Artigo de método

Modelo Murino de Co-Colonização Vaginal por Candida albicans e Streptococcus agalactiae

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DOI:

10.3791/72557

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21 de agosto de 2026

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha um método para co-colonizar camundongos vaginalmente com Candida albicans e Streptococcus agalactiae. Pode ser utilizado para estudar interações polimicrobianas, interações hospedeiro-micro-organismo e respostas do hospedeiro a esses organismos.

Resumo

Diversos microrganismos são isolados do trato vaginal humano, e muitos dos organismos que habitam esse nicho podem alternar entre modos de vida comensais e patogênicos. Fatores como a composição da comunidade microbiana e o ambiente do hospedeiro influenciam os resultados da doença; no entanto, os mecanismos que determinam esses resultados não são bem compreendidos. Neste manuscrito, descrevemos um modelo murino para investigar interações inter-reinos e a resposta do hospedeiro a Candida albicans e Streptococcus agalactiae (Grupo B Streptococcus, GBS), patobiontes que colonizam o trato genital feminino (TGF). Evidências emergentes sugerem que C. albicans a colonização é um fator de risco para a presença de GBS devido ao frequente co-isolamento. Durante a gravidez, a colonização por GBS pode levar a desfechos adversos incluindo corioamnionite e natimorto. O GBS também pode ser transmitido para um feto in utero ou um neonato durante o parto e é uma causa predominante de meningite neonatal. A colonização do trato vaginal é um precursor crítico da doença por GBS, e esse nicho exerce diversas pressões seletivas, algumas das quais podem ser influenciadas por C. albicans colonização. Este protocolo descreve um modelo de concorrência C. albicans- Co-colonização vaginal por GBS utilizando tratamento com antibiótico e uma dose única de 17β-estradiol para estabelecer C. albicans colonização, seguida pela remoção de antibióticos e inoculação com GBS. As cargas microbianas no lúmen vaginal são quantificadas ao longo do experimento por lavagem, e as cargas em todo o trato genital feminino são quantificadas por dissecação, homogeneização e plaqueamento da vagina, colo do útero e útero. Este método permitirá a investigação dos mecanismos pelos quais interações polimicrobianas diretas e indiretas influenciam os estilos de vida e a patogênese desses dois organismos, bem como a paisagem imune do hospedeiro no trato genital feminino.

Introdução

Streptococcus agalactiae (Streptococcus do grupo B, GBS) é um patobionte bacteriano Gram-positivo que coloniza múltiplos sítios polimicrobianos, incluindo os tratos gastrointestinal e vaginal. Embora a colonização vaginal seja tipicamente assintomática, durante a gravidez o GBS pode ascender do trato vaginal para o útero e atravessar membranas íntegras, causando infecção do líquido amniótico e da placenta. Assim, constitui um fator de risco primário para desfechos adversos da gravidez, infecção fetal e doenças neonatais1,2. Como principal causa de infecção invasiva em neonatos, é essencial caracterizar os fatores que influenciam o risco de transmissão e infecção. A profilaxia antibiótica intraparto pode reduzir a transmissão vertical e a doença GBS de início precoce em neonatos3,4; no entanto, tem sido associada ao aumento das taxas de resistência a antibióticos e possíveis efeitos de longo prazo relacionados à administração pré-natal ou na primeira infância de antibióticos5,6,7,8. Esses fatores exigem o desenvolvimento de intervenções preventivas e terapêuticas mais direcionadas.

Evidências emergentes demonstraram que a composição do microbioma e as interações polimicrobianas influenciam a homeostase e a probabilidade de doenças9. A dominância do GBS no microbioma vaginal humano tem sido associada a uma redução na abundância de Lactobacillus, e interações específicas de espécies e cepas foram observadas que podem ter diversos efeitos na colonização in vitro e in vivo10,11. Anteriormente, nosso grupo de pesquisa desenvolveu um modelo murino de colonização vaginal por GBS para estudar os correlatos bacterianos e do hospedeiro relacionados à aptidão do GBS12. Esse modelo envolve o tratamento de camundongos com uma única dose de 17β-estradiol, seguido pela inoculação intravaginal com GBS no dia seguinte. Esse modelo tem sido utilizado para caracterizar a importância das proteínas de superfície do GBS, das redes de sinalização regulatória e da secreção de toxinas na manutenção da colonização e na invasão de tecidos do trato genital feminino. Além disso, descobrimos que o GBS exibe interações complexas com outras bactérias no trato vaginal, incluindo Akkermansia muciniphila e Enterococcus faecalis13,14,15, demonstrando como o estilo de vida e a persistência do GBS são influenciados pela presença de microrganismos vizinhos.

Embora este modelo existente tenha sido adaptado para estudar interações interbacterianas, modificações adicionais foram necessárias para estudar outros microrganismos. Os fungos são um componente pouco estudado do microbioma vaginal, e com o modelo apresentado aqui, buscamos desenvolver uma ferramenta para estudar a colonização fúngica juntamente com interações fúngo-bacterianas in vivo. O fungo mais comumente isolado do trato vaginal humano é Candida albicans, que coloniza mais de 70% dos indivíduos16. C. albicans é polimórfico e pode sofrer morfogênese, alternando entre formas leveduriformes e filamentosas. A filamentação está associada a um repertório distinto de expressão gênica17,18. Alguns desses genes específicos de hifas foram recentemente relatados como conferindo vantagem de aptidão no contexto de colonização polimicrobiana19,20,21.

Vários estudos relataram o co-isolamento de C. albicans e GBS em swabs vaginais humanos, e nosso grupo de pesquisa descobriu recentemente que indivíduos colonizados por C. albicans apresentam taxas significativamente maiores de colonização por GBS22. Desenvolvemos um in vivo sistema para estudar as interações tríplices entre fungos comensais, bactérias e o hospedeiro. Estudos fúngicos em camundongos convencionais geralmente requerem tratamento com antibióticos para superar a resistência à colonização mediada por bactérias e estabelecer colonização persistente23. Para conseguir isso sem comprometer a capacidade de colonização do GBS, tratamos os camundongos com um coquetel de antibióticos e os inoculamos com C. albicans, e após o estabelecimento da colonização, removemos a exposição ao antibiótico para permitir que o GBS colonize subsequentemente. Isso foi otimizado de forma que ambos C. albicans e o GBS colonizam o trato vaginal com cargas e em cronogramas semelhantes, permitindo que ocorram interações diretas dentro do trato vaginal. Este protocolo descreve um método para primar camundongos com antibióticos, administrar 17β-estradiol, estabelecer colonização com fungos e bactérias, e coletar amostras de lavado e teciduais para análise subsequente.

Protocolo

O trabalho com animais apresentado neste manuscrito foi aprovado por e realizado de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Colorado Anschutz sob o protocolo nº 00316. Na linha do tempo abaixo, o dia 0 refere-se ao dia da inoculação com S. agalactiae.

1. Administre antibióticos antes da inoculação.

  1. Prepare uma solução concentrada contendo 50 mg/mL de ampicilina, neomicina e gentamicina dissolvidos em água de beber para camundongos. Estérilize a solução de antibióticos utilizando um filtro de 0,22 µm.
  2. Adicione a solução de antibióticos à água de beber dos camundongos em uma diluição de 1:100, adicionando 1 mL da solução para cada 99 g de água.
  3. Após 7 dias, substitua a água repetindo os passos 1.1 e 1.2.
  4. Mantenha os antibióticos por pelo menos 7–10 dias antes de iniciar o experimento, mas não exceda 14 dias totais de tratamento com antibióticos.

2. Sincronizar os ciclos de estro em camundongos (dia -3).

  1. Adicione 0,5 mg por camundongo de 17β-estradiol, mais um pequeno excesso para compensar a aderência da suspensão às paredes dos tubos, a um tubo cônico estéril de 50 mL. Tampe firmemente o tubo cônico e vortex brevemente para desfazer grumos.
    CAUTION: Como o 17β-estradiol pode penetrar no corpo por contato dérmico ou mucoso, manipule este reagente com cuidado e use os equipamentos de proteção individual apropriados.
  2. Use um filtro de 0,45 µm para esterilizar 100 µL de óleo de gergelim por 0,5 mg de 17β-estradiol diretamente no tubo cônico contendo 17β-estradiol. A concentração é de 5 mg/mL. Tampe firmemente e vortex a solução completamente para criar uma suspensão homogênea.
  3. Prepare seringas estéreis de 1 mL (uma por camundongo) puxando o êmbolo até a marca de 0,15 mL e apoiando-as com o êmbolo voltado para baixo e a ponta luer lock voltada para cima.
  4. Aspire a suspensão de 17β-estradiol em uma nova seringa estéril de 10 mL com uma agulha estéril de 18G 1,5” e use-a para encher as seringas de 1 mL preparadas com 100 µL da suspensão.
  5. Tampe cada seringa de 1 mL com uma agulha estéril de 26G 0,5”.
  6. Prepare uma suspensão de 100 µL de óleo de gergelim contendo 0,5 mg de 17β-estradiol e administre uma dose para cada camundongo por injeção intraperitoneal um dia antes da inoculação com C. albicans.

3. Inocule camundongos com C. albicans (dia -2).

  1. Um dia antes da inoculação (no mesmo dia da administração de 17β-estradiol), cultive uma cultura de 5 mL de C. albicans em caldo Yeast Peptone Dextrose em incubadora a 30 °C com agitação a 250 rpm durante a noite.
  2. No dia da inoculação, transfira uma alíquota da cultura noturna para um tubo estéril de microcentrífuga e centrifugue a ≤10.000 × g durante 7–8 s ou até a formação de um pellet.
  3. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
  4. Utilize um hemocitômetro para calcular a concentração da suspensão.
  5. Transfira uma alíquota da suspensão para um novo tubo estéril de microcentrífuga, re-pellete e ressuspenda em PBS estéril fresco para atingir uma concentração final de 109 células de C. albicans/mL em um volume final de pelo menos 10 µL por camundongo. Por exemplo, se a concentração for de 2 × 108 células/mL e houver 10 camundongos, pelote 500 µL e ressuspenda em 100 µL.
  6. Inocule cada camundongo por via intravaginal com 10 µL de C. albicans suspenso em PBS a 109 células/mL (107 células/camundongo).
    1. Imobilize cada camundongo segurando a pele na nuca entre o polegar e o indicador da mão não dominante, girando então o punho de modo que as costas do camundongo repousem na palma da mão. Use os dedos anular e mínimo para imobilizar a cauda.
    2. Aspire 10 µL da suspensão de C. albicans com uma ponteira estéril. Insira a ponteira aproximadamente 5–10 mm na luz vaginal, ajustando a profundidade conforme a anatomia do camundongo.
    3. Libere a inoculação de C. albicans na vagina e retire a ponteira.
    4. Após soltar a nuca, segure o camundongo pela cauda para elevar as patas traseiras. Faça-o andar sobre as duas patas dianteiras por aproximadamente 1 minuto ou até que a inoculação de C. albicans não seja mais visível.

4. Substitua a água de beber (dia -1).

  1. Um dia após a inoculação de C. albicans, o que coincide com o dia anterior à inoculação de S. agalactiae, transfira os camundongos para gaiolas limpas.
  2. Assegure-se de que os camundongos recebam água fresca sem antibióticos.

5. Quantificar a carga de C. albicans na luz vaginal (dia -1).

  1. No dia -1, prepare um tubo estéril de microcentrífuga e 100 µL de PBS estéril por camundongo.
  2. Imobilize cada camundongo conforme descrito no passo 3.6.1.
  3. Aspire 50 µL de PBS para dentro de uma ponteira estéril. Insira a ponteira aproximadamente 1–5 mm na luz vaginal e pipete todo o volume de PBS para cima e para baixo de 3 a 5 vezes. Transfira o PBS para um tubo estéril de microcentrífuga.
  4. Repita o passo 5.3 para obter um volume total de 100 µL de fluido de lavagem.
  5. Vortexe o tubo de microcentrífuga e, em seguida, realize diluições seriadas de 10 vezes até uma diluição final de 1:10.000 em PBS estéril.
  6. Plaque 10 µL das suspensões diluídas e 25 µL do fluido de lavagem não diluído em placas de ágar cromogênico seletivo para Candida.
  7. Incube as placas a 30 °C por 48 h. As colônias de C. albicans apresentarão aparência lisa e cor esverdeada ou turquesa.

6. Inocule camundongos com S. agalactiae (dia 0).

  1. Um dia antes da inoculação (no mesmo dia da substituição da água de beber), cultivar uma cultura de 3 mL em repouso durante a noite de S. agalactiae em caldo Todd Hewitt (THB) em condições estáticas a 37 °incubadora C
  2. No dia da inoculação, dilua a cultura de crescimento noturno 1:10 em 4 mL de THB e incube em banho-maria estático a 37 °incubadora C até atingir a fase logarítmica média (densidade óptica a 600 nm [OD600] de 0,4–0,5) em aproximadamente 1,5–2 h.
  3. Transfira a cultura na fase logarítmica intermediária para um tubo cônico estéril de 15 mL e centrifugue a 3.000 × g por 5 min ou até a formação de um pellet.
  4. Remova o sobrenatante por aspiração, depois suspenda o pellet em 300 µL de PBS estéril.
  5. Use o pellet ressuspenso para preparar pelo menos 100 µL de S. agalactiae suspensão por camundongo, mais um adicional de 500 µL, em PBS estéril a OD600 0,4 (aproximadamente 108 unidades formadoras de colônias [UFC]/mL; ≥1,5 mL no total para 10 camundongos
    OBSERVAÇÃO: Alguns S. agalactiae cepas podem diferir em sua DO600para CFU/mL. Determine qual OD600 corresponde a 108 UFC/mL com antecedência.
  6. Transfira a suspensão para um novo tubo cônico estéril de 15 mL e centrifugue a 3.000 × g por 5 min ou até a formação de um pellet.
  7. Aspire o sobrenatante e re-suspenda o pellet em 1/10th do volume inicial de PBS estéril (se 1,5 mL da suspensão foi centrifugado, ressuspenda em 150) µL). Essa suspensão será de 109 UFC/mL e servir como o inóculo bacteriano.
  8. Diluir em série e semear 50 µL do inóculo em Ágar Todd Hewitt, em seguida incubar as placas a 37 °C durante 24 h para determinar a concentração exata do inóculo.
  9. Inocule cada camundongo intravaginalmente com 10 µL de S. agalactiae suspenso em PBS a 109 UFC/mL (107 CFU/rato) utilizando a mesma técnica descrita nas etapas 3.6.1–3.6.4.

7. Quantificar as cargas de C. albicans e S. agalactiae na luz vaginal (início no dia +1).

  1. A partir de um dia após a inoculação com S. agalactiae, colete 100 µL de fluido de lavagem vaginal e dilua-o seriamente utilizando a mesma técnica descrita nas etapas 5.1–5.5.
  2. Plaque em duplicata 10 µL das suspensões diluídas e 25 µL do fluido de lavagem não diluído em placas de ágar cromogênico seletivo para Candida e para StrepB.
  3. Incube as placas para Candida a 30 °C por 48 h. As colônias de C. albicans apresentarão aparência lisa e cor verde-azulada ou verde.
  4. Incube as placas para StrepB a 37 °C por 24 h. As colônias de S. agalactiae apresentarão aparência lisa e cor rosa ou malva.
  5. Repita as etapas 7.1–7.4 diariamente, ou em um intervalo de tempo apropriado, para monitorar a carga microbiana na luz vaginal.

8. Quantificar as cargas de C. albicans e S. agalactiae nos tecidos do trato genital feminino (ponto final experimental).

  1. Prepare três tubos com tampa rosqueável de 2 mL contendo aproximadamente 0,4–0,5 g de microesferas de zircônia de 1 mm e 500 µL de PBS estéril por camundongo para coletar os tecidos (vagina, colo do útero e útero). Prepare também um tubo estéril de microcentrífuga e 100 µL de PBS estéril por camundongo para coletar a lavagem. Anote o peso de cada tubo com tampa rosqueável para utilizá-lo como referência no cálculo dos pesos dos tecidos.
  2. Eutanazie o camundongo utilizando um método aprovado pela instituição, como asfixia por CO2 e fratura cervical. Use etanol a 70% para esterilizar as tesouras e pinças.
  3. Levante a extremidade traseira do camundongo pela cauda e colete a lavagem vaginal utilizando a técnica descrita nos passos 5,3–5,4.
  4. Pulverize o abdômen do camundongo com etanol a 70% e use as tesouras esterilizadas para abrir a cavidade abdominal. Use pinças para levantar a pele para trás e deslocar o trato gastrointestinal, expondo os tecidos do trato genital.
  5. Use as tesouras esterilizadas para remover a bexiga, bem como a gordura visceral e as membranas que obscurecem o útero. Separe os cornos uterinos dos ovários cortando entre o corpo uterino e cada ovário.
  6. Usando pinças esterilizadas, segure o trato vaginal no ponto inferior ao colo do útero. Levante até que todo o trato vaginal fique visível e use tesouras esterilizadas para fazer um corte transversal o mais próximo possível da vulva, evitando qualquer tecido da pele. Remova todo o trato genital e coloque em uma placa de Petri estéril de 10 cm.
  7. Use uma lâmina de barbear estéril para fazer dois cortes transversais inferior e superior ao colo do útero, separando a vagina, o colo do útero e o útero. Pique cada um dos tecidos fazendo 2–5 cortes sagitais e transversais adicionais em cada um. Coloque cada tecido no respectivo tubo com tampa rosqueável previamente preparado.
  8. Pese cada tubo com tampa rosqueável e calcule o peso de cada tecido subtraindo o valor obtido no passo 8,1. Feche bem a tampa de cada tubo, homogeneíze com microesferas a 3.450 rpm por 1 minuto, coloque os tubos no gelo por 1 minuto e, em seguida, homogeneíze novamente com microesferas a 3.450 rpm por 1 minuto.
  9. Dilua e plaque sequencialmente cada homogeneizado de tecido e amostra de lavagem utilizando o método descrito nos passos 5,5–5,6. Incube as placas conforme descrito nos passos 7,3–7,4.

Resultados

Para caracterizar a colonização vaginal por GBS e C. albicans, camundongos foram inoculados intravaginalmente com a cepa SC5314 de C. albicans ou com controle veicular de PBS, seguido pela inoculação com a cepa COH1 de GBS. Esta cepa representa isolados hipervirulentos do sorotipo capsular III, tipo de sequência 17, que estão mais frequentemente associados à doença invasiva neonatal e meningite1. Camundongos que não foram colonizados por GBS um dia após a inoculação foram excluídos da análise. Ao longo de um período experimental de quatro dias, camundongos colonizados apenas por GBS eliminam progressivamente o GBS da luz vaginal. A maioria dos camundongos co-colonizados por C. albicans mantém altas cargas de GBS (Figura 1A,B). C. albicans também coloniza a luz vaginal de camundongos por aproximadamente quatro dias antes de ser eliminado (Figura 1C). Trabalhos anteriores utilizando este modelo demonstraram que as cargas de GBS nos tecidos do trato genital feminino, incluindo vagina, colo do útero e útero, também são maiores em camundongos co-colonizados em comparação com animais mono-colonizados22.

Gráficos de colonização por GBS; comparação estatística, curva de sobrevivência, análise de dados em escala logarítmica de UFC/mL.
Figura 1. Quantificação da colonização por Streptococcus do grupo B. Murinos CD-1 foram colonizados com C. albicans (SC5314) ou tratados com solução salina tamponada com fosfato como controle, seguido por inoculação vaginal com GBS (COH1). (A) Carga de GBS no lavado vaginal, medianas apresentadas. (B) Percentual de murinos colonizados ao longo do tempo, avaliado pela detecção de GBS no lavado vaginal. (C) Carga de C. albicans no lavado vaginal, medianas apresentadas. Três experimentos independentes. n = 26-27 murinos por grupo. * p < 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001 por testes t múltiplos com teste de comparações múltiplas de Holm-Sidak (A) ou teste log-rank (B). Abreviaturas: GBS = Streptococcus do grupo B, Ca = Candida albicans, UFC = unidades formadoras de colônias. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

A colonização vaginal por GBS representa um risco crítico para a saúde materno-fetal e neonatal. Modelos in vivo são essenciais para compreender os determinantes da colonização e para desenvolver terapêuticas preventivas. Neste manuscrito, descrevemos um modelo murino para co-colonizar camundongos vaginalmente com GBS e C. albicans, avaliar a carga microbiana na luz vaginal e no TFG e coletar tecidos relevantes para análises posteriores. Esse modelo foi desenvolvido para estudar as interações fungo-bacterianas e hospedeiro-micro-organismo no contexto da colonização vaginal polimicrobiana. Nosso grupo de pesquisa utilizou este modelo para elucidar os mecanismos que contribuem para a promoção da colonização vaginal e infecção ascendente por GBS pela C. albicans22.

Modelos animais têm sido usados com sucesso para compreender as interações entre hospedeiro e microrganismos; no entanto, a incorporação de comunidades polimicrobianas nesses modelos pode apresentar diversos desafios únicos. Os objetivos principais no desenvolvimento deste modelo foram estabelecer a colonização fúngica, permitir tempo para que C. albicans forme hifas e inocular com GBS para monitorar a dinâmica de colonização antes que qualquer microrganismo seja eliminado pelo hospedeiro. Como um fungo polimórfico, C. albicans pode responder a diversos estímulos ambientais relacionados ao hospedeiro, iniciando a morfogênese hifal17. A filamentação in vivo foi priorizada neste modelo devido ao acúmulo de evidências de que interações específicas das hifas com GBS impulsionam a simbiose no trato genital feminino (FGT). Utilizando uma linhagem de C. albicans que expressa NRG1 sob controle do promotor reprimível TetO, nosso grupo de pesquisa já demonstrou que o GBS exibe maior coagregação e maior aderência epitelial com C. albicans bloqueado na forma hifal, em comparação com o bloqueado na forma leveduriforme22. A coagregação com C. albicans e a associação com células epiteliais vaginais humanas são determinantes importantes para a aptidão do GBS nesse ambiente do hospedeiro. Outras bactérias incluindo Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e diversas espécies de Streptococcus também demonstraram modular a expressão gênica associada à morfogênese em C. albicans, além de interagir preferencialmente com hifas24. No futuro, as implicações da filamentação in vivo poderão ser investigadas utilizando este modelo para colonizar camundongos com linhagens de C. albicans bloqueadas na forma hifal ou leveduriforme.

Modelos murinos existentes que envolvem inoculação intravaginal de C. albicans focaram-se principalmente na candidíase vulvovaginal (VVC)25 e foram utilizados para caracterizar o estado hiperinflamatório associado à infecção sintomática26. Nosso modelo, descrito neste manuscrito, representa mais fielmente um estado de colonização. Trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa demonstraram que, utilizando este modelo, a co-colonização com C. albicans reduz a abundância de citocinas pró-inflamatórias IL-6, CXCL1, CXCL2 e TNFα em comparação com a colonização apenas pelo GBS, e que os níveis dessas proteínas em camundongos co-colonizados são comparáveis aos de animais ingênuos22. Isso indica que não observamos o ambiente hiperinflamatório característico da VVC, apesar da filamentação fúngica na luz vaginal. Relatou-se que camundongos CD-1 fora de linhagem são resistentes à VVC, possivelmente devido ao controle imune adequado do crescimento fúngico27. Além disso, camundongos CD-1 iniciam sinalização imune robusta após inoculação intravaginal de GBS, suficiente para controlar a população bacteriana em aproximadamente uma semana na ausência de C. albicans28,29,30, embora tenhamos anteriormente investigado a colonização vaginal por GBS em outras linhagens de camundongos12. O modelo descrito neste manuscrito reflete o caráter transitório tanto da colonização por C. albicans quanto por GBS observado em humanos. Adicionalmente, há grande variabilidade entre humanos quanto ao pH e à composição do microbioma. Este modelo apresenta condições de pH próximo ao neutro (~6,5)31. O microbioma vaginal de camundongos CD-1 é dominado por espécies de Enterobacteriaceae e Proteus13, que estão associadas aos mesmos tipos de estado comunitário microbiano vaginal que o GBS9,32.

Ao tratar camundongos com antibióticos e uma dose única de 17β-estradiol antes da inoculação fúngica, preparamos o ambiente para torná-lo receptivo ao C. albicans, facilitando a colonização. O tratamento com estradiol também promove a reprodutibilidade entre experimentos ao sincronizar a fase do estro, e, consequentemente, o ambiente imunológico local, no momento da inoculação. Sincronizamos os camundongos na fase de proestro no momento da inoculação com C. albicans, que coincide com a redução na abundância de neutrófilos e já foi demonstrado promover cargas fúngicas no trato genital feminino (FGT)33,34. A remoção dos antibióticos e sua substituição por água potável fresca no início da linha do tempo experimental não apenas facilita a colonização por GBS, mas também permite que microrganismos nativos repopulem o trato vaginal. Além disso, limitar o tratamento com estradiol a uma única dose inicial permite que os camundongos retomem a dinâmica típica do ciclo de estro, embora a administração contínua de estradiol tenha sido demonstrada como promotora da colonização12. A composição de células imunes no FGT murino varia ao longo do ciclo de estro, e as respostas imunes mucosas são altamente sensíveis aos hormônios esteroides sexuais35,36,37. Assim, contornamos a variável confundidora da administração repetida de estradiol para investigar especificamente os impactos da colonização microbiana no ambiente do hospedeiro.

Os dados apresentados neste estudo representam a linhagem C. albicans SC5314 e a linhagem GBS COH1. Selecionamos a SC5314 para estabelecer o modelo devido ao seu uso frequente em micologia, à abundância de ferramentas genéticas disponíveis nesse background e a um corpo estabelecido de conhecimento sobre sua biologia e dinâmica in vitro e in vivo. Nossa equipe de pesquisa também demonstrou que a linhagem C. albicans 529L pode promover cargas de GBS no trato genital feminino22. A linhagem GBS COH1 foi utilizada como representante da linhagem do tipo sérico III do tipo de sequência 17, que está associada à resistência antimicrobiana e à doença invasiva neonatal1,2. Este modelo utiliza meios seletivos e diferenciais para quantificar a abundância de GBS e C. albicans no lavado vaginal e nos tecidos. Para adaptar este modelo para uso com outras espécies bacterianas e fúngicas, seria necessário otimizar condições apropriadas de crescimento seletivo.

As interações fungo-bacterianas estão surgindo como importantes mediadores dos estilos de vida microbianos38,39. Vários estudos demonstraram que essas interações podem moldar consideravelmente o comensalismo e o potencial de virulência. Além disso, o ambiente do hospedeiro impõe pressões únicas e pode influenciar fatores como programação metabólica, regulons de fatores de transcrição e perfis de resistência a antimicrobianos. Assim, é essencial utilizar modelos in vivo representativos para caracterizar como os microrganismos interagem entre si. O modelo murino descrito neste manuscrito pode ser usado para estudar como a colonização vaginal por bactérias e fungos de interesse pode influenciar a carga microbiana, a expressão gênica e a resposta do hospedeiro.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Escritório de Recursos para Animais de Laboratório da Universidade de Colorado Anschutz, incluindo o gerente da instalação e a dedicada equipe do biotério. Este trabalho é financiado pelos subsídios R01AI153332 e R21AI188719 do NIH concedidos a K.S.D.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro de 0,22 µmSigma-AldrichSLGSR33SB
Filtro de 0,45 µmSigma-AldrichSLHAR33SB
Seringa de 1 mL com conexão luer lockMcKesson16-S1C
Contas de zircônia de 1,0 mmResearch Products International9835
Seringa de 10 mL com conexão luer lockMcKesson16-S10C
17β-estradiolSigma-AldrichE8875ATENÇÃO: O 17β-estradiol pode ser absorvido pela pele e superfícies mucosas. Use equipamento de proteção individual (EPI) apropriado e tenha cautela durante o manuseio.
Agulha 18G, 1,5"BD305196
Tubo com tampa rosqueável de 2 mLFisher Scientific02-681-374
Agulha 26G, 0,5"McKesson16-N2605
ÁgarAlpha BiosciencesA01-102
AmpicilinaResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
GentamicinaVWR Life Science0304
NeomicinaResearch Products InternationalN20040
Solução salina tamponada com fosfatoFisher ScientificBP2944
Óleo de gergelimSigma-AldrichS3547
Caldo Todd HewittResearch Products InternationalT47500
Caldo Yeast Peptone DextroseBD242810

Referências

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