Paradigma de Reconhecimento Social em Camundongos para Distinguir Relacionamentos de Curto e Longo Prazo

Resumo

Aqui, descrevemos um procedimento detalhado para medir o reconhecimento social entre relacionamentos novos, de curto prazo e de longo prazo utilizando um paradigma comportamental experimental de Quatro Copos. Descrevemos as vantagens e os usos potenciais desse paradigma, juntamente com informações importantes para interpretar com precisão os resultados. 

Resumo

A memória social é a capacidade de lembrar e reconhecer congêneres. É um aspecto fundamental do comportamento de mamíferos, com vantagens comprovadas para a sobrevivência em mamíferos altamente sociáveis, como camundongos e humanos. Roedores, especialmente camundongos, são um modelo animal bem estabelecido e amplamente utilizado para estudar a memória social e seus mecanismos subjacentes. A maioria dos paradigmas de memória social existentes avalia principalmente o reconhecimento social de curto prazo, no qual a duração do relacionamento e o nível de familiaridade entre o sujeito e um agente varia entre 5 e 15 minutos. Assim, os paradigmas existentes e estudos anteriores não abrangem memórias sociais provenientes de relacionamentos de longo prazo e concentram-se na dicotomia novidade versus familiaridade de curto prazo, deixando uma lacuna significativa em nosso entendimento mecanicista das memórias sociais. Para preencher essa lacuna, desenvolvemos um ensaio simples que capta as respostas do camundongo a diferentes níveis de familiaridade, colocando a recordação complexa da memória social em um contexto observável e quantificável. No paradigma dos quatro copos, um camundongo sujeito explora livremente uma arena contendo quatro copos perfurados colocados em cada canto. Esses copos abrigam três camundongos agentes com diferentes níveis de familiaridade (estímulos sociais): um familiar de longo prazo (colega de gaiola; coabitação de 1 mês), um familiar de curto prazo (exposição prévia de 10 minutos), um congênere novo e um copo vazio como controle. Camundongos machos CD-1 demonstram preferência por investigar o camundongo novo e o familiar de longo prazo em vez de investigar camundongos familiares de curto prazo neste paradigma. Esta tarefa demonstra o reconhecimento do nível de familiaridade e minimiza comportamentos agressivos, ao mesmo tempo em que controla a história de exposição. Este ensaio inovador fornece uma plataforma para comparar diretamente os mecanismos neurais da memória social entre indivíduos de longo prazo, de curto prazo e novos. O paradigma dos quatro copos atua como uma medida inovadora para o reconhecimento de familiaridade de longo prazo, complementando os ensaios existentes de reconhecimento de curto prazo. 

Introdução

A memória social é uma característica fundamental do comportamento social de mamíferos e está particularmente bem desenvolvida em espécies altamente sociais, como camundongos e humanos. Em roedores, o reconhecimento de outros é a base das dinâmicas comportamentais essenciais para a sobrevivência dentro de grupos familiares e de indivíduos da mesma espécie, incluindo coesão do grupo, hierarquias de dominância, comportamentos reprodutivos e cuidados parentais^1,2. Além de seu papel evolutivamente vantajoso na sobrevivência animal, a disfunção da memória social em humanos é uma característica comum em diversos transtornos neuropsiquiátricos e neurológicos, incluindo transtorno do espectro autista, esquizofrenia e doença de Alzheimer^3,4,5,6. Como o reconhecimento social é fundamental para o funcionamento diário de espécies sociais e possui clara relevância clínica, o desenvolvimento de ensaios comportamentais que capturem com precisão sua natureza multidimensional e suas bases neurais é essencial. Embora os paradigmas existentes meçam alguns aspectos do reconhecimento social em camundongos, a maioria dos ensaios é projetada para avaliar preferências por novidades comparando interações com indivíduos desconhecidos versus relações de curto prazo formadas em minutos ou horas, em vez de quantificar o reconhecimento de relações sociais de longo prazo.   

Abordagens existentes, como o paradigma de três câmaras ou os paradigmas de habituação-desabituação, avaliam a preferência por novidade após exposição prévia breve, frequentemente limitada a 5–15 minutos^7,8,9,10,11. Esses métodos forneceram visão substancial sobre o mecanismos neurais de estes social de curto prazo memórias em camundongos^12,13. No entanto, memórias sociais naturalísticas e função social devem incorporar os mecanismos distintos envolvidos nas relações de longo prazo, construído por meio da coabitação, de longo prazo hierarquias sociais ou parceiros de acasalamento Embora alguns estudos utilizem o paradigma de três câmaras com animais da mesma ninhada¹⁴ ou camundongos familiares coabrigados com o animal experimental por até 72 h^15,16, o uso principal do paradigma ainda se concentra na simples dicotomia entre novidade e familiaridade. Isso limita as comparações entre múltiplos camundongos familiares diferentes. Com os paradigmas estabelecidos de reconhecimento social tendenciosos para estudando relacionamentos de curto prazo, identificamos uma lacuna clara em nosso conhecimento sobre os mecanismos neurais subjacentes ao reconhecimento social de relacionamentos de longo prazo.   

Para abordar essa limitação, desenvolvemos o paradigma dos quatro copos: um ensaio simples e flexível projetado para diferenciar reconhecimento de múltiplos níveis de familiaridade social dentro de uma única sessão de teste. Nesse paradigma, um camundongo experimental explora quatro cantos de uma arena aberta, cada contendo a perfurado copo segurando a conspecífico ou um copo controle vazio. Os copos contêm um conspecífico familiar de longo prazo (companheiro de gaiola), um curto prazo familiar conspecífico com exposição prévia limitada (10 min), um novo camundongo, e um Por favor, forneça o texto fonte em inglês para tradução. controle. O tempo de investigação serve como um índice quantitativo de reconhecimento social e preferência social. Essa configuração permite comparações simultâneas entre diferentes níveis de familiaridade, minimizando ao mesmo tempo a interação física direta e possíveis encontros agressivos. 

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais devem ser realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Flórida (IACUC).  

1. Preparação e acomodação dos animais  

1. Utilize adulto mesmo sexo camundongos mantidos em grupo para todos os experimentos.  Manuseie os camundongos por pelo menos 2 dias para habituá-los ao manuseio e reduzir a ansiedade antes dos testes experimentais.
2. Mantenha os camundongos em gaiolas de laboratório padrão sob um ciclo luminoso inverso, com acesso ad libitum a alimento e água. 
   OBSERVAÇÃO: Camundongos adultos CD-1 e C57BL/6 (com 3–4 meses de idade) foram utilizados nos experimentos representativos. Os camundongos foram mantidos em grupos de 3–4 animais por gaiola. Os conjuntos de dados representativos incluíram 10 camundongos CD-1 machos, 12 camundongos CD-1 fêmeas e 31 camundongos C57BL/6 machos. O comportamento deve ser avaliado na fase ativa do animal (fase escura). Os camundongos incluídos neste estudo foram testados entre as 9 h e as 18 h e mantidos em ciclo luz-escuro invertido (fase escura das 8 h às 20 h).
3. Defina um agente familiar de longo prazo como um cohabitante de gaiola da mesma linhagem e do mesmo sexo que coabitou com o camundongo experimental na mesma gaiola por um período mínimo de 3 a 4 semanas antes do teste. 
4. Selecionar conspecíficos familiares e novos de curto prazo agentes da mesma linhagem e sexo do camundongo experimental. 
5. Certifique-se de que os camundongos novos não tenham tido exposição física ou olfativa prévia ao camundongo em estudo. 
6. Selecione um agente novo e um agente familiar de curto prazo de gaiolas domiciliares diferentes para evitar pistas olfativas semelhantes entre esses dois agentes.
   NOTA: Registre idades aproximadas de todos os animais utilizados e minimize a reutilização dos mesmos agentes novos e de curta duração várias vezes ao dia. Se os agentes forem reutilizados, forneça >2 h de intervalo na gaiola doméstica entre as tentativas do teste para evitar agentes estressados.

2. Configuração da arena 

1. Coloque um limpo, arena quadrada de campo aberto (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm; Tabela de Materiais) em uma sala de testes comportamentais silenciosa.
2. Ilumine a área usando uma única lâmpada alta ou suspensa ajustada para aproximadamente 8–20 lux.  
3. Coloque quatro copos plásticos perfurados, com pesos idênticos, em cada canto da arena (Figura 1A).
   1. Utilize copos visualmente idênticos sempre que possível. Se forem usados copos de cores diferentes, equilibre a atribuição e a localização dos copos entre os ensaios.
   2. Pressione dois lados de cada copo lavar contra as paredes da arena para restringir o acesso, minimizando o comportamento de esconderijo e padronizando os ângulos de investigação. 
   3. Use copos suficientemente pesados para evitar fuga e suficientemente altos para impedir escalada.
      OBSERVAÇÃO: Neste estudo, a posição dos copos representativos e a localização do agente foram pseudorrandomizadas entre os sujeitos, rotacionando os copos plásticos coloridos no sentido horário, enquanto o tipo de agente era deslocado no sentido anti-horário ao longo dos ensaios.
4. Coloque a câmera suficientemente alto para que o ensaio completo a caixa está no quadro para evitar pontos cegos durante a codificação comportamental. Mantenha o mínimo de reflexo e uma iluminação uniforme em toda a superfície do piso da caixa (Figura 1A).
5. Limpe o piso da arena e as copos cuidadosamente entre os ensaios utilizando um desinfetante apropriado, seguido por água para remover odores residuais. 
6. Deixe a arena secar completamente antes de reintroduzir animais. 

3. Habituação à arena no dia 0

1. Coloque o animal e seus companheiros de gaiola na arena contendo quatro copos vazios perfurados e permita a exploração livre por 20 min.
   NOTA: Habitue os animais individualmente para experimentos com fiação. Pode ser necessário realizar sessões adicionais de habituação. Recomenda-se realizar múltiplos dias de habituação caso os camundongos não explorem completamente toda a arena após um dia.
2. Remova todos os camundongos da arena e devolva-os à gaiola de origem.
3. Coloque todos os agentes sociais sob os copos por 10 min para habituá-los à restrição. Habitue os agentes da mesma gaiola simultaneamente, um por copo (Figure 1B).
4. Limpe a arena e os copos antes de introduzir camundongos de uma nova gaiola.
   NOTA: Permita que os camundongos descansem por pelo menos 15 min após o transporte para a sala antes de iniciar a sessão.

4. Linha de base 

1. Monte a arena de acordo com a seção 2. Mantenha a mesma configuração da arena em todos os dias experimentais. 
2. Coloque o sujeito na arena contendo quatro copos vazios e permita a exploração livre por 10 min.
   NOTA: Não interrompa a gravação em nenhum momento, permitindo que ela prossiga continuamente durante todas as etapas do ensaio atual.  

5. Aquisição de curto prazo 

1. Use um copo perfurado com peso para conter o sujeito enquanto coloca o designado "familiar de curto prazo" agente. Alternativamente, exponha o sujeito ao agente de curta duração em uma gaiola limpa.
2. Se optar por realizar a exposição na arena, confine um familiar designado de curto prazo agente sob um dos copos perfurados na arena, deixando os outros três copos vazio. 
3. Liberação o sujeito e permitir exploração livre por 10 min (Figura 1B).
   OBSERVAÇÃO: Se utilizar o método de exposição a um agente de curta duração em uma arena, alterne o canto usado para o agente familiar de curta duração entre os indivíduos para evitar viés espacial. 

6. Intervalo entre tentativas (ITI) 

1. Retire o agente familiar de curto prazo  e devolva-o à sua gaiola de origem. Deixe o camundongo experimental sozinho na arena   e livre para se movimentar por 10 min.  
2. Reúna os camundongos agentes  novos  e familiarizados de longo prazo  para a fase de teste .  
   NOTA: Devolva o agente familiar de curto prazo ao mesmo copo utilizado durante a aquisição de curto prazo (seção 5). Recomenda-se isso para evitar novidade na localização espacial caso a aquisição de curto prazo seja realizada em uma arena.

7. Fase de reconhecimento social 

1. Coloque um copo perfurado adicional com peso sobre o camundongo em estudo.
2. Coloque um camundongo sob cada um dos três copos perfurados com peso: um familiar de longo prazo (colega de gaiola), um familiar de curto prazo e um congênere novo. Deixe uma quarta xícara designada vazia como controle.  
   OBSERVAÇÃO: Rotule as tampas dos copos para identificar as posições dos agentes durante a pontuação comportamental.
3. Remova o copo perfurado do camundongo experimental no centro da arena e permita exploração livre por 10 min (Figura 1A).
4. Remova todos os camundongos ao final do 10 min intervalo e interrompa a gravação.
5. Retorne todos os camundongos às suas gaiolas de origem. 
6. Limpe completamente a arena e as copas antes do próximo ensaio.  
   OBSERVAÇÃO: Mantenha copos de reposição disponíveis em caso de danos.

8. Pontuação comportamental

1. Importe todos os vídeos gravados para um software de análise comportamental capaz de anotação manual, como o Software Interativo de Pesquisa de Observação Comportamental (BORIS).
   NOTA: A pontuação comportamental não foi cega quanto à localização do companheiro de gaiola, já que rótulos com o ID do agente estavam localizados acima de cada copo e visíveis nos vídeos, e o número da gaiola podia ser inferido. Os avaliadores não prestaram atenção ativa aos rótulos visíveis e estavam cegos quanto à identidade do agente novo e de curto prazo. Todos os avaliadores seguiram definições operacionais pré-definidas de comportamento investigativo e critérios padronizados de pontuação.
2. Defina a matriz comportamental antes da pontuação.
3. Defina um episódio de investigação como o posicionamento do nariz do camundongo sujeito a uma distância de 1 cm de um copo enquanto exibe postura investigativa sustentada. 
   NOTA: Inclua mastigação e roer direcionados ao copo como episódios de investigação.
4. Anote manualmente a duração total da investigação para cada copo ao longo da fase de 10 minutos do teste de reconhecimento social.  Pontue a linha de base e a aquisição conforme desejado.
   NOTA: Pode-se utilizar rastreamento automatizado de postura com uma região semicircular de interesse de 1 cm ao redor de cada copo.
5. Exporte os dados anotados para análise estatística subsequente.

Resultados

Seguindo o protocolo do paradigma dos quatro copos, camundongos machos CD-1 exibiram comportamento diferencial de investigação social frente a conspecíficos familiar de longo prazo (colega de gaiola), familiar de curto prazo e novos (Figura 2). Para cada agente, um índice de discriminação (ID) foi calculado com base nos segundos gastos investigando aquele agente em comparação ao copo vazio, calculado como (agente − vazio)/(agente + vazio) durante a fase de reconhecimento social de 10 minutos...

Discussão

Existem considerações fundamentais para aplicar o paradigma dos quatro copos com o objetivo de medir de forma eficaz e confiável essas dinâmicas sociais em outros ambientes laboratoriais. A habituação no Dia 0 reduz a exploração da arena e dos copos motivada pela novidade não social, a qual pode mascarar a investigação social durante o teste^7,8,9. O controle preciso da duração da familiarização de curto prazo também é essencial,...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Software de Pontuação Comportamental	Software Interativo de Pesquisa de Observação Comportamental	Versão 9.12.7	Software para anotação manual de eventos
Arena de campo aberto	Rafferty Machine and Tool	Feito sob encomenda	Folha estrutural de fibra de vidro FRP, arena quadrada (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm); paredes opacas, caso a arena seja transparente, cobrir as paredes externas com papel para minimizar distrações para o animal
Câmera suspensa	Logitech	Logitech C920x HD Pro PC Webcam	Câmera capaz de gravação contínua de vídeo; montada acima do centro da arena
Copos perfurados	Chinco Store	ONG-Chinco-0279	dimensões dos copos: 4,01"C x 4,01"L x 4,52"A; copos perfurados de plástico ou metal, podendo ser quadrados ou cilíndricos
Prism	Graph Pad	Versão 10.6.0	Software para análise de dados; pode ser realizado com outro software