Este estudo sugere que o dimetilsulfóxido (DMSO) pode atenuar a inflamação pulmonar e a fibrose induzidas pela sílica em camundongos. Análises transcriptômicas e experimentais indicam que seus efeitos protetores podem envolver a supressão da via de sinalização IL-6/STAT3 e a downregulação da expressão de MMP12, fornecendo insights terapêuticos potenciais para o tratamento da silicose.
Relatório rápido
Envolvimento Potencial do Eixo de Sinalização IL-6/STAT3/MMP12 nos Efeitos Antifibróticos Mediados por DMSO na Silicose Experimental
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este estudo tem como objetivo investigar os efeitos anti-inflamatórios e anti-fibróticos do dimetilsulfóxido (DMSO) em um modelo murino de silicose, explorando assim seu potencial valor terapêutico.
Um modelo murino de silicose foi estabelecido por instilação intranasal, e o tratamento com DMSO foi administrado por injeção intraperitoneal. O experimento foi conduzido ao longo de um período de 1 mês. Tecidos pulmonares foram coletados de todos os camundongos; um subconjunto foi submetido à análise transcriptômica, e genes diferencialmente expressos foram identificados utilizando o pacote limma. Análises de enriquecimento de ontologia genética (GO) e do banco de dados Kyoto de genes e genomas (KEGG) foram realizadas utilizando o ClusterProfiler para investigar funções gênicas e vias associadas. As amostras restantes foram submetidas à avaliação histopatológica por coloração com hematoxilina e eosina (HE) e coloração com tricrômio de Masson, enquanto a análise por Western blot foi realizada para validar os resultados transcriptômicos.
Este estudo sugere que o DMSO pode atenuar o processo fibrotico na silicose por meio da modulação do eixo de sinalização IL-6/STAT3-MMP12. No modelo murino de silicose induzida por sílica, o DMSO atenuou a perda de peso associada à doença e reduziu o depósito de colágeno. A análise transcriptômica indicou que o DMSO suprimiu a atividade de múltiplas vias relacionadas à fibrose e identificou 51 genes-chave, incluindo o MMP12, que foi significativamente subregulado. A análise por Western blot confirmou ainda a redução da expressão de MMP12, acompanhada por níveis acentuadamente diminuídos de IL-6 e p-STAT3, sugerindo que a via IL-6/STAT3 pode desempenhar um papel crucial na regulação da expressão de MMP12.
O DMSO pode atenuar respostas inflamatórias e fibrose pulmonar na silicose ao inibir a ativação da via de sinalização IL-6/STAT3, reduzindo assim a expressão de MMP12.
Introdução
A silicose é uma das principais formas de pneumoconiose ocupacional¹, caracterizada por inflamação pulmonar persistente e fibrose pulmonar irreversível resultantes da exposição prolongada ao pó de sílica2,3. A patogênese dessa silicose é altamente complexa. Embora estudos anteriores tenham demonstrado que a ativação anômala de macrófagos4, a proliferação excessiva de fibroblastos, a transição epitelial-mesenquimal e o depósito anormal de componentes da matriz extracelular (ECM) são fatores críticos no desenvolvimento da fibrose5,6Os mecanismos moleculares centrais que sustentam o ciclo vicioso inflamatório-fibrótico permanecem incompletamente compreendidos. Notavelmente, a família das metaloproteinases da matriz (MMP) desempenha um papel crucial na remodelação da matriz extracelular (ECM) e na progressão da fibrose patológica.7. Dentre estas, a metaloproteinase da matriz 12 (MMP12), que é especificamente secretada por macrófagos, degrada componentes-chave da matriz extracelular, como elastina, fibronectina e colágeno do tipo IV, e desempenha um papel importante na patogênese de doenças fibroticas, incluindo a doença pulmonar obstrutiva crônica8Estudos recentes sugerem ainda que a MMP12 derivada de macrófagos pode promover ainda mais a fibrose ao danificar as células endoteliais durante o processo de fibrose pulmonar.9.
O dimetilsulfóxido (DMSO), um composto de baixo peso molecular com diversas atividades biológicas10, demonstrou efeitos anti-inflamatórios em diversas doenças inflamatórias, incluindo cistite, e foi aprovado pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos para o tratamento da cistite intersticial11. Estudos recentes sugerem que o DMSO pode retardar em certa medida a progressão da fibrose ao inibir a liberação de fatores inflamatórios e reduzir as respostas ao estresse oxidativo12. Pesquisas conduzidas por Ingrid Elisia et al. relataram que o DMSO inibe especificamente a ativação das vias de sinalização ERK1/2, p38 MAPK, JNK e PI3K/Akt em monócitos humanos em modelos de sangue total, exercendo assim seus efeitos anti-inflamatórios13.
Embora tenha sido demonstrado que a família de MMPs desempenha um papel crítico no processo de fibrose da silicose, nenhum estudo demonstrou conclusivamente se o DMSO pode afetar a progressão patológica da silicose por meio da regulação da expressão de MMPs. Portanto, este estudo representa a investigação dos efeitos anti-inflamatórios e anti-fibróticos do DMSO em um modelo murino de silicose, com o objetivo de revelar a rede gênica reguladora chave e o mecanismo molecular da intervenção com DMSO e fornecer apoio teórico para estratégias inovadoras de tratamento baseadas em MMPs.
Protocolo
Todos os experimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Ciência e Tecnologia da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui (Número de Aprovação GZ2025-048) e seguiram rigorosamente as normas nacionais chinesas de bem-estar animal em laboratório (GB/T 35892-2018). Figura 1 mostra o desenho do estudo.
Preparação das soluções
Preparação da suspensão de sílica:
A sílica cristalina (SiO₂, 80%, tamanho das partículas 1–5 µm) foi esterilizada por autoclavagem. O pó de sílica estéril foi então disperso em soro fisiológico estéril para obter uma concentração final de 10 mg/mL, e a suspensão foi completamente homogeneizada usando um homogeneizador ultrassônico imediatamente antes da administração, para garantir uma suspensão uniforme de partículas.
Preparação da solução de DMSO:
Em condições assépticas, o DMSO (≥99,9%) foi diluído com solução salina estéril para preparar uma solução de DMSO aproximadamente 10% (v/v), a qual foi homogeneizada por agitação ultrassônica. Cada camundongo recebeu a solução de DMSO em uma dose de 0,9 g/kg, conforme descrito anteriormente14,15.
Animais experimentais
Trinta e dois camundongos machos saudáveis da linhagem C57BL/6J, com idade entre 8 e 12 semanas, foram utilizados neste estudo e aclimatados por 1 semana antes dos experimentos. Os animais foram aleatorizados em quatro grupos experimentais (n = 8 por grupo) utilizando um método de randomização gerado por computador: grupos controle, DMSO, sílica e sílica+DMSO. O tamanho da amostra foi determinado com base em estudos prévios que utilizaram o mesmo modelo murino de silicose e em nossa experiência experimental preliminar, a qual indicou que 8 animais por grupo eram suficientes para detectar diferenças histopatológicas e moleculares entre os grupos. Os animais foram mantidos em condições laboratoriais padrão, com temperatura controlada, ciclo claro/escuro de 12 h e livre acesso a alimento e água. Pontos finais éticos foram estabelecidos antes do início do estudo, e nenhum animal atendeu aos critérios predeterminados para eutanásia precoce.
Estabelecimento do modelo de silicose e intervenção farmacológica
A silicose foi induzida por uma única instilação intranasal de 60 µL de suspensão estéril de sílica cristalina (10 mg/mL). Após a indução da anestesia, os camundongos foram posicionados em decúbito dorsal. Assim que foi observada respiração profunda e lenta, 60 µL da suspensão de sílica foram cuidadosamente instilados gota a gota nas narinas, permitindo que a suspensão fosse inalada espontaneamente para os pulmões16. Os camundongos do grupo que recebeu DMSO foram tratados com injeções intraperitoneais de solução de DMSO em dose fixa duas vezes por semana, com intervalo de 3–4 dias entre as injeções, durante um mês consecutivo. Os camundongos dos demais grupos foram tratados de maneira idêntica com volume igual de solução salina estéril. O monitoramento diário do peso corporal foi realizado durante todo o experimento. No 30º dia após a modelagem, todos os camundongos foram eutanasiados e os tecidos pulmonares foram coletados em condições estéreis. A eutanásia foi realizada por dislocação cervical após administração intraperitoneal de tribromoetanol (0,2 mL/10 g) para induzir anestesia. Parte dos tecidos pulmonares foi preservada em nitrogênio líquido para sequenciamento do transcriptoma. Uma porção dos tecidos foi fixada em paraformaldeído a 4% durante 48 h antes da coloração histopatológica, e os tecidos remanescentes foram armazenados a -80 °C para experimentos moleculares subsequentes. Todos os procedimentos com animais seguiram as diretrizes éticas institucionais para o uso de animais.
A avaliação histopatológica, incluindo o escore de fibrose de Ashcroft, foi realizada independentemente por dois pesquisadores cegos quanto à alocação aos grupos experimentais.
Exame patológico pulmonar
Os tecidos pulmonares fixados foram desidratados, transparentizados e emblocados em parafina, depois cortados em seções com espessura de 5 µm.
coloração com hematoxilina e eosina (HE): os cortes foram corados com hematoxilina por 3–5 min, diferenciados em solução ácida, realçados em água corrente e contra-colorados com eosina por 5 min. Após desidratação em etanol de concentração crescente, os cortes foram clareados em xilol e montados com resina neutra17.
Coloração com tricrômio de Masson: as seções foram coradas sequencialmente com hematoxilina, vermelho de Lichun–fucsina ácida, ácido fosfomolíbdico e verde brilhante. Após diferenciação ácida, as seções foram desidratadas, clareadas em xilol e montadas com resina neutra18,19.
Sequenciamento do transcriptoma
Os tecidos pulmonares de camundongos dos quatro grupos experimentais foram coletados imediatamente após o sacrifício e congelados rapidamente em nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído utilizando o reagente TRIzol, conforme as instruções do fabricante. A concentração e a pureza do RNA foram avaliadas, e a integridade do RNA foi verificada usando um Bioanalyzer com software embutido. Amostras com valores de RIN superiores a 8,0 foram consideradas aceitáveis. A preparação da biblioteca incluiu enriquecimento de mRNA poli(A) utilizando beads de Oligo(dT), fragmentação do RNA, síntese de cDNA, ligação de adaptadores e amplificação por PCR. O sequenciamento foi realizado em uma plataforma Illumina, gerando aproximadamente 6,2–6,4 Gb de dados limpos por amostra. Todos os dados brutos de sequenciamento gerados neste estudo foram depositados no banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) sob o número de acesso GSE311671.
As leituras limpas foram alinhadas ao genoma de referência de Mus musculus (mm8) utilizando o alinhador STAR. Os níveis de expressão gênica foram quantificados como contagens brutas de leituras. A análise de expressão diferencial foi realizada utilizando o pacote limma no R. Antes da modelagem linear, os dados brutos de contagem foram transformados utilizando a função voom para estimar a relação média-variância e gerar pesos de precisão. Os valores P brutos foram ajustados para testes múltiplos utilizando o método de Benjamini-Hochberg (BH), e os genes com |log₂Razão de Expressão| > 1,5 e taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,05 foram considerados diferencialmente expressos. Análises de enriquecimento funcional foram realizadas utilizando o pacote clusterProfiler no R. A análise de enriquecimento de ontologia genética (GO) foi conduzida para identificar categorias significativamente enriquecidas de processo biológico (BP), componente celular (CC) e função molecular (MF), enquanto a análise de enriquecimento de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foi realizada para identificar vias de sinalização significativamente enriquecidas. A significância de enriquecimento foi avaliada utilizando um teste hipergeométrico, e os valores P foram ajustados para comparações múltiplas utilizando o método de Benjamini-Hochberg. Termos GO e vias KEGG com valor P ajustado (padj) < 0,05 foram considerados significativamente enriquecidos20,21,22,23.
Detecção por Western blot
O tecido pulmonar fresco de camundongo foi coletado e homogeneizado com um volume apropriado de tampão de lise RIPA (ensaio de radioimunoprecipitação). Após a centrifugação, o sobrenadante foi coletado e a concentração proteica foi determinada utilizando o kit de ensaio de proteína BCA. As amostras foram então misturadas com tampão de carga e aquecidas a 100 °C por 10 min. A separação proteica foi realizada em géis de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE) com uma corrente de 200 V por 30 min. Posteriormente, as proteínas foram eletrotransferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com corrente constante de 300 mA por 30 min. A membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5%, em seguida incubada durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra β-Actina (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) e MMP12 (1:800). No dia seguinte, a membrana foi lavada com TBST e incubada com anticorpo secundário à temperatura ambiente por 1 h, seguido de lavagens adicionais com TBST. As bandas proteicas foram visualizadas utilizando um substrato quimioluminescente, e a quantificação proteica foi realizada utilizando o software ImageJ.
A análise por Western blot foi realizada utilizando três réplicas biológicas independentes de cada grupo experimental. As amostras proteicas foram preparadas a partir de tecidos pulmonares individuais de camundongos, e cada réplica biológica representou um animal independente.
Análise estatística
Todos os dados experimentais foram analisados utilizando o GraphPad Prism 9.5. Testes de normalidade e de homogeneidade de variância foram realizados previamente. O teste t de Student foi usado para comparação entre dois grupos, e a ANOVA unidirecional combinada ao teste post hoc de Tukey foi adotada para comparação entre múltiplos grupos. Um valor de P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
O DMSO alivia a fibrose pulmonar induzida por sílica em camundongos (Figura 2)
Para avaliar os efeitos do DMSO em processos patológicos e alterações no tecido pulmonar em um modelo de silicose, quatro grupos experimentais foram estabelecidos (Figura 2A). As alterações no peso corporal foram monitoradas durante um período de 1 mês.
Os resultados demonstraram que os camundongos no grupo Silicose exibiram uma diminuição contínua do peso corporal, enquanto o grupo Sílica+DMSO apresentou uma perda inicial de peso seguida por recuperação após a intervenção com DMSO (Figura 2F). Após 30 dias de exposição à sílica, os tecidos pulmonares foram coletados e avaliados quanto às alterações inflamatórias e fibroticas por meio da coloração com HE (Figura 2B) e da coloração de Masson (Figura 2C). A fibrose pulmonar foi pontuada em cortes corados com HE utilizando o método de Ashcroft24, revelando um escore de fibrose menor no grupo Sílica+DMSO em comparação com o grupo Sílica (Figura 2D). A coloração de Masson indicou ainda que a deposição de fibras colágenas no grupo Sílica foi extensa e densa, ocupando aproximadamente 40% da área do tecido pulmonar, valor superior aos 10% observados no grupo controle (Figura 2E), sugerindo que a exposição à sílica induziu fibrose pulmonar grave. Em contraste, a deposição de colágeno no grupo Sílica+DMSO foi reduzida para 20%, indicando que o DMSO pode atenuar a fibrose pulmonar induzida pela sílica ao inibir o acúmulo excessivo de colágeno.
A análise do transcriptoma identifica genes diferencialmente expressos associados ao tratamento com DMSO em camundongos expostos à sílica
Para investigar os efeitos anti-inflamatórios e anti-fibróticos do dimetilsulfóxido (DMSO) em um modelo de silicose, foi realizada sequenciamento transcriptômico em amostras de tecido pulmonar coletadas de camundongos experimentais (Figura 3). Os genes diferencialmente expressos (GDEs) foram identificados utilizando o algoritmo limma, com critérios de seleção definidos como |log2(mudança de razão)| > 1,5 e valor P corrigido (taxa de falsa descoberta [FDR]) < 0,05.
A análise do transcriptoma demonstrou que, em comparação com o grupo controle, o grupo Silica exibiu 132 genes diferencialmente expressos de forma significativa (Figura 3A), incluindo 117 que foram superexpressos e 15 que foram subexpressos. Notavelmente, genes como Saa3 e MMP12 foram acentuadamente superexpressos. Esse padrão de expressão foi ainda confirmado pela análise do mapa de calor de agrupamento hierárquico (Figura 3C), que demonstrou perfis consistentes de expressão gênica entre as amostras individuais.
Na comparação entre os grupos Silica+DMSO e Silica, um total de 3.054 genes diferencialmente expressos de forma significativa foi identificado (Figura 3B), compreendendo 1.399 genes regulados para cima e 1.655 genes regulados para baixo. O mapa térmico correspondente (Figura 3D) revelou alterações transcritômicas substanciais após o tratamento com DMSO, com acentuada regulação negativa de genes como Lcn2 e MMP12. Especificamente, genes-chave que foram regulados para cima no grupo Silica, tais como MMP12, Saa3 e Spp1, apresentaram regulação negativa acentuada no grupo Silica+DMSO. Esses achados sugerem que o DMSO pode atenuar a patologia relacionada à silicose por meio da supressão da expressão de mediadores pró-inflamatórios e pró-fibróticos.
O eixo de sinalização IL-6/STAT3/MMP12 pode estar envolvido nos efeitos protetores do DMSO na fibrose pulmonar induzida por sílica
Para investigar as relações entre genes diferencialmente expressos (DEGs), uma rede de interação gênica foi construída com base nos dados transcriptômicos (Figura 4A). MMP12 parece ocupar uma posição central dentro da rede. Para examinar mais detalhadamente as possíveis associações ao nível proteico, foi gerada uma rede predita de interação proteína-proteína (PPI) utilizando a base de dados STRING (Figura 4B). A análise STRING sugeriu associações funcionais potenciais entre MMP12 e vários DEGs-chave, incluindo IL-6, STAT3, SPP1 e MMP19. Como o STRING integra evidências de diferentes fontes, essas associações correspondem a relações funcionais preditas.
A análise por Western blot foi realizada para quantificar os níveis de expressão proteica de IL-6, STAT3, p-STAT3 e MMP12 (Figura 4C–F). Os resultados mostraram que, em comparação com o grupo Controle, os níveis de expressão proteica de IL-6 e p-STAT3 estavam significativamente elevados no grupo Sílica, e a expressão proteica de MMP12 também apresentou uma tendência ao aumento. Após o tratamento com DMSO, os níveis de expressão dessas três proteínas foram significativamente reduzidos. Notavelmente, a expressão proteica total de STAT3 manteve-se relativamente constante em todos os grupos experimentais.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Todos os dados brutos de sequenciamento gerados neste estudo foram depositados no banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) sob o número de acesso GSE311671. As imagens brutas do estudo estão disponíveis em uma pasta suplementar (Arquivo Suplementar 1).
Figura 1: Esquema do desenho do estudo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: O DMSO atenua a fibrose pulmonar em camundongos com silicose. (A) Diagrama esquemático do delineamento experimental. Setas de cores diferentes representam diferentes regimes de administração. (B) Coloração com hematoxilina e eosina do tecido pulmonar. Em uma ampliação de 200×, a barra de escala corresponde a 50 µm; em uma ampliação de 400×, a barra de escala corresponde a 20 µm. (C) Coloração de Masson do tecido pulmonar (azul: fibras colágenas; vermelho: fibras musculares). Em uma ampliação de 200×, a barra de escala corresponde a 50 µm; em uma ampliação de 400×, a barra de escala corresponde a 20 µm. (D) Pontuações de fibrose dos diferentes grupos com base nos resultados da coloração HE. n = 8, P ≤ 0.0001. (E) Área relativa de colágeno na coloração de Masson no tecido pulmonar dos diferentes grupos. n = 8, P ≤ 0.0001. (F) Alterações no peso corporal dos camundongos ao longo de 30 dias. Os dados são apresentados como média ±± erro padrão da média (SEM). A comparação de múltiplos conjuntos de dados foi realizada por meio de análise de variância unidirecional (ANOVA), e os testes pós-hoc foram realizados utilizando o método de Tukey. n = 8, P(tempo) ≤ 0.0001, P(grupo) ≤ 0.0001. N: grupo controle; S: grupo sílica; SD: grupo sílica + DMSO; D: grupo DMSO. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: O sequenciamento do transcriptoma revela a regulação gênica pelo DMSO no alívio da silicose. (A,B) Gráfico de vulcão dos genes diferencialmente expressos entre o grupo Sílica (S) e o grupo Controle (N), e entre o grupo Sílica + DMSO (SD) e o grupo Sílica (S). (C,D) Mapa de calor comparando o grupo Sílica (S) com o grupo Controle (N), e o grupo Sílica + DMSO (SD) com o grupo Sílica (S). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: O DMSO reduz a expressão proteica de IL-6 e STAT3. (A) Diagrama da rede de genes expressos diferencialmente de forma significativa. (B) Diagrama de interação da rede STRING de MMP12 e genes relacionados. (C–F) Análise por Western blot da expressão proteica de β-Actina, IL-6, MMP12, STAT3 e p-STAT3. Análise de valores de cinza da β-Actina, IL-6 (*P = 0.0257, *P = 0.0195), MMP12 (**P = 0.0013, *P = 0.0318), STAT3 (P = 0.3205, P = 0.2347) e p-STAT3 (*P = 0.0123, **P = 0.0096) por meio de Western blot. A análise por imunoblot foi realizada em triplicata (n = 3). N: grupo controle; S: grupo sílica; SD: grupo sílica + DMSO; D: grupo DMSO. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: Dados brutos deste estudo.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
A silicose permanece uma das doenças pulmonares ocupacionais mais graves em todo o mundo, caracterizada por inflamação persistente e fibrose pulmonar progressiva, que comprometem significativamente a função pulmonar e a qualidade de vida do paciente25. Neste estudo, utilizando um modelo murino induzido por sílica, examinamos sistematicamente os possíveis efeitos protetores do dimetilsulfóxido (DMSO) durante a fase inicial. Os resultados aqui apresentados sugerem que o tratamento com DMSO atenua a infiltração de células inflamatórias e reduz as alterações patológicas fibroticas, indicando que o DMSO pode exercer um papel modulador nas fases iniciais da silicose. Estudos experimentais anteriores demonstraram que o DMSO exerce efeitos protetores contra a fibrose pulmonar em ratos e camundongos. Haschek et al. relataram que o DMSO atenuou as alterações fibroticas pulmonares em modelos animais experimentais, embora os mecanismos moleculares subjacentes permaneçam pouco claros26. Em consonância com esses achados, nossas análises transcriptômicas e de expressão proteica sugerem ainda que o DMSO pode aliviar a fibrose pulmonar induzida por sílica por meio da modulação de vias de sinalização inflamatória, fornecendo assim uma compreensão mecanicista adicional sobre sua possível atividade anti-fibrotica.
O DMSO, um solvente polar aprótico com alta permeabilidade tecidual27, possui propriedades anti-inflamatórias e analgésicas bem documentadas e tem sido aplicado em diversos distúrbios relacionados à inflamação, incluindo cistite intersticial, artrite reumatoide e osteoartrite28,29,30. Além disso, estudos anteriores demonstraram que o DMSO atenua a fibrose pulmonar e lesões pulmonares em modelos animais experimentais, sugerindo que possui efeitos protetores contra doenças pulmonares fibróticas, possivelmente por meio de suas propriedades anti-inflamatórias e de eliminação de radicais livres26. Em nível molecular, relatos indicam que o DMSO suprime as vias de sinalização NF-κB e MAPK, levando à redução da expressão de IL-6 em macrófagos RAW264.7 estimulados por LPS31. Notavelmente, doses elevadas de DMSO podem causar toxicidade sistêmica, com danos multissistêmicos relatados em doses superiores a 8 g/kg14; portanto, adotou-se um protocolo de administração repetida em baixa dose para avaliar os efeitos terapêuticos e a toxicidade.
Ao integrar análises transcriptômicas e histopatológicas, observamos que o tratamento com DMSO atenuou a inflamação pulmonar e a fibrose em camundongos expostos à sílica, acompanhado pela subexpressão da expressão de IL-6. O perfil transcriptômico indicou ainda uma redução na expressão de MMP12 após o tratamento com DMSO. MMP12, predominantemente secretada por macrófagos32, tem sido implicada na progressão fibrótica da silicose, DPOC e lesão pulmonar induzida por bleomicina, por meio da regulação de vias pró-fibróticas incluindo TGF-β1, EGR1 e CYR6133,34,35. No presente estudo, a subexpressão observada de MMP12 sugere seu envolvimento potencial nos efeitos anti-inflamatórios e anti-fibróticos associados ao tratamento com DMSO. Importante ressaltar que MMP12 facilita a degradação de depósitos excessivos de matriz extracelular durante a resolução da fibrose, promovendo assim o remodelamento tecidual e a eliminação de cicatrizes36.
Os macrófagos são principais responsáveis pela produção de citocinas pró-inflamatórias na silicose induzida por sílica37. Macrófagos ativados secretam IL-6 e TNF-α, que contribuem para a inflamação e fibrose38. A IL-6 ativa o complexo receptor gp130 para estimular a via JAK–STAT, particularmente a STAT3, influenciando assim o fenótipo dos macrófagos e promovendo processos pró-fibróticos39,40,41,42. Neste estudo, o tratamento com DMSO reduziu significativamente os níveis de expressão de IL-6, STAT3 e MMP12, indicando que o DMSO pode modular o eixo IL-6/STAT3 e, indiretamente, reprimir a MMP12. Estudos anteriores demonstraram que o eixo IL-6–STAT3 desempenha um papel regulador fundamental em diversos modelos de fibrose pulmonar, e sua ativação sustentada está fortemente associada à gravidade da fibrose e à progressão da doença43,44. A STAT3 tem sido proposta como um importante centro de sinalização que conecta respostas inflamatórias ao remodelamento fibrótico, e sua ativação pode regular a MMP12, aumentando assim sua atividade transcricional45. Além disso, a sinalização por STAT3 está envolvida na polarização de macrófagos, induzindo a transição dos macrófagos do fenótipo pró-inflamatório M1 para o fenótipo pró-fibrótico M246,47, enquanto os macrófagos M2 representam uma das principais fontes celulares de MMP1248. Portanto, a redução concomitante da expressão de STAT3 e MMP12 observada no presente estudo sugere que o DMSO pode diminuir a expressão de MMP12, pelo menos em parte, por meio da modulação da sinalização por STAT3. Entretanto, deve-se observar que o presente estudo foi principalmente concebido para identificar possíveis mecanismos moleculares com base em perfis transcriptômicos combinados com validação in vivo. Embora as alterações coordenadas em IL-6, STAT3 e MMP12 apoiem a participação do eixo de sinalização IL-6/STAT3/MMP12 nos efeitos anti-fibróticos do DMSO, as evidências atuais não estabelecem uma relação causal direta entre a ativação de STAT3 e a regulação de MMP12. Assim, são necessários estudos mecanicistas adicionais para esclarecer melhor as interações regulatórias diretas dentro dessa via de sinalização.
Este estudo apresenta várias limitações. Primeiro, as conclusões deste estudo baseiam-se em perfis transcriptômicos combinados com análises histopatológicas e de expressão proteica em um modelo murino de silicose. Embora esses achados sustentem o envolvimento do eixo de sinalização IL-6/STAT3/MMP12, eles não estabelecem uma relação causal direta entre a ativação de STAT3 e a regulação de MMP12. Segundo, a validação mecanicista, incluindo estudos in vitro baseados em macrófagos e experimentos de resgate por meio de manipulação genética ou farmacológica da via IL-6/STAT3 e de MMP12, não foi realizada. Além disso, nenhum controle anti-fibrótico positivo foi incluído, limitando a comparação direta do DMSO com terapias estabelecidas. Estudos futuros que incorporem validação mecanicista e fármacos anti-fibróticos clinicamente relevantes, como pirfenidona ou nintedanibe, esclarecerão ainda mais o mecanismo molecular e o potencial terapêutico do DMSO na silicose.
Em conclusão, os achados sugerem que o DMSO atenua a inflamação e a fibrose mediadas por macrófagos na silicose induzida por sílica, possivelmente por meio da modulação do eixo de sinalização IL-6/STAT3/MMP12. Esses achados fornecem evidências preliminares que apoiam o envolvimento potencial do eixo de sinalização IL-6/STAT3/MMP12 nos efeitos anti-fibróticos do DMSO e destacam a MMP12 como um alvo molecular potencial para investigações futuras.
Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Os autores agradecem sinceramente à plataforma da Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. e aos professores Deyong Ge e Lei Xu pelo apoio técnico.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| SDS-PAGE a 10% | Servicebio | G2177 | |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Servicebio | G2026 | |
| Camundongos C57BL/6J | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | No: SCXY(Su)2011-0003 | |
| Sílica cristalina | Sigma Aldrich | No.S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| Tampão de carregamento | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| Tampão de lise RIPA | Servicebio | G2002 | |
| Anticorpo secundário | Servicebio | GB23303 | |
| Leite desnatado | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-Actina | Servicebio | GB11001 |
Referências
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