Artigo de método

Detecção por Citometria de Fluxo de Proteínas Intracelulares em Células de Eritroleucemia Humana K562 Utilizando Anticorpos Primários Não Conjugados

52 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/72500

⸱

8 de setembro de 2026

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a detecção por citometria de fluxo de proteínas intracelulares em células de eritroleucemia humana K562 utilizando anticorpos policlonais primários não conjugados. A especificidade do anticorpo é demonstrada pela inibição dependente da dose da marcação por meio da competição com peptídeos.

Resumo

A citometria de fluxo é uma técnica poderosa para análise quantitativa da expressão proteica com resolução em nível de célula única. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho para detecção de proteínas intracelulares em células humanas de eritroleucemia K562 utilizando anticorpos primários policlonais não conjugados e anticorpos secundários conjugados a fluoróforos. As células são fixadas, permeabilizadas e bloqueadas sequencialmente antes da marcação com anticorpos. Ao variar a ordem da incubação com anticorpos em relação à fixação e permeabilização, o protocolo permite a avaliação de proteínas com localização superficial ou intracelular utilizando fluxos de trabalho de marcação separados. A coloração nuclear do fator de splicing 3a subunidade 1 (SF3A1) é demonstrada utilizando um anticorpo policlonal de coelho anti-SF3A1 purificado por afinidade, e a especificidade do anticorpo é avaliada pela inibição dependente da dose da marcação com o peptídeo antigênico correspondente. Além disso, as condições de marcação são utilizadas para avaliar a reatividade de um anticorpo direcionado ao domínio intracelular do receptor de eritropoietina. Este fluxo de trabalho padronizado amplia o uso de anticorpos primários não conjugados em citometria de fluxo e fornece uma abordagem prática para avaliar a expressão e localização proteica, bem como a especificidade de anticorpos em células humanas de eritroleucemia K562.

Introdução

A citometria de fluxo é uma poderosa e amplamente utilizada ferramenta analítica que permite a avaliação quantitativa da expressão proteica em resolução de única célula, facilitando assim o exame de populações celulares heterogêneas e raras1,2,3. Embora as abordagens convencionais de citometria de fluxo utilizem principalmente anticorpos direcionados a antígenos de superfície celular, muitas proteínas funcionalmente importantes, como fatores de transcrição, reguladores do processamento de RNA e receptores que sofrem internalização induzida por ligante, estão localizados em compartimentos intracelulares. Consequentemente, essas proteínas citoplasmáticas e nucleares são inacessíveis utilizando protocolos padrão de marcação de superfície. A incorporação de métodos de marcação intracelular, que envolvem fixação e permeabilização das membranas celulares, expandiu substancialmente a utilidade da citometria de fluxo, permitindo a avaliação quantitativa de proteínas intracelulares, citocinas e intermediários de sinalização, ao mesmo tempo em que preserva as capacidades de alto rendimento e multiparamétricas da análise convencional de citometria de fluxo4,5,6,7.

Uma limitação importante na detecção de proteínas associadas à superfície e intracelulares por citometria de fluxo é a disponibilidade de anticorpos adequados e, em muitos casos, o conhecimento incompleto das sequências de epítopos ou imunógenos8,9. Uma vez que as estratégias de imunofenotipagem baseiam-se principalmente em marcadores de superfície celular, a maioria dos anticorpos comercialmente disponíveis e validados para citometria de fluxo são monoclonais, reconhecem um único epítopo extracelular e são pré-conjugados a fluoróforos. Em contraste, os anticorpos policlonais são capazes de reconhecer múltiplos epítopos dentro de uma proteína alvo e são comumente utilizados em western blot, imunohistoquímica ou imunofluorescência. No entanto, esses anticorpos geralmente não são conjugados e, portanto, não são diretamente compatíveis com os fluxos de trabalho padrão de citometria de fluxo. O uso de anticorpos primários não conjugados em combinação com anticorpos secundários conjugados a fluoróforos oferece uma alternativa flexível que amplia o leque de alvos detectáveis e pode permitir a amplificação do sinal, o que pode ser vantajoso para proteínas de baixa abundância.

Para superar essas limitações, otimizamos um protocolo para coloração de proteínas em células de eritroleucemia humana K56210. A coloração intracelular requer fixação para preservar a estrutura e o estado celulares, bem como permeabilização para permitir que os anticorpos acessem compartimentos intracelulares. Neste protocolo, as células são fixadas com paraformaldeído (PFA), um fixador de reticulação comumente utilizado que mantém a morfologia celular e pode aumentar a permeabilidade da membrana celular sob condições específicas11,12,13,14. A permeabilização com etanol (EtOH) permite a entrada de anticorpos em compartimentos intracelulares, incluindo o acesso a alvos nucleares5,13,15. Após a permeabilização, realiza-se a coloração com anticorpos primários policlonais não conjugados e anticorpos secundários conjugados a fluoróforos. Utilizando este fluxo de trabalho, o tratamento com PFA isoladamente é empregado para detecção de imunorreatividade não superficial, enquanto um passo adicional de permeabilização com EtOH é utilizado para detecção de alvos nucleares. A avaliação da especificidade da coloração nuclear por competição com peptídeo mostrou inibição dependente da dose do ligante do anticorpo pelo peptídeo correspondente, mas não por um controle não específico. No geral, o uso de anticorpos primários policlonais não conjugados amplia a aplicabilidade da citometria de fluxo além da análise convencional de marcadores superficiais com anticorpos conjugados a fluoróforos e fornece uma abordagem flexível para avaliar a expressão proteica intracelular com resolução em nível de célula única.

Protocolo

Células K562 foram obtidas comercialmente e foram periodicamente autenticadas e testadas para micoplasma pelo Núcleo de Genética da Universidade do Arizona. Nenhum participante humano ou animal vertebrado foi envolvido neste estudo.

1. Preparar reagentes

  1. Cultive células em condições estéreis. Utilize a linhagem celular de leucemia mieloide humana K562 para este protocolo.
    1. Descongele e mantenha as células K562 em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina a 37°C em 5% de CO₂16. Para propagação, semeie as células em uma densidade de aproximadamente 1 × 105 células/mL, colha quando os cultivos atingirem 75%–95% da densidade celular máxima recomendada e não cultive além de 20 passagens. Para coloração, colha as células em 50%–75% da densidade celular máxima recomendada.
  2. Prepare solução salina tamponada com fosfato (PBS) 10× estéril dentro de uma cabine de segurança biológica classe II.
    1. Adicione 80 g de cloreto de sódio (NaCl), 2 g de cloreto de potássio (KCl), 2,4 g de fosfato monobásico de potássio (KH₂PO₄) e 14,4 g de fosfato dibásico de sódio (Na₂HPO₄) a 800 mL de água autoclavada em um cilindro graduado de 1 L.
    2. Adicione uma barra de agitação e agite a solução em uma placa magnética até que todo o pó tenha se dissolvido.
    3. Use um eletrodo de pH para ajustar o pH a 7,2–7,4. Complete o volume final para 1 L com água autoclavada. Estérilize a solução por filtração usando um filtro acoplado a uma garrafa com membrana de náilon de 0,2 µm de poro.
  3. Dilua o PBS 10× para PBS 1× adicionando 100 mL de PBS 10× estéril a 900 mL de água autoclavada dentro de uma cabine de segurança biológica classe II.
  4. Prepare o corante fixável de viabilidade de acordo com as instruções do fabricante. Para este protocolo, adicione 50 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) a um tubo com corante liofilizado e vortex até que o corante esteja completamente dissolvido.
    1. Armazene o corante reconstituído a −20°C, protegido da luz, por até 1 ano. Armazene o corante em alíquotas pequenas para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
  5. Prepare o tampão para triagem celular ativada por fluorescência (FACS) combinando 10% de PBS 10×, 86% de água e 4% de soro bovino fetal (FBS). Por exemplo, combine 10 mL de PBS 10×, 86 mL de água e 4 mL de FBS para preparar 100 mL de tampão FACS.
    1. Prepare apenas o volume de tampão FACS necessário para aproximadamente 2 semanas.
    2. Armazene o tampão FACS a 4°C.
  6. Prepare paraformaldeído (PFA) a 1%.
    CAUTION: Manipule o PFA como um agente inflamável, reativo e carcinogênico. Use equipamento de proteção individual adequado e prepare o PFA dentro de uma capela química certificada.
    1. Misture 350 mL de água e 50 mL de PBS 10×, coloque a solução em uma placa de agitação aquecida e aqueça até 65°C. Adicione gradualmente 20 g de pó de PFA à solução aquecida para preparar PFA 4% (peso/volume).
    2. Adicione 1–3 gotas de hidróxido de sódio (NaOH) 5 M para facilitar a dissolução do PFA. Agite a solução em uma placa de agitação aquecida por aproximadamente 20 min. Use um medidor de pH para ajustar o pH a 7,4.
    3. Complete o volume final para 500 mL com água.
    4. Aliquote o PFA 4% em volumes de 50 mL e armazene a −20°C por até 1 ano. Após descongelamento, armazene o PFA 4% a 4°C por até 2 meses. Descarte qualquer PFA 4% descongelado restante após 2 meses.
    5. Dilua o PFA 4% para PFA 1% usando PBS 1× e armazene a solução diluída a 4°C por até 4 semanas17.
  7. Prepare etanol (EtOH) 70% frio combinando 70 mL de etanol 200 proof com 30 mL de água ultrapura tipo I.
    1. Armazene o EtOH 70% a −20°C por até 1 ano. Mantenha a solução gelada imediatamente antes da adição às células para permeabilização.

2. Coletar e contar células

  1. Transfira as células de uma placa de cultura de tecidos de 10 cm para um tubo cônico de 15 mL.
  2. Centrifugue as células a 600 × g durante 5 min a 4°C com o freio ligado para obter o pellet celular.
  3. Remova o meio de cultura e lave as células ressuspendendo-as em 5 mL de PBS 1×. Centrifugue novamente a 600 × g durante 5 min a 4°C com o freio ligado, em seguida aspire o sobrenadante, deixando o pellet celular.
  4. Resuspenda o pellet celular em PBS 1×. Conte as células usando um hemocitômetro ou um contador celular automatizado, misturando 10 µL de suspensão celular com 10 µL de azul de tripano, carregando a amostra em uma lâmina de contagem e determinando a concentração celular.
    NOTA: Prossiga apenas se a viabilidade celular for >90% para garantir resultados confiáveis.
  5. Centrifugue a suspensão celular a 600 × g durante 5 min a 4°C com o freio ligado e aspire o sobrenadante, deixando o pellet celular. Resuspenda as células numa densidade de 2 × 105 células viáveis/mL (mínimo de 0.5 × 105 células viáveis/mL).
  6. Dispense 1 mL de suspensão celular no número necessário de tubos de amostra e controle para citometria de fluxo.
    1. Prepare tubos de amostra separados para cada proteína-alvo e fluxo de coloração. As condições de coloração de superfície (Pré-PFA), Pós-PFA, Pré-EtOH e Pós-EtOH são realizadas em tubos separados, e não por coloração sequencial das mesmas células. Por exemplo, ao avaliar duas proteínas-alvo, prepare oito tubos: Tubo 1 (anticorpo primário A, Pré-PFA), Tubo 2 (anticorpo primário B, Pré-PFA), Tubo 3 (anticorpo primário A, Pós-PFA), Tubo 4 (anticorpo primário B, Pós-PFA), Tubo 5 (anticorpo primário A, Pré-EtOH), Tubo 6 (anticorpo primário B, Pré-EtOH), Tubo 7 (anticorpo primário A, Pós-EtOH) e Tubo 8 (anticorpo primário B, Pós-EtOH).
      NOTA: Conforme mostrado no fluxo de coloração (Figura 1), realize a coloração com anticorpos primário e secundário para as amostras Pré-PFA e Pré-EtOH no Dia 1. Realize a coloração com anticorpos primário e secundário para as amostras Pós-PFA e Pós-EtOH no Dia 2.
    2. Prepare tubos controle não corados e monocorados para cada condição de tratamento. Se estiver avaliando viabilidade e duas proteínas-alvo, prepare um controle não corado, um controle somente com corante de viabilidade e um controle somente com anticorpo secundário para cada condição de tratamento.
      NOTA: Embora o anticorpo primário seja não conjugado, um controle somente com anticorpo primário pode ser incluído durante a validação do ensaio ou ao avaliar a ligação inespecífica do anticorpo primário.
    3. Submeta todos os tubos controle não corados e monocorados aos mesmos tratamentos aplicados aos tubos de amostra. Se as amostras forem fixadas com PFA 1% e permeabilizadas com EtOH 70%, processe os tubos controle de forma idêntica.
  7. Prepare controles de compensação monocorados utilizando microesferas de compensação.
    NOTA: As microesferas podem ser usadas em vez de células para preparar os controles de compensação.
    1. Rotule um tubo controle de compensação para cada fluoróforo e um tubo controle não corado. Se estiver usando um corante de viabilidade e dois anticorpos secundários marcados com fluoróforos diferentes, prepare quatro tubos: um controle não corado, um controle com corante de viabilidade (fluoróforo 1), um controle com anticorpo secundário A (fluoróforo 2) e um controle com anticorpo secundário B (fluoróforo 3).
      NOTA: Se estiver usando um corante de viabilidade reativo a aminas, utilize microesferas de compensação reativas a aminas para o controle com corante de viabilidade.
    2. Adicione apenas um corante ou anticorpo a cada tubo controle de compensação, de modo que cada controle seja positivo para um único fluoróforo durante a compensação em citometria de fluxo.

Quadro do protocolo de coloração com anticorpos com etapas de pré e pós-fixação, delineando processos sequenciais.
Figura 1. Fluxo de trabalho otimizado para detecção de alvos associados à superfície e intracelulares. O fluxo de trabalho ilustra a sequência e o cronograma de fixação, permeabilização, bloqueio, coloração com anticorpo primário e coloração com anticorpo secundário após a coloração com corante vital fixável. Fluxos de trabalho separados são mostrados para as condições Pré-PFA, Pós-PFA, Pré-EtOH e Pós-EtOH. A coloração com anticorpos primário e secundário é realizada no Dia 1 para os fluxos de trabalho Pré-PFA e Pré-EtOH e no Dia 2 para os fluxos de trabalho Pós-PFA e Pós-EtOH. PFA, paraformaldeído; EtOH, etanol. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

3. Corar as células com um corante fixável de viabilidade

  1. Marque as células com um corante vital fixável de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 1 µL da solução estoque do corante vital (preparada na Etapa 1.4) diretamente a cada tubo de amostra e ao tubo controle correspondente monocorado com corante vital contendo 1 × 106 células em 1 mL de PBS 1×.
  2. Vortexie suavemente por 3 s e incube as amostras à temperatura ambiente por 30 min, protegidas da luz.
    NOTA: Proteja as células da luz durante esta e todas as etapas subsequentes.
  3. Centrifugue a suspensão celular a 600 × g por 5 min a 4°C com a frenagem ativada, depois aspire o sobrenadante, deixando o pellet celular.
  4. Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS 1× e reconstitua o pellet celular final em 100 µL de PBS 1×.
    NOTA: Se for realizar marcação de alvos da superfície celular com anticorpos primários conjugados a fluoróforos, realize a marcação de superfície nesta etapa de acordo com as instruções do fabricante antes de prosseguir para a fixação.

4. Tratar as células com PFA a 1%

OBSERVAÇÃO: Para amostras pré-PFA (ver Etapa 2.6.1 e Figura 1), realize as Etapas 6, 7 e 8 antes de prosseguir com esta seção.

  1. Às células ressuspendidas em 100 µL de PBS 1×, adicione 1 mL de PFA a 1% a cada tubo de amostra, incluindo todos os tubos-controle com coloração simples. Vortexie suavemente por 3 s e incube as amostras à temperatura ambiente por 15–20 min, protegidas da luz.
  2. Centrifugue a suspensão celular a 600 × g por 5 min a 4°C com a frenagem ligada. Aspire e descarte o sobrenadante, deixando o pellet celular.
  3. Lave o pellet celular duas vezes ressuspendendo-o em 1 mL de tampão FACS, seguido de centrifugação a 600 × g por 5 min a 4°C com a frenagem ligada.
  4. Ressuspenda o pellet celular final em 100 µL de tampão FACS.
    ​OBSERVAÇÃO: Células fixadas (com ou sem coloração) podem ser armazenadas em 1 mL de tampão FACS a 4°C por 12–48 h. Para retomar o protocolo, centrifugue a suspensão celular a 600 × g por 5 min a 4°C com a frenagem ligada, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 100 µL de tampão FACS.

5. Permeabilizar células com EtOH

OBSERVAÇÃO: Para amostras Pré-EtOH (ver Etapa 2.6.1 e Figura 1), realize as Etapas 6, 7 e 8 antes de prosseguir com esta seção.

  1. Adicione cuidadosamente 1 mL de EtOH a 70% gelado à parede interna de cada tubo de amostra contendo 100 µL de suspensão celular, em seguida vortexe imediatamente com aproximadamente 50% de potência por 5 s. Repita este procedimento para todos os tubos de amostra restantes e para os tubos controle com coloração simples.
  2. Incube os tubos a −20°C por pelo menos 2 h, protegidos da luz.
    ​NOTA: As células podem ser armazenadas em 1 mL de EtOH a 70% a −20°C por 12–48 h antes de prosseguir com o protocolo.
  3. Centrifugue a suspensão celular a 600 × g por 5 min a 4°C com o freio ligado, em seguida aspire o sobrenadante, deixando o pellet celular.
  4. Lave as células três vezes com 1 mL de tampão FACS, centrifugando a 600 × g por 5 min a 4°C com o freio ligado entre cada lavagem.
  5. Reuspenda o pellet celular final em 100 µL de tampão FACS.

6. Bloquear as células

  1. Adicione 820 µL de tampão FACS e 80 µL de soro normal de cabra (NGS) a cada tubo para preparar uma solução bloqueadora final contendo 92% de tampão FACS e 8% de NGS. Agite suavemente por 3 s em vórtex e incube as amostras à temperatura ambiente por 30 min, em repouso e protegidas da luz.
  2. Centrifugue a suspensão celular a 600 × g durante 5 min a 4°C com o freio ligado, em seguida aspire o sobrenadante, deixando o pellet celular.
  3. Lave as células duas vezes ressuspendendo o pellet em 1 mL de tampão FACS, seguido de centrifugação conforme descrito no Passo 6.2.
  4. Ressuspenda o pellet celular final em 100 µL de tampão FACS.

7. Corar as células com um anticorpo primário não conjugado

  1. Adicione 0,5 µL do anticorpo primário não conjugado à suspensão celular de 100 µL (diluição 1:200). Incube as amostras à temperatura ambiente por 1 h, protegidas da luz.
    NOTA: A diluição 1:200 é uma concentração inicial recomendada e pode exigir otimização para outros anticorpos.
    1. Se for realizar competição com peptídeo, adicione o peptídeo imediatamente antes de adicionar o anticorpo primário. Neste protocolo, os peptídeos foram titulados em razões molares peptídeo-anticorpo variando de 50 a 0,625, calculadas em relação à concentração do anticorpo (4,3 nM) na mistura de reação. Pode ser necessária otimização para pares individuais peptídeo–anticorpo.
  2. Adicione 1 mL do tampão FACS e centrifugue a suspensão celular a 600 × g durante 5 min a 4°C com a frenagem ativada. Aspire o sobrenadante, deixando o pellet celular.
  3. Lave as células mais duas vezes com 1 mL de tampão FACS, centrifugando conforme descrito no Passo 7.2.
  4. Resuspenda o pellet celular final em 100 µL de tampão FACS.

8. Incubar as células com um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo

  1. Adicione uma diluição 1:200 do anticorpo secundário conjugado a fluoróforo (0,5 µL de anticorpo em 100 µL de suspensão celular) a cada tubo de amostra e ao tubo controle correspondente.
    NOTA: Neste protocolo, foi utilizado o anticorpo secundário DyLight 488 de cabra anti-coelho.
  2. Incube as amostras à temperatura ambiente por 1 h, protegidas da luz.
  3. Adicione 1 mL de tampão FACS. Centrifugue a suspensão celular a 600 × g durante 5 min a 4°C com freio ligado, depois aspire o sobrenadante, deixando o pellet celular.
  4. Lave as células duas vezes com 1 mL de tampão FACS, repetindo a centrifugação descrita na Etapa 8.3.
  5. Re-suspenda as células em 300–500 µL de tampão FACS.
    NOTA: As células podem ser armazenadas em tampão FACS a 4°C, protegidas da luz, por 1–3 dias antes da análise por citometria de fluxo.

9. Analisar amostras por citometria de fluxo

  1. Realize a compensação de fluorescência utilizando os controles monocorados apropriados. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo e colete pelo menos 5.000–10.000 eventos de células únicas vivas para análise. Para este protocolo, o software FACSDiva foi utilizado para a aquisição de dados.
  2. Analise os dados excluindo primeiro os detritos utilizando dispersão para frente área (FSC-A) versus dispersão lateral área (SSC-A), seguido pela exclusão de dupletes utilizando altura da dispersão para frente (FSC-H) versus largura da dispersão para frente (FSC-W) e altura da dispersão lateral (SSC-H) versus largura da dispersão lateral (SSC-W). Exclua as células mortas utilizando o canal do corante de viabilidade.
  3. Analise a porcentagem das células únicas vivas restantes que são positivas ou negativas para as proteínas-alvo selecionadas (veja Resultados Representativos). Estabeleça os limites de positividade utilizando os controles não corados e apenas com anticorpo secundário, e aplique critérios idênticos de delimitação a todas as amostras comparáveis dentro do mesmo lote de aquisição.

Resultados

O protocolo descrito aqui permite a coloração intracelular de alvos proteicos para os quais não existem anticorpos comerciais validados para citometria de fluxo. Como exemplo representativo, avaliou-se a coloração do fator de spliceamento 3a, subunidade 1 (SF3A1), uma proteína de spliceamento ubiquamente expressa que se localiza no núcleo, utilizando um anticorpo policlonal de coelho gerado contra um peptídeo correspondente aos aminoácidos 18–37 de SF3A1 (SF3A118–37; EPKQPTEEEASSKEDSAPSK)18,19.

Para avaliar o protocolo de coloração, as células foram coradas com o anticorpo primário policlonal anti-SF3A118–37 não conjugado antes ou após o tratamento com paraformaldeído (PFA) isoladamente ou com tratamento sequencial de PFA + EtOH (Figuras 1 e 2). Conforme esperado, nenhuma população positiva para SF3A1 foi detectada nas amostras coradas antes do tratamento com PFA (Pré-PFA) ou antes do tratamento sequencial com PFA e EtOH (Pré-EtOH) (Figura 2A). A coloração realizada após o tratamento com PFA isoladamente (Pós-PFA) identificou uma pequena população positiva para SF3A1 (Figura 2B). Em contraste, uma população distinta positiva para SF3A1 foi observada somente quando a coloração foi realizada após a permeabilização com EtOH (Pós-EtOH) (Figura 2B). Esses resultados indicam que o protocolo detecta uma coloração significativamente maior de SF3A1 após a permeabilização com EtOH do que após o tratamento com PFA isoladamente.

Gráfico de citometria de fluxo; análise de células SF3A1+ antes/depois da fixação; comparação EtOH/PFA; DL488, SSC-A.
Figura 2. Avaliação da marcação de SF3A1 após fixação com paraformaldeído e permeabilização com etanol. Gráficos representativos de citometria de fluxo de células K562 vivas, negativas para corante de viabilidade, mostrando a fluorescência DyLight 488 (DL488) versus área de dispersão lateral (SSC-A). A região destacada em caixa indica a população positiva para SF3A1 (SF3A1⁺). SF3A1, fator de splicing 3a subunidade 1; PFA, paraformaldeído; EtOH, etanol. (A) Marcação com anticorpo anti-SF3A1 realizada antes da fixação com PFA (Pré-PFA; esquerda) ou antes da fixação com PFA seguida de permeabilização com EtOH (Pré-EtOH; direita). (B) Marcação com anticorpo anti-SF3A1 realizada após fixação com PFA (Pós-PFA; esquerda) ou após fixação com PFA seguida de permeabilização com EtOH (Pós-EtOH; direita). (C) Comparação da marcação de SF3A1 após permeabilização com EtOH por 2 h ou durante a noite. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Para determinar se a duração da exposição ao EtOH afetou a coloração ou a integridade celular, as células foram tratadas com EtOH por 2 h ou durante a noite. A análise por citometria de fluxo não mostrou diferenças significativas na intensidade de coloração ou na integridade celular aparente entre as duas condições (Figura 2C). Esses resultados indicam que 2 h de permeabilização com EtOH produziram uma coloração comparável à incubação prolongada, nas condições testadas.

Após confirmar que a permeabilização com EtOH produziu marcação detectável de SF3A1 (Figura 2B) e estabelecer a marcação basal de SF3A1 na ausência de peptídeo competidor (Figura 3A), a especificidade do anticorpo foi avaliada por meio do ensaio de competição com peptídeo. As células foram incubadas com o peptídeo SF3A118–37 ou com um peptídeo controle não específico correspondente aos aminoácidos 778–793 de SF3A1 (SF3A1778–793; GAVIHLALKERGGRKK). Os peptídeos foram adicionados juntamente com o anticorpo primário (Protocolo, Etapa 7). A incubação com excesso do peptídeo específico SF3A118–37 reduziu a porcentagem de células positivas para SF3A1 a um nível comparável ao controle não corado, enquanto o peptídeo não específico SF3A1778–793 não alterou de forma mensurável o perfil de marcação (Figura 3B,C). Experimentos de titulação de peptídeo demonstraram inibição dependente da dose do vínculo do anticorpo pelo peptídeo cognato SF3A118–37 (IC50 = 21,6 nM), enquanto nenhuma inibição foi observada com até 50 vezes o excesso molar do peptídeo não específico SF3A1778–793 (Figura 3D). Esses resultados demonstram que o ensaio de competição com peptídeo pode ser utilizado para avaliar a inibição do vínculo do anticorpo por citometria de fluxo.

Análise por citometria de fluxo da expressão de SF3A1 utilizando anticorpo anti-SF3A1, peptídeo específico e inibição.
Figura 3. Inibição competitiva dependente da dose do anticorpo anti-SF3A1 pelo peptídeo cognato. Gráficos representativos de citometria de fluxo de células K562 vivas, negativas para corante de viabilidade, mostrando fluorescência DyLight 488 (DL488) versus área de dispersão lateral (SSC-A). A região destacada em caixa indica a população positiva para SF3A1 (SF3A1⁺). SF3A1, fator de splicing 3a, subunidade 1. (A) Controle não corado e coloração com anticorpo anti-SF3A1. (B) Coloração para SF3A1 após adição dependente da dose do peptídeo cognato SF3A1(18–37). (C) Coloração para SF3A1 após adição dependente da dose do peptídeo não específico SF3A1(778–793). As concentrações dos peptídeos foram de 216, 43,3, 21,7, 10,8, 5,4 e 2,7 nM; as razões molares peptídeo/anticorpo indicadas na figura foram calculadas em relação a uma concentração de anticorpo anti-SF3A1 de 4,33 nM. (D) Curva de inibição competitiva mostrando a porcentagem de células positivas para SF3A1 em função da concentração do peptídeo. O peptídeo cognato SF3A1(18–37) inibiu a ligação do anticorpo de forma dependente da dose, enquanto o peptídeo SF3A1(778–793) não apresentou inibição. A concentração inibitória半-máxima (IC₅₀) para o peptídeo cognato foi de 21,6 nM, determinada utilizando um modelo não linear de melhor ajuste de inibidor versus resposta normalizada com inclinação variável. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Por fim, o protocolo foi avaliado para a detecção do receptor de eritropoietina (EpoR), um receptor de superfície celular que também está presente intracelularmente durante a biossíntese do receptor e após a internalização induzida pelo ligante20,21. O EpoR é uma proteína de 508 aminoácidos composta por um domínio N-terminal extracelular, uma única região transmembrana que abrange os aminoácidos 251–273 e um domínio C-terminal intracelular. Um anticorpo policlonal anti-EpoR de coelho não conjugado (BS-1424R), previamente validado para western blot, imunohistoquímica e imunofluorescência, mas não para citometria de fluxo22,23,24,25,26, foi aplicado utilizando o fluxo de trabalho de marcação descrito acima. De acordo com o fabricante, o BS-1424R foi produzido contra os aminoácidos 330–365 dentro do domínio intracelular do EpoR.

Quando as células foram coradas antes do tratamento com PFA (Pré-PFA), <10% das células K562 foram positivas para a marcação de EpoR (Figura 4A). Em contraste, aproximadamente 77% e 84% das células K562 foram positivas após o tratamento apenas com PFA (Pós-PFA) e tratamento sequencial com PFA seguido de EtOH (Pós-EtOH), respectivamente (Figura 4B–D). Em contraste com a coloração de SF3A1, observou-se aumento na coloração de EpoR após os protocolos Pós-PFA e Pós-EtOH (compare Figuras 2B e 4D). Esses achados são consistentes com a localização do epítopo BS-1424R dentro do domínio intracelular do EpoR. A detecção de imunorreatividade para EpoR sob ambas as condições de coloração indica que o tratamento com PFA permeabiliza suficientemente a membrana plasmática de células K562, permitindo a ligação do anticorpo ao epítopo intracelular. Neste fluxo de trabalho, o uso de um único anticorpo secundário exige a avaliação dos compartimentos de EpoR na superfície e no interior da célula por meio de amostras tratadas e coradas separadamente. Essa limitação pode ser superada mediante o uso de anticorpos primários produzidos em espécies diferentes, permitindo a detecção multiplex com anticorpos secundários específicos para cada espécie.

Gráficos de dispersão e gráfico de barras da citometria de fluxo mostrando porcentagens de células EpoR+ antes e após a fixação.
Figura 4. Detecção do receptor de eritropoietina (EpoR) em células K562 após diferentes condições de fixação e permeabilização. Gráficos representativos de citometria de fluxo de células K562 vivas, negativas para corante de viabilidade, mostrando fluorescência DyLight 488 (DL488) versus área de dispersão lateral (SSC-A). A região destacada em caixa indica a população positiva para EpoR (EpoR⁺). A coloração para EpoR foi realizada utilizando o anticorpo policlonal BS-1424R gerado contra os aminoácidos 330–365 dentro do domínio intracelular do EpoR. (A) Coloração para EpoR antes da fixação com PFA (Pré-PFA). (B) Coloração para EpoR após fixação com PFA (Pós-PFA). (C) Coloração para EpoR após fixação com PFA seguida de permeabilização com EtOH (Pós-EtOH). (D) Quantificação das células positivas para EpoR em cada condição de coloração. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM) de três experimentos independentes (n = 3). A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student. P < 0,01 é indicado por **. As comparações mostradas são Pré-PFA versus Pós-PFA e Pré-PFA versus Pós-EtOH. Ab, anticorpo; EpoR, receptor de eritropoietina; PFA, paraformaldeído; EtOH, etanol. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Os resultados apresentados aqui destacam vários parâmetros críticos para a detecção de proteínas por citometria de fluxo intracelular utilizando anticorpos primários não conjugados. Uma consideração importante é a estratégia de permeabilização, que deve ser selecionada de acordo com a localização intracelular da proteína-alvo. No fluxo de trabalho descrito aqui, a fixação com PFA seguida da permeabilização com EtOH permitiu a detecção da proteína nuclear SF3A1, enquanto a imunorreatividade de EpoR foi detectada utilizando tanto o fluxo de trabalho Pós-PFA quanto o Pós-EtOH. Ao avaliar proteínas de superfície, a marcação deve ser realizada antes do tratamento com PFA, enquanto a marcação intracelular pode ser feita após o tratamento com PFA e, quando necessário, seguida por permeabilização adicional com EtOH. Esse fluxo de trabalho permite a avaliação de proteínas associadas à superfície e proteínas intracelulares dentro de populações celulares definidas imunofenotipicamente, utilizando condições de marcação separadas.

Embora o PFA seja geralmente usado como fixador celular, o tratamento com 1% de PFA permeabilizou suficientemente a membrana plasmática de células K562, permitindo a ligação do anticorpo contra EpoR a um epítopo intracelular. A permeabilização mediada por PFA também demonstrou permitir a entrada de anticorpos em outras linhagens celulares, incluindo células HEK293T e HeLa; entretanto, isso foi alcançado usando uma concentração mais alta de PFA (4%)11. Essas diferenças sugerem efeitos do PFA dependentes do tipo celular; portanto, pode ser necessário otimizar as condições de fixação para maximizar a detecção do epítopo. Reagentes alternativos para permeabilização celular incluem os detergentes saponina, digitonina e Triton X-100, que atuam por meio de mecanismos diferentes. Enquanto o Triton X-100 permeabiliza de forma não específica as membranas celulares, a saponina e a digitonina permeabilizam as células por meio da ligação ao colesterol e a outros esteróis da membrana27. Estudos demonstraram que concentrações baixas de digitonina permeabilizam seletivamente a membrana plasmática, preservando a integridade das membranas mitocondriais e nucleares28,29,30. Assim, combinações adequadas desses reagentes podem ser utilizadas para distinguir a localização proteica em diferentes compartimentos subcelulares, embora uma limitação dessas abordagens seja a possível perda de antígenos intracelulares e de integridade do epítopo13,31.

O protocolo é facilmente adaptável e pode ser modificado de acordo com as exigências experimentais. Por exemplo, a duração do tratamento com EtOH pode ser ajustada sem perda aparente do desempenho da coloração ou da integridade celular, proporcionando flexibilidade para fluxos de trabalho de vários dias, especialmente quando as condições de coloração pré- e pós-permeabilização são realizadas em paralelo (Figura 1). O protocolo também pode ser aplicado a outros tipos celulares, incluindo células hematopoéticas humanas primárias; no entanto, as condições de fixação, permeabilização e centrifugação podem exigir otimização, pois esses tratamentos podem influenciar a acessibilidade do epítopo, a eficiência de ligação do anticorpo, a integridade celular e a intensidade do sinal de fluorescência14,32,33. Além disso, a otimização dos tempos de exposição ao PFA e ao EtOH, bem como das condições de centrifugação, pode ajudar a manter a viabilidade celular e minimizar a perda excessiva de células. A detecção de outros alvos proteicos também é possível após a otimização da concentração do anticorpo e das condições de incubação.

Limitações potenciais incluem baixa intensidade do sinal, que pode ser melhorada aumentando a concentração do anticorpo primário ou utilizando amplificação por anticorpo secundário. A coloração inespecífica pode ser reduzida mediante a otimização das condições de bloqueio ou por competição com peptídeos. O uso de anticorpos policlonais também pode introduzir variabilidade entre lotes e aumentar o potencial de ligação fora do alvo; portanto, a especificidade do anticorpo deve ser cuidadosamente validada para cada aplicação. Além disso, a competição com peptídeos demonstra dependência em relação ao peptídeo imunizante, mas não estabelece independentemente a especificidade do anticorpo. No caso do anticorpo anti-SF3A1, estudos prévios de imunoprecipitação já confirmaram a especificidade do anticorpo19. Outras abordagens complementares para validar a especificidade do anticorpo incluem esgotamento do antígeno, silenciamento gênico, eliminação gênica ou o uso de modelos celulares negativos para o antígeno. Além disso, esta abordagem não é inherentemente compatível com todos os painéis multicoloridos, pois o uso de múltiplos anticorpos secundários pode introduzir reatividade cruzada e limitar a multiplexação, a menos que controles apropriados sejam implementados. Assim, a seleção cuidadosa de anticorpos secundários e fluoróforos é essencial para minimizar a coloração de fundo e maximizar a resolução do sinal.

O protocolo descrito aqui fornece um fluxo de trabalho para a avaliação citométrica de fluxo de proteínas intracelulares em células de eritroleucemia humana K562. Também permite a avaliação do desempenho de anticorpos por meio da competição com peptídeos e a análise da imunorreatividade associada a receptores sob diferentes condições de marcação. A abordagem pode ser útil para investigar alterações na expressão proteica durante a diferenciação celular ou em resposta a estímulos extracelulares, incluindo estudos de fatores de transcrição, proteínas envolvidas no processamento de RNA e biologia de receptores em populações celulares definidas imunofenotipicamente. Em um estudo separado, este fluxo de trabalho foi utilizado para investigar alterações mediadas pela eritropoetina em enzimas metabólicas de lipídios intracelulares em células-tronco e progenitoras hematopoiéticas humanas em processo de diferenciação eritoide34, demonstrando a adaptabilidade do protocolo a células primárias. De modo geral, este protocolo amplia a aplicação de anticorpos primários não conjugados na citometria de fluxo e fornece um fluxo de trabalho flexível para avaliar a expressão proteica em células cultivadas.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio financeiro recebido por SS do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R01GM127464) e do Instituto Nacional do Câncer (P30CA023074), ambos dos Institutos Nacionais de Saúde, do Programa de Parceria de Pesquisa do Vale (VRP P1-4009 e VRP77) e do Centro de Pesquisa Biomédica do Arizona (ABRC: RFGA2022-010-30). O conteúdo é de inteira responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Os autores também agradecem o apoio da Dra. Mrinalini Kala, diretora da Instalação Central de Citometria de Fluxo, Faculdade de Medicina–Phoenix, Universidade do Arizona.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10× Solução salina tamponada com fosfato (PBS)In-houseN/AAlternativa: PBS comercialmente disponível
Tubos cónicos de 15 mLVWR89039-664Alternativa: Qualquer tubo cónico estéril de tamanho apropriado
Tubos de poliestireno redondos de 5 mLCorning352052Alternativa: Qualquer tubo para citometria de fluxo compatível com o citómetro disponível
Anticorpo secundário DyLight 488 anti-coelhoThermo Fisher ScientificPI35553Alternativa: Anticorpo secundário compatível com a espécie hospedeira do anticorpo primário
Contador celular automatizadoThermo Fisher ScientificAMQAF2000Alternativa ao hemocitómetro
Kit de microesferas de compensação reativas a aminas ArCThermo Fisher ScientificA10628Alternativa: Células; se forem usadas células para controles de coloração única, todos os tubos controle devem ser processados de forma idêntica aos tubos de amostra
Filtro de boca de garrafaThermo Fisher Scientific595-4520Membrana de náilon; 0,2 µm
Lâminas para contagem celularThermo Fisher ScientificC10228Exigidas apenas quando se utiliza um contador celular automatizado
Dissulfóxido de dimetilo (DMSO)Fornecido com o kit do corante de viabilidadeN/AUtilizado para reconstituir o corante de viabilidade liofilizado
Etanol, 200 provasThermo Fisher ScientificBP28184Qualidade para biologia molecular; utilizado para preparar etanol 70% gelado
Anticorpo policlonal primário contra o receptor de eritropoietinaBiossBS-1424R
Soro bovino fetal (FBS)Omega ScientificFB-12Alternativa: Qualquer FBS validado para a linhagem celular-alvo
Citómetro de fluxoBD BiosciencesBD Canto II Alternativa: Qualquer citómetro de fluxo adequado
HemocitómetroHausser ScientificHS3200Alternativa: Contador celular automatizado
Placa de agitação magnética aquecidaThermo Fisher ScientificSP88857100Utilizada para preparação de PBS e paraformaldeído
Células de leucemia mielóide humana K562ATCCCCL-243Pode ser adquirido de qualquer outra fonte autenticada
Corante fixável de viabilidade Live-or-Dye (405/545)Biotium32009Alternativa: Qualquer corante fixável compatível. Corantes não fixáveis (por exemplo, 7-AAD) não são adequados
Soro normal de cabraThermo Fisher Scientific16210064Utilizado para bloqueio
Paraformaldeído em póSigma-AldrichP6148Alternativa: Solução de paraformaldeído comercialmente disponível
Medidor/probe de pHAccumetAB15Utilizado para ajustar o pH do tampão
Cloreto de potássio (KCl)Thermo Fisher ScientificBP366-1
Fosfato monobásico de potássio (KH2PO4)Thermo Fisher ScientificBP362-1
Anticorpo policlonal primário SF3A1 In-houseN/A
Cloreto de sódio (NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1
Solução de hidróxido de sódio (5 M)MilliporeSigmaS8263Alternativa: Preparar uma solução 5 M a partir de pastilhas de hidróxido de sódio
Fosfato dibásico de sódio (Na2HPO4)Thermo Fisher ScientificBP332-1
Barra de agitaçãoVWR74950-286Utilizada com a placa de agitação magnética
Azul de tripano, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061Utilizado para contagem de viabilidade celular
Microesferas de compensação UltraComp eBeadsThermo Fisher Scientific01-2222-42Alternativa: Células; se forem usadas células para controles de coloração única, todos os tubos controle devem ser processados de forma idêntica aos tubos de amostra

Referências

  1. Schippel N, Sharma S. Dynamics of human hematopoietic stem and progenitor cell differentiation to the erythroid lineage. Exp Hematol. 2023;123:1-17. DOI:10.1016/j.exphem.2023.05.001.
  2. Schippel N, Kala M, Sharma S. Erythropoietin-dependent acquisition of CD71hiCD105hi phenotype within CD235a- early erythroid progenitors. Stem Cells. 2025;43(12). DOI:10.1093/stmcls/sxaf061.
  3. Robinson JP. Flow cytometry: past and future. BioTechniques. 2022;72(4):159-169. DOI:10.2144/btn-2022-0005.
  4. Freer G, Rindi L. Intracellular cytokine detection by fluorescence-activated flow cytometry: basic principles and recent advances. Methods. 2013;61(1):30-38. DOI:10.1016/j.ymeth.2013.03.035.
  5. Krutzik PO, Nolan GP. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single-cell signaling events. Cytometry A. 2003;55(2):61-70. DOI:10.1002/cyto.a.10072.
  6. Manso BA, Medina KL. Standardized flow-cytometry-based protocol to simultaneously measure transcription factor levels. STAR Protoc. 2021;2(2):100485. DOI:10.1016/j.xpro.2021.100485.
  7. Hallden G, Andersson U, Hed J, Johansson SG. A new membrane permeabilization method for the detection of intracellular antigens by flow cytometry. J Immunol Methods. 1989;124(1):103-109. DOI:10.1016/0022-1759(89)90191-9.
  8. Kalina T, Lundsten K, Engel P. Relevance of antibody validation for flow cytometry. Cytometry A. 2020;97(2):126-136. DOI:10.1002/cyto.a.23895.
  9. Voskuil JL. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 2017;6:161. DOI:10.12688/f1000research.10851.1.
  10. Koeffler HP, Golde DW. Human myeloid leukemia cell lines: a review. Blood. 1980;56(3):344-350.
  11. Bernard E, et al. Assessing the limitations of paraformaldehyde fixation for accurate cell surface receptor measurement. Front Pharmacol. 2026;17:1727410. DOI:10.3389/fphar.2026.1727410.
  12. Jamur MC, Oliver C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 2010;588:63-66. DOI:10.1007/978-1-59745-324-0_9.
  13. Cheng R, et al. Influence of fixation and permeabilization on the mass density of single cells: a surface plasmon resonance imaging study. Front Chem. 2019;7:588. DOI:10.3389/fchem.2019.00588.
  14. Hobro AJ, Smith NI. An evaluation of fixation methods: spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vib Spectrosc. 2017;91:31-45. DOI:10.1016/j.vibspec.2016.10.012.
  15. Schimenti KJ, Jacobberger JW. Fixation of mammalian cells for flow cytometric evaluation of DNA content and nuclear immunofluorescence. Cytometry. 1992;13(1):48-59. DOI:10.1002/cyto.990130109.
  16. Kandarian F, Sunga GM, Arango-Saenz D, Rossetti M. A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity. J Vis Exp. 2017;(126). DOI:10.3791/56191.
  17. Bapat A, Keita N, Sharma S. Pan-myeloid differentiation of human cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. J Vis Exp. 2019;(150). DOI:10.3791/59836.
  18. Martelly W, et al. Identification of a noncanonical RNA binding domain in the U2 snRNP protein SF3A1. RNA. 2019;25(11):1509-1521. DOI:10.1261/rna.072256.119.
  19. Sharma S, et al. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes Dev. 2014;28(22):2518-2531. DOI:10.1101/gad.248625.114.
  20. Sulahian R, Cleaver O, Huang LJ. Ligand-induced EpoR internalization is mediated by JAK2 and p85 and is impaired by mutations responsible for primary familial and congenital polycythemia. Blood. 2009;113(21):5287-5297. DOI:10.1182/blood-2008-09-179572.
  21. Sinclair AM, et al. Erythropoietin receptor transcription is neither elevated nor predictive of surface expression in human tumour cells. Br J Cancer. 2008;98(6):1059-1067. DOI:10.1038/sj.bjc.6604220.
  22. Li X, et al. Oxidative stress induces the decline of brain EPO expression in aging rats. Exp Gerontol. 2016;83:89-93. DOI:10.1016/j.exger.2016.07.012.
  23. Liu T, et al. Multifaceted roles of a bioengineered nanoreactor in repressing radiation-induced lung injury. Biomaterials. 2021;277:121103. DOI:10.1016/j.biomaterials.2021.121103.
  24. Zhang Y, et al. Erythropoietin receptor is a risk factor for prognosis: a potential biomarker in lung adenocarcinoma. Pathol Res Pract. 2023;251:154891. DOI:10.1016/j.prp.2023.154891.
  25. Liu J, et al. Lithium chloride promotes endogenous synthesis of CLA in bovine mammary epithelial cells. Biol Trace Elem Res. 2024;202(2):513-526. DOI:10.1007/s12011-023-03679-z.
  26. Wu G, et al. EPO promotes the progression of rheumatoid arthritis by inducing desialylation via increasing the expression of neuraminidase 3. Ann Rheum Dis. 2024;83(5):564-575. DOI:10.1136/ard-2023-224852.
  27. Sudji IR, et al. Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules. 2015;20(11):20146-20160. DOI:10.3390/molecules201119682.
  28. Niklas J, Melnyk A, Yuan Y, Heinzle E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 2011;416(2):218-227. DOI:10.1016/j.ab.2011.05.039.
  29. Liu J, Xiao N, DeFranco DB. Use of digitonin-permeabilized cells in studies of steroid receptor subnuclear trafficking. Methods. 1999;19(3):403-409. DOI:10.1006/meth.1999.0876.
  30. Krawczyk E, Suprynowicz FA, Sudarshan SR, Schlegel R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 2010;84(4):1696-1703. DOI:10.1128/JVI.01968-09.
  31. Goldenthal KL, et al. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. J Histochem Cytochem. 1985;33(8):813-820. DOI:10.1177/33.8.3894499.
  32. Fahlberg MD, et al. Overcoming fixation and permeabilization challenges in flow cytometry by optical barcoding and multi-pass acquisition. Cytometry A. 2024;105(11):838-848. DOI:10.1002/cyto.a.24904.
  33. Law JP, et al. The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Cytometry A. 2009;75(12):1040-1050. DOI:10.1002/cyto.a.20815.
  34. Schippel N, et al. Erythropoietin mediates glycerophospholipid remodeling during human early erythropoiesis. bioRxiv. 2026. DOI:10.64898/2026.02.20.707106.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Citometria de FluxoDetec o de Prote nas IntracelularesC lulas K562Colora o com Anticorpos Secund riosAn lise de Express o ProteicaPermeabiliza o CelularColora o NuclearEspecificidade de Anticorpos

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.