Fluxo de Trabalho Otimizado de Exibição de Superfície de Levedura para Evolução Dirigida de Proteases

Resumo

Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho otimizado para a evolução dirigida de proteases virais em Saccharomyces cerevisiae usando um sistema de seleção baseado em exibição de superfícies. Ele descreve o design da biblioteca de insertos de DNA e do cassete de substrato, eletroporação otimizada para alta eficiência de transformação, seleção baseada em separação celular ativada por fluorescência para clivagem de protease e sequenciamento de variantes enriquecidas.

Resumo

A evolução dirigida imita o processo evolutivo natural em um ambiente de laboratório rápido e controlado para evoluir proteínas com funções ou características desejáveis. A triagem de um grande conjunto de genes codificadores de proteínas mutantes permite a seleção funcional das variantes desejadas para aplicações em biotecnologia, medicina e biologia sintética. Usando esse protocolo, realizamos evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae para engenheirar variantes de protease com alta especificidade para uma sequência de substrato não nativa. Exibimos essas variantes de protease na superfície celular da levedura para facilitar a seleção das variantes desejadas por meio de filtração celular ativada por fluorescência (FACS) ao longo de múltiplas rodadas de enriquecimento. Quatro elementos-chave do cassete substrato são coexpressos com a biblioteca de proteases: uma proteína de fusão composta por (i) a subunidade receptora de adesão da levedura Aga2, (ii) sequências de seleção e (iii) sequências de substrato de contra-seleção, (iv) sequências de etiquetas de epítopo e uma sequência opcional de sinal de recuperação do retículo endoplasmático (RE). Células de levedura nas quais apenas a sequência do substrato de seleção é clivada são isoladas usando FACS multicolorido por meio de anticorpos anti-epítopos fluorescentes (marcados com isotiocianato com ficoeritrina/fluoresceína). Aqui fornecemos detalhes do protocolo otimizado, passo a passo, para conduzir uma campanha de evolução de proteases, incluindo design de biblioteca de inserção de DNA e design de fitas cassete de substrato, eletroporação de células de levedura com alta eficiência de transformação (até 10⁹ transformantes por micrograma de DNA), seleção, enriquecimento e sequenciamento baseados em FACS de variantes evoluídas. Demonstramos nosso protocolo de evolução dirigida evoluindo a protease de inclusão nuclear A (TEVp) do vírus do gravador do tabaco de secar sua sequência natural de substrato, ENLYFQ↓S, para a clivagem de uma nova sequência, ENLYFE↓S.

Introdução

As proteases cisteínas da família Potyviridae, especificamente as proteases de inclusão nuclear A (NIa), representam uma fonte amplamente inexplorada de endopeptidases específicas de sequência. Com mais de 3.800 membros da família caracterizada, as proteases NIa clivam uma sequência distinta de substrato composto por sete aminoácidos. A família dos potivirais oferece um conjunto diversificado de proteases para engenharia de sistemas programáveis de controle proteico, construção de circuitos genéticos ortogonais baseados em proteases e desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas específicas para^{sequências 1,2}. Apesar dessa diversidade natural, apenas duas proteases NIa, TEVp e protease do vírus manchado por veias do tabaco (TVMVp), foram completamente caracterizadas e projetadas para uso amplo em laboratório e^{biotecnologia 3,4}. Esse conjunto limitado de proteases limita o espaço de projeto para circuitos multicomponentes que requerem atividades ortogonais de^{proteases 5}, motivando assim esforços para expandir e caracterizar ainda mais as proteases NIa por meio da evolução^{dirigida 6,7}.

A exibição superficial de leveduras emergiu como uma das plataformas mais poderosas para evolução dirigida, permitindo uma triagem de alta produtividade em bibliotecas de proteínas por meio da filtragem celular ativada por fluorescência (FACS^)6,7. Por exemplo, o sistema de rastreamento do retículo endoplasmático da levedura (YESS) acopla a atividade da protease à exibição superficial através da via secretora de S. cerevisiae ^6,7. O sistema YESS foi aplicado para engenheirar novas especificidades de substrato protease e demonstrou utilidade para campanhas de evolução dirigida em múltiplas rodadas. Neste sistema, variantes de protease são coexpressas com uma proteína de fusão contendo um cassete de substrato de clivagem com marcadores de epítopo, e a âncora superficial Aga1p é expressa na cepa de levedura EBY100. A marcação diferencial com anticorpos fluorescentes distingue cassetes de substrato não clivado exibidos na superfície celular. Esse mecanismo de exibição dependente da atividade é diretamente compatível com a seleção iterativa baseada em FACS para bibliotecas de 10,⁷ ou mais^{variantes 6,7}.

Um pré-requisito fundamental para a evolução dirigida é a capacidade de introduzir bibliotecas variantes em escala suficiente para alcançar uma cobertura adequada do espaço de sequências alvo. Para bibliotecas de mutagênese por saturação de sítios abrangendo múltiplas posições de aminoácidos, são necessários rendimentos de transformação de 10⁸ a 10⁹ transformantes únicos para garantir que a diversidade introduzida na biblioteca esteja bem representada na população ordenada. Existem vários métodos para introduzir DNA exógeno em S. cerevisiae, cada um com tetos distintos de rendimento. O método convencional de transformação química utiliza acetato de lítio/DNA transportador de fita simples/polietilenoglicol (LiAc/ssDNA/PEG) devido à sua simplicidade e acessibilidade. No entanto, normalmente alcança eficiências de transformação de apenas^{10 unidades de formação} de colônia (CFU) de 4 a^{10 6} por micrograma de DNA, ficando aquém da variação de sequência necessária para campanhas de grandes^{bibliotecas 8}. Em contraste, o método de eletroporação aplica um campo elétrico de alta voltagem para permeabilizar transitoriamente a membrana celular e facilitar a absorção do DNA. A eletroporação alcança consistentemente as maiores eficiências de transformação entre os métodos disponíveis, com protocolos otimizados reportando rendimentos de 10⁸–10^{9 CFU 9}. Foi observado que a eficiência da eletroporação em S. cerevisiae é criticamente sensível à fase de crescimento celular, massa de DNA e composição do tampão, fornecendo uma estrutura que desde então foi amplamente adaptada para evolução dirigida^{em escala de biblioteca 9}.

O protocolo descrito aqui utiliza a cepa S. cerevisiae EBY100, uma cepa hospedeira amplamente adotada para exibição superficial de leveduras. O EBY100 foi desenvolvido por Boder e Wittrup integrando uma cassete de expressão AGA1 sob o controle do promotor GAL1 induzível por galactose no locus cromossômico AGA1 da cepa parental deficiente em protease BJ5465¹⁰. A cepa está comercialmente disponível no ATCC (nº de catálogo MYA-4941; depositante K.D. Wittrup), portando o genótipo MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). Como resultado, tanto Aga1p quanto a fusão do cassete do substrato Aga2p são expressas a partir do mesmo promotor induzível por galactose, garantindo que as duas subunidades sejam coinduzidas e se montem no complexo ligado a dissulfeto Aga1p–Aga2p que ancora a fusão exibida na parede celular.

Apesar do uso generalizado do EBY100 em aplicações de exibição de leveduras, nenhum protocolo publicado foi sistematicamente otimizado para eletroporar essa cepa em rendimentos em escala de biblioteca. Parâmetros específicos do EBY100, como a fase ótima de crescimento na colheita, a composição do meio durante a subcultura e a relação quantitativa entre densidade óptica inicial em 600 nm (OD₆₀₀) e eficiência de transformação, ainda precisam ser rigorosamente caracterizados e otimizados. Aqui, relatamos que a eficiência da transformação no EBY100 aumenta monotonamente com o OD₆₀₀ da cultura na colheita, com células na fase final de logaritaria apresentando taxas de transformação substancialmente maiores do que aquelas colhidas na fase inicial de log. Avaliamos parâmetros críticos do protocolo, incluindo valores iniciais de_{OD 600} na inoculação, uso de meio 2 × Peptone Dextrose (YPD) de extrato de levedura (YPD) para subculturas, formulações de tampão de eletroporação e condições de crescimento pós-eletroporação. O protocolo apresentado aqui fornece um fluxo de trabalho otimizado passo a passo (Figura 1A–C, Figura 2, Figura 3A–D, Figura 4A–E) para preparar células EBY100 eletrocompetentes e realizar eletroporação de biblioteca de DNA de alta eficiência, resultando em taxas de transformação consistentemente acima de 10⁹ CFU. Para validar esse protocolo, realizamos uma campanha abrangente de evolução dirigida para projetar TEVp com especificidade de clivagem alterada ao longo de quatro rodadas de seleção e enriquecimento baseadas em FACS. O sequenciamento de variantes enriquecidas da protease confirmou diversificação substancial em resíduos-alvo dentro do bolso de ligação ao substrato da protease, demonstrando que o protocolo fornece cobertura suficiente de biblioteca do espaço de sequência para apoiar campanhas produtivas de evolução. Este protocolo será de ampla utilidade para pesquisadores que utilizam EBY100 para evolução dirigida baseada em exibição de superfície de levedura e triagem de alto rendimento compatível com FACS de proteases,^{anticorpos 9}, quinases¹¹ e receptores¹², entre outras proteínas.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo S. cerevisiae recombinante foram conduzidos de acordo com as políticas e procedimentos do Comitê Institucional de Biossegurança e Segurança Química da Universidade do Texas em Dallas. Cepas de levedura recombinantes foram manuseadas sob contenção de Biossegurança Nível 1 (BSL-1) de acordo com práticas institucionais microbiológicas estabelecidas. Eletroporação, cultura e separação celular ativada por fluorescência (FACS) foram realizadas de acordo com procedimentos institucionais aprovados de biossegurança. Culturas de levedura e consumíveis contaminados foram descontaminados e descartados como resíduos bio-perigosos, de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Preparação de vetores e inserções

1. Geração de bibliotecas de proteases potívirais via mutagênese por saturação de sítios
   1. Projetar usando software de design de sequências que sobrepõe oligonucleotídeos diretos e reversos de 30 a 50 mer, para gerar uma biblioteca mutante de proteases. Substitua o códon do tipo selvagem no oligonucleotídeo correspondente por um codon degenerado NNS, onde N representa A, T, G ou C, e S representa G ou C, para posições alvo da mutagênese.
   2. Projete a sobreposição de 3′ entre cada par de oligonucleotídeos direto e reverso com uma temperatura de fusão (Tm) de 55–60 °C. Projete o primeiro e o último oligonucleotídeo para conter uma sobreposição de 50-nt com o vetor de exibição da superfície da levedura além dos sítios de restrição.
   3. Certifique-se de que pelo menos uma extremidade do inserto se sobreponha exatamente a uma extremidade do vetor linearizado para facilitar a recombinação^{homóloga 13}. Evite lacunas entre oligonucleotídeos^{adjacentes 14}.
   4. Resuspenda os oligos a 100 μM com H_2Odeionizado. Em um tubo estéril de 1,5 mL, combine 0,5 μL de cada olígono para um volume final de 200 μL (concentração final de 250 nM para cada oligô).
   5. Configure uma reação de PCR com os componentes listados na Tabela 1 para montar a biblioteca de proteases, usando as condições de termociclagem da Tabela 2.
   6. Configure uma segunda reação de PCR usando os oligos mais externos para frente e para trás (Tabela 3) usando o primeiro produto de PCR montado como modelo. Amplifique o produto conforme mostrado na Tabela 4.
   7. Execute o segundo produto de PCR em um gel de agarose a 1% com brometo de etídio (0,5 μg/mL) a 240 V por 30 minutos. Retirar a faixa correspondente ao comprimento esperado do DNA.
      NOTA: ATENÇÃO: O brometo de etídio é um mutagênico e deve ser manuseado com equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jaleco, luvas de nitrilo e óculos de segurança. Evite contato com a pele e a inalação. Descarte géis, tampões e consumíveis contendo brometo de etídio como resíduos químicos perigosos, de acordo com as diretrizes institucionais de segurança.
   8. Purifique usando um kit de extração em gel. Elute em 50 μL de_H2Odeionizado.
   9. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro. Armazene o DNA a −20 °C.
      NOTA: Cada reação de 50 μL da^{segunda PCR} resultaria em cerca de 0,5–1,0 μg de DNA total. Como cada eletroporação requer 12 μg da biblioteca de protease (ou seja, inserir), aumente as reações de acordo.
2. Conjunto de cassete de substrato
   1. Prepare placas de ágar LB e meios líquidos de cloranfenicol LB. Veja as receitas na Tabela 5.
   2. Projetar um conjunto de oligonucleotídeos sobrepostos de 30 meros nas direções direta e reversa para a montagem do cassete do substrato. Projete as extremidades 5′ de cada oligonucleotídeo reverso e o oligonucleotídeo direto do próximo fragmento para corresponderem em 4 nucleotídeos.
   3. Resuspenda oligos liofilizados a 100 μM usando_H2Odesionizado.
   4. Misture os reagentes conforme na Tabela 6.
   5. Use o programa de ciclagem na Tabela 7 para recozer e fosforilar a mistura de oligo.
   6. Diluir oligos recozidos 4 vezes em H_2Odesionizado para atingir uma concentração final de 1,25 μM.
   7. Combine a mistura de oligo recozido com o vetor (por exemplo, pDD1523), seguindo a Tabela 8.
   8. Realize a montagem Golden Gate, seguindo o programa de ciclismo na Tabela 9.
      NOTA: Por exemplo, o plasmídeo pDD1523 possui um sítio de restrição tipo IIS (BsmBI) a jusante do promotor GAL1/10. A montagem bem-sucedida permite a indução de galactose do substrato^{cassete 7}.
   9. Transforme o plasmídeo resultante em E. coli.
   10. Células de placa em ágar LB com o antibiótico correspondente. Incubar por 16–18 horas a 37 °C.
   11. Escolha colônias isoladas e inocule-as em 5 mL de meio LB. Incubar durante a noite (16–18 h) a 37 °C com agitação (220 rpm).
   12. Extraia plasmídeos de culturas durante a noite usando um kit de minipreparação de plasmídeos.
   13. Meça a concentração de plasmídeos usando um espectrofotômetro e então peça para sequenciamento.
3. Linearização do vetor de exibição de leveduras
   1. Linearize o plasmídeo de exibição da levedura, por exemplo, digera pDD1524 com enzimas de restrição SphI e PstI para preparar o vetor de exibição da levedura contendo o cassete substrato para eletroporação. Misture os reagentes listados na Tabela 10 e incube a 37 °C por 1 hora.
   2. Administre o produto de digestão de restrição em um gel de agarose a 1% a 240 V por 30 minutos. Retire a faixa correspondente ao comprimento esperado de DNA e purifique usando um kit de extração em gel.
      NOTA: Cada 50 μL de digestão de restrição geraria cerca de 0,5–1,0 μg de DNA total. Como cada eletroporação requer 4 μg de vetor linearizado, aumente as reações de digestão de acordo.

2. Eletroporação

Nota: Siga os procedimentos institucionais de segurança para o manuseio de materiais biológicos e reagentes, use EPIs adequados e descarte resíduos biológicos e químicos de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Preparação de tampões, placas e meios (2 dias antes da eletroporação)
   1. Preparar meios de cultivo (1 × YPD; 2 × YPD; Dextrose Sintética de Ácidos Casamino, SDCAA+; e Ácidos Casamino de Galactose Sintético, SGCAA+), placas (YPD e SDCAA), amortecedor de eletroporação e água estéril, seguindo as receitas da Tabela 5. Armazene a 4 °C.
2. Preparação de uma placa riscada de EBY100.
   1. Faça uma estria de levedura EBY100 em ágar YPD a partir de um estoque de glicerol. Cultive a 30 °C por 2 dias.
   2. Armazene o prato a 4 °C após o crescimento.
      NOTA: Uma placa riscada permanece utilizável por até 1 mês; Marque a data da sequência no prato.
3. Preparação da pré-cultura do EBY100 (1 dia antes da eletroporação)
   1. Prepare 125 mL de 1 × YPD em um frasco Erlenmeyer de 500 mL.
   2. Prepare 25 mL de 1 × YPD em um tubo cônico de 50 mL. Usando uma ponta de micropipeta, colete células EBY100 da placa cultivada por 2 dias. Depois, transfira as células de levedura da ponta da pipeta para o tubo cônico contendo 1 × YPD.
      NOTA: A faixa de células deve formar uma mancha de aproximadamente 1–2 mm de comprimento.
   3. Remova a ponta da micropipeta e faça um vórtice no tubo cônico para garantir uma mistura adequada.
   4. Prepare uma pré-cultura de 150 mL transferindo 25 mL de 1 × YPD contendo as células da levedura para o frasco de 500 mL contendo 125 mL de 1 × YPD. Gire para misturar.
   5. Usando um espectrofotômetro, meça o OD₆₀₀ preparando duas microcuvetas com comprimento de caminho de 1 cm: uma com 1 mL de 1 × YPD como controle em branco e outra com 1 mL da pré-cultura
   6. Cultive 150 mL de pré-cultura durante a noite (16–20 h) a 30 °C com agitação orbital a 270 rpm.
4. Preparação da subcultura no OD_{inicial desejado 600} (no dia da eletroporação)
   1. Prepare o tampão de condicionamento e o meio de crescimento, conforme descrito na Tabela 5.
   2. Meça o OD₆₀₀ da pré-cultura da noite anterior (o OD₆₀₀ esperado é 17–22). Para estar dentro da faixa linear do espectrofotômetro, meça uma diluição de 1:20 da pré-cultura.
   3. Calcule o volume de pré-cultura necessário para inocular uma subcultura de 100 mL. Recomenda-se uma subcultura inicial OD₆₀₀ de 3,0–4,0.
   4. Dilua a cultura até o OD inicial_{desejado de 600} em 100 mL de 2 × YPD em um frasco Erlenmeyer de 500 mL.
   5. Incube a subcultura de 100 mL a 30 °C com tremores orbitais a 270 rpm por 4 horas.
5. Preparação do meio durante incubação de 4 horas
   1. Mantenha o buffer de eletroporação gelado e a água estéril prontos (a partir da etapa 2.1.1).
   2. Prepare o tampão de condicionamento (100 mL), seguindo a receita da Tabela 5. Use 20 mL de buffer de condicionamento por transformação; Aumente conforme a escala. Armazene em temperatura ambiente (20–23 °C).
      NOTA: ATENÇÃO: O tampão condicionador contém ditiotreitol (DTT) e acetato de lítio (LiAc), que são irritantes químicos que podem causar irritação na pele e nos olhos. Use EPI adequado, incluindo jaleco, luvas de nitrilo e óculos de segurança, e manuseie esses reagentes de acordo com os procedimentos institucionais de segurança química. Descartar soluções não utilizadas e tampões usados como resíduos químicos, de acordo com as diretrizes institucionais.
   3. Prepare o meio de crescimento (50 mL): Misture 25 mL de 2 × YPD e 25 mL de 1 M de sorbitol. Use 8 mL de meio de crescimento por transformação. Armazene em temperatura ambiente (20–23 °C).
6. Preparação de células de levedura eletrocompetentes após incubação de 4 horas.
   1. Divida a subcultura de 100 mL em dois tubos cônicos de 50 mL. Colete as células por centrifugação a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos, depois decante o meio. Mantenha as células no gelo até que a etapa 2.6.4 seja concluída.
   2. Suspenda suavemente cada pellet celular com 25 mL de água estéril gelada. Centrifuge a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos, depois decante o meio.
   3. Repita o passo 2.6.2.
   4. Ressuspenda suavemente cada pellet celular com 25 mL de tampão de eletroporação gelado. Centrifuge a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos, depois decante o meio.
   5. Retire as células do gelo e ressuspenda suavemente cada pellet celular com 10 mL de tampão de condicionamento em temperatura ambiente (20–23 °C). Depois, acumule em um único frasco Erlenmeyer de 125 mL e incube a 30 °C com agitação orbital a 270 rpm por 30 minutos.
   6. Despeje as células em um tubo de 50 mL. Centrifuge a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos. Decante a mídia.
   7. Resuspenda suavemente o pellet celular com 50 mL de tampão de eletroporação gelado. Centrifuge a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos, depois decante o meio.
   8. Resuspenda a pastilha da célula até um volume final de 1 mL adicionando aproximadamente 100–200 μL de tampão de eletroporação. Mantenha as células no gelo até a eletroporação.
      NOTA: Células eletrocompetentes podem ser congeladas (ou seja, colocadas em um freezer a –80 °C) e usadas posteriormente sem perda significativa de eficiência de eletroporação.
7. Eletroporação, crescimento e revestimento
   1. Pré-resfriar cuveta de eletroporação com espaço de 0,2 cm sobre gelo.
   2. Transfira 380 μL do pellet ressuspenso para um tubo estéril de 1,5 mL. Misture com 4 μg de DNA plasmídico ou com 4 μg de vetor plasmídico linearizado e 12 μg de inserção. Misture suavemente pipetando.
      NOTA: Para maximizar o número de células eletroporadas, as concentrações de vetor e DNA inserido devem idealmente ser de 700–800 ng/μL. Se as concentrações forem menores que isso, use um concentrador a vácuo.
   3. Transfira a suspensão para a(s) cubeta(s) de eletroporação pré-resfriada. Fique no gelo por 5 minutos.
   4. Limpe as laterais da cuvette após 5 minutos com um lenço de laboratório sem fiapos para eliminar a umidade residual, que pode causar arcos durante a eletroporação. Evite bolhas ou células acima das placas metálicas da cubeta, pois elas também podem causar arcos elétricos. Para manter a temperatura fria da cubeta, não toque nos eletrodos da placa.
   5. Prepare 8 mL de meio de crescimento em um tubo cônico de 50 mL.
   6. Eletropore as células com as seguintes configurações: tensão de 2,5 kV, capacitância de 25 μF e resistência de 200 Ω⁹. A faixa de constantes de tempo aceitável é de 2,8–4,5 ms.
      NOTA: CUIDADO: A eletroporação envolve pulsos elétricos de alta voltagem. Certifique-se de que as cuvetas estejam bem encaixadas e siga as instruções de operação do fabricante. Descarte as cuvetas de eletroporação usadas como resíduos bio-perigosos conforme as diretrizes institucionais.
   7. Inunde imediatamente a cuveta com aproximadamente 200 μL de meio de crescimento do tubo cônico e transfira as células eletroporadas para o tubo cônico de 50 mL. Adicione mais 200–350 μL de meio de crescimento até que não reste mais líquido visível na cubeta.
   8. Incubar o tubo cônico de 50 mL das células eletroporadas em 8 mL de meio de crescimento a 30 °C sem agitar por 1 hora. Inverta o tubo a cada 15 minutos para misturar.
   9. Colete as células por centrifugação a 1.500 × g, 25 °C por 3 minutos. Depois, decante a mídia.
   10. Resuspenda as células em meios adequados de dropout para leveduras para manter a seleção das células transformadas. Para plasmídeos contendo o marcador de seleção TRP1, ressuspendam células em 250 mL de SDCAA+ (que não contém triptofano) para recuperar seletivamente leveduras que retiveram o plasmídeo.
   11. Incubar durante a noite (16–20 h) a 30 °C com tremores orbitais a 270 rpm.

3. Indução, coloração e separação citométrica de fluxo de células de levedura

1. Indução da biblioteca de protease e do cassete substrato (1 dia antes da separação)
   1. Meda OD₆₀₀ como no passo 2.4.2 após o crescimento da noite dos transformantes em meios de dropout.
   2. Aliquota 12 mL de transformantes de levedura e centrífuga a 3.200 × g por 5 minutos.
   3. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em meio indução SGCAA+ até um OD₆₀₀ de 0,5. Calcule o volume de resuspensão necessário usando a equação de diluição, C₁V₁ = C₂V₂.
   4. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 125 mL e cresça durante a noite por 18–24 horas a 30 °C com tremores orbitais a 270 rpm.
2. Coloração por anticorpos fluorescentes (no dia da seleção)
   1. Meça OD₆₀₀ de células após a indução. Use duas cubetas: uma com 1 mL de SGCAA+ e outra com 950 μL de SGCAA+ misturado com 50 μL de células. Multiplique o valor medido de_{OD 600} por 20 para obter o verdadeiro OD₆₀₀ das células pós-indução.
   2. Normalize cada amostra para 3 × 10⁷ células para coloração de anticorpos e classificação FACS. Use C₁V₁ = C₂V₂ para calcular o volume de células a serem transferidas do frasco de indução.
      NOTA: Para mutagênese por saturação de NNS em quatro sítios, o tamanho teórico da biblioteca é de 10⁶ variantes. Para amostrar suficientemente a biblioteca, faça uma triagem pelo menos 10 vezes maior que o tamanho da biblioteca, ou seja,^{10 células 7} . Exemplo: se desejado_{C 1}V₁ = 3 × 10⁷ células e C₂ = pós-indução_{OD 600} de 6 (ou seja, 6 × 10⁷ células/mL), então aliquota 500 μL de células induzidas (ou seja, V₂ = 3 × 10⁷ células / 6 × 10⁷ células/mL = 500 μL).
   3. Transfira o volume calculado das células para um tubo de 1,5 mL e centrifuge a 5.000 × g por 5 min.
   4. Remova o sobrenadante e resuspenda em 500 μL de soro tampão fosfatado (PBS) + 0,5% de albumina sérica bovina (BSA).
   5. Centrifuge a 5.000 × g por 5 minutos e repita o passo 3.2.4.
   6. Centrifuge a 5.000 × g por 5 minutos e, enquanto isso, complete o passo 3.2.7.
   7. Prepare uma mistura de coloração de anticorpos em um tubo de 1,5 mL contendo isotiocianato de fluoresceína anti-HA (FITC) (0,5 μg/10⁷ células), anti-FLAG ficoeritrina (PE) (0,05 μg/10⁷ células) e PBS + 0,5% de BSA (100 μL/10⁷ células). Mantenha o tubo no gelo.
   8. Remova o sobrenadante e ressuspenda com a mistura de mancha. Use 300 μL da mistura de corante por 3 × 10⁷ células. Não faça vórtice no tubo; Apenas inverta ou faz um flick.
   9. Mantenha as células no gelo no escuro por 1 hora após a ressuspensão.
3. Lavagem pós-mancha
   1. Tinga células com centrifugação a 5.000 × g por 5 minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em PBS contendo 0,5% de BSA usando 0,5 mL por 1 × 10⁷ células (por exemplo, 500 μL para 1 × 10⁷ células ou 1,5 mL para 3 × 10⁷ células).
   2. Centrifuge a 5.000 × g, 5 min. Remova o sobrenadante, resuspenda em 750 μL de PBS + 0,5% de BSA.
   3. Transfira mais 750 μL de PBS + 0,5% de BSA para um tubo coletor de 10 mL.
4. FACS
   1. Realize a inicialização e preparação necessárias do citômetro para um novo experimento.
   2. Crie três dot-plots. No primeiro gráfico de pontos, selecione o nome do eixo X para exibir o canal de área de dispersão frontal (FSC-A) e o nome do eixo Y para exibir o canal de área de dispersão lateral (SSC-A).
      NOTA: Isso facilitará a seleção de células vivas.
   3. Mantenha o nome do eixo X para exibir o canal FSC-A enquanto altera o canal do eixo Y para mostrar a altura de dispersão direta (FSC-H) no segundo ponto gráfico.
      NOTA: Isso facilitará a seleção de singlets.
   4. Selecione o nome do eixo X para exibir o canal PE e o nome do eixo Y para exibir o canal FITC no terceiro dot-plot.
   5. Execute controle negativo no citômetro usando os canais de 530/30 nm (FITC) e 585/42 nm (PE). Realize a separação usando um bico de 70 μm a 70 psi de pressão de bainha. Adquira amostras a uma velocidade de 4000–5000 eventos/s.
   6. Desenhe uma porta de polígonos ao redor da população principal de células de levedura intactas para excluir detritos e pequenas partículas com sinais baixos de FSC-A e SSC-A no primeiro ponto gráfico (FSC-A versus SSC-A).
   7. Singlets de porta em um gráfico FSC-H versus FSC-A dentro desse portal, selecionando a população linear que exibe uma relação proporcional entre FSC-H e FSC-A. Exclua eventos que se desviam da distribuição linear e correspondem a doublets e agregados de células.
      NOTA: O terceiro dot-plot para PE versus FITC exibirá um aglomerado diagonal de pontos para o controle negativo (ou seja, células de levedura expressando o cassete do substrato intacto).
   8. Faça amostras e separe as células de levedura com base nos valores desejados de PE/FITC em um(s) tubo(s) coleta. Analise um número total de células correspondente a pelo menos 10 vezes o tamanho teórico da biblioteca para garantir uma representação adequada de todas as variantes (por exemplo, analise ~1 ×^{10 7} células para uma biblioteca com diversidade teórica de ~1 × 10⁶ variantes).
   9. Posicione a porta de classificação abaixo da diagonal PE/FITC da população controle negativa.
      NOTA: Portas mais rigorosas melhoram o enriquecimento das variantes desejadas, mas reduzem a recuperação celular.
5. Pós-FACS
   1. Válvula(s) de coleta de centrífuga a 3.200 × g por 5 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando 1 mL, e resuspenda 5 mL de PBS.
      NOTA: Deixe 1 mL de sobrenadante, pois a célula na parte inferior não será visível após a centrifugação.
   2. Centrifuge as células novamente a 3.200 × g por 5 minutos. Remova o sobrenadante, restando 1 mL. Resuspenda com 4 mL de SDCAA+.
   3. Em um frasco Erlenmeyer de 250 mL, adicione 15 mL de SDCAA+. Transfira as células ressuspensas do passo 3.5.2 para este frasco.
   4. Incube durante a noite por 18–24 horas a 30 °C com tremores orbitais a 270 rpm.
   5. Repita os passos 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 em cada rodada de evolução direcionada.

4. Recuperação de plasmídeos e sequenciamento de clones individuais

1. Cultivar colônias individuais
   1. Faça um estoque de glicerol misturando 500 μL da cultura líquida após a etapa 3.5.4 e 500 μL de glicerol estéril de 50%, resultando em uma solução de estoque de glicerol a 25%. Vórtice para misturar bem as células.
   2. Armazene no freezer a –80 °C durante a noite. Para armazenamento a longo prazo, transfira para nitrogênio líquido.
   3. Raspe o material de glicerol usando uma ponta estéril de 1000 μL e misture em 100 μL de SDCAA+. Coloque essa mistura em uma placa SDCAA e incube-a de cabeça para baixo a 30 °C.
   4. Colha as colônias após 3 dias e cultive-as durante a noite em 1,5 mL de SDCAA+ em tubos de 14 mL.
2. Realize o miniprep de levedura para extrair plasmídeos
   1. Granule a cultura durante a noite centrifugando a 16.000 × g por 1 minuto e ressuspenda 200 μL da Solução 1 de um kit de purificação de plasmídeos de levedura.
   2. Adicione 5 μL de solução enzimática lítica (5 U/μL).
   3. Incube em uma incubadora a 37 °C por 4 horas em uma batedeira ponta a ponta.
   4. Realize um ciclo de congelamento-descongelamento congelando a -80 °C por 20 minutos e descongelando a 42 °C por 10 minutos em banho-maria.
   5. Adicione 200 μL da Solução 2 de um kit de purificação de plasmídeos de levedura, misture invertendo 2–3 vezes e deixe agir por 5 minutos.
   6. Adicione 400 μL da Solução 3 de um kit de purificação de plasmídeos de levedura e misture invertendo 2–3 vezes. Centrifuge a 16.000 × g por 5 minutos.
   7. Purifique o DNA plasmídico usando um kit de purificação com uma coluna de alta capacidade de ligação ao DNA.
      NOTA: Devido à grande quantidade de DNA genômico de levedura cisalhado proveniente das células lisadas, é necessário usar uma coluna à base de sílica com maior capacidade de ligação ao DNA (35 μg) em vez de uma coluna de purificação de DNA plasmídico de levedura de menor capacidade (5 μg⁾¹⁵.
   8. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro. Os rendimentos de DNA são de 10–30 ng/μL.
3. Transformar plasmídeos purificados em células de E. coli quimicamente competentes
   1. Prepare o meio SOC, seguindo a receita da Tabela 5, e placas de LB-cloranfenicol. Além disso, pré-aqueça um banho-maria a 42 °C.
   2. Aqueça uma placa de LB-cloranfenicol para cada plasmídeo a 37 °C por 20 minutos.
   3. Pegue um tubo de células quimicamente competentes do freezer a –80 °C e descongele no gelo.
   4. Aliquota 30 μL de células competentes para cada plasmídeo em um tubo de 1,5 mL sobre gelo.
   5. Pipete 3 μL de plasmídeo em células competentes. Mexa para misturar e deixe descansar por 5 minutos no gelo.
   6. Realize choque térmico incubando brevemente as células no banho-maria a 42 °C por 40 segundos.
   7. Incube no gelo por 2 minutos.
   8. Adicione 300 μL de meio SOC às células e incube por 15 minutos a 37 °C a 220 rpm.
   9. Placa 50–100 μL de células competentes transformadas em placas pré-aquecidas.
   10. Incube as placas a 37 °C de cabeça para baixo por 18 horas.
4. Colheita de colônias
   1. Adicione 5 mL de meio líquido de LB-cloranfenicol em tubos de cultura de fundo redondo de 14 mL.
   2. Escolha uma colônia usando uma ponta estéril de 1000 μL e coloque-a em um tubo de cultura.
   3. Coloque os tubos em um shaker (220 rpm, ângulo de 30°–45° para maximizar a aeração) a 37 °C por 18 horas.
5. Extração de plasmídeos a partir de cultura líquida bacteriana
   1. Centrifuge as culturas líquidas a 3.200 × g por 4 minutos. Decante o sobrenadante.
   2. Extraia plasmídeos de culturas durante a noite usando um kit de purificação de plasmídeos.
   3. Meça a concentração de plasmídeos purificados usando um espectrofotômetro.
6. Submeter plasmídeos para sequenciamento
   NOTA: Use serviços como sequenciamento de nanoporos de plasmídeos inteiros ou, alternativamente, sequenciamento Sanger com um primer flanqueando a região mutagenizada.

Resultados

A construção eficiente da biblioteca é fundamental para garantir cobertura suficiente do espaço mutacional. Para evitar a perda de variantes funcionais raras, o número de transformantes deve atingir pelo menos 10× a 100× o tamanho teórico da biblioteca. Como a eficiência da transformação em S. cerevisiae é influenciada pela concentração celular e é maior nas células de fase logarítmica inicial^{a média 16}, otimizamos a densidade inicial da célula antes da eletroporação. Culturas de levedura foram subcultivadas com valores iniciais de_{DO 600} variando de 1,0–4,0 e incubadas por 4 h (n = 2–4 experimentos biológicos independentes), após os quais os valores finais de_{OD 600} foram mapeados na curva de crescimento de S. cerevisiae para confirmar que as células permaneceram dentro da fase de crescimento médio (Figura 5A, Figura Suplementar 1).

A eletroporação dessas culturas com 4 μg de DNA plasmídico (n = 2 experimentos biológicos independentes) mostrou que a eficiência da transformação diferia significativamente nas condições iniciais de OD₆₀₀ (ANOVA unidirecional, p = 8,92 × 10⁻⁷). Em relação às culturas iniciadas em OD₆₀₀ = 1,0, todas as densidades celulares iniciais maiores produziram eficiências de transformação significativamente maiores (teste de múltiplas comparações de Dunnett; OD₆₀₀ = 1,5, ajustado p = 0,0020; OD₆₀₀ ≥ 2,0, ajustado p < 0,0001), com a maior eficiência de transformação observada em um OD_{inicial de 600} de 4,0. Para aproveitar a capacidade natural das células de levedura de realizar recombinação homóloga, também eletroporamos 4 μg do vetor plasmídico linearizado e 12 μg do inserto (ou seja, biblioteca de proteases) em células de levedura (n = 2 experimentos biológicos independentes). A eficiência da transformação diferia significativamente entre as condições iniciais testadas do_{OD 600} (ANOVA unidirecional, p = 0,0023). Em relação às culturas iniciadas em OD₆₀₀ = 1,0, as eficiências de transformação foram significativamente maiores em OD₆₀₀ = 3,0 ( ajustado p = 0,0018), 3,5 ( ajustado p = 0,0062) e 4,0 ( ajustado p = 0,0024) (teste de múltiplas comparações de Dunnett). Observamos a maior eficiência de transformação em uma densidade inicial moderada de subcultura (OD₆₀₀ = 3,0), indicando um equilíbrio ótimo entre competência celular e eficiência de recombinação nessas condições (Figura 5B). Comparado à transformação apenas plasmídica, a coeletroporação de um vetor linearizado e inserto de biblioteca de protease (n = 2 réplicas biológicas independentes) gerou eficiências de transformação significativamente maiores nas condições iniciais testadas_{de OD 600} (ANOVA bidirecional nas eficiências de transformação log10, p = 9,40 × 10⁻¹²). Em média, a coeletroporação produziu um aumento médio de 121 vezes na eficiência de transformação (IC 95%, 63–233 vezes) em relação à transformação apenas por plasmídeo (Figura 5B).

Durante uma corrida FACS de células de levedura contendo a biblioteca de protease mutante e o cassete de seleção de substrato (Figura 6A), as células exibirão uma cassete truncada ou uma protease que ainda cliva o substrato de contra-seleção (Q1), expressarão variantes de protease não funcionais (Q2) ou expressarão variantes de protease que cortam com sucesso apenas o substrato de seleção (Q3). Células de levedura que expressam variantes não funcionais apareceram como uma população dominante distribuída ao longo da diagonal nos gráficos PE versus FITC, refletindo a co-retenção de ambos os sinais (Figura 6A, Q2). Em contraste, variantes funcionais que dividiram o substrato de seleção enquanto poupavam o substrato nativo (contra-seleção) formaram uma população fora da diagonal distinta, caracterizada por alta intensidade de sinal de PE e média a baixa de FITC (Figura 6A, Q3). A aplicação de uma estratégia rigorosa de gate para isolar essa população fora da diagonal resultou em enriquecimento progressivo das variantes funcionais ao longo de rodadas sucessivas de classificação¹⁰. Esse enriquecimento é observado visualmente como um agrupamento cada vez mais definido de células separadas do agrupamento diagonal (Figura 6B, da esquerda para a direita). Se não houver uma população fora da diagonal distinta, isso pode indicar baixa qualidade da biblioteca, expressão insuficiente ou condições de coloração subótimas. Como controle negativo, a Figura 6C,D mostra células de levedura eletroporadas, induzidas e não coradas, além dos correspondentes histogramas de fluorescência FITC e PE.

Dentro da população enriquecida fora da diagonal, as subpopulações podem ser ainda mais resolvidas com base na intensidade do FITC. Células que exibem um sinal FITC médio podem ser ordenadas separadamente daquelas com sinal FITC baixo. O sequenciamento dessas populações distintas revelou perfis de mutação únicos (Tabela 11), indicando que diferentes eficiências de clivagem estão associadas a diferentes variantes de protease.

Figura 1: Preparação de Vetores e Inserção. (A) Geração de bibliotecas de proteases potyvirais via mutagênese por saturação de sítios. (B) Montagem de cassete de substrato e integração no vetor de exibição da levedura (pDD1523). (C) Linearização do vetor de exibição da levedura (pDD1524) via digestão por restrição. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Eletroporação do cassete substrato e da biblioteca de proteases mutantes amplificadas por PCR em células competentes EBY100. (Caixa tracejada) Circularização in vivo do plasmídeo contendo tanto protease quanto cassete substrato. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Indução, coloração e separação citométrica de células de levedura. (A) Indução da biblioteca de protease e do cassete substrato. (B) Coloração por anticorpos fluorescentes: Coloração com anticorpos anti-HA fluoresceína isotiocianato (FITC) e anti-FLAG fileritrina (PE). (C) As células coradas são ordenadas usando Filtração de Células Ativadas por Fluorescência (FACS). (D) Recuperação de células separadas por FACS em meios de seleção. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Recuperação de plasmídeos e sequenciamento de células de levedura separadas. (A) Placagem de células de levedura separadas. (B) Extração de plasmídeos de colônias individuais de leveduras. (C) Transformação de plasmídeos extraídos por E. coli. (D) Extração de plasmídeos de colônias individuais de E. coli. (E) Sequenciamento nanopore dos plasmídeos extraídos. Ícones de frascos e tubos adaptados do DBCLS e Helicase 11, respectivamente, via Bioicons (https://bioicons.com) e adaptados sob os termos da Licença Internacional Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Curvas de crescimento da levedura em diferentes meios de cultivo e a influência da densidade óptica inicial a 600 nm (OD₆₀₀) de subcultura na eficiência da eletroporação da levedura. (A) Curvas de crescimento da levedura em 1 × Extrato de Peptona de Dextrose (YPD), 2 × YPD, Ágar de Ácidos Casaminos de Dextrose Sintética sem antibióticos (SDCAA-) e Ágar de Ácidos Casamino de Dextrose Sintética com antibióticos (SDCAA+). (B) Eficiência de transformação da levedura eletroporada com vetor plasmídico de 4 μg em vários OD inicial de subcultura₆₀₀, e eficiência de transformação usando vetor linearizado (4 μg) e inserção de biblioteca de proteases (12 μg) nos mesmos valores iniciais de OD₆₀₀ . Os dados em (A) são apresentados como OD₆₀₀ ± SD de dois experimentos biológicos independentes (n = 2). Os dados em (B) são apresentados como número médio de transformantes por eletroporação em um eixo y logarítmico, com réplicas biológicas individuais mostradas como círculos (n = 2). A significância estatística para os experimentos de otimização por eletroporação plasmídeo e vetor mais inserto foi determinada usando ANOVA unidirecional nas eficiências de eletroporação transformadas log10, seguida pelo teste de múltiplas comparações de Dunnett usando OD₆₀₀ = 1,0 como controle. ns, não significativo; p < 0,01 (**); p < 0,0001 (****). A significância estatística da diferença entre eficiências de transformação apenas plasmídico e vetor-mais-inserto foi determinada usando ANOVA bidirecional nas eficiências transformadas log10. p < 0,0001 (****). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Enriquecimento baseado em Filtração Celular Ativada por Fluorescência (FACS) de clones de levedura. (A) Representação esquemática da estratégia de cancelamento. As células foram divididas em três regiões: Q1, células de ficoeritrina (PE)-baixa; Q2, PE alto/fluoresceína isotiocianato (FITC) - células altas; e Q3, células PE-altas com fluorescência FITC baixa a intermediária. Células dentro do Q3 foram coletadas para enriquecimento. (B) Gráficos FACS representativos de uma campanha evolutiva independente mostrando rodadas sequenciais de triagem com crescente rigor de bloqueio FITC. Células de FITC médio e baixo foram coletadas separadamente para sequenciamento. Percentuais indicam a fração de células vivas de levedura única dentro da população controlada. (C) Gráfico representativo FACS mostrando células de levedura eletroporadas e não coradas como controle negativo. (D) Histogramas das intensidades de fluorescência FITC-A (esquerda) e PE-A (direita) correspondentes aos dados mostrados em (C). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Mistura de reação para amplificação de PCR na primeira rodada da biblioteca de proteases. Composição da reação PCR usada para a amplificação inicial da biblioteca de proteases, incluindo as concentrações finais e quantidades de cada reagente em uma reação de 50 μL. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Condições de ciclo para amplificação por PCR na primeira rodada da biblioteca de proteases. O programa de ciclo térmico foi usado para a amplificação por PCR na primeira rodada da biblioteca de proteases. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Mistura de reação para amplificação de PCR na segunda rodada da biblioteca de proteases. Composição da reação PCR usada para a amplificação da segunda rodada da biblioteca de proteases, incluindo as concentrações finais e quantidades de cada reagente em uma reação de 50 μL. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 4: Condições de ciclo para amplificação de PCR na segunda rodada da biblioteca de proteases. O programa de ciclo térmico foi usado para a amplificação PCR de segunda rodada da biblioteca de proteases. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 5: Mídia e Reagentes para Eletroporação e Crescimento de Leveduras. Descrição tabular da massa necessária de cada componente químico para formular quantidades específicas de 1 × e 2 × Extrato de Levedura Peptona Dextrose (YPD), tampão de eletroporação, tampão de condicionamento, meio de crescimento, Dextrose Sintetica Ácidos Casmininos com antibióticos (SDCAA+), Ácidos Casamino Galactose Sintéticos com antibióticos (SGCAA+), meio de Caldo de Lisógena (LB), meio LB-cloranfenicol, meio de caldo Super Ótimo (SOB) e meio Super Ótimo com meio de repressão catabólica (SOC). Instruções para preparar soluções de estoque, como 2 M de Sorbitol, 1 M ditiotreitol (DTT) e 2 M de acetato de lítio (LiAc), estão incluídas. Instruções adicionais para preparar placas de ágar SDCAA, LB e YPD são fornecidas. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 6: Mistura de reação para recozimento e fosforilação de oligos. Composição da mistura de reação usada para recozimento simultâneo e fosforilação de oligonucleotídeos para montagem de cassete de substrato. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 7: Condições de ciclagem para recozimento e fosforilação de oligos. Programa de temperatura usado para recozimento de oligonucleotídeos e fosforilação para montagem de cassetes de substrato. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 8: Mistura de reação para a montagem Golden Gate de casete substrato e plasmídeo vetorial. Composição da reação de montagem Golden Gate usada para ligar o cassete substrato no plasmídeo vetorial. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 9: Condições de ciclagem para a montagem Golden Gate de plasmídeos de cassete e vetores de substrato. Programa de ciclo térmico usado para montagem do Golden Gate. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 10: Mistura de reação para linearização de plasmídeo vetorial. Composição da reação de digestão por restrição usada para linearizar o plasmídeo vetorial antes da construção da biblioteca. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 11: Resultados do sequenciamento nanoporo de variantes TEVp que clivam ENLYFES. Plasmídeos foram extraídos das células de levedura após a quarta e última sessão de FACS. As mutações em cada clone são mostradas em relação à sequência do tipo selvagem. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura suplementar 1: Relação entre a densidade inicial e final da cultura EBY100 durante a subcultura. As culturas EBY100 foram subcultivadas em valores iniciais variados de_{OD 600} , e a OD_{final 600} foi medida após incubação sob condições idênticas de crescimento (30 °C, 220 rpm). A densidade final de cultura aumentou linearmente com o aumento do OD_{inicial 600} (R² = 0,969, p = 5,77 × 10⁻⁵). Os pontos de dados representam médias ± DS de réplicas biológicas independentes (n = 2–4). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Projeto racional da biblioteca de mutagênese TEVp. Representação em desenho animado do TEVp (PDB ID: 1LVB) com os quatro resíduos (dourados) <5Å de distância do resíduo P1 (roxo) direcionados para mutagênese por saturação do sítio. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A evolução dirigida é um método de alto rendimento que utiliza ciclos iterativos de diversificação e seleção para identificar proteínas com função bioquímica aprimorada^{ou nova 17}. Neste protocolo, detalhamos um fluxo de trabalho otimizado para evoluir o reconhecimento de substrato protease usando um sistema de exibição de superfície celular em S. cerevisiae. O sistema de exibição de superfície mapeia a atividade de protease para um fenótipo detectável baseado em fluorescência, permitindo o enriquecimento baseado em FACS dos clones desejados. Fornecemos os passos detalhados para a montagem de fitas cassete de biblioteca de proteases e substratos, eletroporação de alta eficiência, portão e triagem de FACS, e sequenciamento final de variantes de protease.

Um dos passos mais essenciais na evolução dirigida é garantir diversidade suficiente na biblioteca e cobertura de potenciais^{mutações 17}. Nossos experimentos de eficiência de eletroporação mostram que uma subcultura inicial OD₆₀₀ de 3,0 gera a maior eficiência de transformação, excedendo^10,9 CFU. Essa escala, alcançada com eletroporação otimizada por levedura, supera substancialmente a dos métodos convencionais de transformação química e permite uma cobertura adequada de grandes bibliotecas combinatórias ^8,9. A triagem e a triagem precisas do FACS são essenciais para separar células que exibem as propriedades de clivagem desejadas daquelas que apresentam clivagem inespecífica. Durante múltiplas rodadas de seleção baseada em FACS, a estratégia de gate se torna cada vez mais rigorosa para enriquecer seletivamente as variantes desejadas de proteases. Se o gate for muito amplo, células indesejadas podem ser separadas junto com as variantes desejadas. O gating rigoroso (por exemplo, limiares cada vez mais baixos para o sinal FITC entre rodadas) permite que a população celular se enriqueça para variantes de protease com maior especificidade e atividade em relação à nova sequência do substrato^{alvo 10}. De acordo com campanhas^{anteriores 7,18}, realizamos mutagênese por NNS-códon de quatro resíduos no bolsão de ligação ao substrato do TEVp que interagem com o resíduo do substrato P1, Q (T146, D148, H167, S170) (Figura Suplementar 2). Os gráficos FACS mostrados na Figura 6B representam um único experimento representativo de ordenação que ilustra a estratégia de gate e o fluxo de trabalho de enriquecimento. Curiosamente, os resultados da nossa campanha produziram variantes TEVp com um conjunto diferente de mutações em aminoácidos (Tabela 11). Esses resultados apoiam uma característica fundamental da evolução da protease: múltiplos caminhos evolutivos podem levar ao mesmo objetivo.

Modificações e estratégias de solução de problemas podem ser necessárias durante a condução dos experimentos. Por exemplo, durante a eletroporação, trabalhar no gelo quando indicado e ressuspender cuidadosamente os pellets celulares a cada etapa garante que as células estejam vivas e saudáveis antes da eletroporação. As células de levedura são delicadas durante as etapas de eletroporação até a etapa de recuperação do crescimento exterior. Além disso, pode ser necessária a modificação do fluido da bainha FACS para evitar a floculação das células de levedura. O fluido de bainha é comumente usado em máquinas FACS e pode conter conservantes que inibem o crescimento bacteriano e fúngico. Portanto, o fluido da bainha pode ser substituído por PBS puro para evitar a morte celular durante a seleção.

O sistema de exibição da superfície da levedura requer proteínas devidamente dobradas para atravessar com sucesso a via secretora. Algumas variantes de protease podem perder atividade devido a dobramentos incorretos, levando a falsos positivos durante a seleção do FACS causados por clivagem inespecífica ou fluorescência de fundo. Fontes bem caracterizadas de falsos positivos merecem destaque para campanhas baseadas em plasmídeos como esta. Como a clivagem é interpretada como perda da etiqueta epitópica C-terminal, qualquer mutação que perturbe essa marca gera o mesmo fenótipo de baixo FITC que um evento genuíno de clivage; tais mutações de etiquetas surgem durante a recombinação homóloga em grande escala e podem enriquecer ao longo de rodadas de seleção sucessivas. A integração cromossômica do cassete de substrato constante foi recentemente demonstrada como capaz de mitigar esse^{problema 19}. O protocolo depende do uso de uma biblioteca de inserção mantendo o vetor (contendo a fita cassete substrato) constante. Portanto, esse protocolo não é adequado para aqueles que desejam evoluir tanto bibliotecas de protease quanto de substrato.

A plataforma YESS foi pioneira em uma rota geral para reprogramar a especificidade^{protease-substrato 18}. Melhorias recentes incluem: adição de controle enzimático/substrato titratável no YESS2.0⁷, acoplamento ao sequenciamento de próxima geração, possibilitado de perfil de especificidade^{de alta resolução 20} e integração cromossômica dos relatores para reduzir ruído de expressão e falsos^{positivos 19}. Outras estratégias ortogonais, como a evolução contínua assistida por fagos, também foram aplicadas na engenharia da especificidade de protease para alvos terapêuticos²¹. Essas ferramentas encontraram aplicações além da engenharia de proteases TEV, como o perfilamento de alta resolução da protease principal do SARS-CoV-2 para guiar o projeto^{inibidor 22}. Um determinante crucial de qualquer campanha desse tipo é gerar transformadores suficientes para cobrir grandes bibliotecas combinatórias (>10⁹), que não haviam sido sistematicamente otimizadas na cepa EBY100 S. cerevisiae . Ao definir as condições de fase de crescimento e eletroporação que impulsionam a transformação EBY100 acima de^10,9 CFU, esse protocolo remove esse gargalo, permitindo uma triagem abrangente baseada em FACS de milhões de variantes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software