Aqui, descrevemos um procedimento detalhado para medir o reconhecimento social entre relacionamentos novos, de curto prazo e de longo prazo utilizando um paradigma comportamental experimental de Quatro Copos. Descrevemos as vantagens e os usos potenciais desse paradigma, juntamente com informações importantes para interpretar com precisão os resultados.
Artigo de método
Paradigma de Reconhecimento Social em Camundongos para Distinguir Relacionamentos de Curto e Longo Prazo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A memória social é a capacidade de lembrar e reconhecer congêneres. É um aspecto fundamental do comportamento de mamíferos, com vantagens comprovadas para a sobrevivência em mamíferos altamente sociáveis, como camundongos e humanos. Roedores, especialmente camundongos, são um modelo animal bem estabelecido e amplamente utilizado para estudar a memória social e seus mecanismos subjacentes. A maioria dos paradigmas de memória social existentes avalia principalmente o reconhecimento social de curto prazo, no qual a duração do relacionamento e o nível de familiaridade entre o sujeito e um agente varia entre 5 e 15 minutos. Assim, os paradigmas existentes e estudos anteriores não abrangem memórias sociais provenientes de relacionamentos de longo prazo e concentram-se na dicotomia novidade versus familiaridade de curto prazo, deixando uma lacuna significativa em nosso entendimento mecanicista das memórias sociais. Para preencher essa lacuna, desenvolvemos um ensaio simples que capta as respostas do camundongo a diferentes níveis de familiaridade, colocando a recordação complexa da memória social em um contexto observável e quantificável. No paradigma dos quatro copos, um camundongo sujeito explora livremente uma arena contendo quatro copos perfurados colocados em cada canto. Esses copos abrigam três camundongos agentes com diferentes níveis de familiaridade (estímulos sociais): um familiar de longo prazo (colega de gaiola; coabitação de 1 mês), um familiar de curto prazo (exposição prévia de 10 minutos), um congênere novo e um copo vazio como controle. Camundongos machos CD-1 demonstram preferência por investigar o camundongo novo e o familiar de longo prazo em vez de investigar camundongos familiares de curto prazo neste paradigma. Esta tarefa demonstra o reconhecimento do nível de familiaridade e minimiza comportamentos agressivos, ao mesmo tempo em que controla a história de exposição. Este ensaio inovador fornece uma plataforma para comparar diretamente os mecanismos neurais da memória social entre indivíduos de longo prazo, de curto prazo e novos. O paradigma dos quatro copos atua como uma medida inovadora para o reconhecimento de familiaridade de longo prazo, complementando os ensaios existentes de reconhecimento de curto prazo.
Introdução
A memória social é uma característica fundamental do comportamento social de mamíferos e está particularmente bem desenvolvida em espécies altamente sociais, como camundongos e humanos. Em roedores, o reconhecimento de outros é a base das dinâmicas comportamentais essenciais para a sobrevivência dentro de grupos familiares e de indivíduos da mesma espécie, incluindo coesão do grupo, hierarquias de dominância, comportamentos reprodutivos e cuidados parentais1,2. Além de seu papel evolutivamente vantajoso na sobrevivência animal, a disfunção da memória social em humanos é uma característica comum em diversos transtornos neuropsiquiátricos e neurológicos, incluindo transtorno do espectro autista, esquizofrenia e doença de Alzheimer3,4,5,6. Como o reconhecimento social é fundamental para o funcionamento diário de espécies sociais e possui clara relevância clínica, o desenvolvimento de ensaios comportamentais que capturem com precisão sua natureza multidimensional e suas bases neurais é essencial. Embora os paradigmas existentes meçam alguns aspectos do reconhecimento social em camundongos, a maioria dos ensaios é projetada para avaliar preferências por novidades comparando interações com indivíduos desconhecidos versus relações de curto prazo formadas em minutos ou horas, em vez de quantificar o reconhecimento de relações sociais de longo prazo.
Abordagens existentes, como o paradigma de três câmaras ou os paradigmas de habituação-desabituação, avaliam a preferência por novidade após exposição prévia breve, frequentemente limitada a 5–15 minutos7,8,9,10,11. Esses métodos forneceram visão substancial sobre o mecanismos neurais de estes social de curto prazo memórias em camundongos12,13. No entanto, memórias sociais naturalísticas e função social devem incorporar os mecanismos distintos envolvidos nas relações de longo prazo, construído por meio da coabitação, de longo prazo hierarquias sociais ou parceiros de acasalamento Embora alguns estudos utilizem o paradigma de três câmaras com animais da mesma ninhada14 ou camundongos familiares coabrigados com o animal experimental por até 72 h15,16, o uso principal do paradigma ainda se concentra na simples dicotomia entre novidade e familiaridade. Isso limita as comparações entre múltiplos camundongos familiares diferentes. Com os paradigmas estabelecidos de reconhecimento social tendenciosos para estudando relacionamentos de curto prazo, identificamos uma lacuna clara em nosso conhecimento sobre os mecanismos neurais subjacentes ao reconhecimento social de relacionamentos de longo prazo.
Para abordar essa limitação, desenvolvemos o paradigma dos quatro copos: um ensaio simples e flexível projetado para diferenciar reconhecimento de múltiplos níveis de familiaridade social dentro de uma única sessão de teste. Nesse paradigma, um camundongo experimental explora quatro cantos de uma arena aberta, cada contendo a perfurado copo segurando a conspecífico ou um copo controle vazio. Os copos contêm um conspecífico familiar de longo prazo (companheiro de gaiola), um curto prazo familiar conspecífico com exposição prévia limitada (10 min), um novo camundongo, e um Por favor, forneça o texto fonte em inglês para tradução. controle. O tempo de investigação serve como um índice quantitativo de reconhecimento social e preferência social. Essa configuração permite comparações simultâneas entre diferentes níveis de familiaridade, minimizando ao mesmo tempo a interação física direta e possíveis encontros agressivos.
Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo animais devem ser realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Flórida (IACUC).
1. Preparação e acomodação dos animais
- Utilize adulto mesmo sexo camundongos mantidos em grupo para todos os experimentos. Manuseie os camundongos por pelo menos 2 dias para habituá-los ao manuseio e reduzir a ansiedade antes dos testes experimentais.
- Mantenha os camundongos em gaiolas de laboratório padrão sob um ciclo luminoso inverso, com acesso ad libitum a alimento e água.
OBSERVAÇÃO: Camundongos adultos CD-1 e C57BL/6 (com 3–4 meses de idade) foram utilizados nos experimentos representativos. Os camundongos foram mantidos em grupos de 3–4 animais por gaiola. Os conjuntos de dados representativos incluíram 10 camundongos CD-1 machos, 12 camundongos CD-1 fêmeas e 31 camundongos C57BL/6 machos. O comportamento deve ser avaliado na fase ativa do animal (fase escura). Os camundongos incluídos neste estudo foram testados entre as 9 h e as 18 h e mantidos em ciclo luz-escuro invertido (fase escura das 8 h às 20 h). - Defina um agente familiar de longo prazo como um cohabitante de gaiola da mesma linhagem e do mesmo sexo que coabitou com o camundongo experimental na mesma gaiola por um período mínimo de 3 a 4 semanas antes do teste.
- Selecionar conspecíficos familiares e novos de curto prazo agentes da mesma linhagem e sexo do camundongo experimental.
- Certifique-se de que os camundongos novos não tenham tido exposição física ou olfativa prévia ao camundongo em estudo.
- Selecione um agente novo e um agente familiar de curto prazo de gaiolas domiciliares diferentes para evitar pistas olfativas semelhantes entre esses dois agentes.
NOTA: Registre idades aproximadas de todos os animais utilizados e minimize a reutilização dos mesmos agentes novos e de curta duração várias vezes ao dia. Se os agentes forem reutilizados, forneça >2 h de intervalo na gaiola doméstica entre as tentativas do teste para evitar agentes estressados.
2. Configuração da arena
- Coloque um limpo, arena quadrada de campo aberto (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm; Tabela de Materiais) em uma sala de testes comportamentais silenciosa.
- Ilumine a área usando uma única lâmpada alta ou suspensa ajustada para aproximadamente 8–20 lux.
- Coloque quatro copos plásticos perfurados, com pesos idênticos, em cada canto da arena (Figura 1A).
- Utilize copos visualmente idênticos sempre que possível. Se forem usados copos de cores diferentes, equilibre a atribuição e a localização dos copos entre os ensaios.
- Pressione dois lados de cada copo lavar contra as paredes da arena para restringir o acesso, minimizando o comportamento de esconderijo e padronizando os ângulos de investigação.
- Use copos suficientemente pesados para evitar fuga e suficientemente altos para impedir escalada.
OBSERVAÇÃO: Neste estudo, a posição dos copos representativos e a localização do agente foram pseudorrandomizadas entre os sujeitos, rotacionando os copos plásticos coloridos no sentido horário, enquanto o tipo de agente era deslocado no sentido anti-horário ao longo dos ensaios.
- Coloque a câmera suficientemente alto para que o ensaio completo a caixa está no quadro para evitar pontos cegos durante a codificação comportamental. Mantenha o mínimo de reflexo e uma iluminação uniforme em toda a superfície do piso da caixa (Figura 1A).
- Limpe o piso da arena e as copos cuidadosamente entre os ensaios utilizando um desinfetante apropriado, seguido por água para remover odores residuais.
- Deixe a arena secar completamente antes de reintroduzir animais.
3. Habituação à arena no dia 0
- Coloque o animal e seus companheiros de gaiola na arena contendo quatro copos vazios perfurados e permita a exploração livre por 20 min.
NOTA: Habitue os animais individualmente para experimentos com fiação. Pode ser necessário realizar sessões adicionais de habituação. Recomenda-se realizar múltiplos dias de habituação caso os camundongos não explorem completamente toda a arena após um dia. - Remova todos os camundongos da arena e devolva-os à gaiola de origem.
- Coloque todos os agentes sociais sob os copos por 10 min para habituá-los à restrição. Habitue os agentes da mesma gaiola simultaneamente, um por copo (Figure 1B).
- Limpe a arena e os copos antes de introduzir camundongos de uma nova gaiola.
NOTA: Permita que os camundongos descansem por pelo menos 15 min após o transporte para a sala antes de iniciar a sessão.
4. Linha de base
- Monte a arena de acordo com a seção 2. Mantenha a mesma configuração da arena em todos os dias experimentais.
- Coloque o sujeito na arena contendo quatro copos vazios e permita a exploração livre por 10 min.
NOTA: Não interrompa a gravação em nenhum momento, permitindo que ela prossiga continuamente durante todas as etapas do ensaio atual.
5. Aquisição de curto prazo
- Use um copo perfurado com peso para conter o sujeito enquanto coloca o designado "familiar de curto prazo" agente. Alternativamente, exponha o sujeito ao agente de curta duração em uma gaiola limpa.
- Se optar por realizar a exposição na arena, confine um familiar designado de curto prazo agente sob um dos copos perfurados na arena, deixando os outros três copos vazio.
- Liberação o sujeito e permitir exploração livre por 10 min (Figura 1B).
OBSERVAÇÃO: Se utilizar o método de exposição a um agente de curta duração em uma arena, alterne o canto usado para o agente familiar de curta duração entre os indivíduos para evitar viés espacial.
6. Intervalo entre tentativas (ITI)
- Retire o agente familiar de curto prazo e devolva-o à sua gaiola de origem. Deixe o camundongo experimental sozinho na arena e livre para se movimentar por 10 min.
- Reúna os camundongos agentes novos e familiarizados de longo prazo para a fase de teste .
NOTA: Devolva o agente familiar de curto prazo ao mesmo copo utilizado durante a aquisição de curto prazo (seção 5). Recomenda-se isso para evitar novidade na localização espacial caso a aquisição de curto prazo seja realizada em uma arena.
7. Fase de reconhecimento social
- Coloque um copo perfurado adicional com peso sobre o camundongo em estudo.
- Coloque um camundongo sob cada um dos três copos perfurados com peso: um familiar de longo prazo (colega de gaiola), um familiar de curto prazo e um congênere novo. Deixe uma quarta xícara designada vazia como controle.
OBSERVAÇÃO: Rotule as tampas dos copos para identificar as posições dos agentes durante a pontuação comportamental. - Remova o copo perfurado do camundongo experimental no centro da arena e permita exploração livre por 10 min (Figura 1A).
- Remova todos os camundongos ao final do 10 min intervalo e interrompa a gravação.
- Retorne todos os camundongos às suas gaiolas de origem.
- Limpe completamente a arena e as copas antes do próximo ensaio.
OBSERVAÇÃO: Mantenha copos de reposição disponíveis em caso de danos.
8. Pontuação comportamental
- Importe todos os vídeos gravados para um software de análise comportamental capaz de anotação manual, como o Software Interativo de Pesquisa de Observação Comportamental (BORIS).
NOTA: A pontuação comportamental não foi cega quanto à localização do companheiro de gaiola, já que rótulos com o ID do agente estavam localizados acima de cada copo e visíveis nos vídeos, e o número da gaiola podia ser inferido. Os avaliadores não prestaram atenção ativa aos rótulos visíveis e estavam cegos quanto à identidade do agente novo e de curto prazo. Todos os avaliadores seguiram definições operacionais pré-definidas de comportamento investigativo e critérios padronizados de pontuação. - Defina a matriz comportamental antes da pontuação.
- Defina um episódio de investigação como o posicionamento do nariz do camundongo sujeito a uma distância de 1 cm de um copo enquanto exibe postura investigativa sustentada.
NOTA: Inclua mastigação e roer direcionados ao copo como episódios de investigação. - Anote manualmente a duração total da investigação para cada copo ao longo da fase de 10 minutos do teste de reconhecimento social. Pontue a linha de base e a aquisição conforme desejado.
NOTA: Pode-se utilizar rastreamento automatizado de postura com uma região semicircular de interesse de 1 cm ao redor de cada copo. - Exporte os dados anotados para análise estatística subsequente.
Resultados
Seguindo o protocolo do paradigma dos quatro copos, camundongos machos CD-1 exibiram comportamento diferencial de investigação social frente a conspecíficos familiar de longo prazo (colega de gaiola), familiar de curto prazo e novos (Figura 2). Para cada agente, um índice de discriminação (ID) foi calculado com base nos segundos gastos investigando aquele agente em comparação ao copo vazio, calculado como (agente − vazio)/(agente + vazio) durante a fase de reconhecimento social de 10 minutos. Esse índice apresentou distribuição normal com base no teste de Shapiro-Wilk; portanto, utilizamos testes estatísticos que assumem normalidade dos dados. Os camundongos exibiram discriminação significativamente maior em relação ao conspecífico novo comparado ao conspecífico familiar de curto prazo (Figura 2; novo versus curto prazo t(9) = 3,70, p ajustado por Bonferroni-Holm = 0,01). O paradigma também revelou que os camundongos exibiram discriminação significativamente maior em relação ao colega de gaiola familiar de longo prazo comparado ao conspecífico familiar de curto prazo (Figura 2; colega de gaiola versus curto prazo t(9) = 2,87, p ajustado por Bonferroni-Holm = 0,04). Não houve diferença significativa na discriminação entre o conspecífico novo e o colega de gaiola (Figura 2; novo versus colega de gaiola t(9) = -1,13, p ajustado = 0,29), sugerindo que os camundongos investigaram preferencialmente tanto os conspecíficos novos quanto os familiares de longo prazo em vez do camundongo familiar de curto prazo. O tempo de investigação em cada posição de copo durante a fase inicial com arena vazia não diferiu conforme qual agente social posteriormente ocuparia aquela posição específica, confirmando que não houve preferência prévia por um copo que poderia ter influenciado nossos resultados (nova linha de base versus colega de gaiola linha de base t(9) = -1,99, p = 0,23; nova versus linha de base de curto prazo t(9) = -1,97, p = 0,23; colega de gaiola versus linha de base de curto prazo t(9) = 0,54, p = 0,60).
Em contraste, camundongos fêmeas CD-1 não exibiram diferenças significativas no índice de discriminação entre os conspecíficos novos, familiares de curto prazo e familiares de longo prazo (Figura 3). Nenhuma diferença significativa foi observada entre novos e familiares de curto prazo (p = 0,35), novos e companheiros de gaiola (p = 0,69), ou familiares de curto prazo e companheiros de gaiola (p = 0,70). Os camundongos fêmeas investigaram amplamente todos os agentes em relação ao copo vazio, demonstrando um padrão distinto de comportamento nesta tarefa, possivelmente refletindo uma sociabilidade mais ampla em comparação com camundongos machos.
Da mesma forma, camundongos machos C57BL/6 exibiram uma tendência na mesma direção, com maior discriminação em relação ao conspecífico novo do que em relação ao conspecífico familiar de curto prazo. Essa diferença aproximou-se, mas não atingiu, significância após a correção de Bonferroni-Holm, sugerindo maior variância interindividual nesse coorte maior de C57BL/6 (n = 31) do que nos machos CD-1 (Figura 4; p ajustado = 0,055). Nenhuma diferença significativa foi observada entre o conspecífico novo e o companheiro de gaiola (p = 0,62) ou entre o conspecífico familiar de curto prazo e o companheiro de gaiola (p = 0,62). Esses resultados sugerem que o forte comportamento investigativo de companheiros de gaiola observado em machos CD1 varia entre linhagens e sexos.
Para determinar se a dominância social contribuía para a investigação dos companheiros de gaiola, as pontuações de marcação urinária David foram correlacionadas com o índice de discriminação dos companheiros de gaiola. Nenhuma correlação significativa foi observada nem em camundongos machos CD-1 (Pearson's r = 0.28, p = 0.44) nem em camundongos machos C57BL/6 (Pearson's r = 0.10, p = 0.57), sugerindo que a hierarquia social não influenciou o índice de discriminação dos companheiros de gaiola.
Juntos, esses resultados demonstram que o paradigma dos quatro copos pode detectar investigação social diferencial enquanto avalia simultaneamente familiaridade de longo e curto prazo, bem como novidade social, dentro de uma única sessão comportamental. Importante destacar que o sexo e a linhagem podem influenciar o comportamento neste ensaio.
Figura 1: Configuração e processo experimental do paradigma dos quatro copos. (A) Esquerda, caixa do paradigma dos quatro copos com quatro copos vazios perfurados. Direita, animal explorando a caixa do paradigma dos quatro copos com quatro copos perfurados contendo agentes posicionados. As etiquetas indicam a identidade do agente social para facilitar a pontuação comportamental precisa. (B) Esquema comportamental para o Dia 1 do paradigma. As cores dos camundongos indicam as identidades dos agentes. Observe que as imagens foram tiradas com flash da câmera, o que resulta em uma arena mais clara comparada à iluminação de 8–20 lux utilizada durante os experimentos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preferência social no paradigma de quatro copos em camundongos machos CD-1. Índice de discriminação (ID) para investigação de conspecíficos novos, familiares de curto prazo e familiares de longo prazo (companheiro de gaiola) durante a fase de reconhecimento social de 10 minutos. O ID foi calculado como (agente – vazio)/(agente + vazio). Os camundongos exibiram discriminação significativamente maior em relação aos conspecíficos novos e companheiros de gaiola comparados ao conspecífico familiar de curto prazo (p < 0,05), enquanto nenhuma diferença significativa foi observada entre a discriminação de indivíduos novos e companheiros de gaiola. Os dados são apresentados como média ± erro padrão para 10 camundongos. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando testes t pareados com correção de Bonferroni-Holm para comparações múltiplas. *p < 0,05. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Preferência social no paradigma de quatro copos em camundongos fêmeas CD-1. Índice de discriminação (ID) para investigação de conspecíficos novos, familiarizados em curto prazo e familiarizados em longo prazo (companheiro de gaiola) durante a fase de reconhecimento social de 10 minutos. O ID foi calculado como (agente – vazio)/(agente + vazio). Não foram observadas diferenças significativas no índice de discriminação entre os três estímulos sociais. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média em 12 camundongos. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando testes t pareados com correção de Bonferroni-Holm para comparações múltiplas. *p < 0,05. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Preferência social no paradigma de quatro copos em camundongos machos C57BL/6. Índice de discriminação (ID) para investigação dos conspecíficos novo, familiar de curto prazo e familiar de longo prazo (companheiro de gaiola) durante a fase de reconhecimento social de 10 minutos. O ID foi calculado como (agente − vazio)/(agente + vazio). Observou-se uma tendência de maior discriminação do conspecífico novo em comparação ao conspecífico familiar de curto prazo, mas essa diferença não permaneceu significativa após a correção de Bonferroni-Holm (p = 0,055). Não foram observadas diferenças significativas entre novo e companheiro de gaiola, nem entre familiar de curto prazo e companheiro de gaiola. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média em 31 camundongos. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando testes t pareados com correção de Bonferroni-Holm para múltiplas comparações. #p < 0,06. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Discussão
Existem considerações fundamentais para aplicar o paradigma dos quatro copos com o objetivo de medir de forma eficaz e confiável essas dinâmicas sociais em outros ambientes laboratoriais. A habituação no Dia 0 reduz a exploração da arena e dos copos motivada pela novidade não social, a qual pode mascarar a investigação social durante o teste7,8,9. O controle preciso da duração da familiarização de curto prazo também é essencial, pois pequenas diferenças no tempo de exposição podem alterar significativamente os padrões de preferência subsequentes8,9,10. O período de familiarização de 10 minutos foi escolhido para estabelecer uma memória social de curto prazo robusta, mantendo-se consistente com paradigmas de reconhecimento social previamente descritos que utilizam períodos breves de exposição para distinguir conspecíficos familiares de novos7,8,10. Além disso, um período de coabitação de 3 a 4 semanas foi escolhido para estabelecer uma familiaridade social de longo prazo estável por meio de coabitação prolongada, em vez de exposições breves repetidas. Essa duração oferece oportunidade suficiente para interações sociais contínuas e para a formação de familiaridade duradoura entre companheiros de gaiola10. A distinção entre o período de familiarização de 10 minutos e o período de coabitação de 3 a 4 semanas foi intencionalmente projetada para criar dois níveis qualitativamente diferentes de familiaridade (recente e de longo prazo) dentro da mesma sessão comportamental. Durante o experimento, é necessário contrabalançar as identidades dos agentes entre as posições dos copos ao longo dos ensaios, a fim de controlar possíveis vieses espaciais inerentes aos camundongos7,8. O uso repetido de camundongos agentes ao longo dos ensaios pode alterar os níveis de estresse dos agentes e, consequentemente, o comportamento de investigação dos sujeitos. Para minimizar possíveis fatores de confusão, os camundongos agentes não foram usados repetidamente dentro de um mesmo dia de teste, sempre que possível, e a identidade dos agentes e a localização dos copos foram contrabalançadas entre os sujeitos. Além disso, como a dominância social pode influenciar a investigação social, a hierarquia de dominância foi avaliada por meio de dominância baseada em território e escores de David. Nenhuma relação significativa foi observada entre o escore de David e o índice de discriminação de companheiros de gaiola em camundongos machos CD-1 e em camundongos machos C57BL/6, sugerindo que a preferência observada por conspecíficos familiarizados a longo prazo não foi explicada pelo status de dominância. Durante a análise, definições operacionais consistentes dos comportamentos investigativos, especialmente a duração da investigação, são necessárias para garantir a reprodutibilidade entre avaliadores e coortes experimentais. Um desafio potencial enfrentado por todos os paradigmas sociais baseados em investigação são os "efeitos de piso", ou seja, tempos de investigação próximos de zero que impedem comparações. Para linhagens de camundongos que exibem baixos níveis de investigação social, a redução adicional da iluminação visível e o uso de rastreamento de vídeo infravermelho podem reduzir a ansiedade e aumentar o comportamento exploratório.
O protocolo permite flexibilidade e modificações conforme os objetivos experimentais, mas certas adaptações exigem consideração cuidadosa. O material do copo é uma variável fundamental no ensaio. Embora este protocolo utilize copos plásticos perfurados, copos metálicos pesados com pequenas perfurações metálicas podem reduzir comportamentos de mastigação e tentativas de fuga em comparação com copos plásticos leves. O uso de copos plásticos pode aumentar comportamentos de manipulação, incluindo roer ou escalar, os quais devem ser monitorados e anotados durante a pontuação. Uma abordagem alternativa consiste em substituir os copos perfurados por divisórias verticais altas e perfuradas que separem cada canto da arena central, mantendo a comunicação olfativa e visual limitada. Embora este desenho possa reduzir ainda mais o comportamento de escalada, copos perfurados removíveis oferecem a vantagem prática de converter rapidamente uma arena de campo aberto padrão no paradigma de quatro copos, sem necessidade de modificações permanentes. A interação excessiva com os copos pode ser mitigada aumentando o peso dos copos, modificando o tamanho das perfurações e mantendo uma cor consistente para reduzir fontes de viés. Além disso, os camundongos agentes devem ser balanceados e não reutilizados dentro de um mesmo dia de teste, para reduzir efeitos indesejados de familiaridade.
Várias limitações do paradigma dos quatro copos devem ser reconhecidas. Como a interação social é restrita por barreiras perfuradas, o ensaio avalia principalmente a investigação iniciada pelo sujeito, não recíproca, com base em pistas olfativas e visuais limitadas, em vez de contato físico direto8,9. Além disso, o uso de copos como barreira física e visual introduz uma ambiguidade potencial na interpretação do comportamento investigativo. Nos casos em que é observada uma investigação aumentada dos companheiros de gaiola, particularmente em machos CD-1, permanece incerto se isso reflete apenas reconhecimento social ou uma combinação de investigação e motivação afiliativa, incluindo comportamentos relacionados à ajuda direcionados a um conspecífico familiar (por exemplo, tentativas de auxiliar a fuga do companheiro de gaiola por meio da mastigação do copo de plástico). Essas considerações destacam a importância de uma interpretação cautelosa e, sempre que possível, do uso de ensaios comportamentais complementares. Relações sociais preexistentes entre os companheiros de gaiola, incluindo hierarquia de dominância, interações afiliativas e experiências sociais anteriores, também podem contribuir para as preferências de investigação. No entanto, não observamos uma relação aparente entre a posição de dominância e o comportamento investigativo dos companheiros de gaiola. Apesar disso, esses fatores podem variar entre linhagens, condições de manejo e paradigmas experimentais e devem ser considerados ao interpretar preferências de familiaridade de longo prazo.
Em comparação com os ensaios de reconhecimento social existentes, o paradigma dos quatro copos permite a comparação simultânea de múltiplos agentes, como um congênere familiar de longo prazo, de curto prazo e um novo congênere, dentro de uma única sessão comportamental. Paradigmas tradicionais, como os ensaios de três compartimentos e de habituação–dessensibilização, avaliam principalmente a preferência por novidade de curto prazo após períodos breves de exposição7,8,9,10. Estudos anteriores também incorporaram companheiros de gaiola de longo prazo juntamente com congêneres novos, incluindo paradigmas de interação social irrestrita e arenas multicompartimentais modificadas projetadas para avaliar a familiaridade social17,18. No entanto, essas abordagens não comparam simultaneamente estímulos sociais familiares de longo prazo, familiares de curto prazo e novos dentro do mesmo ensaio. Ao incluir companheiros de gaiola de longo prazo em conjunto com agentes de curto prazo, o paradigma dos quatro copos fornece um meio para investigar memórias sociais duradouras que surgem da coabitação prolongada. Dados representativos de camundongos CD-1 machos e fêmeas demonstram que o paradigma dos quatro copos pode ser aplicado com sucesso em ambos os sexos, evidenciando padrões comportamentais específicos por sexo. Da mesma forma, dados representativos de camundongos CD-1 e C57BL/6 demonstram ainda que o paradigma dos quatro copos pode ser implementado com sucesso em várias linhagens de laboratório comumente utilizadas. Embora o reconhecimento social e a preferência por novidade frequentemente variem entre linhagens de camundongos7,19, o padrão geral de discriminação de familiaridade observado em machos de ambas as linhagens sugere que o ensaio é amplamente aplicável. Contudo, como os comportamentos de reconhecimento social podem variar conforme a linhagem, o sexo, a idade e o contexto experimental, os pesquisadores devem validar o ensaio no modelo animal específico relevante para sua questão. Além disso, embora este paradigma possa ser adaptado em uma arena de quatro braços ou quatro compartimentos, a realização em uma arena de campo aberto permite uma maior dissociação entre memória de navegação e espacial e memória social. A carga de memória espacial é maior ao navegar por compartimentos ou braços distintos; portanto, ao investigar mecanismos de memória social, a memória espacial deve ser uma variável importante a ser avaliada. Netser et al. (2017) também discutem essas ressalvas relativas à arena típica de ensaio de três compartimentos ao propor uma alternativa análoga com arena de dois compartimentos, que minimiza a necessidade de navegação espacial20. Este método é particularmente adequado para estudos que examinam a representação neural da familiaridade social, alterações longitudinais na cognição social e condições nas quais a memória social de longo prazo possa ser seletivamente alterada.
Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio McKnight em Neurociência e pelo Prêmio Klingenstein em Neurociência concedidos a NPC.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Software de Pontuação Comportamental | Software Interativo de Pesquisa de Observação Comportamental | Versão 9.12.7 | Software para anotação manual de eventos |
| Arena de campo aberto | Rafferty Machine and Tool | Feito sob encomenda | Folha estrutural de fibra de vidro FRP, arena quadrada (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm); paredes opacas, caso a arena seja transparente, cobrir as paredes externas com papel para minimizar distrações para o animal |
| Câmera suspensa | Logitech | Logitech C920x HD Pro PC Webcam | Câmera capaz de gravação contínua de vídeo; montada acima do centro da arena |
| Copos perfurados | Chinco Store | ONG-Chinco-0279 | dimensões dos copos: 4,01"C x 4,01"L x 4,52"A; copos perfurados de plástico ou metal, podendo ser quadrados ou cilíndricos |
| Prism | Graph Pad | Versão 10.6.0 | Software para análise de dados; pode ser realizado com outro software |
Referências
- Wolff JO, Sherman PW, editors. Rodent societies: an ecological and evolutionary perspective. University of Chicago Press; Chicago; 2008.
- Thor DH, Holloway WR. Social memory of the male laboratory rat. J Comp Physiol Psychol. 1982;96(6):1000-1006.
- Theory of mind and autism: A review. International Review of Research in Mental Retardation. Academic Press; 2000.
- Bediou B, et al. Impaired social cognition in mild Alzheimer disease. J Geriatr Psychiatry Neurol. 2009;22(2):130-140.
- Green MF, Horan WP, Lee J. Social cognition in schizophrenia. Nat Rev Neurosci. 2015;16(10):620-631.
- Bäckman L, Herlitz A. The relationship between prior knowledge and face recognition memory in normal aging and Alzheimer's disease. J Gerontol. 1990;45(3):P94-P100.
- Moy SS, et al. Sociability and preference for social novelty in five inbred strains: An approach to assess autistic-like behavior in mice. Genes Brain Behav. 2004;3(5):287-302.
- Engelmann M, Hädicke J, Noack J. Testing declarative memory in laboratory rats and mice using the nonconditioned social discrimination procedure. Nat Protoc. 2011;6(8):1152-1162.
- van der Kooij MA, Sandi C. Social memories in rodents: Methods, mechanisms and modulation by stress. Neurosci Biobehav Rev. 2012;36(7):1763-1772.
- Cum M, et al. A systematic review and meta-analysis of how social memory is studied. Sci Rep. 2024;14(1):2221.
- Oliva A, Fernández-Ruiz A, Leroy F, Siegelbaum SA. Hippocampal CA2 sharp-wave ripples reactivate and promote social memory. Nature. 2020;587(7833):264-269.
- Oliva A. Neuronal ensemble dynamics in social memory. Curr Opin Neurobiol. 2023;78:102654.
- Okuyama T. Social memory engram in the hippocampus. Neurosci Res. 2018;129:17-23.
- Hitti FL, Siegelbaum SA. The hippocampal CA2 region is essential for social memory. Nature. 2014;508(7494):88-92.
- Dykstra B, Kim P, Lin A, Berman GJ, Murugan M. The intermediate CA1 and CA3 subfields of the hippocampus differentially encode social recognition. bioRxiv. 2025; doi.org/10.1101/2025.10.27.684580.
- Rashid M, et al. A ventral hippocampal-lateral septum pathway regulates social novelty preference. eLife. 2025;13:RP97259.
- Phillips ML, Robinson HA, Pozzo-Miller L. Ventral hippocampal projections to the medial prefrontal cortex regulate social memory. eLife. 2019;8:e44182.
- Medeiros D, Polepalli L, Li W, Pozzo-Miller L. Altered activity of mPFC pyramidal neurons and parvalbumin-expressing interneurons during social interactions in a Mecp2 mouse model for Rett syndrome. J Neurophysiol. 2025;134(6):2070-2085.
- Netser S, et al. Distinct dynamics of social motivation drive differential social behavior in laboratory rat and mouse strains. Nat Commun. 2020;11(1):5908.
- Netser S, Haskal S, Magalnik H, Wagner S. A novel system for tracking social preference dynamics in mice reveals sex- and strain-specific characteristics. Mol Autism. 2017;8:53.
Reimpressões e permissões
Este artigo foi publicado
Vídeo em breve