Artigo de método

Técnica de Contenção Manual Orientada ao Bem-Estar para Administração de Substâncias e Coleta de Sangue em Camundongos

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DOI:

10.3791/72535

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25 de agosto de 2026

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1Department of Hematology, Oncology, and Tumor Immunology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 2Taskforce Refinement C3R, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 4Julius Wolff Institute for Biomechanics and Musculoskeletal Regeneration, Berlin Institute of Health at Charité – Universitätsmedizin Berlin, 5Research Facilities of Experimental Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um novo método manual de contenção para imobilizar camundongos durante injeções ou coleta de sangue, reduzindo assim o estresse e melhorando o bem-estar durante os procedimentos.

Resumo

Os testes em animais continuam sendo essenciais na pesquisa biomédica, contribuindo significativamente para a compreensão dos mecanismos das doenças e para a avaliação da eficácia e segurança de medicamentos e substâncias químicas, com roedores entre os animais de laboratório mais frequentemente utilizados. Entre as intervenções mais comuns na prática laboratorial estão o manejo e a contenção durante procedimentos como injeções e coleta de sangue, que são rotineiramente realizados em camundongos conscientes sem sedação ou anestesia. A contenção adequada é necessária para garantir a segurança tanto do animal quanto do manipulador. No entanto, métodos tradicionais de contenção, como fixação manual ou tubos de contenção, são conhecidos por induzir respostas agudas de estresse em camundongos, afetando negativamente o bem-estar animal e potencialmente influenciando os resultados experimentais. Para promover o refinamento dentro do enfoque do princípio das 3Rs e melhorar o bem-estar animal, este protocolo descreve o uso de um túnel recém-desenvolvido para injeções e coleta de sangue em camundongos. O túnel oferece um método de contenção menos invasivo, porém ainda seguro, em comparação com as técnicas convencionais. Esse método de contenção voltado ao bem-estar pode ser facilmente implementado em procedimentos padrão, como injeções intraperitoneais e intravenosas e coleta de sangue, minimizando o estresse e melhorando as condições de manejo para camundongos de laboratório.

Introdução

Os testes em animais continuam desempenhando um papel central na pesquisa biomédica, contribuindo significativamente para a compreensão dos mecanismos das doenças e para a avaliação da eficácia e segurança de medicamentos e substâncias químicas. Roedores representam as espécies de animais de laboratório mais comumente utilizadas; na União Europeia, aproximadamente 3,5 milhões de camundongos e 0,5 milhão de ratos foram usados para fins científicos em 20231. Uma crescente conscientização social sobre o sofrimento causado por procedimentos experimentais levou a exigências legais para melhorar o bem-estar animal em estudos de pesquisa, seguindo o princípio dos 3R2,3. Como a substituição completa dos testes em animais por métodos alternativos ainda não é possível, a otimização dos procedimentos experimentais existentes é particularmente importante para aliviar o sofrimento animal. O manejo, incluindo restrições de imobilização durante procedimentos como injeções, é uma das intervenções mais comuns às quais os animais de laboratório são submetidos tanto nos cuidados de rotina quanto durante experimentos.

O método tradicional de contenção imobilizadora para injeções intraperitoneais envolve segurar firmemente a pele e o pelo do pescoço com o polegar e o indicador, segurar a cauda e virar os animais para expor o abdômen para as injeções. Essa posição é antinatural e pode resultar em dificuldade respiratória, o que induz medo nos animais4. Diversas técnicas refinadas de contenção já foram descritas, incluindo, por exemplo, o chamado método de três dedos, no qual a pressão na região do pescoço é reduzida em comparação com as técnicas clássicas de contenção pelo pescoço4. Outro método evita amplamente a imobilização completa: nesse caso, os animais podem se agarrar a uma malha de arame enquanto a cauda e as patas traseiras são contidas, permitindo o acesso ao abdômen inferior para as injeções5. No entanto, ambos os procedimentos apresentam limitações. Com o método de três dedos, os animais ainda precisam ser levantados e colocados em uma posição antinatural, o que pode potencialmente desencadear respostas de estresse. A técnica alternativa, por outro lado, não oferece proteção suficiente contra mordidas de animais estressados ou defensivos e pode limitar o tempo disponível para realizar as injeções. Além do risco potencial de lesões por mordida, também há um aumento do risco de contenção inadequada ou acidentes com agulhas. A imobilização para injeções intravenosas ou coleta de sangue da veia da cauda exige o uso de dispositivos de contenção que imobilizem os animais sem necessidade de segurá-los manualmente, deixando as mãos livres para os procedimentos. Os dispositivos de contenção são geralmente tubos feitos de acrílico transparente, com uma extremidade fechada contendo fendas ou orifícios para acesso à cauda e uma extremidade aberta para inserção dos camundongos, que pode ser fixada com tampões ajustáveis. Isso exige que os animais sejam pegos pela cauda e puxados para dentro do dispositivo de contenção de costas primeiro, para que a cauda possa ser passada pelas fendas de acesso. Trata-se de um procedimento estressante, agravado pelo diâmetro relativamente estreito dos dispositivos de contenção, necessário para impedir que os camundongos se virem durante os procedimentos, o que poderia resultar em lesões6,7.

Este protocolo descreve o uso de um novo aplicativo em forma de túnel para injeções e coleta de sangue em camundongos, que permite uma fixação menos agressiva, mas ainda assim segura. O túnel é composto por uma estrutura externa rígida e um revestimento interno removível de pelúcia, criando um espaço macio e escuro semelhante a uma toca. Em comparação com os contenções convencionais, o túnel foi deliberadamente projetado com dimensões maiores para acomodar um inserto de Vetbed Isobed cortado sob medida, fornecendo um revestimento interno macio e confortável que aumenta a sensação de segurança dos animais, mantendo uma contenção adequada (Figura 1A–B). Ambas as extremidades do túnel estão abertas, de modo que os camundongos podem entrar simplesmente caminhando pela frente e sair pela traseira. Uma vez dentro do túnel, os animais são impedidos de se virar, enquanto a cauda permanece acessível para injeções intravenosas ou coleta de sangue (Figura 1C). Para injeções intraperitoneais, a região abdominal caudal pode ser acessada posicionando o túnel em um ângulo (Figura 1D) e segurando a cauda do animal pela base, ao mesmo tempo em que se aplica pressão suave na região sacral, dobrando a extremidade traseira do camundongo para cima (Figura 1C). Este método é menos estressante tanto para os camundongos quanto para os experimentadores, pois não é necessária fixação manual.

Um estudo anterior mostrou que o uso do túnel para injeções intraperitoneais reduz de forma duradoura os níveis de estresse e melhora o bem-estar dos camundongos, mesmo em modelos experimentais com injeções intraperitoneais frequentes8. Neste estudo, o túnel de aplicação também foi testado com sucesso para injeção intravenosa e coleta de sangue da veia da cauda em camundongos machos e fêmeas.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram analisados e aprovados pela autoridade local competente (Escritório Estadual de Saúde e Assuntos Sociais de Berlim (LAGeSo); número de aprovação 2022-077-G) e foram realizados de acordo com as diretrizes ARRIVE 2.0. Todos os materiais utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Administração intravenosa

OBSERVAÇÃO: Este método descreve uma abordagem de contenção manual orientada ao bem-estar para administração intravenosa em camundongos. Injeções intravenosas devem ser realizadas somente por pessoal treinado, em conformidade com as diretrizes institucionais e procedimentos estabelecidos de segurança e higiene.

  1. Preparação dos animais
    CAUTION: Use sempre os equipamentos de proteção individual (EPI) necessários de acordo com os requisitos de biossegurança e higiene da instituição (por exemplo, jalecos, luvas, toucas, máscaras) ao trabalhar com animais.
    1. Coloque a gaiola de alojamento sob uma lâmpada vermelha por 10–15 min para promover a vasodilatação e melhorar a visibilidade das veias da cauda.
  2. Preparação da área de trabalho
    1. Limpe o túnel de aplicação com etanol 70%. Deixe o etanol evaporar completamente por aproximadamente 5 min.
    2. Coloque um pedaço enrolado de forração lavada e autoclavada (corte uma Vetbed Isobed no tamanho necessário) dentro do túnel (Figura 1B).
    3. Com os dedos, comprima suavemente a forração na entrada do túnel até que a abertura restante tenha aproximadamente a largura de dois dedos adjacentes. Não comprima a forração além disso.
    4. Posicione o túnel de aplicação sobre a superfície de trabalho e coloque um pedaço adicional de forração plana na frente da abertura do túnel.
    5. Prepare a seringa de injeção equipada com uma agulha 27G contendo a solução de injeção desejada e coloque-a ao lado do túnel. Certifique-se de que cotonetes e spray desinfetante estejam facilmente acessíveis.
  3. Restrição orientada ao bem-estar em um túnel
    1. Transfira o camundongo da gaiola de alojamento usando um tubo de manipulação.
    2. Permita que o camundongo entre voluntariamente no túnel de aplicação posicionando o túnel de manipulação diretamente em frente à abertura do túnel (Figura 1C).
      NOTE: Alguns camundongos preferem primeiro pisar na forração colocada na frente do túnel de aplicação antes de entrar voluntariamente no túnel. Pode-se impedir que os camundongos caminhem muito para dentro do túnel segurando suavemente a base da cauda.
    3. Uma vez dentro, o camundongo geralmente permanece posicionado dentro da forração enrolada sem se virar.
      NOTE: Se os camundongos não entrarem no túnel, a abertura pode estar muito pequena; comprima levemente a forração na entrada do túnel. Se os camundongos forem muito pequenos e tenderem a se virar, aperte mais a forração enrolada ou adicione uma camada adicional (Figura 1B).
  4. Injeção intravenosa
    NOTE: A injeção intravenosa é realizada utilizando procedimentos convencionais bem estabelecidos de injeção na veia da cauda.
    1. Endireite suavemente a cauda segurando a ponta e desinfete o local de injeção pretendido. Gire a cauda aproximadamente 90° para posicionar as veias laterais da cauda dorsalmente.
    2. Inicie a injeção na extremidade distal da cauda para permitir tentativas adicionais em locais mais proximais, se necessário.
      CRITICAL STEP: Insira a agulha em um ângulo de aproximadamente 15–20° em relação à cauda, mantendo a agulha quase paralela à cauda. Avance a agulha apenas ligeiramente além da bisel, pois as veias da cauda são superficiais. A colocação correta da agulha é indicada por resistência mínima durante a injeção e fluxo visível da solução injetada através da veia. Injete o volume desejado em uma taxa lenta e constante (≤5 mL/kg em 13 s). Após a retirada da agulha, aplique pressão suave no local da injeção com um cotonete estéril para evitar sangramento.
      CAUTION: Descarte imediatamente as agulhas/seringas usadas em recipientes resistentes a perfuração e vazamento para objetos cortantes. Não tente recolocar a tampa das seringas para prevenir acidentes com agulhas.
  5. Soltura e reforço positivo
    1. Retorne o túnel contendo o camundongo para a gaiola de alojamento e permita que o animal saia voluntariamente pela extremidade oposta do túnel (Figura 1C).
    2. Ofereça petiscos na gaiola de alojamento para apoiar o reforço positivo e a habituação ao procedimento.
  6. Limpeza e manutenção
    1. Remova a forração interna do túnel de aplicação. Limpe o túnel de aplicação com etanol 70%.
    2. Se a forração permanecer limpa, ela pode ser reutilizada em experimentos subsequentes. Se estiver contaminada ou visivelmente suja, lave e autoclave antes de reutilizar.
      NOTE: Use uma forração por grupo experimental. Substitua a forração entre diferentes experimentos, entre animais machos e fêmeas, e sempre que exigido pelas diretrizes institucionais de higiene.

2. Administração intraperitoneal

OBSERVAÇÃO: Este método descreve uma abordagem de contenção manual orientada ao bem-estar para administração intraperitoneal em camundongos. Injeções intraperitoneais devem ser realizadas somente por pessoal treinado, em conformidade com as diretrizes institucionais e de acordo com procedimentos estabelecidos de segurança e higiene. Para facilitar um melhor acesso à área de injeção, o túnel de aplicação é usado em combinação com uma plataforma inclinada (cunha), que eleva a parte posterior dos camundongos para cima.

  1. Preparação da área de trabalho
    1. Limpe o túnel de aplicação e o cunho com etanol a 70%. Deixe o etanol evaporar completamente por aproximadamente 5 min.
    2. Coloque um pedaço enrolado de forração lavada e autoclavada (corte uma Vetbed Isobed no tamanho necessário) dentro do túnel (Figura 1B).
    3. Usando os dedos, comprima suavemente a forração na entrada do túnel até que a abertura restante tenha aproximadamente a largura de dois dedos adjacentes. Não comprima a forração além disso.
    4. Posicione o túnel de aplicação sobre o cunho (Figura 1D) na superfície de trabalho e coloque uma forração plana adicional na frente da entrada do túnel.
    5. Prepare a seringa de injeção equipada com uma agulha 27G contendo a solução de injeção desejada e coloque-a ao lado do túnel.
  2. Restrição orientada ao bem-estar em um túnel
    ATENÇÃO: Use sempre os equipamentos de proteção individual (EPI) necessários de acordo com os requisitos de biossegurança e higiene da instituição (por exemplo, jalecos, luvas, toucas, máscaras) ao trabalhar com animais.
    1. Transfira o camundongo da gaiola de origem usando um tubo de manipulação. Permita que o camundongo entre voluntariamente no túnel de aplicação posicionando o túnel de manipulação diretamente em frente à abertura do túnel (Figura 1C).
      OBSERVAÇÃO: Alguns camundongos preferem primeiro pisar na forração colocada na frente do túnel de aplicação antes de entrarem voluntariamente no túnel. Nesse caso, permita que o camundongo entre no túnel antes de posicionar o túnel sobre o cunho.
    2. Uma vez dentro do túnel, segure suavemente a base da cauda entre o indicador e o polegar para impedir que o camundongo avance muito para dentro do túnel. Normalmente, o camundongo permanece posicionado dentro da forração enrolada sem se virar.
      OBSERVAÇÃO: Se os camundongos não entrarem no túnel, a abertura pode estar muito pequena; comprima levemente a forração na entrada do túnel. Se os camundongos forem muito pequenos e tenderem a se virar, aperte mais a forração enrolada ou adicione uma camada extra (Figura 1B).
  3. Injeção intraperitoneal
    1. Segure a base da cauda entre o polegar e o indicador de uma das mãos (Figura 1C). Aplique pressão suave na região sacral usando o dedo médio da mesma mão e levante ligeiramente a cauda. Isso estabiliza o animal e proporciona acesso claro à região abdominal caudal.
    2. ETAPA CRÍTICA: Realize a injeção segurando a seringa paralelamente à superfície de trabalho e inserindo-a na região abdominal caudal claramente visível.
    3. Após a injeção, libere suavemente a pressão e solte a cauda.
      ATENÇÃO: Descarte imediatamente as agulhas/seringas usadas em recipientes resistentes a perfurações e vazamentos, destinados a materiais perfurocortantes. Não tente recolocar as tampas nas seringas para evitar acidentes com agulhas.
  4. Soltura e reforço positivo
    1. Retorne o túnel contendo o camundongo para a gaiola de origem e permita que o animal saia voluntariamente pela extremidade oposta do túnel (Figura 1C).
    2. Ofereça petiscos na gaiola de origem para promover o reforço positivo e a habituação ao procedimento.
  5. Limpeza e manutenção
    1. Remova a forração interna do túnel de aplicação. Limpe o túnel de aplicação e o cunho com etanol a 70%.
    2. Se a forração permanecer limpa, ela poderá ser reutilizada em experimentos subsequentes. Se estiver contaminada ou visivelmente suja, lave e autoclave antes de reutilizar.
      OBSERVAÇÃO: Utilize uma forração por grupo experimental. Substitua a forração entre diferentes experimentos, entre animais machos e fêmeas, e sempre que exigido pelas diretrizes institucionais de higiene.

3. Coleta de sangue da veia da cauda

OBSERVAÇÃO: Este método descreve uma abordagem de contenção manual orientada ao bem-estar para coleta de sangue da veia da cauda em camundongos. Todos os procedimentos devem ser realizados por pessoal treinado em conformidade com as diretrizes institucionais e os protocolos estabelecidos de segurança e higiene.

  1. Preparação da área de trabalho
    1. Limpe o túnel de aplicação com etanol 70%. Deixe o etanol evaporar completamente por aproximadamente 5 min.
    2. Coloque um pedaço enrolado de forração lavada e autoclavada (corte uma Vetbed Isobed no tamanho necessário) dentro do túnel (Figura 1B).
    3. Usando os dedos, comprima suavemente a forração na entrada do túnel até que a abertura restante tenha aproximadamente a largura de dois dedos adjacentes. Não comprima a forração além disso.
    4. Posicione o túnel de aplicação sobre a superfície de trabalho e coloque uma forração adicional, plana, na frente da entrada do túnel.
    5. Assegure-se de que lancetas, microtubos para coleta de sangue, cotonetes e spray desinfetante estejam prontamente disponíveis.
  2. Restrição com foco no bem-estar em um túnel
    ATENÇÃO: Use sempre os equipamentos de proteção individual (EPI) necessários de acordo com os requisitos de biossegurança e higiene da instituição (por exemplo, jalecos, luvas, toucas, máscaras) ao trabalhar com animais.
    1. Transfira o camundongo da gaiola de origem usando um tubo de manipulação. Permita que o camundongo entre voluntariamente no túnel de aplicação posicionando o tubo de manipulação diretamente em frente à abertura do túnel (Figura 1C).
      OBSERVAÇÃO: Alguns camundongos preferem primeiro pisar na forração colocada na frente do túnel de aplicação antes de entrarem voluntariamente no túnel. Pode-se impedir que os camundongos caminhem muito para dentro do túnel segurando suavemente a base da cauda.
    2. Uma vez dentro, o camundongo geralmente permanece posicionado dentro da forração enrolada sem se virar.
      OBSERVAÇÃO: Se os camundongos não entrarem no túnel, a abertura pode estar muito pequena; comprima levemente a forração na entrada do túnel. Se os camundongos forem muito pequenos e tenderem a se virar, aperte mais a forração enrolada ou adicione uma camada adicional (Figura 1B).
  3. Coleta de sangue
    1. Endireite suavemente a cauda segurando a ponta e desinfete o local de coleta pretendido. Gire a cauda aproximadamente 90° para posicionar as veias laterais da cauda dorsalmente.
    2. ETAPA CRÍTICA: Puncture a veia lateral usando uma lanceta. Colete as gotas de sangue usando um microtubo ou capilar.
      CAUTELA: Descarte imediatamente as lancetas usadas em recipientes resistentes a perfuração e vazamento, apropriados para objetos cortantes. Não tente recolocar a tampa das lancetas para prevenir acidentes com agulhas.
    3. Após a coleta, aplique pressão suave no local da punção com um cotonete estéril para controlar o sangramento.
  4. Soltura e reforço positivo
    1. Retorne o túnel contendo o camundongo para a gaiola de origem e permita que o animal saia voluntariamente pela extremidade oposta do túnel (Figura 1C).
    2. Ofereça petiscos na gaiola de origem para promover o reforço positivo e a habituação ao procedimento.
  5. Limpeza e manutenção
    1. Remova a forração interna do túnel de aplicação. Limpe o túnel de aplicação com etanol 70%.
    2. Se a forração permanecer limpa, ela pode ser reutilizada em experimentos subsequentes. Se estiver contaminada ou visivelmente suja, lave e autoclave antes de reutilizar.
      OBSERVAÇÃO: Use uma forração por grupo experimental. Substitua a forração entre diferentes experimentos, entre animais machos e fêmeas, e sempre que exigido pelas diretrizes institucionais de higiene.

Resultados

Para avaliar a influência da nova técnica de contenção no bem-estar dos camundongos, coletas de sangue da veia da cauda e injeções intravenosas foram realizadas conforme o protocolo descrito. Camundongos machos e fêmeas selvagens da linhagem C57BL/6 foram submetidos aos procedimentos, seja no túnel de aplicação, seja em um contenção convencional, e avaliados quanto a sinais de dor e estresse. A escala de caretas de camundongo (MGS) foi utilizada para determinar o nível de estresse dos animais após a coleta de sangue da veia da cauda. A MGS é um sistema de pontuação amplamente utilizado, que analisa a expressão dos músculos faciais como reação à dor ou a procedimentos estressantes9,10. Para determinar as pontuações, fotografias foram tiradas imediatamente após a liberação dos camundongos do dispositivo de contenção ou do túnel (imagens representativas são mostradas na Figura 2). Dois observadores experientes na avaliação do comportamento de camundongos analisaram três parâmetros de expressão facial (mostrados nos esquemas na Figura 2C): aperto orbital (fechamento da pálpebra e estreitamento da área orbital; uma ruga pode ser visível ao redor do olho), saliência no nariz (saliente na ponte do nariz e rugas verticais podem aparecer nas laterais do nariz) e posição das orelhas (as orelhas giram para fora e/ou para trás, afastando-se do rosto, e podem dobrar-se formando um formato ‘pontiagudo’; o espaço entre as orelhas aumenta). A posição dos bigodes e a saliência nas bochechas não foram avaliadas porque a cor escura da pelagem dos camundongos dificultou uma avaliação confiável. Cada parâmetro foi pontuado utilizando uma escala de três pontos variando de 0 a 2 (0 = ausente, 1 = moderadamente presente, 2 = claramente presente), e os três parâmetros faciais foram médios para obter uma pontuação média de MGS por animal. Para garantir a confiabilidade, cada animal foi pontuado independentemente e de forma cega por ambos os observadores, e as duas pontuações de MGS foram posteriormente médias para gerar uma pontuação final de MGS para cada animal. Tanto camundongos fêmeas quanto machos apresentaram uma redução significativa na pontuação de MGS quando a coleta de sangue foi realizada no túnel de aplicação em comparação com o contenção convencional (Figura 2A–B).

Um grupo separado de camundongos foi submetido à injeção intravenosa de 100 µL de cloreto de sódio (NaCl) 0,9%, e foram registradas as ocorrências de vocalizações audíveis, bem como tentativas de girar dentro do dispositivo de contenção. Os camundongos vocalizam por meio de guinchos audíveis como sinal de sofrimento intenso, especialmente ao sentirem dor ou medo e durante comportamentos defensivos11,12,13. Além disso, os camundongos reagem naturalmente à contenção física com pânico, resultando em uma resposta de fuga para escapar do espaço confinado. Portanto, as tentativas de girar 180 graus dentro do dispositivo de contenção foram consideradas sinais de medo. Em camundongos fêmeas e machos, observou-se uma ocorrência maior de vocalizações audíveis e tentativas de girar quando as injeções intravenosas foram realizadas dentro do dispositivo de contenção, em comparação com o túnel de aplicação (Figura 3).

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Figura 1: Túnel de aplicação inovador. (A) Imagens representativas ilustrando a diferença de tamanho entre um contenção convencional e o túnel de aplicação inovador. (B) O revestimento interno do túnel consiste em um pedaço cortado sob medida de Vetbed enrolado, proporcionando um ambiente macio, suportivo e escuro. Se os camundongos forem muito pequenos e tenderem a se virar, o revestimento enrolado pode ser apertado para reduzir o espaço disponível. (C) Diferentes etapas de manipulação dentro do túnel de aplicação, incluindo entrada e saída, fixação segura e confortável, e acesso ao abdômen e à cauda. (D) Uma cunha adicional para realizar injeções intraperitoneais dentro do túnel. A cunha aumenta o ângulo do túnel em relação ao manipulador, facilitando um acesso mais fácil à região abdominal. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Escala de expressão facial de dor em camundongos após coleta de sangue da veia da cauda. Camundongos machos ou fêmeas foram submetidos à coleta de sangue dentro de um túnel de contenção ou de um dispositivo convencional de contenção. Imagens para avaliação da escala de expressão facial de dor foram obtidas imediatamente após os animais saírem do dispositivo de contenção ou do túnel e posteriormente pontuadas independentemente por dois experimentadores experientes, cegos quanto à alocação dos grupos dos camundongos, que avaliaram o estreitamento orbital, o inchaço do nariz e a posição das orelhas. Uma pontuação média foi calculada para cada animal com base nas duas pontuações. (A) Camundongos fêmeas (túnel n = 5; contenção convencional n = 8). (B) Camundongos machos (túnel n = 11; contenção convencional n = 11). Este gráfico foi adaptado de Schlutt et al., 2026, PLOS ONE. Os dados originais, publicados como um gráfico de barras sob licença CC BY 4.0, foram modificados e replotados aqui como um gráfico de caixa com bigodes. (C) Ilustração esquemática das unidades de ação facial geradas a partir de um prompt textual desenvolvido pelos autores utilizando o ChatGPT Image 2 (OpenAI; disponível em https://chatgpt.com/); a imagem final foi revisada e aprovada pelos autores quanto à precisão científica. Os dados são apresentados como gráficos de caixa com bigodes (mínimo a máximo); a linha indica a média. Teste de Mann-Whitney, valores de p < 0,05 foram considerados significativos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Vocalizações audíveis e tentativas de virar-se após injeção intravenosa. Camundongos machos ou fêmeas foram submetidos à injeção intravenosa de 100 µL de NaCl 0,9% dentro do túnel de aplicação ou de um restritor convencional. Foram registrados durante o procedimento os episódios de vocalização audível e tentativas de virar-se dentro do dispositivo de contenção (sim/não). Todos os grupos n = 10. Os dados são apresentados como gráficos de barras empilhadas de contingência. O teste exato de Fisher foi utilizado, considerando-se significativos valores de p < 0,05. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 1: Injeção intraperitoneal em ratos utilizando uma versão maior do túnel de aplicação. Um túnel de aplicação com diâmetro de 15 cm foi utilizado para injeção intraperitoneal em ratos. O procedimento foi realizado de acordo com o mesmo protocolo descrito para camundongos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Essa técnica de contenção foi desenvolvida para administração de substâncias e coleta de sangue, visando apoiar uma abordagem de boas práticas ao bem-estar animal. Algumas comunidades científicas ainda permanecem relutantes em adotar métodos aprimorados de manipulação e contenção que diferem dos procedimentos padronizados de longa data, especialmente quando podem exigir tempo e esforço adicionais. No entanto, reduzir o estresse em animais de laboratório não é apenas desejável do ponto de vista do bem-estar animal, mas também contribui significativamente para o sucesso experimental ao reduzir a variabilidade dos dados, minimizar alterações fisiológicas induzidas pelo estresse e diminuir tentativas fracassadas e desistências de animais. Este protocolo apresenta um método de fácil implementação que melhora significativamente o bem-estar animal, ao mesmo tempo que proporciona contenção segura e acesso com as mãos livres para procedimentos seguros de aplicação e coleta.

Uma etapa crítica do protocolo é garantir a entrada bem-sucedida e a posição estável dentro do túnel de aplicação. Para a entrada voluntária, duas abordagens possíveis são recomendadas: a entrada direta do tubo de transferência para o túnel ou, primeiramente, colocar os camundongos do tubo de transferência sobre o revestimento macio previamente posicionado, a partir do qual eles podem entrar no túnel. A abordagem ideal depende do comportamento dos animais, e ambos os métodos devem ser avaliados. A variante preferida é aquela em que os camundongos entram mais rapidamente e com menor relutância. Se os camundongos hesitarem em entrar no túnel, diversos fatores devem ser considerados: a abertura de entrada pode ser muito estreita, caso em que o revestimento pode ser ligeiramente comprimido para ampliar a abertura; (2) pistas olfativas provenientes do revestimento interno podem influenciar a aceitação, portanto, os revestimentos devem preferencialmente manter o odor familiar da gaiola, assegurando ao mesmo tempo a separação entre grupos experimentais, gaiolas e sexos, e substituindo o material sujo para evitar odores confundidores; (3) demonstrou-se que camundongos se sentem mais seguros em superfícies com cores semelhantes à cor de seu pelo14, portanto, combinar a cor do revestimento com a cor do pelo dos animais pode ser benéfico; e (4) posicionar a abertura do túnel em direção à parede da gaiola pode incentivar a entrada, pois os camundongos ainda conseguem ver a gaiola de origem e os companheiros de gaiola. Uma limitação potencial do túnel de aplicação é que ele depende da entrada voluntária do animal, o que pode ser percebido como introduzindo um breve atraso antes do tratamento ou da coleta de amostras. No entanto, neste estudo, os camundongos entraram no túnel rapidamente e de forma consistente, geralmente dentro de 2–10 s, permitindo que os procedimentos fossem realizados dentro de uma janela de tempo estreita e reprodutível. Embora esta abordagem possa exigir um tempo ligeiramente maior do que a contenção convencional pela nuca, o modesto aumento no tempo de manipulação deve ser ponderado frente à substancial melhoria no bem-estar animal alcançada pela redução do estresse associado à manipulação. Além disso, a inserção em contensores convencionais também está associada a tempo de manipulação, já que os camundongos frequentemente resistem à colocação, resultando em nenhuma diferença relevante. Em menos de 5% dos casos, os camundongos não entraram voluntariamente no túnel. Embora as medidas descritas acima tenham sido geralmente suficientes para incentivar a entrada, os animais também poderiam ser suavemente auxiliados a entrar no túnel, se necessário. Mesmo nesses casos, o revestimento interno macio oferece uma vantagem em termos de bem-estar em comparação com os contensores convencionais.

Uma vez dentro do túnel, os camundongos conseguem segurar firmemente o revestimento interno. Isso é altamente favorável do ponto de vista do bem-estar animal, pois já foi demonstrado que camundongos restritos apresentam níveis mais baixos de estresse quando têm permissão para segurar uma superfície durante o manejo4. Simultaneamente, o manipulador pode segurar com segurança a base da cauda sem que o camundongo tente se virar. É essencial que o revestimento interno envolva firmemente o animal. Se os camundongos forem muito pequenos e tenderem a girar dentro do túnel, ajustes rápidos podem ser feitos apertando mais o revestimento enrolado ou adicionando uma camada extra. Para experimentos envolvendo animais de diferentes tamanhos (por exemplo, devido a idade, sexo ou dieta diferentes), túneis com diâmetros variados também podem ser utilizados (consulte os modelos de impressão8).

As injeções e a coleta de sangue devem sempre ser realizadas por pessoal treinado. Ainda assim, o túnel de aplicação mostrou-se eficaz tanto para pessoal altamente experiente quanto para usuários menos experientes. Em particular, o pessoal inexperiente relatou menos tentativas malsucedidas, reduzindo assim o manuseio repetido e procedimentos prolongados. Os usuários também relataram sentir-se mais confortáveis e seguros ao restringir camundongos no túnel, em comparação com o aprendizado das técnicas convencionais de fixação manual. Isso representa uma vantagem considerável para laboratórios com alta rotatividade de pessoal, pois o método é fácil de adotar e traz benefícios tanto para os animais quanto para o experimentador. Essas observações estão de acordo com as melhorias previamente relatadas no conforto de manuseio e na confiança dos técnicos associadas a técnicas refinadas de manipulação, como o manuseio com túnel e com as mãos em formato de xícara15.

É importante destacar que o método descrito aqui é eficaz mesmo em camundongos não treinados, e todos os resultados apresentados foram obtidos utilizando animais sem habituação prévia. Estudos anteriores demonstraram que a habituação e o treinamento médico dos animais podem reduzir as respostas ao estresse em camundongos ao familiarizá-los com os procedimentos planejados16,17. Um protocolo de treinamento que inclua o uso do túnel pode, portanto, reduzir ainda mais os níveis de estresse, especialmente quando intervenções frequentes são necessárias, o que poderia, de outra forma, induzir associações negativas com o túnel. Esse tipo de programa de treinamento foi aplicado com sucesso em um estudo anterior, permitindo-nos utilizar o túnel para injeções intraperitoneais repetidas ao longo de várias semanas8. Em especial em estudos que exigem injeções repetidas, o túnel pode representar uma melhoria significativa. Técnicas aprimoradas de manejo que utilizam tubos de transferência e restrição reduzida demonstraram manter efeitos positivos mesmo após restrição pela nuca ou injeções intraperitoneais repetidas, incluindo maior disposição para interagir com os manipuladores e redução de comportamentos semelhantes à ansiedade em testes comportamentais padrão18,19. Da mesma forma, injeções repetidas realizadas dentro do túnel não aumentaram parâmetros relacionados ao estresse em camundongos8.

Alimentar os animais tem demonstrado facilitar a habituação por meio de reforço positivo, um princípio bem estabelecido no treinamento animal. Portanto, recomenda-se oferecer um pequeno petisco ao final de cada sessão de manipulação como recompensa. Ao testar o túnel, quantidades muito pequenas, como um único grão de aveia, foram suficientes e dificilmente interferirão na dieta normal dos animais. Se a ingestão alimentar for uma preocupação, por exemplo, em estudos metabólicos, petiscos saborizados compatíveis com dietas especiais (por exemplo, dietas cetogênicas) também estão disponíveis. É importante ressaltar que os petiscos devem ser considerados uma medida adicional de aperfeiçoamento que melhora a habituação, e não um pré-requisito para o uso bem-sucedido do túnel de aplicação. Uma vez familiarizados com o sistema, os camundongos também entraram voluntariamente no túnel de aplicação repetidamente, sem receber recompensa alimentar.

O método descrito aqui apresenta certas limitações quanto ao acesso a regiões corporais específicas. Embora a cauda possa ser facilmente e seguramente acessada para injeções intravenosas e coleta de sangue, e a região abdominal caudal seja adequada para injeções intraperitoneais, o acesso às regiões laterais do corpo para aplicações subcutâneas é limitado. A administração oral também deve ser considerada com cuidado. A gavagem oral convencional não é compatível com este sistema, pois a extensão cervical necessária não pode ser alcançada. No entanto, métodos mais refinados de administração oral, nos quais os camundongos consomem voluntariamente substâncias da ponta de uma pipeta (por exemplo, misturadas com leite condensado)20, podem ser viáveis através do lado aberto do túnel. Nesses casos, é essencial garantir que a cabeça permaneça claramente visível e que o camundongo não esteja posicionado muito profundamente dentro do revestimento ou túnel, a fim de confirmar a ingestão completa da substância.

Em comparação com os túneis de contenção existentes, o túnel de aplicação descrito aqui oferece vantagens claras para o bem-estar animal. Embora a contenção seja frequentemente necessária para procedimentos seguros de aplicação e coleta de amostras, também é reconhecida como um dos maiores estressores que roedores enfrentam durante procedimentos experimentais7,21,22. Estudos anteriores já demonstraram que substituir o manejo tradicional pela cauda e a contenção por métodos aprimorados, como o manejo com túnel ou com as mãos em forma de concha, melhora significativamente o bem-estar animal. Camundongos manuseados com essas abordagens refinadas exibem menor ansiedade e maior disposição para interagir com os manipuladores do que camundongos levantados pela cauda23,24. O uso do túnel de aplicação, que é voluntariamente adentrado pelos camundongos, é uma extensão coerente do manejo com túnel. A escala de expressão facial de camundongos saindo do túnel de aplicação indica que os animais não se sentem contidos ou presos. Embora o método de injeção intraperitoneal, no qual os camundongos se agarram à grade da gaiola, se assemelhe à preensão descrita que levanta a região pélvica5, o primeiro baseia-se na luta dos animais para escapar. Sobre uma grade, os camundongos se seguram com as patas e puxam para frente, afastando-se do aperto dos manipuladores, o que leva à contenção e, portanto, ao estresse. Além disso, esse tipo de contenção aumenta o tônus muscular abdominal, promovendo subsequentemente a dor provocada pela punção com a agulha. Em contraste, o túnel de aplicação representa um método de contenção aprimorado, e os resultados indicam parâmetros reduzidos associados ao estresse, incluindo escores menores na escala de expressão facial, menos vocalizações audíveis e manutenção da disposição para interagir com os manipuladores811,12,13. Embora as vocalizações ultrassônicas (VUS) sejam cada vez mais reconhecidas como sinais de comunicação etologicamente relevantes, seu uso como marcadores de estresse em camundongos adultos ainda está em investigação, pois as VUS são altamente dependentes do contexto e também ocorrem durante comportamentos fisiológicos normais25.

No entanto, evidências recentes sugerem que a gravação de USV pode representar uma abordagem promissora, não invasiva e reprodutível para avaliar respostas comportamentais ao confinamento26. A inclusão de gravações de USV em estudos futuros pode, portanto, fornecer uma medida objetiva adicional para caracterizar melhor o estresse e as respostas emocionais. Em conjunto, esses achados indicam que o túnel de aplicação permite um procedimento de contenção mais seguro e menos estressante para aplicações e coletas de rotina, em comparação com os contenidores convencionais. Importante ressaltar que, ao contrário dos contenidores acrílicos transparentes, o revestimento interno macio permite que os camundongos agarrem a superfície com segurança, o que é considerado um aprimoramento importante no bem-estar, conforme as recomendações do NC3Rs27. Foram observadas significativamente menos tentativas de girar dentro do túnel, melhorando tanto o bem-estar quanto a segurança no manejo. Nos contenidores plásticos convencionais, as tentativas de girar estão frequentemente associadas à urinação, e o pelo molhado resultante compromete ainda mais o conforto. Esse problema foi amplamente eliminado com o uso do túnel de aplicação.

As aplicações potenciais deste método são extensas. É importante destacar que o método aprimorado de contenção não se limita a camundongos, podendo também ser aplicado a ratos ao utilizar um túnel com diâmetro maior (Supplementary Figure 1). Roedores são as espécies de animais de laboratório mais amplamente utilizadas nas diversas disciplinas científicas, e a contenção para administração de substâncias e coleta de amostras é um procedimento rotineiro em muitos laboratórios. No entanto, demonstrou-se que o estresse provocado pela contenção não apenas compromete o bem-estar animal, mas também influencia significativamente os resultados científicos, incluindo respostas comportamentais28,29 e mecanismos fisiológicos, como a função imunológica30. Portanto, minimizar a variabilidade relacionada ao estresse é essencial tanto para a validade científica quanto para as considerações éticas nos experimentos com animais. Ao reduzir o estresse associado à contenção, mantendo ao mesmo tempo um manuseio seguro e prático, o túnel de aplicação pode melhorar substancialmente a qualidade e a reprodutibilidade dos experimentos, ao mesmo tempo que promove o bem-estar animal.

Divulgações

A.S., J.K.U. e L.H. são titulares de um modelo de utilidade para o túnel de injeção na Alemanha (número de registro 20 2024 100 448). Todos os demais autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos à equipe do nosso biotério do Charité e aos oficiais de bem-estar animal, especialmente ao Dr. André Dülsner, pelo apoio; ao Charité 3R pelo apoio financeiro para a disseminação do túnel de aplicação; e a todos os membros do Grupo de Trabalho de Aperfeiçoamento do Charité 3R pelas discussões úteis.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulhas estéreis para testes de alergiaHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Hamburgo, Alemanha1110106
Túnel de aplicação com cunha opcionalTúnel impresso em 3D caseiromodelos de impressão disponíveis em https://osf.io/vsjnb.
Tubos para coleta de sangue: Microvette 100 EDTA K3E, 100 µL SARSTEDT AG & Co. KG, Nümbrecht, Alemanha20.1278.100
Tubo transparente para manuseioDatesand Group, Stockport, Reino UnidoGZCHTUBE-100tamanho: 50 x 3 x 100 mm
Etanol, ≥70%Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AlemanhaT913.1
Seringa de dose fina descartável Inject-F, 1 mL B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Alemanha9166017V
AveiaSchapfen Mühle GmbH Co.KG, Ulm, AlemanhaW100197autoclavada
Lâmpada infravermelha Sanitas SIL 06Beurer Europe GmbH, Ulm, Alemanha61424
Forro interno macio: Vetbed Isobed SL originalVetbed Deutschland, Mudersbach, Alemanha1999981cortado nos tamanhos necessários
Desinfetante em spray Softasept ISO 70%B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Alemanha19905
Agulhas hipodérmicas estéreis descartáveis Sterican 27 G x ¾B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Alemanha4657705Btamanho: 0,40 mm x 20 mm
Chumaços: aplicadores médicos FIWA appFink & Walter GmbH, Merchweiler, Alemanha329012

Referências

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