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Um Método Baseado em Impedância em Tempo Real e Sem Marcadores para Triagem Antiviral de Alto Rendimento

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DOI:

10.3791/72539

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3 de setembro de 2026

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1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

Neste artigo

Resumo

A abordagem de análise celular em tempo real (RTCA) baseada em impedância permite a quantificação em tempo real e livre de marcadores dos efeitos citopáticos induzidos por vírus, fornecendo um método rápido para avaliar compostos antivirais e anticorpos monoclonais por meio de um fluxo de trabalho de ensaio integrado e orientado por software.

Resumo

As tecnologias baseadas em impedância fornecem um meio robusto e objetivo para quantificar efeitos citopáticos (CPE) em monocamadas de culturas celulares, superando as limitações dos ensaios tradicionais de ponto final ou subjetivos visualmente. Vírus citolíticos geralmente induzem alterações morfológicas acentuadas e morte celular em culturas infectadas, tornando as medições de impedância — que refletem mudanças na adesão celular, morfologia e viabilidade — um indicador sensível e dinâmico de infecção e progressão viral. Como resultado, leituras baseadas em impedância oferecem uma abordagem poderosa e eficiente para avaliar os efeitos protetores de intervenções antivirais. Este estudo apresenta uma plataforma de triagem em tempo real e livre de marcadores que utiliza sistemas avançados de medição de impedância para monitorar continuamente o CPE induzido por vírus. Essa abordagem permite uma avaliação rápida e quantitativa da eficácia antiviral de fármacos de pequenas moléculas e anticorpos monoclonais, sem necessidade de etapas adicionais de marcação ou coloração. O protocolo detalha todo o fluxo de trabalho do ensaio, desde o semeador celular e infecção viral até a aquisição e análise de dados. Além disso, o software integrado ao sistema, especificamente adaptado para aplicações em virologia, simplifica o processamento e a interpretação dos dados, facilitando a determinação do potencial neutralizante de anticorpos monoclonais e da atividade de compostos antivirais.

Introdução

Quando confrontados com a ameaça de um surto viral, vacinas e terapêuticas antivirais representam as estratégias principais para limitar a transmissão viral e tratar pacientes infectados1. As vacinas previnem infecções ao preparar o sistema imunológico para reconhecer patógenos e fornecem proteção proativa e de longo prazo. As terapêuticas antivirais têm diversos usos, dependendo da modalidade e do design da droga. Semelhantes às vacinas, os anticorpos monoclonais podem proporcionar proteção proativa e sustentada (semanas a vários meses) e também podem ser utilizados como ferramenta para controle pós-exposição. Tanto os anticorpos monoclonais quanto as terapêuticas antivirais de pequenas moléculas são usados para tratar infecções estabelecidas, atuando diretamente sobre componentes virais ou inibindo-os, reduzindo assim a gravidade da doença e funcionando como uma intervenção reativa de curto prazo.

A abordagem convencional para avaliar funcionalmente a atividade antiviral em sistemas biológicos é o teste de neutralização por redução de vírus (VRNT), que quantifica a redução na formação de placas nos testes de neutralização por redução de placas (PRNT), focos por meio de imunomarcação no teste de neutralização por redução de focos (FRNT) ou efeitos citopáticos (CPE) utilizando ensaios baseados na viabilidade celular. O PRNT é considerado o método fenotípico padrão-ouro para determinar a atividade inibitória de agentes antivirais contra uma ampla gama de infecções virais2. No entanto, o PRNT é demorado e intensivo em mão de obra, e a interpretação dos resultados pode ser subjetiva, especialmente quando ocorre supercrescimento ou fusão de placas durante incubação prolongada. A objetividade das leituras do ensaio pode ser aprimorada usando o FRNT, que depende da detecção de antígenos específicos do vírus ou da expressão de genes repórter. Contudo, essa abordagem pode ser limitada pela disponibilidade e desempenho de anticorpos de alta qualidade ou enzimas de detecção. Vários reagentes e protocolos de ensaio são bem estabelecidos e amplamente utilizados para avaliação da viabilidade celular, medindo certos aspectos dos CPE. A redução enzimática do sal mono-tetrazólio MTT (reagente colorimétrico 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio brometo) por desidrogenases mitocondriais em células vivas produz um sinal colorimétrico quantificável causado pelo produto formazano colorido. O reagente do ensaio de viabilidade (que lisa as células e libera ATP intracelular que impulsiona uma reação catalisada por luciferase, convertendo o substrato luciferina em oxiluciferina) é um ensaio luminiscente homogêneo. Tais ensaios de viabilidade celular podem ser empregados para quantificar a diminuição dos CPE durante a triagem de agentes antivirais3. No entanto, esses métodos também exigem múltiplas etapas de lavagem e coloração e, assim como os ensaios PRNT e FRNT, são ensaios de ponto final. Como resultado, agentes antivirais parcialmente eficazes que exercem efeitos retardados sobre a infecção viral podem ser ignorados se o ensaio antiviral for encerrado em um ponto temporal subótimo. Portanto, existe uma necessidade urgente de um ensaio automatizado, de média a alta produtividade, que permita o monitoramento em tempo real das respostas celulares às infecções virais.

Os sistemas de análise celular em tempo real (RTCA) permitem o monitoramento contínuo do desenvolvimento de ECP e das respostas antivirais em modelos celulares permissivos por meio de uma leitura baseada em impedância, livre de marcadores e não invasiva. A ECP induzida por vírus inclui não apenas a morte celular, mas também alterações na morfologia e adesão celular, todas as quais podem ser detectadas com sensibilidade por meio de mudanças na impedância elétrica4,5. Essas medições de impedância são obtidas utilizando sensores de microeletrodos de ouro embutidos em uma placa especializada de cultura celular de 96 poços, permitindo a avaliação quantitativa de respostas celulares dinâmicas sem a necessidade de marcadores ou expressão de genes repórter. A tecnologia RTCA tem sido amplamente relatada para a detecção de ECP em diversos modelos celulares infectados com vírus de múltiplas famílias, bem como para a avaliação da atividade neutralizante de anticorpos6–10.

Aqui, foram definidos os passos críticos deste ensaio antiviral in vitro em tempo real e sem marcadores baseado em impedância. Essa abordagem foi baseada em estudos anteriores envolvendo a triagem de compostos antivirais em células HEK293A infectadas com adenovírus 5 e a avaliação de anticorpos neutralizantes utilizando um vírus da estomatite vesicular recombinante com capacidade de replicação que expressa a glicoproteína do vírus Lassa (rVSV-LASV(Lin IV)) em células Vero CCL-8111. Todos esses experimentos foram realizados em um sistema RTCA MP, que permite operar simultaneamente até 6× placas de 96 poços. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma base para a triagem antiviral baseada em impedância. O método pode ser facilmente estendido a uma ampla gama de modelos vírus-célula, uma vez que as condições ideais do ensaio tenham sido definidas usando o protocolo descrito aqui.

Protocolo

Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultivo e passagem de células permissivas

OBSERVAÇÃO: Neste protocolo, células Vero CCL-81 são utilizadas para neutralização por anticorpos, enquanto células HEK293A são utilizadas para triagem de compostos antivirais. Para reduzir a variação entre experimentos, recomenda-se fortemente criar um banco de células permissivas na mesma passagem celular para o ensaio.

  1. Pré-aqueça o meio de crescimento celular — Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina — em banho-maria a 37 °C antes do uso.
  2. Descongele um frasco de células criopreservadas em banho-maria a 37 °C até que reste apenas um pequeno cristal de gelo; não submerja a tampa no banho-maria. 
  3. Coloque o frasco contendo as células revividas na cabine de segurança biológica (CSB) após limpar a superfície externa com etanol 70%.
  4. Transfira suavemente as células para um novo tubo cônico de 50 mL e adicione gota a gota 9 mL de meio de crescimento aquecido às células. Misture suavemente.
  5. Centrifugue a suspensão celular a 200 × g durante 5 min à temperatura ambiente (TA).
  6. Transfira as células re-suspensas em 5 mL de meio de crescimento pré-aquecido para um novo frasco T-25.
  7. Cultive as células até atingirem 80%–90% de confluência em incubadora a 37 °C com 5% de CO2 antes da próxima subcultura celular. 
  8. Realize a passagem das células.
    1. Aspire o meio e lave suavemente a monocamada celular duas vezes com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e sem magnésio 1× para remover o meio de crescimento residual.
    2. Adicione 2 mL de tripsina-EDTA 0,25% ao frasco para cobrir as células.
    3. Após 2–5 min de incubação a 37 °C, neutralize a tripsina adicionando um volume 5 vezes maior de meio de crescimento pré-aquecido.
    4. Re-suspenda as células pipetando suavemente a suspensão celular para cima e para baixo contra a parede do frasco.
    5. Plante as células na densidade de semeadura desejada ou na razão de divisão com meio fresco. 
      NOTA: A densidade de semeadura desejada é determinada empiricamente com base na taxa de crescimento celular, frequência de passagem e confluência alvo no momento da passagem. Por exemplo, semear células Vero CCL-81 com no mínimo 0,4 × 104 células/cm2 permite que as células sejam passadas a cada 3 dias antes de atingirem 90% de confluência.

2. Triagem de agentes antivirais

OBSERVAÇÃO: Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho do ensaio de triagem antiviral baseado em impedância. Resumidamente, células permissivas são semeadas em microplacas de 96 poços integradas a microeletrodos, e o desempenho celular é monitorado por aproximadamente 24 h antes do ensaio. Em testes de neutralização por anticorpos, vírus com uma multiplicidade de infecção (MOI) fixa são misturados com anticorpos e pré-incubados por 1 h antes de serem adicionados às células. Em contraste, na triagem de compostos antivirais, vírus com MOI fixa e compostos são adicionados simultaneamente às células. O efeito citopático induzido pelo vírus é monitorado continuamente por meio de leituras baseadas em impedância, e a análise dos dados pode ser realizada durante ou após a conclusão do ensaio.

  1. Dia 0: Medir o fundo da placa e semear células permissivas
    1. Para iniciar um experimento, abra o software do instrumento (RTCA Pro) e selecione o berço desejado para o ensaio. Em seguida, escolha o Virologia módulo antes de iniciar o experimento.
    2. Insira quaisquer notas relevantes no Notas Exp guia (por exemplo, Nome do Experimento, Número de série do dispositivo, Tipo de Dispositivoou outros detalhes pertinentes). Esses campos são opcionais e podem ser deixados em branco se não forem aplicáveis.
    3. Navegue até o Layout aba e defina as poças utilizadas no experimento. Se determinadas poças não forem utilizadas, selecione as poças não utilizadas, clique com o botão direito dentro da interface de layout da placa e selecione Desligar Poço(s) do menu suspenso para excluí-los do ensaio.
    4. Medição do fundo da microplaca de 96 poços com microeletrodos integrados
      1. Dispensar 50 µL do meio de ensaio em cada poço da placa usando uma pipeta multicanal no modo de pipetagem reversa para minimizar a formação de bolhas.
        OBSERVAÇÃO: A seleção do meio do ensaio deve ser otimizada antes da triagem para minimizar interferências na sensibilidade do ensaio e garantir uma avaliação precisa da eficácia do tratamento. Por exemplo, os ensaios de neutralização por anticorpos foram realizados em DMEM contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina, enquanto os ensaios de triagem de compostos antivirais utilizaram o meio de crescimento celular, DMEM contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.
      2. Coloque a placa no suporte do instrumento localizado dentro de um 37 °C incubadora com 5% de CO₂2. Certifique-se de que a placa está orientada corretamente, com o poço A1 posicionado conforme indicado. Em seguida, verifique a guia Mensagem para quaisquer notificações de erro.
        OBSERVAÇÃO: Toda vez que a placa for colocada na base, verifique se a mensagem “Placa escaneada. Conexões corretas” é exibida. Se ocorrer um erro, remova a placa e reposicione-a na base.
      3. Navegue até o Agenda aba; a Etapa 1 aparece por padrão, pois é uma etapa obrigatória para a medição do fundo da placa. Clique no Iniciar botão para iniciar a gravação das poças. O passo conclui-se automaticamente após uma única medição de impedância de fundo ter sido registrada.
        OBSERVAÇÃO: Esta etapa de fundo deve ser realizada antes de cada experimento. Todas as cavidades utilizadas no experimento devem conter apenas meio de ensaio (ou seja, antes da semeadura celular).
    5. Semeadura permissiva de células na placa de 96 poços integrada a microeletrodos
      1. Triesinize as células permissivas no frasco T25 seguindo os passos descritos na seção de subcultivo de células permissivas.
      2. Conte as células ressuspendidas no meio do ensaio e realize os seguintes cálculos:
        1. Calcule o número total de células viáveis na suspensão utilizando a densidade de células viáveis: Número total de células viáveis = densidade de células viáveis × volume de suspensão
        2. Ajuste a suspensão celular para uma densidade final (por exemplo, 0,30–0,35 × 106 células/mL para Vero CCL-81, equivalente a aproximadamente 15.000–18.000 células por 50 µL, ou 0,12 × 106 células/mL para HEK293A, equivalente a 6.000 células por 50 µL).
          OBSERVAÇÃO: Essas densidades de semeadura foram previamente determinadas como ideais para cada modelo vírus-célula. A densidade adequada de semeadura celular é essencial, pois o uso de muitas ou poucas células pode afetar a sensibilidade do ensaio.
      3. Remova a microplaca contendo 50 µL do meio de ensaio do instrumento e transfira-o para a CAB para o semeio celular.
      4. Dispensar 50 µL da suspensão celular em cada poço da placa utilizando uma pipeta multicanal no modo de pipetagem reversa para minimizar a formação de bolhas, ajustando o volume final de cada poço para 100 µL.
    6. Após a adição das células, deixe a placa na cabine de segurança biológica à temperatura ambiente por 30 minutos para permitir a distribuição uniforme das células no fundo de cada poço.
    7. Retorne a placa ao suporte do instrumento localizado dentro de um 37 °C incubadora com 5% de CO₂2.
      OBSERVAÇÃO: Se forem utilizadas múltiplas placas, identifique cada placa claramente e certifique-se de que ela seja devolvida ao mesmo suporte utilizado durante a medição de fundo.
    8. Navegue até o Layout guia e abra o Célula subaba. Selecione as placas apropriadas, insira a célula permissiva Nome e Númeroe clique em Aplicar para salvar as informações. As informações das células também podem ser inseridas ou atualizadas a qualquer momento durante o experimento.
    9. Adicione a Etapa 2 no Agenda guia com as configurações padrão de gravação (100 varreduras e intervalo de 15 min), então clique em Iniciar para iniciar o monitoramento contínuo noturno da adesão e proliferação celular.
      OBSERVAÇÃO: Esta etapa serve como uma medida de controle de qualidade (CQ) celular antes da inoculação viral. Como o Índice de Células (IC) reflete a adesão e a proliferação celulares, os valores de IC obtidos durante o período de 18–24 h após a semeadura são utilizados como métrica-chave de CQ. O comportamento celular reprodutível entre experimentos é essencial para a reprodutibilidade ideal do ensaio. Notavelmente, tanto a amplitude quanto os perfis cinéticos do IC são específicos do tipo celular. Por exemplo, após cultura noturna, células Vero CCL-81 saudáveis semeadas a 18.000 células/poço tipicamente apresentam um Índice de Células entre 6 e 8, enquanto células HEK293A saudáveis semeadas a 6.000 células/poço geralmente apresentam um Índice de Células entre 0,8 e 1,2.
  2. Dia 1: Triagem de agentes antivirais baseada em impedância
    OBSERVAÇÃO: Antes de realizar o ensaio de triagem, o vírus deve ser titulado adequadamente para determinar a diluição de trabalho ideal. Esta etapa estabelece uma concentração viral que permite um desempenho robusto e reprodutível do ensaio, ao mesmo tempo que atende aos requisitos definidos pelo usuário, como a duração desejada do ensaio. Por exemplo, no protocolo de neutralização por anticorpos11, uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 foi escolhida para o ensaio de neutralização, pois produziu efeito citopático completo (100%) em 40 h pós-inoculação. No ensaio baseado em impedância, o efeito citopático completo é indicado pela redução do Índice de Células ou do Índice de Células Normalizado a zero. Durante a triagem de compostos antivirais, foi utilizada uma MOI de 1, e observou-se 100% de efeito citopático em 70 h pós-inoculação. O protocolo de titulação viral seguiu procedimentos estabelecidos descritos em um relato anterior12. Se vírus infecciosos forem utilizados no ensaio, certifique-se de seguir todas as precauções de segurança aplicáveis. Consulte a seção de orientações de segurança para o manuseio de vírus infecciosos.
    1. Prepare o vírus na concentração predeterminada e prepare diluições seriadas do anticorpo ou composto antiviral no meio de ensaio.
    2. Para ensaios de neutralização com anticorpos monoclonais, misture 60 µL de vírus a 4× a concentração final do ensaio com 60 µL de anticorpo a 4× a concentração final do ensaio e incubar em 37 °C por 1 h antes da adição às células permissivas. Após a mistura, o vírus e o anticorpo estão presentes em 2× suas concentrações finais no ensaio. Em contraste, não é necessária pré-incubação entre o vírus e o composto em ensaios de triagem de compostos antivirais.
    3. Navegue até o Layout guia e selecione o Tratamento subguia para inserir as informações sobre o tratamento com agentes antivirais nos poços apropriados.
    4. Selecione os poços para o mesmo tratamento, depois insira os Nome dos agentes e insira o início Diluição ou Concentração. Por exemplo, se a concentração inicial for 10 µg/mL, digite 10 e selecione µg/mL como o “Unidade”. Inserir 3 como o Fator de diluição e especificar o Direção de diluição (por exemplo, de Cima para Baixo).
      OBSERVAÇÃO: Após clicar em Aplicar, as concentrações ou diluições dos agentes antivirais serão automaticamente calculadas e salvas com base na configuração da placa informada e exibidas nos poços correspondentes. Os valores calculados também são armazenados para análises subsequentes dos dados. Inserindo as informações sobre o vírus (por exemplo, Nome e Diluição) é opcional, pois o ensaio utiliza uma única multiplicidade de infecção (MOI) fixa para todos os poços tratados com o vírus.
    5. Atribua poços tratados apenas com vírus como controles positivos, selecionando os poços apropriados e escolhendo Controle positivo sob Tipo de poço.
    6. Atribua poços não infectados como controles negativos seguindo o passo descrito acima e verificando Controle negativo sob Tipo de poço.
      OBSERVAÇÃO: Atribuição correta de poços com vírus apenas e poços não infectados como Controle positivo e Controle negativo, respectivamente, utilizando o Tipo de poço o ajuste é crítico, pois os valores de CI desses poços são utilizados em todos os cálculos relacionados à neutralização (por exemplo, %Neutralização). Para cálculos relacionados ao EPC (por exemplo, %EPC), são necessários poços de controle negativo explicitamente designados. Para ensaios de neutralização por anticorpos, recomenda-se fortemente a inclusão, na mesma placa, de anticorpos controles positivo e negativo, a fim de garantir uma interpretação precisa dos dados. No entanto, esses anticorpos controle devem ser designados como Amostras sob Tipo de poço.
    7. Quando o ensaio estiver pronto para a adição do agente antiviral, pressione o Interromper Etapa Atual botão para pular as varreduras restantes na Etapa 2 e prosseguir para a próxima etapa.
    8. Clique no Desbloquear Placa botão, depois remova a placa do suporte e coloque-a na CAB.
    9. Dispense suavemente 100 µL da mistura vírus-anticorpo ou vírus-composto antiviral em cada poço utilizando uma pipeta multicanal, resultando em um volume final do poço de 200 µL. O inóculo contém vírus e anticorpo ou composto antiviral na concentração de 2× suas concentrações finais no ensaio, que são diluídas para as concentrações de trabalho finais ao serem adicionadas às células.
    10. Após retornar a placa ao suporte, navegue até o Agenda guia e adicione a Etapa 3. Especifique o número de Varreduras e o Intervalol entre varreduras. Certifique-se de que a duração total da varredura (número de varreduras × intervalo) excede a duração esperada do tratamento. Clique em Iniciar para retomar a aquisição de dados e continuar o ensaio.
      OBSERVAÇÃO: Designar uma etapa separada (por exemplo, Etapa 3) após a adição do agente antiviral facilita a identificação do período de monitoramento pós-tratamento. Sempre programe cada etapa (exceto a Etapa 1) para durar mais tempo do que a duração esperada do ensaio. Se o tempo de execução programado for atingido, o instrumento interromperá a aquisição de medidas, resultando em pontos de dados ausentes.
  3. Dia 1 e seguintes: Análise de dados
    1. Para revisar a gravação em tempo real e/ou a análise das respostas celulares durante a aquisição de dados, navegue até o Análise de Dados na guia, selecione um ponto temporal específico ou um intervalo de tempo e, em seguida, selecione e adicione as poças a serem incluídas na análise para exibição no gráfico.
    2. Selecione parâmetros a partir do Eixo Y menu suspenso. Quando Índice de Células Normalizado (NCI) é selecionado, especifique o Tempo de Normalização, o ponto temporal imediatamente antes do tratamento, na lista suspensa de tempo. %CPE ou %Neutralização também pode ser exibido selecionando a opção correspondente no menu suspenso do eixo Y.
      OBSERVAÇÃO: O instrumento utiliza um parâmetro adimensional, o Índice de Células (IC), para representar a impedância. O Índice de Células Normalizado (ICN) é recomendado para avaliar as diferenças decorrentes do tratamento, minimizando ao mesmo tempo o impacto da variação inerente entre poços.
    3. Navegue até o Parâmetro seção sobre o Análise de Dados guia para calcular e gerar diferentes tipos de figuras, como um gráfico de barras e curvas de regressão logística de 4 parâmetros (4PL, inclinação variável) de resposta à dose em um ponto temporal específico (por exemplo, no ponto médio ou no ponto final do ensaio). Alternativamente, o IC₅₀ derivado da área sob a curva (AUC) do Índice de Células ou Índice de Células Normalizado após o tratamento fornece uma medida da resposta global dose-resposta de agentes antivirais ao longo do período de tratamento.
    4. No final do teste, clique em Pausar, em seguida pressione o Desbloquear Placa botão. Remova a placa do suporte e eletronicamente Liberação ele/ela via o Placa menu.

3. Orientações de segurança para o manuseio de vírus infecciosos

  1. Use EPI adequado com dupla luva, protetor facial e jaleco de laboratório. Isso é fortemente recomendado ao manipular vírus.
  2. Manipule materiais contendo vírus e adicione às placas exclusivamente dentro de uma CAB em funcionamento.
  3. Transporte os frascos de vírus e quaisquer placas contendo vírus para dentro e para fora da CAB dentro de um recipiente de biossegurança fechado.
  4. Antes e depois de manipular materiais contendo vírus na CAB, pulverize completamente todas as superfícies internas com um desinfetante e deixe agir por 5 minutos para garantir a inativação viral completa. Limpe as superfícies e, em seguida, desinfete-as com etanol 70% para remover qualquer resíduo do desinfetante.
  5. Após a conclusão do ensaio de triagem antiviral baseado em impedância, remova todas as placas do equipamento e transporte-as em um recipiente de biossegurança fechado diretamente para uma CAB limpa.
  6. Prepare uma solução fresca de água sanitária a 20% e adicione em todos os poços das placas do ensaio. Deixe a água sanitária agir por 10 minutos antes de aspirar todos os poços e descartar as placas.
  7. Descontamine todas as placas do ensaio, pipetas serológicas, ponteiras, tubos e outros plásticos descartáveis que possam ter entrado em contato com o vírus usando água sanitária e descarte-os em sacos de resíduos biológicos designados.
  8. Pulverize plásticos não descartáveis, como suportes de tubos e pipetas, com um desinfetante e limpe-os com pano.

Resultados

Leitura em tempo real, sem marcação, de impedância revela EPC induzida por vírus e proteção antiviral
Conforme mostrado na Figura 2A, células hospedeiras HEK293A foram semeadas em uma placa de 96 poços com microeletrodos integrados, numa densidade de 6.000 células por poço13. Após uma incubação de 24 h, o adenovírus tipo 5 foi adicionado com uma MOI de 1, na presença ou ausência de compostos antivirais. As respostas celulares à infecção viral e ao tratamento antiviral foram monitoradas continuamente por meio de medições em tempo real e sem marcação da impedância. Na ausência do vírus, as células proliferaram continuamente ao longo do período de monitoramento de 80 h, atingindo confluência, conforme indicado pelo aumento constante da impedância seguido por um platô. A infecção pelo adenovírus permitiu inicialmente o crescimento celular por aproximadamente 20 h, após o que foi observada uma EPC acentuada, resultando em uma queda rápida do sinal de impedância até o valor basal por volta de 65 h pós-infecção. O tratamento com estavudina (50 µM) ou ribavirina (20 µM) teve impacto mínimo sobre a EPC induzida pelo vírus, com traçados de impedância semelhantes aos das células infectadas apenas com o vírus. O ganciclovir (50 µM) exibiu atividade antiviral moderada, evidenciada por uma recuperação parcial do Índice Celular Normalizado. Em contraste, o cidofovir (50 µM) e o brincidofovir (1 µM) atenuaram marcadamente a EPC, produzindo perfis de impedância comparáveis aos observados nas células controle negativas não infectadas. Notavelmente, nenhum dos compostos afetou significativamente o Índice Celular em comparação com os controles tratados com veículo nas concentrações testadas em estudos preliminares (dados não mostrados).

Em um ensaio de neutralização por anticorpos baseado em impedância, células Vero CCL-81 foram semeadas numa densidade de 18.000 células por poço em uma placa de 96 poços com microeletrodos integrados e cultivadas por 24 h antes da infecção. No dia do ensaio, anticorpos monoclonais foram pré-incubados com rVSV–LASV a uma MOI de 0,01 durante 1 h antes da adição às células. Foram observados perfis de neutralização distintos entre os anticorpos monoclonais testados (AcMs). Para clareza, Figura 2B apresenta resultados representativos de anticorpos que exibem atividade neutralizante potente, parcial ou nenhuma. Anticorpos não neutralizantes induziram CPE completa, com traçados de impedância sobrepostos aos dos controles com vírus apenas. Anticorpos com atividade neutralizante intermediária reduziram parcialmente a citotoxicidade induzida pelo vírus, resultando em CPE diminuída, mas detectável. Em contraste, anticorpos totalmente neutralizantes inibiram completamente a CPE, mantendo sinais de impedância comparáveis aos dos controles de células não infectadas. Em conjunto, esses perfis de impedância permitiram uma clara diferenciação entre anticorpos monoclonais não neutralizantes, parcialmente neutralizantes e totalmente neutralizantes.

Quantificação e caracterização da atividade antiviral
Após demonstrar a capacidade do ensaio RTCA baseado em impedância de identificar "acertos" a partir de uma biblioteca de fármacos e de anticorpos monoclonais (mAbs), o estudo buscou em seguida caracterizar a eficácia dos compostos e anticorpos líderes. O aumento progressivo da concentração do fármaco antiviral brincidofovir de 15,6 nM a 1.000 nM resulta em um aumento escalonado do sinal de impedância; quanto maior a concentração do fármaco, mais as células se comportam como o controle não infectado (Figura 3A). Além disso, o tratamento com brincidofovir isoladamente resultou em um aumento marginal do Índice de Células Normalizadas (NCI) apenas na concentração mais alta testada (1100 nM). No entanto, em concentrações abaixo de 1100 nM, o NCI diminuiu moderadamente, embora o efeito não fosse dependente da dose. Esse resultado indica que a recuperação do Índice de Células foi atribuível exclusivamente à atividade antiviral do fármaco, e não a qualquer aumento direto da proliferação ou adesão celular (Figura 3B). A representação da área sob a curva do Índice de Células Normalizadas (AUC) em função da concentração de brincidofovir fornece a curva dose-resposta, que apresenta um excelente ajuste (R2 de 0,99) e indica um IC50 de 265 nM (Figura 3C). No ensaio de neutralização por anticorpos, ao final do ensaio (aproximadamente 50 h após o tratamento), o software do sistema calculou automaticamente as porcentagens de neutralização em cada concentração de mAb, e os valores de IC50 foram posteriormente derivados. Como mostrado na Figura 3D, em contraste com o anticorpo controle negativo rANDV-5, os outros três mAbs, r37.2D, r25.1C e r12.1F, demonstraram alta potência antiviral, com valores de IC₅₀ de 4.315 ng/mL, 83 ng/mL e 232 ng/mL, respectivamente14,15.

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Figura 1: Ilustração esquemática do fluxo de trabalho para o ensaio de triagem antiviral baseado em impedância. Dia 0, Etapa 1: Células permissivas foram semeadas em microplacas, e o crescimento celular foi monitorado no suporte do instrumento localizado em um incubador a 37 °C com 5% de CO2 por aproximadamente 24 h. Dia 1, Etapa 2: O vírus foi preparado em uma MOI fixa e diluições seriadas de agentes antivirais. Para ensaios de neutralização por anticorpos, o vírus foi pré-incubado com anticorpos a 37 °C por 1 h antes de adicionar a mistura às células. Etapa 3: As misturas de vírus e agente antiviral foram adicionadas às células. Dia 1 e seguintes, Etapa 4: O efeito citopático induzido pelo vírus foi continuamente monitorado por meio de medições baseadas em impedância ao longo de vários dias. Etapa 5: Os dados foram analisados em tempo real ou após a conclusão do ensaio. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Monitoramento em tempo real da atividade antiviral utilizando medições de Índice Celular baseadas em impedância. (A) Triagem de fármacos antivirais avaliada por análise de impedância. Todos os compostos foram testados a 50 µM, exceto a ribavirina (20 µM) e a brincidofovir (1 µM), na presença do adenovírus tipo 5 com uma MOI de 1. Os dados são apresentados como média ± DP de três poços replicados. A figura é adaptada de Zhang et al.13. (B) Ensaio de neutralização por anticorpos monoclonais baseado em impedância. Perfis representativos do Índice Celular são mostrados para anticorpos monoclonais que exibem ausência de neutralização (CPE completo, vermelho), neutralização parcial (CPE parcial, laranja) ou neutralização potente (sem CPE detectável, preto). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Quantificação da atividade antiviral utilizando impedância. (A) Alterações dinâmicas do Índice Celular Normalizado em tempo real após tratamento com concentrações crescentes de brincidofovir em combinação com infecção pelo adenovírus tipo 5 em uma MOI de 1. (B) Alterações dinâmicas do Índice Celular Normalizado em tempo real após tratamento com concentrações crescentes de brincidofovir isoladamente. (C) A área sob as curvas de impedância foi representada como uma função do brincidofovir para gerar uma curva dose-resposta. (A) e (C) foram adaptadas de Zhang et al.13. (D) Curvas representativas de neutralização de rVSV–LASV Linhagem IV (Josiah) para os anticorpos monoclonais r37.2D, r25.1C, r12.1F e rANDV-5 incluído como controle negativo. Os anticorpos monoclonais 37.2D, 25.1C, 12.1F e ANDV-5 foram produzidos de forma recombinante com base na literatura existente (ver seção Resultados). Os dados apresentados são curvas representativas de dois experimentos independentes e são relatados como média ± DP de três poços replicados. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Como todos os ensaios baseados em células, o ensaio de triagem antiviral RTCA exige otimização para cada sistema vírus-célula. Como o ensaio detecta o ECP induzido pelo vírus por meio de alterações na impedância, ele depende de um modelo celular permissivo que suporte a replicação viral e o ECP mensurável. Vírus que não geram ECP detectável por impedância podem não ser adequados para esta abordagem; nesses casos, métodos alternativos, como o FRNT, podem ser utilizados quando estiverem disponíveis anticorpos específicos para o vírus. Outra consideração importante é que as alterações no Índice de Células não são causadas exclusivamente pela citólise induzida pelo vírus. Alterações na morfologia celular, adesão, proliferação e ligação também podem influenciar os sinais de impedância e potencialmente confundir a avaliação da atividade antiviral. Portanto, os efeitos dos agentes antivirais no Índice de Células devem ser avaliados em estudos preliminares ou por meio de controles apropriados com apenas o agente. No presente estudo, para maximizar o número de agentes avaliados por placa, os controles com apenas o agente antiviral foram testados antes do ensaio de triagem, a fim de estabelecer os efeitos basais de cada candidato na ausência de infecção viral. O desempenho do ensaio também é influenciado por fatores como densidade de semeadura celular, momento da inoculação do vírus e condições do meio, os quais podem afetar o crescimento celular, replicação viral, desenvolvimento do ECP e reprodutibilidade do ensaio7,10,16. Consequentemente, a otimização sistemática é essencial para uma triagem antiviral robusta e confiável baseada em RTCA.

Após o estabelecimento das condições ideais do ensaio, a implementação bem-sucedida de ensaios antivirais em tempo real baseados em impedância exige semeadura celular consistente, células saudáveis e condições estáveis do ensaio. A alta variabilidade entre poços é frequentemente causada por distribuição desigual das células ou pipetagem imprecisa; portanto, as suspensões celulares devem ser misturadas completamente antes da semeadura, e as placas devem permanecer em temperatura ambiente (RT) por 30 minutos após a semeadura para promover a deposição uniforme das células e reduzir os efeitos de borda. Recomenda-se um mínimo de três réplicas por tratamento, sendo fortemente incentivadas réplicas adicionais para os controles negativo (não infectado) e positivo (apenas vírus), pois esses valores servem como pontos de referência para os cálculos de %ECP e %Neutralização em todas as condições de tratamento. Se a ECP induzida pelo vírus for fraca ou inconsistente, verifique a qualidade do estoque viral e a saúde da linhagem celular permissiva. Para manter a infectividade viral, evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, preparando alíquotas de vírus de uso único para cada experimento. Por fim, recomenda-se fortemente o uso de um banco celular contendo células permissivas em um número de passagem constante para minimizar a variabilidade experimental e melhorar a reprodutibilidade do ensaio. Se o Índice de Células medido imediatamente antes da infecção (geralmente cerca de 24 h após a semeadura) estiver abaixo do valor de referência estabelecido para a linhagem celular permissiva, indicando saúde ou crescimento celular subótimos, o experimento deve ser interrompido. Nesses casos, um novo frasco de células criopreservadas deve ser descongelado e o ensaio de triagem antiviral deve ser repetido.

Quando o ensaio de triagem antiviral é realizado sob condições bem controladas e otimizadas, como demonstrado pelos dados de triagem apresentados aqui, o ensaio baseado em impedância pode quantificar com precisão a redução em tempo real do EPC por agentes antivirais. Em contraste com abordagens tradicionais que dependem de medições terminais demoradas, a leitura contínua e não invasiva da impedância permite o monitoramento longitudinal de todo o espectro de danos celulares induzidos pelo vírus e dos perfis cinéticos das respostas antivirais. Essa capacidade de medição em tempo real facilita a identificação de janelas temporais ideais para detectar não apenas efeitos antivirais precoces, mas também efeitos retardados que podem passar despercebidos em ensaios terminais convencionais.

Além disso, o protocolo RTCA descrito aqui oferece um fluxo de trabalho mais rápido e substancialmente simplificado para triagem antiviral em comparação com métodos tradicionais. O ensaio requer apenas uma etapa inicial de semeadura celular, seguida pela adição do vírus na presença ou ausência de agentes antivirais. Nenhuma manipulação adicional ou processamento pós-ensaio é necessário. A configuração experimental e a análise de dados são ainda mais otimizadas pelo módulo de software personalizado de virologia do sistema, que permite o cálculo automatizado de parâmetros comumente utilizados no VRNT, incluindo %ECP, %neutralização e a maior diluição ou menor concentração de um agente antiviral que atinge um nível de neutralização definido pelo usuário. Em conjunto, essas vantagens permitem a triagem rápida e paralela de muito mais condições experimentais (comparações de fármacos, diluições estendidas, etc.) do que é tipicamente possível com métodos tradicionais.

Embora o ensaio descrito aqui tenha sido desenvolvido no formato de placa de 96 poços, com as condições de ensaio apropriadas descritas acima, ele pode ser adaptado para o formato de placa de 384 poços. Para suportar esse ensaio baseado em impedância com maior produtividade, pode-se empregar um sistema automatizado de RTCA baseado em impedância, que permite o processamento simultâneo de até quatro placas de 384 poços.

Além da triagem antiviral, este método RTCA pode ser aplicado a estudos de terapia combinada, sorologia e investigações de escape imunológico viral. Ao medir a capacidade de anticorpos terapêuticos ou soros imunes de prevenir a CPE induzida pelo vírus, o ensaio fornece uma avaliação em tempo real e sem marcadores da atividade neutralizante e das respostas imunes protetoras após infecção ou vacinação. Além disso, a comparação dos perfis de neutralização entre variantes virais pode revelar alterações na suscetibilidade associadas ao escape imunológico. Quando combinado com o sequenciamento genômico, esta abordagem pode facilitar a identificação de variantes resistentes a anticorpos e apoiar o desenvolvimento de vacinas de nova geração, terapias com anticorpos e estratégias antivirais.

Divulgações

J.E.C. atuou como consultor da Moderna e da Merck, é fundador da IDBiologics e recebe royalties da UpToDate. O laboratório de J.E.C. recebeu acordos de pesquisa patrocinada não relacionados da IDBiologics durante a realização do estudo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte por concessões U19 AI181979 e U19AI181930 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Adenovírus-GFPVector Biolabs 1060
Brincidofovir (CMX001)AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024desinfetante 
CidofovirSelleck S1516
Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)ATCC30-2002
Placa E-Plate 96Agilent5232368001placa de 96 poços com microeletrodos integrados
Soro bovino fetalAvantor97068-085
Ganciclovir Sódico Selleck S5065
Célula HEK293AThermo Fisher Scientific  R70507
Viaflo multicanalINTEGRAVIAFLO 96
Solução de Penicilina-EstreptomicinaGibco10378016
Solução tampão de fosfato (1x)HyCloneSH30256.01
mAbs recombinantesCrowe LabN/A
RibavirinaSelleck S2504
rVSV-LASV (Lin IV)Crowe LabN/A
Estavudina Selleck S1398
Tripsina 0,25% 0,53 mM EDTA  (1x)ATCC30-2101
Reservatórios reagentes de 12 canaisVistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
Módulo de VirologiaAgilentS2807-90089
Sistema xCELLigence RTCA MPAgilent380601040

Referências

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