRRX1 (verde) e EC positivas para CD31 (vermelho)10. (C) Biópsia de MM humano mostrando PC malignas positivas para CD1388. Barras de escala: (A) 250 µm (visão geral), 20 µm (ampliação combinada) e 50 µm (imagens de canal único); (B) 500 µm (visão geral) e 20 µm (ampliações combinadas e de canal único); (C) 500 µm. Abreviações: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; EC = célula endotelial; MM = mieloma múltiplo; MSC = célula estromal mesenquimal; PC = célula plasmática. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Juntos, a morfologia do tecido e os resultados do DV200 apoiam a adequação de amostras processadas com EDTA para análises espaciais de transcriptômica. Aplicações de transcriptômica espacial com este protocolo de preparação já foram relatadas anteriormente8,10.

Discussão

Ao integrar a descalcificação controlada baseada em EDTA, o processamento padronizado de FFPE e pontos de controle de qualidade rigorosos, este protocolo supera muitas das limitações tradicionalmente associadas à preparação de tecido ósseo para transcriptômica espacial, especialmente aquelas relacionadas à degradação do RNA e aos danos morfológicos causados por métodos de descalcificação com ácidos fortes8,10,20,33,36. O passo mais crítico no processamento de amostras mineralizadas para transcriptômica espacial é a descalcificação. Uma descalcificação insuficiente resulta em osso que permanece muito rígido para o corte em seções, tornando fisicamente impossível obter seções de alta qualidade para transcriptômica espacial8,20,23,37,50. Quando o tecido ósseo permanece muito duro, ele se fragmenta ou vibra contra a lâmina do micrótomo, levando a seções rasgadas ou com furos que não representam com precisão a arquitetura nativa da medula óssea (BM). É importante destacar que o sucesso da descalcificação só pode ser plenamente confirmado na etapa de microtomia: mesmo amostras que aparentam estar superficialmente amolecidas ainda podem conter minerais residuais, o que se torna evidente apenas ao tentar cortar seções finas de FFPE. Por essa razão, o monitoramento cuidadoso do progresso da descalcificação é essencial para garantir resultados reprodutíveis.

O protocolo utiliza EDTA 0,25 M em pH 6,95 durante 10 dias, com agitação constante e substituição da solução no quinto dia8,10. Durante o desenvolvimento do protocolo, foram avaliados o EDTA isolado, o EDTA suplementado com polivinilpirrolidona e o ácido fórmico a 10%, juntamente com diferentes durações de descalcificação e esquemas de substituição da solução; os dados comparativos não são apresentados aqui. Durações inferiores a 10 dias frequentemente resultaram em ruptura do tecido durante o corte de amostras de camundongos, enquanto as amostras humanas exibiram comportamento dependente da amostra. Assim, a duração de 10 dias é utilizada para fêmures de camundongos, enquanto as amostras humanas podem exigir uma descalcificação mais prolongada, conforme a densidade e o conteúdo trabecular. Pontos de controle físico de qualidade devem ser utilizados antes da inclusão em parafina. Se a descalcificação insuficiente se tornar evidente durante a microtomia, utilize o procedimento de reprocesamento apenas como um recurso final de salvamento, pois o calor adicional, a exposição a solventes e a reidratação podem comprometer a qualidade do RNA.

A principal limitação deste método é o tempo prolongado de processamento, o qual contrasta fortemente com os protocolos ácidos rápidos comumente utilizados em patologia clínica20,36. Embora tempos de processamento mais longos sejam geralmente aceitáveis em ambientes de pesquisa, estudos recentes, como o protocolo descrito por Miao et al., que utiliza solução de Morse (22,5% de ácido fórmico e 10% de citrato de sódio) para descalcificar em até 24 h, destacam o crescente interesse em acelerar o preparo ósseo para ensaios espaciais20. Contudo, métodos baseados em ácido historicamente apresentam risco muito maior de degradação do RNA, reduzindo os valores de DV200 e limitando, em última instância, sua compatibilidade com a transcriptômica espacial1,8,35,36. Esta abordagem baseada em EDTA prioriza a preservação do RNA em detrimento da velocidade, garantindo compatibilidade com plataformas espaciais baseadas em sequenciamento, como o Visium.

Uma limitação potencial da transcriptômica espacial de MO é a alta abundância de transcritos de imunoglobulina derivados de CP, o que pode reduzir a detecção de genes de baixa abundância. Assim como nas estratégias de controle de qualidade e filtragem aplicadas em um estudo anterior do grupo de pesquisa, incluindo a remoção de pontos de baixa qualidade (<200 UMIs e <150 genes detectados), a filtragem de tipos celulares com baixa contribuição (<20% por ponto) durante as análises de desconvolução e a seleção de genes marcadores detectados nos conjuntos de dados de transcriptômica espacial, os transcritos de imunoglobulina também podem ser filtrados computacionalmente durante a análise downstream para minimizar seu impacto quando apropriado8. Abordagens direcionadas de transcriptômica espacial podem ainda melhorar a detecção de transcritos de baixa abundância em aplicações específicas.

As possíveis aplicações para este método são extensas. A integração recente de dados espaciais e de célula única revelou nichos osteogênicos humanos especializados e gradientes de sinalização intrincados que se irradiam a partir do osso trabecular3,26. Além disso, a transcriptômica espacial demonstrou que o envelhecimento remodela o microambiente da MO ao alterar a organização espacial e a comunicação das CE, levando a um suporte osteogênico prejudicado e ao surgimento de redes de sinalização inflamatória dentro do nicho envelhecido10. O perfil multiômico também identificou compartimentos microambientais distintos, como regiões arterio-endosteais que sustentam a mielopoiese inicial e zonas peri-adipocíticas enriquecidas por células-tronco hematopoiéticas e progenitoras3. No contexto do MM, este protocolo permite a integração de abordagens transcriptômicas espaciais e de célula única para caracterizar a composição da MO murina doente e as interações célula-célula. Trabalhos anteriores revelaram distribuições espacialmente distintas de CP malignas e identificaram programas imunes e inflamatórios, como a NETose e a sinalização por IL-17, que estavam inversamente associados a regiões enriquecidas por tumor. Adicionalmente, um aumento na densidade de CP malignas correlacionou-se com uma transição de estados de linfócitos T efetores para exaustos. Essas descobertas também foram validadas em amostras de MO humanas em FFPE, demonstrando sua relevância translacional em diferentes cargas de doença8. Em última instância, este fluxo de trabalho de preparação fornece a base técnica para explorar as complexas interações celulares dentro da arquitetura mineralizada da MO.

Plataformas de expressão gênica espacial de alta definição podem fornecer perfis de todo o transcriptoma com resolução próxima à de célula única38,51,52. Essas abordagens podem ampliar o uso do fluxo de trabalho de preparação para análises de maior resolução de neoplasias hematológicas e medula óssea organizadas espacialmente. O fluxo de trabalho, portanto, fornece uma base técnica para estudos futuros da hematopoiese fisiológica e maligna.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesses. Uma patente sobre o know-how e o uso experimental dos modelos de camundongos MIcγ1 de MM foi licenciada para a MIMO Biosciences (número do pedido: PCT/EP2023/071025).

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Salud Carlos III e cofinanciado pelo ERDF, uma forma de fazer a Europa (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) e RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020-000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud do Governo de Navarra (GN2024/04); o Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC e AIRC no âmbito do Programa Accelerator Award; a Fundação Internacional de Mieloma (Brian van Novis) e a Fundação Paula e Rodger Riney para FP. IAC recebeu apoio de uma bolsa Marie Curie (H2020-MSCA-IF-837491) da Comissão Europeia, de uma bolsa AECC Talent (INVES258003CALV) e do Departamento de Salud, Governo de Navarra (GN2023/03). MC foi apoiado por uma bolsa FPU (FPU22/03283) do Ministério de Ciência, Inovação e Universidades. Gostaríamos de agradecer ao pessoal do Laboratório de Genômica Avançada e da Instalação Animal do CIMA, Universidade de Navarra, por sua inestimável assistência técnica e intelectual. Agradecemos também aos Departamentos de Patologia da Clínica Universidad de Navarra (CUN) e do Hospital Universitário de Navarra pela disponibilização de amostras de medula óssea e por sua excelente colaboração. Agradecimentos especiais a José Ángel Martínez-Climent e Marta Larrayoz pelos seus modelos de camundongos com mieloma múltiplo. Agradecemos a Patxi San Martín-Uriz, Tania López e Eduardo Larequi pelo excelente apoio na otimização tecnológica, desenvolvimento de protocolos e solução de problemas no processamento de amostras de medula óssea de camundongos e humanos para transcritômica espacial. Agradecemos também a Beñat Ariceta e Asier Ullate por todo o seu trabalho computacional em transcritômica espacial. Por fim, somos profundamente gratos aos pacientes e doadores saudáveis que generosamente participaram deste estudo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
tubos de 1,5 mLEppendorf15625367
recipiente estéril de 100 mL deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991AEletroforese capilar–sistema baseado em para avaliação da integridade do RNA
recipiente estéril de 50 mL IberoMedREOR001
tubo de 50 mL FALCON352070
Pincel PAP avançadoTed Pella 22309Z377821-1EACaneta de barreira hidrofóbica 
anticorpo anti-PRRX1 produzido em coelhoSigma-AldrichHPA051084
BSA (Albumina Sérica Bovina)Sigma-AldrichA9418-50G
Cassetes KartellLABWARE2921
Anticorpo Monoclonal CD271 (Receptor de NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, Célula Endotelial (Concentrado) Clone JC70AAligent DakoM0823
Lâminas de coberturaFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (Meio de Montagem Antidesvanecimento VECTASHIELD com DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
Solução de desparafinizaçãoQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals Solução salina tamponada com fosfato (DPBS, 1×), fórmula de Dulbecco, sem cálcio, sem magnésio
Meio de montagem DPX para histologiaSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), solução 0,5 M, grau biologia molecular, ultrapuro
Estação de inclusão Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Anticorpo Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Genoma de Referência Ensembl (GRCh38 / mm10, versão 105)EMBL-EBIN/AGenoma de referência utilizado para o alinhamento das leituras.
EosinaMillipore SigmaHT110116
EtanolMillipore SigmaE7023-500MLTesoura cirúrgica
Banhomaria de Histologia Falc Instruments B-IFalco610.1030.00
Formalina 4% PanReac AppliChem2524311315Formaldeído 3,7%–4,0% p/v tamponado a pH = 7 e estabilizado com metanol (CE-IVD) para diagnóstico clínico
Suporte para coloração de lâminas de vidro WHEATONZ710970-3EA
Frascos para coloração de vidro MARCABR472200-10EAMastercycler  X50
GlicerolSigma-AldrichC3H803
Anticorpo Secundário de Cabra Anti-Mouse IgG (H+L) Cruz-Absorvido, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Anticorpo Secundário de Cabra Anti-Mouse IgG (H+L) Altamente Cruz-Adsorvido, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723
Anticorpo secundário de cabra anti-IgG de coelho (H+L) altamente adsorvido por cruzamento, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Hematoxilina Millipore SigmaMHS16
Tira de RNA de Alta SensibilidadeAgilent5067-5579Avaliação da integridade do RNA
Marcador High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5581Avaliação da integridade do RNA
Tampão para amostra High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5580Avaliação da integridade do RNA
Microscópio de alta resolução Leica BiosystemsN/AAperio CS2 Scanner
Ácido clorídrico (0,1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
plataforma Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
Invitrogen Anti-Rato IgG (H+L) Secundário Conjugado com Alexa Fluor 568, Adsorção CruzadaInvitrogenA11077
Tesoura de Iris - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Isoflurano
Carbonato de lítio Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/ASoftware utilizado para visualizar imagens de HE e curar pontos do Visium; abre arquivos .cloupe gerados pelo pipeline de análise.
Moldes de inclusão em metalBio-Óptica07-BM24256
Lâminas de microscópioavantor631-0108Lâminas para Microscopia Superfrost Plus
Lâminas de micrótomoFEATHERFEAT207500006_U
Microtomo HM 340EEprediaN/Amodelo HM 340E
AgulhaBD301156BD Microlanc 3 Agulha 21 G 1 pol. (25 mm)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Microscópio óptico de campo claro
Parafina PanReac AppliChem256993Parafina P.F. 55–58°C pellets plastificados + DMSO (CE-IVD) para diagnóstico clínico
placa de Petri CorningCLS430167-100EA
Moldes de inclusão de plástico Bio-Óptica07-MP7070
Pinça Potts-SmithF.S.T 11012-18Pinça
Fluorímetro Qubit 3.0Invitrogen Q33216
Tubos para ensaio QubitInvitrogen Q32856
Qubit RNA HS Assay KitInvotrogen Q32855
Tubo microcentrífuga de 1,5 mL livre de RNaseThermo Scientific AM12400
água livre de RNase MerkW4502
RNaseZap RnaseInvitrogen AM9780Solução de descontaminação
Kit RNeasy FFPE (50)Qiagen73504Extração de RNA total
SCTransform (v0.3.5)Laboratório SatijaN/AMétodo de normalização estabilizador da variância implementado no Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Laboratório SatijaN/APacote R utilizado para análise de transcriptômica de célula única e espacial.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/ASoftware utilizado para desmultiplexação, alinhamento e geração de matrizes de características-barcode para conjuntos de dados Visium.
Estilete Stlime Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Laboratório BergenN/APacote R utilizado para visualização e integração de transcriptômica espacial.
Lâmina de bisturi cirúrgico nº 23Swann-Morton210Lâminas de bisturi cirúrgico
Ciclador térmico Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Plataforma de imagem multiespectral para visualização de IF
Visium Accessory Kit 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium Mouse Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 reações 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
XilenoPanreac214736Xileno, mistura de isômeros para análise, ACS, ISO

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