Envolvimento Potencial do Eixo de Sinalização IL-6/STAT3/MMP12 nos Efeitos Antifibróticos Mediados por DMSO na Silicose Experimental

Resumo

Este estudo sugere que o dimetilsulfóxido (DMSO) pode atenuar a inflamação pulmonar e a fibrose induzidas pela sílica em camundongos. Análises transcriptômicas e experimentais indicam que seus efeitos protetores podem envolver a supressão da via de sinalização IL-6/STAT3 e a downregulação da expressão de MMP12, fornecendo insights terapêuticos potenciais para o tratamento da silicose.

Resumo

Este estudo tem como objetivo investigar os efeitos anti-inflamatórios e anti-fibróticos do dimetilsulfóxido (DMSO) em um modelo murino de silicose, explorando assim seu potencial valor terapêutico.

Um modelo murino de silicose foi estabelecido por instilação intranasal, e o tratamento com DMSO foi administrado por injeção intraperitoneal. O experimento foi conduzido ao longo de um período de 1 mês. Tecidos pulmonares foram coletados de todos os camundongos; um subconjunto foi submetido à análise transcriptômica, e genes diferencialmente expressos foram identificados utilizando o pacote limma. Análises de enriquecimento de ontologia genética (GO) e do banco de dados Kyoto de genes e genomas (KEGG) foram realizadas utilizando o ClusterProfiler para investigar funções gênicas e vias associadas. As amostras restantes foram submetidas à avaliação histopatológica por coloração com hematoxilina e eosina (HE) e coloração com tricrômio de Masson, enquanto a análise por Western blot foi realizada para validar os resultados transcriptômicos.

Este estudo sugere que o DMSO pode atenuar o processo fibrotico na silicose por meio da modulação do eixo de sinalização IL-6/STAT3-MMP12. No modelo murino de silicose induzida por sílica, o DMSO atenuou a perda de peso associada à doença e reduziu o depósito de colágeno. A análise transcriptômica indicou que o DMSO suprimiu a atividade de múltiplas vias relacionadas à fibrose e identificou 51 genes-chave, incluindo o MMP12, que foi significativamente subregulado. A análise por Western blot confirmou ainda a redução da expressão de MMP12, acompanhada por níveis acentuadamente diminuídos de IL-6 e p-STAT3, sugerindo que a via IL-6/STAT3 pode desempenhar um papel crucial na regulação da expressão de MMP12.

O DMSO pode atenuar respostas inflamatórias e fibrose pulmonar na silicose ao inibir a ativação da via de sinalização IL-6/STAT3, reduzindo assim a expressão de MMP12.

Introdução

A silicose é uma das principais formas de pneumoconiose ocupacional¹, caracterizada por inflamação pulmonar persistente e fibrose pulmonar irreversível resultantes da exposição prolongada ao pó de sílica^2,3. A patogênese dessa silicose é altamente complexa. Embora estudos anteriores tenham demonstrado que a ativação anômala de macrófagos⁴, a proliferação excessiva de fibroblastos, a transição epitelial-mesenquimal e o depósito anormal de componentes da matriz extracelular (ECM) são fatores críticos no desenvolvimento da fibrose^5,6Os mecanismos moleculares centrais que sustentam o ciclo vicioso inflamatório-fibrótico permanecem incompletamente compreendidos. Notavelmente, a família das metaloproteinases da matriz (MMP) desempenha um papel crucial na remodelação da matriz extracelular (ECM) e na progressão da fibrose patológica.⁷. Dentre estas, a metaloproteinase da matriz 12 (MMP12), que é especificamente secretada por macrófagos, degrada componentes-chave da matriz extracelular, como elastina, fibronectina e colágeno do tipo IV, e desempenha um papel importante na patogênese de doenças fibroticas, incluindo a doença pulmonar obstrutiva crônica⁸Estudos recentes sugerem ainda que a MMP12 derivada de macrófagos pode promover ainda mais a fibrose ao danificar as células endoteliais durante o processo de fibrose pulmonar.⁹.

O dimetilsulfóxido (DMSO), um composto de baixo peso molecular com diversas atividades biológicas¹⁰, demonstrou efeitos anti-inflamatórios em diversas doenças inflamatórias, incluindo cistite, e foi aprovado pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos para o tratamento da cistite intersticial¹¹. Estudos recentes sugerem que o DMSO pode retardar em certa medida a progressão da fibrose ao inibir a liberação de fatores inflamatórios e reduzir as respostas ao estresse oxidativo¹². Pesquisas conduzidas por Ingrid Elisia et al. relataram que o DMSO inibe especificamente a ativação das vias de sinalização ERK1/2, p38 MAPK, JNK e PI3K/Akt em monócitos humanos em modelos de sangue total, exercendo assim seus efeitos anti-inflamatórios¹³.

Embora tenha sido demonstrado que a família de MMPs desempenha um papel crítico no processo de fibrose da silicose, nenhum estudo demonstrou conclusivamente se o DMSO pode afetar a progressão patológica da silicose por meio da regulação da expressão de MMPs. Portanto, este estudo representa a investigação dos efeitos anti-inflamatórios e anti-fibróticos do DMSO em um modelo murino de silicose, com o objetivo de revelar a rede gênica reguladora chave e o mecanismo molecular da intervenção com DMSO e fornecer apoio teórico para estratégias inovadoras de tratamento baseadas em MMPs.

Protocolo

Todos os experimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Ciência e Tecnologia da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui (Número de Aprovação GZ2025-048) e seguiram rigorosamente as normas nacionais chinesas de bem-estar animal em laboratório (GB/T 35892-2018). Figura 1 mostra o desenho do estudo.

Preparação das soluções​

Preparação da suspensão de sílica:

A sílica cristalina (SiO₂, 80%, tamanho das partículas 1–5 µm) foi esterilizada por autoclavagem. O pó de sílica estéril foi então disperso em soro fisiológico estéril para obter uma concentração final de 10 mg/mL, e a suspensão foi completamente homogeneizada usando um homogeneizador ultrassônico imediatamente antes da administração, para garantir uma suspensão uniforme de partículas.

Preparação da solução de DMSO:

Em condições assépticas, o DMSO (≥99,9%) foi diluído com solução salina estéril para preparar uma solução de DMSO aproximadamente 10% (v/v), a qual foi homogeneizada por agitação ultrassônica. Cada camundongo recebeu a solução de DMSO em uma dose de 0,9 g/kg, conforme descrito anteriormente^14,15.

Animais experimentais

Trinta e dois camundongos machos saudáveis da linhagem C57BL/6J, com idade entre 8 e 12 semanas, foram utilizados neste estudo e aclimatados por 1 semana antes dos experimentos. Os animais foram aleatorizados em quatro grupos experimentais (n = 8 por grupo) utilizando um método de randomização gerado por computador: grupos controle, DMSO, sílica e sílica+DMSO. O tamanho da amostra foi determinado com base em estudos prévios que utilizaram o mesmo modelo murino de silicose e em nossa experiência experimental preliminar, a qual indicou que 8 animais por grupo eram suficientes para detectar diferenças histopatológicas e moleculares entre os grupos. Os animais foram mantidos em condições laboratoriais padrão, com temperatura controlada, ciclo claro/escuro de 12 h e livre acesso a alimento e água. Pontos finais éticos foram estabelecidos antes do início do estudo, e nenhum animal atendeu aos critérios predeterminados para eutanásia precoce.

Estabelecimento do modelo de silicose e intervenção farmacológica

A silicose foi induzida por uma única instilação intranasal de 60 µL de suspensão estéril de sílica cristalina (10 mg/mL). Após a indução da anestesia, os camundongos foram posicionados em decúbito dorsal. Assim que foi observada respiração profunda e lenta, 60 µL da suspensão de sílica foram cuidadosamente instilados gota a gota nas narinas, permitindo que a suspensão fosse inalada espontaneamente para os pulmões¹⁶. Os camundongos do grupo que recebeu DMSO foram tratados com injeções intraperitoneais de solução de DMSO em dose fixa duas vezes por semana, com intervalo de 3–4 dias entre as injeções, durante um mês consecutivo. Os camundongos dos demais grupos foram tratados de maneira idêntica com volume igual de solução salina estéril. O monitoramento diário do peso corporal foi realizado durante todo o experimento. No 30º dia após a modelagem, todos os camundongos foram eutanasiados e os tecidos pulmonares foram coletados em condições estéreis. A eutanásia foi realizada por dislocação cervical após administração intraperitoneal de tribromoetanol (0,2 mL/10 g) para induzir anestesia. Parte dos tecidos pulmonares foi preservada em nitrogênio líquido para sequenciamento do transcriptoma. Uma porção dos tecidos foi fixada em paraformaldeído a 4% durante 48 h antes da coloração histopatológica, e os tecidos remanescentes foram armazenados a -80 °C para experimentos moleculares subsequentes. Todos os procedimentos com animais seguiram as diretrizes éticas institucionais para o uso de animais.

A avaliação histopatológica, incluindo o escore de fibrose de Ashcroft, foi realizada independentemente por dois pesquisadores cegos quanto à alocação aos grupos experimentais.

Exame patológico pulmonar

Os tecidos pulmonares fixados foram desidratados, transparentizados e emblocados em parafina, depois cortados em seções com espessura de 5 µm.

coloração com hematoxilina e eosina (HE): os cortes foram corados com hematoxilina por 3–5 min, diferenciados em solução ácida, realçados em água corrente e contra-colorados com eosina por 5 min. Após desidratação em etanol de concentração crescente, os cortes foram clareados em xilol e montados com resina neutra¹⁷.

Coloração com tricrômio de Masson: as seções foram coradas sequencialmente com hematoxilina, vermelho de Lichun–fucsina ácida, ácido fosfomolíbdico e verde brilhante. Após diferenciação ácida, as seções foram desidratadas, clareadas em xilol e montadas com resina neutra^18,19.

Sequenciamento do transcriptoma

Os tecidos pulmonares de camundongos dos quatro grupos experimentais foram coletados imediatamente após o sacrifício e congelados rapidamente em nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído utilizando o reagente TRIzol, conforme as instruções do fabricante. A concentração e a pureza do RNA foram avaliadas, e a integridade do RNA foi verificada usando um Bioanalyzer com software embutido. Amostras com valores de RIN superiores a 8,0 foram consideradas aceitáveis. A preparação da biblioteca incluiu enriquecimento de mRNA poli(A) utilizando beads de Oligo(dT), fragmentação do RNA, síntese de cDNA, ligação de adaptadores e amplificação por PCR. O sequenciamento foi realizado em uma plataforma Illumina, gerando aproximadamente 6,2–6,4 Gb de dados limpos por amostra. Todos os dados brutos de sequenciamento gerados neste estudo foram depositados no banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) sob o número de acesso GSE311671.

As leituras limpas foram alinhadas ao genoma de referência de Mus musculus (mm8) utilizando o alinhador STAR. Os níveis de expressão gênica foram quantificados como contagens brutas de leituras. A análise de expressão diferencial foi realizada utilizando o pacote limma no R. Antes da modelagem linear, os dados brutos de contagem foram transformados utilizando a função voom para estimar a relação média-variância e gerar pesos de precisão. Os valores P brutos foram ajustados para testes múltiplos utilizando o método de Benjamini-Hochberg (BH), e os genes com |log₂Razão de Expressão| > 1,5 e taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,05 foram considerados diferencialmente expressos. Análises de enriquecimento funcional foram realizadas utilizando o pacote clusterProfiler no R. A análise de enriquecimento de ontologia genética (GO) foi conduzida para identificar categorias significativamente enriquecidas de processo biológico (BP), componente celular (CC) e função molecular (MF), enquanto a análise de enriquecimento de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foi realizada para identificar vias de sinalização significativamente enriquecidas. A significância de enriquecimento foi avaliada utilizando um teste hipergeométrico, e os valores P foram ajustados para comparações múltiplas utilizando o método de Benjamini-Hochberg. Termos GO e vias KEGG com valor P ajustado (padj) < 0,05 foram considerados significativamente enriquecidos^20,21,22,23.

Detecção por Western blot

O tecido pulmonar fresco de camundongo foi coletado e homogeneizado com um volume apropriado de tampão de lise RIPA (ensaio de radioimunoprecipitação). Após a centrifugação, o sobrenadante foi coletado e a concentração proteica foi determinada utilizando o kit de ensaio de proteína BCA. As amostras foram então misturadas com tampão de carga e aquecidas a 100 °C por 10 min. A separação proteica foi realizada em géis de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE) com uma corrente de 200 V por 30 min. Posteriormente, as proteínas foram eletrotransferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com corrente constante de 300 mA por 30 min. A membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5%, em seguida incubada durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra β-Actina (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) e MMP12 (1:800). No dia seguinte, a membrana foi lavada com TBST e incubada com anticorpo secundário à temperatura ambiente por 1 h, seguido de lavagens adicionais com TBST. As bandas proteicas foram visualizadas utilizando um substrato quimioluminescente, e a quantificação proteica foi realizada utilizando o software ImageJ.

A análise por Western blot foi realizada utilizando três réplicas biológicas independentes de cada grupo experimental. As amostras proteicas foram preparadas a partir de tecidos pulmonares individuais de camundongos, e cada réplica biológica representou um animal independente.

Análise estatística

Todos os dados experimentais foram analisados utilizando o GraphPad Prism 9.5. Testes de normalidade e de homogeneidade de variância foram realizados previamente. O teste t de Student foi usado para comparação entre dois grupos, e a ANOVA unidirecional combinada ao teste post hoc de Tukey foi adotada para comparação entre múltiplos grupos. Um valor de P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

O DMSO alivia a fibrose pulmonar induzida por sílica em camundongos (Figura 2)

Para avaliar os efeitos do DMSO em processos patológicos e alterações no tecido pulmonar em um modelo de silicose, quatro grupos experimentais foram estabelecidos (Figura 2A). As alterações no peso corporal foram monitoradas durante um período de 1 mês.

Os resultados demonstraram que os camundong...

Discussão

A silicose permanece uma das doenças pulmonares ocupacionais mais graves em todo o mundo, caracterizada por inflamação persistente e fibrose pulmonar progressiva, que comprometem significativamente a função pulmonar e a qualidade de vida do paciente²⁵. Neste estudo, utilizando um modelo murino induzido por sílica, examinamos sistematicamente os possíveis efeitos protetores do dimetilsulfóxido (DMSO) durante a fase inicial. Os resultados aqui apresentados sugerem que o tratamento com DMSO atenua a ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SDS-PAGE a 10%	Servicebio	G2177
Kit de ensaio de proteína BCA	Servicebio	G2026
Camundongos C57BL/6J	Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.	No: SCXY(Su)2011-0003
Sílica cristalina	Sigma Aldrich	No.S5631
DMSO	Servicebio	GC203006
IL-6	Affinity Biosciences	DF6087
Tampão de carregamento	Bioteke	P0015L
MMP12	Servicebio	GB115475
p-STAT3	Servicebio	GB150001
Tampão de lise RIPA	Servicebio	G2002
Anticorpo secundário	Servicebio	GB23303
Leite desnatado	Servicebio	GC310001
STAT3	Servicebio	GB11176
β-Actina	Servicebio	GB11001