Este protocolo demonstra a avaliação da Xiaoyao San Modificada em um modelo murino de depressão induzida por estresse leve imprevisível crônico, incluindo avaliações comportamentais, histológicas e moleculares da necroptose neuronal.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de investigação
Xiaoyao San Modificado Melhora Comportamentos Semelhantes à Depressão e a Necroptose Neuronal em um Modelo de Camundongo de Estresse Leve Imprevisível Crônico
Neste artigo
Resumo
Resumo
A perda e a lesão neuronais são características patológicas importantes da depressão, e a necroptose tem sido proposta como um mecanismo potencial de morte celular neuronal. A análise de conjuntos de dados do Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE54565, GSE54566 e GSE54568) identificou uma associação entre depressão e necroptose, sugerindo que a inibição dessa via pode representar uma estratégia terapêutica potencial. O Xiaoyao San Modificado (XSM), uma formulação modificada da medicina tradicional chinesa Xiaoyao San, foi desenvolvido pela incorporação de ervas com propriedades de eliminação de calor, resfriamento do sangue, melhora cognitiva e promoção da ressuscitação, com o objetivo de aumentar a eficácia terapêutica. No entanto, seus efeitos sobre a necroptose neuronal e os constituintes ativos que atingem o tecido cerebral permanecem pouco claros. A cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas de alta resolução (UHPLC-HRMS) foi utilizada para identificar preliminarmente os constituintes do XSM detectados no tecido cerebral. A eficácia terapêutica foi avaliada em um modelo murino de estresse leve imprevisível crônico (CUMS) de depressão por meio de avaliações comportamentais, exame histológico, imunofluorescência, western blot e análises bioinformáticas. A administração de XSM foi associada à melhora de comportamentos semelhantes à depressão, atenuação de lesões cerebrais patológicas e redução da fosforilação da proteína quinase 3 associada ao receptor de interação com proteína (RIPK3) e da proteína com domínio semelhante à quinase de linhagem mista (MLKL). Esses achados sugerem que o XSM exerce efeitos semelhantes aos antidepressivos, os quais estão associados à redução de marcadores de necroptose neuronal, fornecendo apoio experimental para investigações adicionais do XSM como uma estratégia terapêutica potencial para a depressão.
Introdução
A depressão, um transtorno mental grave dentro do espectro dos transtornos do humor, caracteriza-se principalmente pelo humor persistentemente baixo e é influenciada por múltiplos fatores1. Clinicamente, os pacientes com depressão frequentemente apresentam sintomas como humor deprimido, lentidão cognitiva, redução da comunicação verbal e da atividade física e, em casos graves, comportamentos autolésivos e ideação suicida2. Devido à sua alta prevalência, taxa de recorrência, incapacidade e suicídio, a depressão é uma das principais causas de incapacidade no mundo e impõe pesados encargos sociais e econômicos3. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, espera-se que a depressão se torne a principal causa da carga global de doenças até 2030, superando o câncer e as doenças cardiovasculares e cerebrovasculares3. Além disso, a pandemia da doença pelo coronavírus 2019 (COVID-19) esteve associada a um aumento de 27,6% na prevalência global do transtorno depressivo maior4. Na China, a prevalência anual da depressão é de 3,6%, com uma prevalência ao longo da vida de 6,8%5. A patogênese da depressão ainda não é completamente compreendida devido à sua etiologia complexa e aos múltiplos fatores contribuintes. Consequentemente, as opções de tratamento permanecem limitadas, e cerca de 30%–40% dos pacientes desenvolvem depressão resistente ao tratamento devido à resposta inadequada aos antidepressivos atualmente disponíveis6. Além disso, o início tardio da ação, os sintomas residuais, a neurotoxicidade e os efeitos adversos associados aos antidepressivos existentes continuam a representar desafios terapêuticos significativos7.
A morte celular programada tem sido por muito tempo um foco principal da pesquisa biomédica. Evidências crescentes sugerem que a depressão está associada à necroptose8,9,10,11. A necroptose, assim como a apoptose, é uma forma de morte celular programada; no entanto, diferentemente da apoptose, ela provoca respostas imunes e inflamatórias acentuadas12. Na ausência de atividade da caspase-8, o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) liga-se ao receptor 1 do fator de necrose tumoral (TNFR1), resultando na ativação da quinase 1 associada ao receptor de interação com proteínas (RIPK1)13. A RIPK1 ativada interage com a quinase 3 associada ao receptor de interação com proteínas (RIPK3) para formar o complexo necrossomo, que subsequentemente ativa a proteína com domínio semelhante a quinase de linhagem mista (MLKL)14. Após a oligomerização, a MLKL transloca-se do citoplasma para a membrana plasmática, causando inchaço dos organelos15,16, ruptura da integridade da membrana celular e liberação de conteúdos intracelulares, incluindo padrões moleculares associados a danos (DAMPs) e mediadores inflamatórios como TNF-α, interleucina (IL)-1 e IL-6, exarcebando assim as respostas inflamatórias17. A necroptose tem sido implicada em diversas doenças inflamatórias e neurodegenerativas, incluindo esclerose múltipla, depressão, esclerose lateral amiotrófica, doença de Parkinson e doença de Alzheimer18,19,20. Análises proteômicas demonstraram que a depressão induzida por estresse leve imprevisível crônico (CUMS) está associada ao aumento da expressão de RIPK3 e MLKL e à ativação da via de necroptose2. Em outro modelo murino de depressão com CUMS, a fluoxetina exerceu efeitos semelhantes aos de antidepressivos, os quais estiveram associados à inibição da necroptose mediada por RIPK110. Além disso, o Nec-1s, um inibidor da necroptose, demonstrou melhorar comportamentos semelhantes à depressão induzidos por lipopolissacarídeo (LPS)21. Como a lesão neuronal é uma característica patológica importante da depressão, o direcionamento da necroptose pode representar uma estratégia terapêutica promissora para o tratamento da depressão.
A medicina tradicional chinesa (MTC) possui uma longa história no tratamento da depressão. De acordo com a teoria da MTC, o fígado rege o fluxo livre do qi; portanto, a depressão é principalmente atribuída ao sofrimento emocional que leva à estagnação do qi hepático. Assim, a principal estratégia terapêutica consiste em suavizar o fígado e aliviar a depressão. Xiaoyao San (XYS) é uma prescrição herbácea clássica amplamente utilizada para esse fim, e há amplas evidências que apoiam sua aplicação no tratamento da depressão22. Além disso, relatos indicam que o XYS possui propriedades anti-necroptóticas23,24. Com base nos conceitos da MTC de “depressão do fígado transformando-se em fogo” e “yang claro ascendendo ao cérebro”, o XYS foi modificado pela adição de Moutan Cortex (Mudan Pi) e Gardeniae Fructus (Zhizi) para eliminar o calor e resfriar o sangue, juntamente com Acori Tatarinowii Rhizoma (Shi Changpu) e Polygalae Radix (Yuan Zhi) para promover a função cognitiva e a ressuscitação. A formulação resultante foi denominada Xiaoyao San Modificado (MXYS) e foi desenvolvida para proporcionar efeitos terapêuticos aprimorados com base nos princípios da MTC. No entanto, neste estudo não foi realizada comparação direta com a formulação original de XYS25. Estudos clínicos demonstraram a eficácia antidepressiva do MXYS26,27,28, e seus efeitos terapêuticos podem estar associados à regulação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e à inibição da neuroinflamação29,30,31. Contudo, permanece incerto se o MXYS está associado à redução da necroptose neuronal.
No presente estudo, utilizou-se cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas de alta resolução (UHPLC-HRMS) para identificar de forma preliminar compostos derivados do MXYS detectados no tecido cerebral. Conjuntos de dados publicamente disponíveis do Gene Expression Omnibus (GEO) e análises bioinformáticas, incluindo análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA), análise de expressão diferencial e análise de enriquecimento, foram utilizados para investigar as associações entre MXYS, depressão e necroptose. Com base nesses achados, formulamos a hipótese de que o MXYS pode exercer efeitos semelhantes aos antidepressivos, associados à redução de marcadores de necroptose neuronal, sendo a via do fator de transcrição ativador 4 (ATF4)/proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP (CREB)/fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) um mecanismo correlativo candidato. Para avaliar essa hipótese, compostos detectados no tecido cerebral foram identificados preliminarmente por meio de UHPLC-HRMS, realizaram-se análises bioinformáticas para identificar alvos terapêuticos potenciais e conduziram-se experimentos in vivo para verificar se o tratamento com MXYS está associado a alterações nos marcadores de necroptose e na via ATF4/CREB/BDNF. Esses achados fornecem evidências preliminares que apoiam a possível aplicação terapêutica do MXYS na depressão, embora reconhecendo que estudos comparativos com a formulação original de XYS e a validação de resposta à dose ainda sejam necessários.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Henan (número de aprovação: DWLLGZR202200023). Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais para o bem-estar animal e cumpriram as diretrizes ARRIVE. Ratos machos Sprague–Dawley (SD) foram obtidos de um fornecedor autorizado de animais de laboratório. Os animais foram mantidos em temperatura e umidade controladas, com ciclo de 12 h de luz/escuridão, e receberam ração padrão e água ad libitum.
Identificação dos Componentes Presentes no Tecido Cerebral de MXYS
Preparação do Pó Liofilizado de MXYS:
As 11 ervas de MXYS foram maceradas em 10 volumes de água destilada durante 2 h e, em seguida, fervidas por 40 min. A pimenta foi adicionada nos últimos 5 min da decocção. Uma segunda decocção foi preparada da mesma maneira, utilizando 8 volumes de água destilada. As duas decocções foram combinadas, filtradas através de gaze, concentradas sob pressão reduzida até uma concentração de 1 g/mL (equivalente em droga bruta) e liofilizadas sob vácuo por 48 h para obter o pó liofilizado de MXYS. O rendimento da extração foi de 21,7% (p/p)25,29,31.
Animais e administração de MXYS:
Doze ratos machos da linhagem SD foram aleatoriamente distribuídos em dois grupos e receberam, duas vezes ao dia por gavagem oral, MXYS ou água purificada. As duas administrações diárias foram realizadas às 8:00 e às 20:00 (intervalo de 12 horas). O pó de MXYS foi dissolvido em água purificada e administrado na dose de 24,4 g/kg (aproximadamente o dobro da dose clínica para ratos)25. O grupo controle recebeu água purificada em volume equivalente (10 mL/kg).
Preparação do Tecido Cerebral Contendo MXYS:
Após 14 dias, todas as ratas foram anestesiadas com pentobarbital de sódio (40 mg/kg, intraperitonealmente) 2 h após a administração final de MXYS. Os tecidos cerebrais foram coletados após perfusão transcardial com solução salina normal. Os cérebros inteiros foram imediatamente removidos e colocados sobre gelo para obter amostras de tecido cerebral controle e de tecido cerebral tratado com MXYS.
Condições Cromatográficas/De Espectrometria de Massas e Base de Dados:
O pó liofilizado de MXYS, tecido cerebral branco adicionado com pó de MXYS, tecido cerebral branco e extratos de tecido cerebral contendo MXYS foram analisados usando um sistema de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência equipado com uma coluna HSS-T3 (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) mantida a 35 °C. As fases móveis consistiram em água contendo 0,1% de ácido fórmico (fase móvel A) e acetonitrila contendo 0,1% de ácido fórmico (fase móvel B). As amostras foram separadas a uma vazão de 0,3 mL/min usando um gradiente de 5% de B por 1 min, aumentando para 98% de B em 16 min, retornando a 5% de B em 0,5 min e mantendo-se em 5% de B por 2,5 min.
Os espectros de massa foram adquiridos em ambos os modos de ionização por spray eletrostático positivo e negativo, utilizando aquisição dependente de dados em uma faixa de m/z de 90–1.300. Os espectros MS/MS foram gerados a partir dos 10 íons precursores mais intensos, utilizando energias de colisão com dissociação por colisão em energia mais alta em etapas de 20, 40 e 60 eV. A temperatura da capilaridade foi mantida em 320°C e a temperatura do aquecedor da sonda foi ajustada em 350°C.
A anotação dos compostos foi realizada mediante correspondência da massa exata, distribuição isotópica e espectros MS/MS com um banco de dados interno de medicina tradicional chinesa e com os bancos de dados públicos GNPS32, ReSpect33 e MassBank34. Foram mantidos os compostos com correspondência confiável em MS/MS e com formas de pico cromatográfico consistentes. A lista completa dos compostos identificados de forma tentativa está fornecida na Tabela Suplementar 1.
Bioinformática
Seleção e Pré-processamento de Conjuntos de Dados do Banco de Dados GEO:
A possível participação da necroptose na patologia da depressão foi investigada por meio da busca no banco de dados GEO utilizando a palavra-chave “depressão”. Com base nos critérios de seleção, três conjuntos de dados (GSE54566, GSE54565 e GSE54568) foram identificados para análise adicional. Os conjuntos de dados foram obtidos de diferentes regiões cerebrais: GSE54565 (córtex cingulado anterior), GSE54566 (amígdala) e GSE54568 (córtex pré-frontal dorsolateral, BA9). Todos os conjuntos de dados foram gerados utilizando a plataforma Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array (GPL570) e consistiram em amostras de tecido cerebral post mortem de pacientes com transtorno depressivo maior (TDM) e controles sem transtornos psiquiátricos. As características detalhadas das amostras para cada conjunto de dados estão resumidas na Tabela Suplementar 2. Esses conjuntos de dados compreendiam dados transcriptômicos de três regiões cerebrais implicadas na depressão. A análise de expressão gênica diferencial foi realizada entre os grupos com TDM e controles para cada conjunto de dados, e os genes consistentemente regulados para cima e para baixo foram integrados utilizando o pacote R Robust Rank Aggregation (RRA).
Todos os conjuntos de dados foram pré-processados utilizando o algoritmo robusto de média multiarranjo (RMA) para correção de fundo e normalização. Após a normalização RMA, o algoritmo ComBat implementado no pacote R sva foi aplicado para ajustar os efeitos de lote entre os conjuntos de dados, considerando a origem do conjunto de dados como covariável de lote. Este procedimento reduziu a variação técnica entre os conjuntos de dados e melhorou a comparabilidade para análises subsequentes.
As análises bioinformáticas foram realizadas utilizando o software R (versão 4.2.1). Os principais pacotes R incluíram o ClusterProfiler (versão 4.8.2) para análises de enriquecimento da Ontologia Genética (GO) e da Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas (KEGG), o WGCNA (versão 1.72) para análise de rede de coexpressão gênica ponderada, o RRA para integração de genes diferencialmente expressos e o sva (versão 3.48.0) para correção de lote ComBat. O fluxo de trabalho analítico compreendeu a aquisição de dados, normalização RMA, correção de lote ComBat, análise de expressão diferencial com integração RRA, construção de módulos WGCNA, análises de enriquecimento GO e KEGG com taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,05 e predição de alvos com análise de rede de interação proteína-proteína (PPI).
Uso do WGCNA para Construir Redes de Coexpressão Gênica e Identificar Módulos Significativamente Associados à Depressão e à Necroptose:
O WGCNA constrói redes ponderadas de coexpressão gênica aplicando uma potência de limiarização suave (valor β) para aproximar uma topologia livre de escala. O valor β foi selecionado quando o coeficiente de correlação entre log(k) e log(p(k)) atingiu pelo menos 0,9. Após a seleção do valor β, os módulos gênicos foram identificados utilizando o método de corte dinâmico da árvore. Os parâmetros adicionais foram definidos da seguinte forma: minModuleSize = 30, cutHeight = 0,25 e deepSplit = 2. O valor β foi selecionado quando o coeficiente de correlação entre log(k) e log(p(k)) atingiu pelo menos 0,9. Uma potência de limiarização suave de β = 7 foi utilizada para a construção da rede. O Eigengene do Módulo (ME) foi calculado para cada módulo a fim de resumir os padrões de expressão gênica e avaliar as associações com características biológicas. A Significância Gênica (GS) e a Pertencente ao Módulo (MM) foram subsequentemente calculadas, e as relações entre módulos e características foram avaliadas utilizando o coeficiente de correlação (cor) e o valor p correspondente. Coeficientes de correlação mais altos e valores p mais baixos indicaram associações mais fortes entre os módulos gênicos e as características biológicas.
Análise de Enriquecimento Funcional e Construção da Rede PPI:
O ClusterProfiler foi utilizado para realizar a análise de enriquecimento de vias KEGG. O método FDR de Benjamini–Hochberg foi aplicado para correção de múltiplos testes, e um valor de p ajustado (FDR) < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Após identificar o módulo-alvo, os genes-chave dentro do módulo foram intersectados com genes associados à MXYS e à necroptose. Uma rede PPI foi subsequentemente construída utilizando o banco de dados STRING.
Previsão de Alvos para Compostos Detectados no Tecido Cerebral:
Os 143 compostos identificados preliminarmente no tecido cerebral de rato após a administração de MXYS foram utilizados para previsão de alvos. Para cada composto, alvos potenciais foram recuperados do banco de dados GeneCards utilizando a função Alvos Relacionados com pontuação de relevância > 5. Alvos duplicados foram agrupados, e somente genes humanos com símbolos gênicos oficiais foram mantidos, resultando em 3.164 alvos únicos. Esses alvos foram submetidos a análises de enriquecimento GO e KEGG utilizando o pacote R ClusterProfiler, considerando-se estatisticamente significativo um FDR < 0,05. O conjunto de genes de fundo compreendia todos os genes humanos codificadores de proteínas anotados no banco de dados KEGG.
Verificação Experimental
Cultura Celular:
As células HT-22 foram obtidas da Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (CL-0697, RRID: CVCL_0321) e cultivadas em meio de crescimento suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. As células foram mantidas a 37°C em incubadora umidificada com 5% de CO₂.
Atividade Anti-Necroptose do MXYS:
O pó liofilizado de MXYS foi reconstituído em meio de crescimento celular na concentração de 1,0 g/mL, esterilizado por meio de filtro de membrana de 0,22 μm e armazenado a −20°C até o uso. Células HT-22 foram semeadas na densidade de 8.000 células por poço em placas de 96 poços, com três poços por grupo. O MXYS foi diluído em meio de crescimento para concentrações finais de 2, 4 e 6 mg/mL. Após incubação por 12 h, as células foram tratadas com cloreto de SM-164 (10 nM) e o inibidor de caspase z-VAD-fmk (20 μM) durante 30 min, seguido por estimulação com fator de necrose tumoral humano-α (h-TNF-α; 20 ng/mL) por mais 12 h. A viabilidade celular foi avaliada por meio de um ensaio luminométrico de viabilidade celular, conforme instruções do fabricante. A luminescência foi medida utilizando um leitor de microplacas. A morfologia celular foi examinada em microscópio invertido, e imagens representativas foram obtidas para análise.
Animais:
Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Henan (número de aprovação: DWLLGZR202200023). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais para o bem-estar animal e cumpriram as diretrizes ARRIVE. Apenas camundongos machos da linhagem BALB/c, com idade entre 6 e 8 semanas, foram utilizados para o estabelecimento do modelo CUMS. Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura e umidade, com ciclo de 12 h de luz/escuro, e receberam ração padrão e água ad libitum.
Modelo de Depressão Induzida por CUMS:
Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em um grupo controle ou em um grupo CUMS. Após uma semana de aclimatação, os camundongos do grupo CUMS foram submetidos a estímulos estressantes leves intermitentes e imprevisíveis, enquanto os camundongos controle permaneceram indisturbados. O paradigma de estresse consistiu em 13 estímulos diferentes, incluindo inclinação da gaiola, agitação da gaiola, troca de gaiola, cama úmida, privação de água, iluminação estroboscópica, exposição ao ruído, luz contínua, escuridão contínua, iluminação intermitente, natação em água fria (4°C), natação em água morna (40°C), estresse por restrição e outros estímulos leves. Cada estímulo foi aplicado por 2–6 h por sessão, em sequência aleatória, para manter a imprevisibilidade. Os camundongos foram expostos a um ou dois estímulos diferentes por dia, de acordo com um cronograma aleatório.
Grupos e Tratamento com Medicamentos:
Após seis semanas de exposição ao CUMS, os camundongos foram aleatoriamente distribuídos nos grupos CUMS, MXYS, paroxetina ou Nec-1. O grupo MXYS recebeu o pó liofilizado de MXYS por gavagem oral na dose de 35,2 g/kg/dia. O grupo paroxetina recebeu paroxetina (20 mg/kg) por gavagem oral, enquanto o grupo Nec-1 recebeu Nec-1 (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal durante quatro semanas consecutivas. No mesmo período, os grupos controle e CUMS receberam um volume equivalente de solução salina normal por gavagem oral.
Experimentos Comportamentais:
Os camundongos foram alocados aleatoriamente em grupos experimentais utilizando uma sequência de números aleatórios gerada por computador antes do início da administração do fármaco. A sequência de randomização foi gerada por um pesquisador independente que não participou dos experimentos subsequentes nem da análise de dados.
Os testes comportamentais foram conduzidos por um pesquisador cegado quanto aos grupos de tratamento. O mesmo pesquisador realizou a pontuação comportamental baseada em vídeo (tempo de imobilidade, distância percorrida e tempo gasto no centro) utilizando um software de rastreamento automatizado para minimizar o viés subjetivo. O pesquisador cegado não teve acesso aos códigos de alocação dos grupos até que todos os dados comportamentais tivessem sido coletados e registrados.
Análises de imunofluorescência foram realizadas por um pesquisador independente que também estava cegado aos grupos experimentais. As amostras foram identificadas usando códigos, e a alocação aos grupos só foi revelada após a conclusão das medições de densitometria ou intensidade de fluorescência. As análises estatísticas foram conduzidas por um terceiro pesquisador que permaneceu cegado tanto à alocação dos grupos quanto aos resultados experimentais correspondentes até que todos os dados quantitativos tivessem sido compilados.
Teste de Preferência pela Sacarose (SPT): O teste comportamental foi realizado após a última administração da droga. Antes do teste, os camundongos foram aclimatados à solução de sacarose a 1% fornecendo-se duas garrafas contendo solução de sacarose a 1% por 12 h, seguido por uma garrafa contendo solução de sacarose a 1% e outra contendo água potável por mais 12 h. Em seguida, os camundongos foram privados de alimento e água por 12 h antes do teste formal. Durante o teste, cada camundongo recebeu uma garrafa contendo solução de sacarose a 1% e outra contendo água potável. Após 12 h, o volume consumido de cada garrafa foi medido. A preferência pela sacarose foi calculada da seguinte forma:
Teste de Suspensão pela Cauda (TST): A cauda de cada camundongo foi fixada na parte superior do aparelho de teste usando fita adesiva. O comportamento dos camundongos foi gravado durante 6 min utilizando software de gravação e análise de vídeo comportamental. A duração da imobilidade durante os últimos 4 min do teste foi quantificada.
Teste do Campo Aberto (TCA): Cada camundongo foi colocado individualmente no centro do aparelho de campo aberto. A atividade comportamental foi registrada e analisada durante 5 min utilizando um software de rastreamento comportamental, incluindo a distância percorrida e a atividade de movimento. Após cada teste, o aparelho foi limpo com etanol 75%.
Coleta de Amostras:
Camundongos que morreram durante o procedimento CUMS ou apresentaram sinais de doença grave (por exemplo, perda de peso corporal >20%, infecção visível ou incapacidade de se mover) foram excluídos do estudo. A eutanásia foi realizada por pessoal certificado mediante sobredosagem de pentobarbital de sódio (150 mg/kg, por via intraperitoneal). Após a perda da consciência, foi realizada a dislocação cervical como método secundário para garantir a morte. Para as análises de coloração de Nissl e imunofluorescência, três camundongos foram selecionados aleatoriamente de cada grupo. Os tecidos do hipocampo destinados à análise por western blot foram imediatamente dissecados sob gelo e congelados rapidamente em nitrogênio líquido.
Coloração de Nissl:
Para análises de coloração de Nissl e imunofluorescência, camundongos foram profundamente anestesiados com pentobarbital de sódio (150 mg/kg, intraperitonealmente) e decapitados sem perfusão transcardíaca. Os cérebros foram rapidamente removidos e fixados em paraformaldeído a 4% por 24–48 h antes do inclusão em parafina. Cortes em parafina foram realizados com espessura de 3 μm. Os cortes em parafina foram desparafinizados mediante incubação sequencial em solução removedora de parafina, etanol absoluto e etanol a 75%, antes da lavagem com água corrente. Cortes congelados, quando aplicável, foram levados à temperatura ambiente, fixados com fixador de tecidos por 15 min e lavados com água corrente. As seções de tecido foram coradas com solução de coloração de Nissl por 2–5 min, lavadas com água, diferenciadas com ácido acético glacial a 0,1%, lavadas para encerrar a reação, analisadas microscopicamente para controle da diferenciação, secas, clareadas em xilol por 10 min e montadas com meio de montagem neutro.
Imunofluorescência:
Os procedimentos de imunofluorescência foram realizados utilizando métodos padrão. O tecido cerebral foi fixado em paraformaldeído a 4% e embutido em parafina para coloração por imunofluorescência. Cortes teciduais foram incubados durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra NeuN (1:200), MLKL (1:300), ATF4 (1:5000) e CREB (1:1000). Após a incubação com os anticorpos primários, os cortes foram lavados quatro vezes com PBS e incubados por 1 h no escuro com os anticorpos secundários fluorescentes correspondentes: IgG de cabra anti-murino conjugado com CY3 (1:300, Servicebio, GB21301) para anti-ATF4 murino; IgG de cabra anti-murino conjugado com Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25301) para anti-MLKL murino; IgG de cabra anti-coelho conjugado com CY3 (1:300, Servicebio, GB21303) para anti-NeuN coelho; e IgG de cabra anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25303) para anti-CREB coelho. Em seguida, os cortes foram corados com DAPI por 10 min à temperatura ambiente, lavados com PBS, montados com um meio de montagem antidesbotamento e as imagens de fluorescência foram adquiridas utilizando microscopia confocal.
Western Blot:
Os tecidos cerebrais foram homogenizados em tampão de lise RIPA (radioimmunoprecipitation assay). As concentrações proteicas foram determinadas e 20 μg de proteína total por poço foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), seguida de transferência para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após o bloqueio, as membranas foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos primários (1:1000), seguidas de incubação com anticorpos secundários conjugados à peroxidase do rabo-de-cavalo (HRP) por 1 h. As bandas proteicas foram visualizadas utilizando um sistema de imagem por quimioluminescência e as intensidades das bandas foram quantificadas com o software ImageJ. Para a análise por western blot de tecidos do hipocampo, dois camundongos por grupo foram analisados e imunoblotagens representativas são apresentadas. Para os experimentos com células HT-22, a análise por western blot foi realizada uma vez como experimento representativo. Esses dados são apresentados como observações qualitativas de tendências, e não como resultados quantificados estatisticamente.
Análise Estatística:
As diferenças entre os grupos foram analisadas por meio de análise de variância unifatorial (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Disponibilidade de Dados:
Os conjuntos de dados gerados e analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e em seus materiais suplementares. Os resultados da identificação de compostos por UHPLC-HRMS estão fornecidos na Tabela Suplementar 1, e as características dos conjuntos de dados GEO utilizados para as análises bioinformáticas são resumidas na Tabela Suplementar 2. Dados adicionais de apoio, incluindo imunofluorescência para GFAP (Figura Suplementar 1), coloração de imunofluorescência para p-RIPK3 e p-MLKL (Figura Suplementar 2), o delineamento experimental e a linha do tempo de alocação dos animais (Figura Suplementar 3), e as imagens originais não recortadas dos western blots (Figura Suplementar 4), estão disponíveis nos materiais suplementares.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
WGCNA Identifica um Módulo Gênico Associado à Depressão Enriquecido na Via de Necroptose
O pacote RRA foi utilizado para integrar genes diferencialmente expressos consistentemente regulados para cima e para baixo nos conjuntos de dados GSE54566, GSE54565 e GSE54568, resultando na identificação de 2.513 genes. Um mapa de calor desses genes é mostrado na Figura 1A. Os três conjuntos de dados foram derivados de regiões cerebrais distintas — córtex cingulado anterior, amígda...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A morte neuronal anormal desempenha um papel crucial na patogênese da depressão8. A necroptose, uma forma de morte celular programada, tem sido amplamente investigada, resultando em avanços significativos no desenvolvimento de inibidores que visam essa via39. Desde a identificação do inibidor da necroptose Nec-1 em 200540, foram feitos progressos consideráveis no desenvolvimento de compostos que atuam sobre componentes-chave da via de sinalização nec...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Conflitos de Interesse:
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto-Chave de Pesquisa Científica das Instituições de Ensino Superior de Henan, China (nº 26A360008), pelo Projeto de Pesquisa Científica de Medicina Tradicional Chinesa da Província de Henan (nº 2025ZY3152), pela Fundação Nacional Natural de Ciências da China (nº 82274496), pelo Projeto de Pesquisa Científica e Tecnológica da Província de Henan (nº 232301420018) e pelo Projeto de Herança e Inovação Zhang Zhongjing do Departamento de Ciência e Tecnologia da Administração Nacional de Medicina Tradicional Chinesa (nº GZY-KJS-2022-044-1).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Rizoma de Acori Tatarinowii (Acorus tatarinowii Schott; Shi Changpu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 231001 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Fita adesiva | Não aplicável | Não aplicável | Teste de suspensão pela cauda |
| Raiz de Angelica Sinensis (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; Dang Gui) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | G01230507-16 | Ingrediente herbal (10 g) |
| Anticorpo anti-ATF4 (imunofluorescência) | Servicebio | GB111137 | Anticorpo primário |
| Anticorpo anti-ATF4 (western blot) | MedChemExpress | HY-P80486 | Anticorpo primário |
| Anticorpo anti-BDNF | MedChemExpress | HY-P80567 | Anticorpo primário para western blot |
| Anticorpo anti-CREB | Beyotime | AF1018 | Anticorpo primário para western blot e imunofluorescência |
| Anticorpo anti-GAPDH | Abcam | ab181602 | Controle de carga |
| Anticorpo anti-MLKL | Proteintech | 66675-1-Ig | Anticorpo primário para western blot e imunofluorescência |
| Anticorpo anti-NeuN | Servicebio | GB11138 | Anticorpo primário para imunofluorescência |
| Anticorpo anti-CREB fosforilado | Beyotime | AF5785 | Anticorpo primário |
| Anticorpo anti-MLKL fosforilado | Bioss | bsm-54104R | Anticorpo primário |
| Anticorpo anti-RIPK1 fosforilado | Biolynx | BX60008 | Anticorpo primário |
| Anticorpo anti-RIPK3 fosforilado | Abcam | ab195117 | Anticorpo primário |
| Anticorpo anti-RIPK1 | Cell Signaling Technology | 3493S | Anticorpo primário |
| Anticorpo anti-RIPK3 | Proteintech | 17563-1-AP | Anticorpo primário |
| Atractylodes macrocephala (Atractylodes macrocephala Koidz.; Bai Zhu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230801 | Ingrediente herbal (10 g) |
| Software automatizado de rastreamento comportamental | Panlab (Harvard Apparatus) | N/A | Software de rastreamento de vídeo SMART 3.0 para testes de campo aberto e suspensão pela cauda |
| Kit de ensaio de proteína BCA | CWBIO | CW0014S | Quantificação de proteína |
| Sistema de gravação comportamental | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | Testes de campo aberto e suspensão pela cauda |
| Sistema de imagem de quimioluminescência Bio-Rad | Bio-Rad | 12003154 | Sistema de imagem ChemiDoc MP para detecção de western blot por quimioluminescência |
| Kit de ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Lumi II | Beyotime | C0056XL | Ensaio de viabilidade celular |
| Microscópio confocal | Nikon Eclipse C1 | N/A | Imagem de imunofluorescência |
| DAPI | Servicebio | G1012 | Corante nuclear |
| Solução ambiental de desparafinização | Servicebio | G1128 | Desparafinização de parafina |
| Soro bovino fetal (FBS) | BI | C04001-500 | Suplemento para cultura celular |
| Fruto de Gardeniae (Gardenia jasminoides J. Ellis; Zhi Zi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 22102109 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Raiz de Glycyrrhizae (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; Gan Cao) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230301 | Ingrediente herbal (3 g) |
| IgG de cabra conjugado com CY3 anti-murino | Servicebio | GB21301 | Anticorpo secundário fluorescente para anti-ATF4 murino (IF, CY3, 1:300) |
| IgG de cabra conjugado com Alexa Fluor 488 anti-murino | Servicebio | GB25301 | Anticorpo secundário fluorescente para anti-MLKL murino (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| IgG de cabra conjugado com CY3 anti-coelho | Servicebio | GB21303 | Anticorpo secundário fluorescente para anti-NeuN coelho (IF, CY3, 1:300) |
| IgG de cabra conjugado com Alexa Fluor 488 anti-coelho | Servicebio | GB25303 | Anticorpo secundário fluorescente para anti-CREB coelho (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| IgG de cabra HRP anti-coelho | Absin | abs20040 | Anticorpo secundário para western blot |
| IgG leve de camundongo anti-coelho conjugado com HRP | ABclonal | AS061 | Anticorpo secundário para western blot |
| TNF-α humano | Novoprotein | C008 | Indutor de necroptose |
| Células HT-22 | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| Meio de crescimento HyClone | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | Meio de cultura celular |
| ImageJ | NIH | Software gratuito | Quantificação de bandas |
| Microscópio invertido | Nikon | Eclipse Ti-SR | Morfologia celular |
| Nitrogênio líquido | Henan Jilai New Energy Technology Co., Ltd. | N/A | Preservação de tecidos |
| Leitor de microplacas Molecular Devices | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Medição de luminescência |
| Casca de Moutan (Paeonia suffruticosa Andr.; Mu Danpi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 22121714 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Necrostatina-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | Inibidor de RIPK1 |
| Paraformaldeído | Servicebio | G1101-500ML | Fixação de tecidos |
| Paroxetina hemidratada de cloridrato | Aladdin | P129711 | Controle positivo |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | Tampão de lavagem |
| Hortelã (Mentha haplocalyx Briq.; Bo He) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230101 | Ingrediente herbal (6 g) |
| Penicilina–estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Antibiótico para cultura celular |
| Raiz de Polygalae (Polygala tenuifolia Willd.; Yuan Zhi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 20221101 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) | Merck Millipore | ISEQ00010 | Western blot |
| Poria (Wolfiporia cocos; Fu Ling) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | D23070601 | Ingrediente herbal (15 g) |
| Tampão de lise para ensaio de imunoprecipitação de radioimunoensaio (RIPA) | CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.) | CW2333S | Extração de proteína |
| Raiz de Bupleuri (Bupleurum chinense DC.; Chai Hu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230801 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Reagentes de SDS-PAGE | Solarbio; Servicebio; Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. | Não aplicável | Acrylamida, bis-acrylamida, Tris, SDS, APS e TEMED preparados in loco |
| Pentobarbital de sódio | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69020181 | Anestésico |
| Sistema de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência | Thermo Fisher Scientific | Vanquish UHPLC System | Análise por LC-MS |
| Coluna UHPLC HSS-T3 (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) | Waters | 186003539 | Separacão cromatográfica |
| z-VAD-fmk | TargetMol | T6013 | Inibidor pan-caspase |
Referências
- Zhang Y, et al. Natural volatile oils derived from herbal medicines: A promising therapy way for treating depressive disorder. Pharmacol Res. 2021;164:105376.
- O’Connor EA, et al. Depression and suicide risk screening: Updated evidence report and systematic review for the US Preventive Services Task Force. JAMA. 2023;329(23):2068-85.
- World Health Organization. The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization; Geneva; 2008.
- Pedrosa-Naudín MA, et al. Non-adherence to antidepressant treatment and related factors in a region of Spain: A population-based registry study. Pharmaceutics. 2022;14(12):2696.
- Huang Y, et al. Prevalence of mental disorders in China: A cross-sectional epidemiological study. Lancet Psychiatry. 2019;6(3):211-24.
- Thase ME. New medications for treatment-resistant depression: A brief review of recent developments. CNS Spectr. 2017;22(S1):39-48.
- Monteggia LM, Malenka RC, Deisseroth K. Depression: The best way forward. Nature. 2014;515(7526):200-1.
- Cao H, et al. Hippocampal proteomic analysis reveals activation of necroptosis and ferroptosis in a mouse model of chronic unpredictable mild stress-induced depression. Behav Brain Res. 2021;403:113261.
- Sun Y, et al. Dysmyelination by oligodendrocyte-specific ablation of Ninj2 contributes to depressive-like behaviors. Adv Sci (Weinh). 2022;9(3):e2103065.
- Zeb S, et al. Necroptotic kinases are involved in the reduction of depression-induced astrocytes and fluoxetine’s inhibitory effects on necroptotic kinases. Front Pharmacol. 2022;13:1060954.
- Duan YW, Chen SX, Li QY, Zang Y. Neuroimmune mechanisms underlying neuropathic pain: The potential role of the TNF-α-necroptosis pathway. Int J Mol Sci. 2022;23(13):7191.
- Frank D, Vince JE. Pyroptosis versus necroptosis: Similarities, differences, and crosstalk. Cell Death Differ. 2019;26(1):99-114.
- Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: An ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(10):700-14.
- Linkermann A, Green DR. Necroptosis. N Engl J Med. 2014;370(5):455-65.
- Sun L, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012;148(1-2):213-27.
- Cai Z, et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 2014;16(1):55-65.
- Kaczmarek A, Vandenabeele P, Krysko DV. Necroptosis: The release of damage-associated molecular patterns and its physiological relevance. Immunity. 2013;38(2):209-23.
- Wallach D, Kang TB, Kovalenko A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: A historical perspective. Nat Rev Immunol. 2014;14(1):51-9.
- Yuan J, Amin P, Ofengeim D. Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases. Nat Rev Neurosci. 2019;20(1):19-33.
- Mitroshina EV, Saviuk M, Vedunova MV. Necroptosis in CNS diseases: Focus on astrocytes. Front Aging Neurosci. 2022;14:1016053.
- Gong Q, et al. RIPK1 inhibition mitigates neuroinflammation and rescues depressive-like behaviors in a mouse model of LPS-induced depression. Cell Commun Signal. 2024;22(1):427.
- Kwon TG, et al. A review of antidepressant and anxiolytic effects of Soyo-san (Xiaoyao-san) and modified Soyo-san in animal models. Phytomedicine. 2024;135:155387.
- Jiao H, et al. Xiaoyaosan ameliorates CUMS-induced depressive-like and anorexia behaviors in mice via necroptosis-related cellular senescence in the hypothalamus. J Ethnopharmacol. 2024;318(Pt A):116938.
- Yan ZY, et al. Antidepressant mechanism of traditional Chinese medicine formula Xiaoyaosan in a CUMS-induced depressed mouse model via RIPK1-RIPK3-MLKL-mediated necroptosis based on network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 2021;12:773562.
- Wu M, et al. Integration of network pharmacology and experimental verification to reveal the active components and molecular mechanism of modified Danzhi Xiaoyao San in the treatment of depression. J Ethnopharmacol. 2025;337:118739.
- Chen X, et al. Therapeutic effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder combined with intravenous human umbilical cord mesenchymal stem cells on post-stroke depression. Chin J Pathophysiol. 2019;35(12):2274-79.
- Zhang J. Clinical observation of Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets in the treatment of 30 cases of depression. New J Tradit Chin Med. 2008;40(11):48-49.
- Zhang J, Zhang B. Thirty-five patients with post-stroke depression were treated with Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets. New J Tradit Chin Med. 2006;38(3):75-76.
- Su P, et al. Modified Xiaoyao San reverses lipopolysaccharide-induced depression-like behavior through suppressing microglial M1 polarization by enhancing autophagy via the PI3K/AKT/mTOR pathway in mice. J Ethnopharmacol. 2023;308:116659.
- Guo X, et al. Effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder on mineralocorticoid receptor and glucocorticoid receptor in the hippocampus of depression model rats. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 2014;20(11):119-22.
- Wang B, et al. Modified Danzhi Xiaoyaosan inhibits neuroinflammation by regulating the TRIM31/NLRP3 inflammasome in chronic unpredictable mild stress-induced depression. Exp Gerontol. 2024;187:112451.
- Wang M, et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nat Biotechnol. 2016;34(8):828-37.
- Sawada Y, et al. RIKEN tandem mass spectral database (ReSpect) for phytochemicals: A plant-specific MS/MS-based data resource and database. Phytochemistry. 2012;82:38-45.
- Horai H, et al. MassBank: A public repository for sharing mass spectral data for life sciences. J Mass Spectrom. 2010;45(7):703-14.
- Wang M, et al. Targeting programmed cell death in inflammatory bowel disease through natural products: New insights from molecular mechanisms to targeted therapies. Phytother Res. 2024;38:4587-611.
- Huang X, et al. Shikonin overcomes drug resistance and induces necroptosis by regulating the miR-92a-1-5p/MLKL axis in chronic myeloid leukemia. Aging (Albany NY). 2020;12(17):17662-80.
- Yuan J, Najafov A, Py BF. Roles of caspases in necrotic cell death. Cell. 2016;167(7):1693-704.
- Mu R, et al. Activation of TGR5 ameliorates streptozotocin-induced cognitive impairment by modulating apoptosis, neurogenesis, and neuronal firing. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:3716609.
- Gardner CR, et al. From (tool)bench to bedside: The potential of necroptosis inhibitors. J Med Chem. 2023;66(4):2361-85.
- Degterev A ,et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat Chem Biol. 2005;1(2):112-19.
- Cao L, Mu W. Necrostatin-1 and necroptosis inhibition: Pathophysiology and therapeutic implications. Pharmacol Res. 2021;163:105297.
- Vissers M, et al. Safety, pharmacokinetics and target engagement of the novel RIPK1 inhibitor SAR443060 (DNL747) for neurodegenerative disorders: Randomized, placebo-controlled, double-blind phase I/Ib studies in healthy subjects and patients. Clin Transl Sci. 2022;15(8):2010-23.
- Mo K, et al. Targeting HNRNPC suppresses thyroid follicular epithelial cell apoptosis and necroptosis through m6A-modified ATF4 in autoimmune thyroid disease. Pharmacol Res. 2023;195:106933.
- Liu J, et al. Brain-derived neurotrophic factor elevates activating transcription factor 4 (ATF4) in neurons and promotes ATF4-dependent induction of SESN2. Front Mol Neurosci. 2018;11:62.
- Tang H, Kang R, Liu J, Tang D. ATF4 in cellular stress, ferroptosis, and cancer. Arch Toxicol. 2024;98(4):1025-41.
- Pang BPS, et al. Deficiency of muscle-generated brain-derived neurotrophic factor causes inflammatory myopathy through reactive oxygen species-mediated necroptosis and pyroptosis. Redox Biol. 2024;74:103418.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.