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Artigo de investigação

CCL4 como um potencial biomarcador imuno-metabólico em infarto agudo do miocárdio por meio de aprendizado de máquina e transcriptômica unicelular

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DOI:

10.3791/72480

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11 de agosto de 2026

 ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, 2Anhui Public Health Clinical Center

Neste artigo

Resumo

Este estudo integra transcriptômica em massa e de célula única com aprendizado de máquina para identificar CCL4 e outros cinco genes como potenciais biomarcadores diagnósticos para infarto agudo do miocárdio, revelando diafonia imuno-metabólica e padrões de expressão específicos por tipo celular.

Resumo

O infarto agudo do miocárdio (IMA) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, destacando a necessidade de novos biomarcadores complementares. Ao integrar dados transcriptômicos em massa e de célula única com abordagens de aprendizado de máquina, genes relacionados à calmodulina associados à AMI e exploraram suas características imunometabólicas foram identificados. Análises de expressão diferencial e coexpressão ponderada revelaram 60 genes relacionados à calmodulina, dos quais seis genes-chave (SOCS3, GBP4, ST14, KPNA5, STAB1 e CCL4) foram triados usando múltiplos algoritmos de aprendizado de máquina e validados em conjuntos de dados independentes. Análises funcionais indicaram enriquecimento nas vias imunológica, inflamatória e metabólica. A infiltração imune e a transcriptômica de célula única mostraram padrões de expressão específicos para o tipo celular, com CCL4 predominantemente expresso em células T e NK e marcadamente reduzido em amostras de AMI. A validação da qPCR confirmou mudanças significativas na expressão de quatro dos seis genes da coorte local. Análises de interação fármaco-gene e acoplamento sugeriram compostos candidatos para investigação adicional. Coletivamente, os achados sugerem que o CCL4 pode servir como um potencial biomarcador diagnóstico para a IAM, e as associações imunometabólicas observadas fornecem uma base para futuros estudos mecanicistas e translacionalistas.

Introdução

O infarto agudo do miocárdio (IAM), causado por isquemia miocárdica prolongada, está entre as doenças cardiovasculares mais letais nomundo 1˒2. Sua patogênese é multifatorial, com principais contribuintes incluindo aterosclerose, trombose, espasmo das artérias coronarianas earritmias 3˒4. Hipertensão, diabetes, hiperlipidemia, tabagismo, obesidade e estresse psicológico também são reconhecidos como fatores de riscoimportantes 5. Embora avanços em técnicas intervencionistas, terapias antiplaquetárias e estratégias trombolíticas tenham melhorado significativamente a sobrevivência no curto prazo, a incidência geral de AMI continua a aumentar, especialmente entre populaçõesmais jovens 6. A troponina cardíaca (cTn) é atualmente o biomarcador padrão ouro para o diagnóstico da IAM. É uma proteína estrutural liberada na circulação após necrose celular do miocárdio e apresenta alta sensibilidade e especificidade. No entanto, os níveis de cTn podem ser influenciados pela função renal e pelo momento da coleta daamostra 7˒8. Portanto, ainda há a necessidade de desenvolver novos biomarcadores complementares.

A calmodulina (CaM) é uma pequena proteína de ligação ao cálcio, expressa de forma ubíqua e altamente conservada, que atua como um transdutor intracelular chave dos sinais de cálcio e participa de uma ampla gama de processos biológicos9˒10. Ao detectar mudanças nas concentrações intracelulares de Ca2⁺, o CaM interage com diversas proteínas-alvo, incluindo quinases, fosfatases e canais iônicos, para regular a proliferação celular, apoptose, metabolismo, contração muscular e respostasinflamatórias 11. No sistema cardiovascular, a CaM desempenha um papel central no controle da contratilidade dos cardiomiócitos, frequência cardíaca, estabilidade elétrica e tônus muscular lisovascular 12˒13. Evidências acumuladas indicam que a disfunção da CaM ou a desregulação das vias de sinalização relacionadas à CaM contribui para vários distúrbios cardiovasculares, incluindo arritmias, insuficiência cardíaca, hipertensão e hipertrofiacardíaca 14˒15. Além disso, a CaM participa das respostas cardiomiocíticas à isquemia, estresse oxidativo e estímulos inflamatórios, sugerindo seu potencial envolvimento na progressão patológica daAMI 16. Portanto, investigar a CaM no contexto das doenças cardiovasculares é de grande interesse científico e clínico.

Conjuntos de conjuntos de dados de RNA-seq em massa e RNA-seq de célula única foram integrados para identificar sistematicamente genes diferencialmente expressos (DEGs) significativamente associados ao escore CaM. A análise ponderada da rede de coexpressão gênica (WGCNA) foi usada para identificar ainda mais genes candidatos relacionados à CaM envolvidos na AMI. Múltiplos algoritmos de aprendizado de máquina foram então aplicados para rastrear genes-chave e construir modelos preditivos para avaliar o risco individual de AMI. Características transcriptômicas, perfis de infiltração imune e redes regulatórias concorrentes de RNA endógeno (ceRNA) também foram integradas para investigar como esses genes-chave podem contribuir para a regulação imune e potenciais interações fármaco-alvo. Os achados indicam que vários genes centrais estão envolvidos nas vias de comunicação imunometabólica e exibem valor preditivo e potencial terapêutico. Essa abordagem integrada refina a compreensão molecular da AMI e fornece uma justificativa para o desenvolvimento de biomarcadores e intervenções direcionadas.

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Protocolo

O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Centro Clínico de Saúde Pública de Anhui em 19 de setembro de 2025 (ID de aprovação: PJ-YX2025-062). Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os participantes antes da coleta de sangue. A coorte local incluiu oito pacientes com infarto agudo do miocárdio (IAM) e oito controles saudáveis. As ferramentas de pesquisa usadas no protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Fontes de dados e processamento

Conjuntos de dados de sequenciamento de RNA em massa relacionados ao infarto do miocárdio foram obtidos a partir do Gene Expression Omnibus (GEO). Os conjuntos de dados GSE59867 e GSE48060 foram usados para análises transcriptômicas em massa, e o GSE269269 conjunto de dados de sequenciamento de RNA de célula única foi usado para análises em nível celular (Tabela 1). Um conjunto de 255 genes relacionados à calmodulina foi obtido do Human Protein Atlas para análises subsequentes do conjunto de genes.

Conjunto de dadosTipo de amostraExemplo (controles)Amostra (pacientes)Plataforma de sequenciamento
GSE59867RNA-seq em granel46111GPL6244
GSE48060RNA-seq em granel2131GPL570
GSE269269scRNA-seq (sangue periférico)10GPL24676

Tabela 1: Características dos conjuntos de dados utilizados no estudo. A tabela lista os números de acesso ao conjunto de dados, tipos de amostras, números de amostras controle e de pacientes, e plataformas de sequenciamento para os conjuntos de dados de sequenciamento de RNA em massa e RNA de célula única. RNA-seq, sequenciamento de RNA; scRNA-seq, sequenciamento de RNA de célula única.

A variabilidade entre amostras nos conjuntos de dados transcriptômicos em massa foi corrigida usando a função normalizeBetweenArrays no pacote limma, versão 3.60.6. A análise diferencial de expressão gênica foi então realizada usando limma. Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram definidos usando os limiares P < 0,05 e |log₂ de mudança de dobra| > 0,5. Os DEGs resultantes foram visualizados usando gráficos de vulcões e mapas de calor e classificados como significativamente aumentados, significativamente reduzidos ou não significativamente alterados.

2. Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos de amostra única e análise de rede de coexpressão gênica ponderada

A análise de enriquecimento de conjuntos gênicos com amostra única (ssGSEA) foi realizada utilizando os 255 genes relacionados à calmodulina. O pacote GSVA foi usado para calcular um escore gênico relacionado à calmodulina, designado Calmodulin_score, para cada AMI e amostra controle. As diferenças de Calmodulin_score entre os grupos AMI e controle foram avaliadas usando o teste de soma de ranks de Wilcoxon.

A análise ponderada da rede de coexpressão gênica (WGCNA) foi realizada utilizando dados transcriptômicos em massa de pacientes com IAM. Genes com valor médio de fragmentos por kilobase de transcrito por milhão de leituras mapeadas de ≤0,5 foram excluídos. As amostras foram agrupadas para identificar e remover valores atípicos.

Foi selecionada uma potência de limiar suave que alcançou um ajuste topológico sem escala de R² > 0,8. Uma matriz de sobreposição topológica foi então construída. Módulos gênicos foram identificados usando o algoritmo de corte de árvore dinâmica com tamanho mínimo de módulo de 200. Módulos com autogênios altamente semelhantes foram fundidos usando um limiar de correlação de >0,75, correspondente a um limiar de fusão de módulos de 0,25.

As relações entre autogênios do módulo e características clínicas, incluindo Calmodulin_score, foram avaliadas por meio da análise de correlação de Pearson. As relações resultantes entre módulos e características foram exibidas em um mapa de calor anotado com coeficientes de correlação e valores P correspondentes. A pertença ao módulo e a significância gênica foram calculadas para cada gene. Foram gerados gráficos de dispersão da pertença aos módulos em relação à significância gênica para identificar genes com alta conectividade intramodular e relevância de características.

3. Identificação de genes relacionados à calmodulina associados à AMI

Genes relacionados à calmodulina associados à AMI foram identificados pela interseção dos DEGs com genes de módulos WGCNA significativamente correlacionados com Calmodulin_score. Os genes sobrepostos foram mantidos para análises posteriores.

A análise de enriquecimento funcional foi realizada usando o pacote clusterProfer. A Ontologia Genética e a Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto foram usadas para identificar processos biológicos, funções moleculares, componentes celulares e vias de sinalização associadas aos genes sobrepostos.

4. Identificação e validação de genes-chave usando aprendizado de máquina

A análise de regressão logística univariada foi realizada usando genes sobrepostos. Três algoritmos de aprendizado de máquina foram então aplicados independentemente usando os seguintes pacotes e parâmetros R: random forest, XGBoost e support vector machine.

Cada algoritmo foi usado para priorizar genes com valor preditivo para IAM. Genes candidatos à chave foram definidos como os genes identificados pelos três algoritmos. Genes que também apresentaram expressão diferencial significativa e direcionalmente consistente tanto no conjunto de dados de treinamento GSE59867 quanto no conjunto de dados externo de validação GSE48060 foram mantidos como genes-chave finais.

5. Construção e avaliação de modelos diagnósticos

Um modelo de regressão logística foi construído usando os genes-chave identificados e a função lrm. Um nomograma foi gerado usando a função regplot para exibir a contribuição de cada gene de característica para a probabilidade prevista de AMI.

A discriminação do modelo foi avaliada por análise de características operacionais do receptor usando o pacote pROC. A área sob a curva característica operacional do receptor foi calculada para avaliar a capacidade do modelo de distinguir AMI de amostras controle.

Curvas de calibração foram geradas para comparar probabilidades previstas com os resultados observados. Foi realizada uma análise da curva de decisão para estimar o benefício clínico líquido do modelo em uma faixa de probabilidades limiar.

6. Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos e construção de redes endógenas de RNA concorrentes

A análise de enriquecimento de conjuntos gênicos foi realizada separadamente para cada gene-chave usando sua matriz de correlação gênica e o pacote clusterProfer. Os resultados do enriquecimento de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto foram classificados pela pontuação absoluta de enriquecimento normalizado. As cinco vias de maior classificação foram exibidas para cada gene.

Associações funcionais e redes de interação gênica foram examinadas usando o GeneMANIA. Potenciais reguladores de microRNA dos genes-chave foram previstos usando miRanda, miRTarBase, TargetScan e miRDB. Interações candidatas microRNA-mRNA foram identificadas ao intersectar as previsões dos quatro bancos de dados.

Longas interações RNA-microRNA não codificantes foram obtidas a partir do spongeScan. As longas relações não codificantes RNA-microRNA e microRNA-mRNA foram então integradas para construir uma rede reguladora endógena concorrente de RNA. A rede foi visualizada como um diagrama de Sankey usando o pacote ggalluvial.

7. Previsão de fármacos e acoplamento molecular

As interações fármaco-gene foram previstas usando o Banco de Dados de Interação Medicamento-Gênico. A rede de interação resultante foi visualizada usando software de análise de rede.

O identificador da proteína UniProt para CCL4 foi recuperado como P13236. A estrutura proteica tridimensional correspondente foi obtida no formato de Banco de Dados de Proteínas (PDB) sob o número de acesso 1HUM (MIP-1β humano, estrutura de difração de raios X), que foi selecionado para acoplamento. A Chain A, representando o monômero biologicamente relevante, foi selecionada para acoplamento. A preparação de proteínas foi realizada usando o módulo Prepare Protein no CB-Dock2, que inclui remoção de moléculas de água, adição de hidrogênios polares e atribuição de cargas de Gasteiger. As estruturas químicas tridimensionais dos compostos candidatos (ácido clodrônico e epoetina alfa) foram recuperadas do banco de dados PubChem no formato Structure-Data File (SDF). As simulações de acoplamento foram realizadas usando a plataforma online CB-Dock2, que emprega o algoritmo AutoDock Vina para acoplamento às cegas. O local de acoplamento foi configurado para cobrir toda a superfície da proteína, permitindo a identificação imparcial de possíveis bolsões de ligação. A afinidade de ligação foi calculada como a energia livre de ligação prevista (ΔG) em kcal/mol. As poses finais de acoplamento e as interações proteína-ligando (por exemplo, ligações de hidrogênio, contatos hidrofóbicos) foram visualizadas usando o PyMOL e o visualizador de interação embutido do CB-Dock2.

8. Pré-processamento de dados de sequenciamento de RNA de célula única

O controle de qualidade foi realizado antes da análise posterior do sequenciamento de RNA de célula única. As células foram retidas quando o número de genes detectados estava entre 200 e 10.000, a contagem total de identificadores moleculares únicos era ≥1.000 e a proporção de transcritos mitocondriais era ≤20%.
Células com menos de 200 genes e genes detectados em menos de três células foram excluídas. Esses filtros foram aplicados para reduzir a inclusão de células de baixa qualidade e ruído técnico. Os valores de expressão gênica foram normalizados usando a função NormalizeData no pacote Seurat. Genes altamente variáveis foram identificados usando a função FindVariableFeatures. Os valores de expressão dos genes altamente variáveis foram centralizados e padronizados usando a função ScaleData.

Efeitos em lote associados à variação experimental ou sequenciante foram corrigidos usando a função RunHarmony do framework de integraçãoHarmony 17.

9. Redução de adimensionalidade em célula única, agrupamento e anotação

A análise de componentes principais foi aplicada pela primeira vez para reduzir a dimensionalidade do conjunto de dados de sequenciamento de RNA de célula única. Aproximação e projeção uniforme de variedades, e imersão estocástica de vizinhos distribuídos por t foram posteriormente usados para visualizar a heterogeneidade celular.

Células transcricionalmente semelhantes foram agrupadas usando as funções FindNeighbors e FindClusters em Seurat. Genes marcadores diferencialmente expressos para cada cluster foram identificados usando a função FindAllMarkers, comparando cada cluster com todos os clusters restantes.

Os tipos celulares foram atribuídos usando genes marcadores canônicos obtidos da literatura publicada e bancos de dados estabelecidos de marcadores celulares. A distribuição espacial e os níveis de expressão dos genes-chave foram visualizados usando a funçãoFeaturePlot 18.

10. Análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase

Foram obtidas amostras de sangue periférico de 8 pacientes com AMI e 8 controles saudáveis no Centro Clínico de Saúde Pública de Anhui. O grupo AMI incluiu pacientes diagnosticados de acordo com a Quarta Definição Universal de Infarto do Miocárdio, com sintomas compatíveis com isquemia miocárdica e níveis elevados de troponina cardíaca I acima do limite superior de referência do percentil 99. O grupo controle era composto por indivíduos saudáveis com pareamento de idade e sexo, sem histórico de doença cardiovascular, eletrocardiogramas normais e sem anormalidades nos exames de sangue rotineiros, função hepática ou função renal. Para pacientes com IMA, 3 mL de sangue com ácido anticoagulante etilendediaminetetraacético foram coletados dentro de 24 horas após a internação. O mesmo volume foi coletado de controles saudáveis durante o período correspondente do estudo.

O RNA total foi isolado do sangue periférico de acordo com o protocolo fornecido com o kit de isolamento de RNA sanguíneo. A concentração e pureza do RNA foram avaliadas usando um espectrofotômetro NanoDrop, e a integridade do RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarosa. Apenas amostras com razão A260/A280 entre 1,8 e 2,1 foram usadas para análises subsequentes. Um total de 500 ng de RNA foi transcrito reversamente em DNA complementar usando um reagente de síntese complementar de DNA de primeira fita. O DNA complementar resultante foi diluído até uma concentração final de 150 ng/mL. A amplificação quantitativa da reação em cadeia da polimerase foi realizada em um volume total de reação de 10 μL usando uma mistura mestre à base de SYBR Green, sem corante de referência passivo. Todas as reações qPCR foram realizadas em duplicados técnicos duas vezes, e os cálculos subsequentes foram baseados nos valores médios de Ct.

A amplificação foi realizada usando um instrumento de reação em cadeia da polimerase em tempo real. As condições de ciclagem consistiram em desnaturação inicial a 95 °C por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 10 segundos, recozimento a 60 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 30 segundos. A análise da curva de fusão foi realizada após amplificação.

Os níveis de expressão gênica foram normalizados para β-actina. A expressão relativa foi calculada usando o método 2−ΔΔCt .

11. Análise estatística

Análises estatísticas foram realizadas em R. Visualizações de rede foram geradas usando software de análise de rede. As diferenças entre os dois grupos foram avaliadas usando o teste de Wilcoxon, salvo especificação em contrário. Variáveis contínuas com distribuição normal foram comparadas usando o teste t de Student. Variáveis contínuas não normalmente distribuídas foram comparadas usando o teste Mann-Whitney U, também conhecido como teste de soma de ranks de Wilcoxon. Todos os testes estatísticos foram de duas caras. Um valor P de <0,05 foi considerado estatisticamentesignificativo 19.

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Resultados

Identificação e análise de enriquecimento de genes relacionados à calmodulina associados à AMI
A correção de efeito lote foi realizada pela primeira vez no conjunto de dados GSE59867 para garantir a comparabilidade entre amostras (Figura 1A). Um total de 168 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram posteriormente identificados, incluindo 77 genes com regulação positiva e 91 genes com regulação negativa em amostras de AMI em comparaçã...

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Discussão

O infarto agudo do miocárdio (IMA) resulta da oclusão aguda da artéria coronária, levando à necrose isquêmica do miocárdio e alta morbidade e mortalidade em todo o mundo. A calmodulina, uma proteína reguladora dependente de cálcio, desempenha um papel fundamental na transdução intracelular de sinais. Estudos anteriores demonstraram que a calmodulina regula a apoptose cardiomiocyta, as respostas inflamatórias e a homeostase do cálcio durante a IAM, sugerindo que pode ser uma molécula impo...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa da Universidade Médica de Anhui (Bolsa nº 2022xkj059) e pelo Instituto de Medicina Translacional de Anhui (Bolsa nº 2021zhyx-C71). Os autores agradecem a todos os colegas que ajudaram e apoiaram essa pesquisa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
β-actin primerTsingkeN/AForward: 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′
Reverse: 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′
calibratermsN/AParameters: lrmModel, method = "boot", B = 1000
CB-Dock2CB-Dock2 ServerOnline toolhttps://cadd.labshare.cn/cb-dock2/
CCL4 primerTsingkeN/AForward: 5′-CTGTGCTGATCCCAGTGAATC-3′
Reverse: 5′-TCAGTTCAGTTCCAGGTCATACA-3′
CIBERSORTStanford UniversityOnline toolParameters: function(sig_matrix, mixture_file, perm = 0, QN = TRUE)Spearman correlation analysis was performed between immune-cell abundance and gene expression.
clusterProfilerBioconductor4.12.6https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
CytoscapeCytoscape Consortium3.9.1https://cytoscape.org/
Drug-Gene Interaction DatabaseDGIdbOnline databasehttps://www.dgidb.org/
Gene Expression OmnibusNCBIOnline databasehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Gene Ontology databaseGene Ontology ConsortiumOnline databasehttp://geneontology.org/
GeneMANIAUniversity of TorontoOnline toolhttps://genemania.org/
GBP4 primerTsingkeN/AForward: 5′-AGGCTGCTAAAACACAAGCTG-3′
Reverse: 5′-CCCCAGGTAGAGTGACAATCAT-3′
ggalluvialCRAN0.12.5Sankey diagram generation
GSVABioconductor1.52.3Parameter: P < 0.05
Harmony integration frameworkCRAN1.2.0https://github.com/immunogenomics/harmony
Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMixYEASEN11141ES10Reverse-transcription reagent
Hieff qPCR SYBR Green Master MixYEASEN11201ESqPCR reagent
Human Protein AtlasHuman Protein Atlas ConsortiumOnline databasehttps://www.proteinatlas.org/
KPNA5 primerTsingkeN/AForward: 5′-TCAAGAGATGCGTAGACGAAGA-3′
Reverse: 5′-ACATTTCTGCGTTTGAACAACTG-3′
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes databaseKanehisa LaboratoriesOnline databasehttps://www.kegg.jp/
LightCycler 480 Instrument IIRocheLightCycler 480 IIReal-time PCR instrument
limmaBioconductor3.60.6Differentially expressed gene screening
lrmrmsN/AParameters: Type ~ SOCS3 + GBP4 + ST14 + KPNA5 + STAB1 + CCL4, data = aSAH, maxit = 100
miRandaMicroRNA.orgOnline toolhttp://www.microrna.org/microrna/home.do
miRDBmiRDBOnline toolhttp://mirdb.org/
miRTarBaseNational Chiao Tung UniversityOnline databasehttps://mirtarbase.cuhk.edu.cn/
Protein Data BankRCSBOnline databasehttps://www.rcsb.org/
PubChemNCBIOnline databasehttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOLSchrödinger, LLC2.5.4Visualization of molecular docking results
pROCCRAN1.18.5Receiver operating characteristic curve generation and visualization
Random forest packageCRAN3.3.1Parameters: ntree = 100, seed = 200
R softwareR Foundation4.2.2Bioinformatics and statistical analyses
regplotCRAN1.1Parameters: glm(Status ~ gene, family = binomial(), data = merged_data)lrm(Type ~ SOCS3 + GBP4 + ST14 + KPNA5 + STAB1 + CCL4, data = aSAH, maxit = 100)
rmdaCRAN1.6Parameters: decision_curve(Type ~ SOCS3 + GBP4 + ST14 + KPNA5 + STAB1 + CCL4, data = aSAH, family = binomial(link = "logit"), thresholds = seq(0, 1, by = 0.01), confidence.intervals = 0.95)
RNA isolater MolPure Blood RNA KitYEASEN19241ES50RNA isolation kit
SeuratSatija Lab5.1.0Marker genes used for cell annotation:Monocytes: FCN1, S100A9, S100A8B cells: CD79B, MS4A1T cells: LDHB, CD4, CD3DNK cells: FGFBP2, GZMB, NKG7, KLRD1Megakaryocytes: CD163, CD36, PF4, PPBPBlood cells: ALAS2, AHSP, CA1Plasma cells: IGHA1, CD79A, MZB1, JCHAINDendritic cells: HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DQB1Mast cells: FCER1A, MS4A2
SOCS3 primerTsingkeN/AForward: 5′-CCTGCGCCTCAAGACCTTC-3′
Reverse: 5′-GTCACTGCGCTCCAGTAGAA-3′
spongeScanspongeScanOnline toolhttp://spongescan.rc.ufl.edu/
ST14 primerTsingkeN/AForward: 5′-TTCCTGCCAGTCAACAACGTC-3′
Reverse: 5′-GGTACTGCAAATGCCACACC-3′
STAB1 primerTsingkeN/AForward: 5′-CCGGGAAATCCTTACCACAGC-3′
Reverse: 5′-ACCTTCGTGTTTGTTGGGTCC-3′
Support vector machine packageCRAN1.7-13Parameters: input, k = 10, halve.above = 100
survminerCRAN0.5.0Survival curve plotting
TargetScanTargetScanOnline toolhttp://www.targetscan.org/
UniProtUniProt ConsortiumOnline databasehttps://www.uniprot.org/
Weighted gene co-expression network analysis packageCRAN1.73Parameters: R² > 0.8, minModuleSize = 200
XGBoost packageCRAN1.7.8.1Parameters: nrounds = c(50, 200), max_depth = c(3, 8), eta = c(0.01, 0.3)

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