É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Fluxo de Trabalho Otimizado de Exibição de Superfície de Levedura para Evolução Dirigida de Proteases

331 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/72559

⸱

4 de agosto de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho otimizado para a evolução dirigida de proteases virais em Saccharomyces cerevisiae usando um sistema de seleção baseado em exibição de superfícies. Ele descreve o design da biblioteca de insertos de DNA e do cassete de substrato, eletroporação otimizada para alta eficiência de transformação, seleção baseada em separação celular ativada por fluorescência para clivagem de protease e sequenciamento de variantes enriquecidas.

Resumo

A evolução dirigida imita o processo evolutivo natural em um ambiente de laboratório rápido e controlado para evoluir proteínas com funções ou características desejáveis. A triagem de um grande conjunto de genes codificadores de proteínas mutantes permite a seleção funcional das variantes desejadas para aplicações em biotecnologia, medicina e biologia sintética. Usando esse protocolo, realizamos evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae para engenheirar variantes de protease com alta especificidade para uma sequência de substrato não nativa. Exibimos essas variantes de protease na superfície celular da levedura para facilitar a seleção das variantes desejadas por meio de filtração celular ativada por fluorescência (FACS) ao longo de múltiplas rodadas de enriquecimento. Quatro elementos-chave do cassete substrato são coexpressos com a biblioteca de proteases: uma proteína de fusão composta por (i) a subunidade receptora de adesão da levedura Aga2, (ii) sequências de seleção e (iii) sequências de substrato de contra-seleção, (iv) sequências de etiquetas de epítopo e uma sequência opcional de sinal de recuperação do retículo endoplasmático (RE). Células de levedura nas quais apenas a sequência do substrato de seleção é clivada são isoladas usando FACS multicolorido por meio de anticorpos anti-epítopos fluorescentes (marcados com isotiocianato com ficoeritrina/fluoresceína). Aqui fornecemos detalhes do protocolo otimizado, passo a passo, para conduzir uma campanha de evolução de proteases, incluindo design de biblioteca de inserção de DNA e design de fitas cassete de substrato, eletroporação de células de levedura com alta eficiência de transformação (até 109 transformantes por micrograma de DNA), seleção, enriquecimento e sequenciamento baseados em FACS de variantes evoluídas. Demonstramos nosso protocolo de evolução dirigida evoluindo a protease de inclusão nuclear A (TEVp) do vírus do gravador do tabaco de secar sua sequência natural de substrato, ENLYFQ↓S, para a clivagem de uma nova sequência, ENLYFE↓S.

Introdução

As proteases cisteínas da família Potyviridae, especificamente as proteases de inclusão nuclear A (NIa), representam uma fonte amplamente inexplorada de endopeptidases específicas de sequência. Com mais de 3.800 membros da família caracterizada, as proteases NIa clivam uma sequência distinta de substrato composto por sete aminoácidos. A família dos potivirais oferece um conjunto diversificado de proteases para engenharia de sistemas programáveis de controle proteico, construção de circuitos genéticos ortogonais baseados em proteases e desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas específicas parasequências 1,2. Apesar dessa diversidade natural, apenas duas proteases NIa, TEVp e protease do vírus manchado por veias do tabaco (TVMVp), foram completamente caracterizadas e projetadas para uso amplo em laboratório ebiotecnologia 3,4. Esse conjunto limitado de proteases limita o espaço de projeto para circuitos multicomponentes que requerem atividades ortogonais deproteases 5, motivando assim esforços para expandir e caracterizar ainda mais as proteases NIa por meio da evoluçãodirigida 6,7.

A exibição superficial de leveduras emergiu como uma das plataformas mais poderosas para evolução dirigida, permitindo uma triagem de alta produtividade em bibliotecas de proteínas por meio da filtragem celular ativada por fluorescência (FACS)6,7. Por exemplo, o sistema de rastreamento do retículo endoplasmático da levedura (YESS) acopla a atividade da protease à exibição superficial através da via secretora de S. cerevisiae 6,7. O sistema YESS foi aplicado para engenheirar novas especificidades de substrato protease e demonstrou utilidade para campanhas de evolução dirigida em múltiplas rodadas. Neste sistema, variantes de protease são coexpressas com uma proteína de fusão contendo um cassete de substrato de clivagem com marcadores de epítopo, e a âncora superficial Aga1p é expressa na cepa de levedura EBY100. A marcação diferencial com anticorpos fluorescentes distingue cassetes de substrato não clivado exibidos na superfície celular. Esse mecanismo de exibição dependente da atividade é diretamente compatível com a seleção iterativa baseada em FACS para bibliotecas de 10,7 ou maisvariantes 6,7.

Um pré-requisito fundamental para a evolução dirigida é a capacidade de introduzir bibliotecas variantes em escala suficiente para alcançar uma cobertura adequada do espaço de sequências alvo. Para bibliotecas de mutagênese por saturação de sítios abrangendo múltiplas posições de aminoácidos, são necessários rendimentos de transformação de 108 a 109 transformantes únicos para garantir que a diversidade introduzida na biblioteca esteja bem representada na população ordenada. Existem vários métodos para introduzir DNA exógeno em S. cerevisiae, cada um com tetos distintos de rendimento. O método convencional de transformação química utiliza acetato de lítio/DNA transportador de fita simples/polietilenoglicol (LiAc/ssDNA/PEG) devido à sua simplicidade e acessibilidade. No entanto, normalmente alcança eficiências de transformação de apenas10 unidades de formação de colônia (CFU) de 4 a10 6 por micrograma de DNA, ficando aquém da variação de sequência necessária para campanhas de grandesbibliotecas 8. Em contraste, o método de eletroporação aplica um campo elétrico de alta voltagem para permeabilizar transitoriamente a membrana celular e facilitar a absorção do DNA. A eletroporação alcança consistentemente as maiores eficiências de transformação entre os métodos disponíveis, com protocolos otimizados reportando rendimentos de 108–109 CFU 9. Foi observado que a eficiência da eletroporação em S. cerevisiae é criticamente sensível à fase de crescimento celular, massa de DNA e composição do tampão, fornecendo uma estrutura que desde então foi amplamente adaptada para evolução dirigidaem escala de biblioteca 9.

O protocolo descrito aqui utiliza a cepa S. cerevisiae EBY100, uma cepa hospedeira amplamente adotada para exibição superficial de leveduras. O EBY100 foi desenvolvido por Boder e Wittrup integrando uma cassete de expressão AGA1 sob o controle do promotor GAL1 induzível por galactose no locus cromossômico AGA1 da cepa parental deficiente em protease BJ546510. A cepa está comercialmente disponível no ATCC (nº de catálogo MYA-4941; depositante K.D. Wittrup), portando o genótipo MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). Como resultado, tanto Aga1p quanto a fusão do cassete do substrato Aga2p são expressas a partir do mesmo promotor induzível por galactose, garantindo que as duas subunidades sejam coinduzidas e se montem no complexo ligado a dissulfeto Aga1p–Aga2p que ancora a fusão exibida na parede celular.

Apesar do uso generalizado do EBY100 em aplicações de exibição de leveduras, nenhum protocolo publicado foi sistematicamente otimizado para eletroporar essa cepa em rendimentos em escala de biblioteca. Parâmetros específicos do EBY100, como a fase ótima de crescimento na colheita, a composição do meio durante a subcultura e a relação quantitativa entre densidade óptica inicial em 600 nm (OD600) e eficiência de transformação, ainda precisam ser rigorosamente caracterizados e otimizados. Aqui, relatamos que a eficiência da transformação no EBY100 aumenta monotonamente com o OD600 da cultura na colheita, com células na fase final de logaritaria apresentando taxas de transformação substancialmente maiores do que aquelas colhidas na fase inicial de log. Avaliamos parâmetros críticos do protocolo, incluindo valores iniciais deOD 600 na inoculação, uso de meio 2 × Peptone Dextrose (YPD) de extrato de levedura (YPD) para subculturas, formulações de tampão de eletroporação e condições de crescimento pós-eletroporação. O protocolo apresentado aqui fornece um fluxo de trabalho otimizado passo a passo (Figura 1A–C, Figura 2, Figura 3A–D, Figura 4A–E) para preparar células EBY100 eletrocompetentes e realizar eletroporação de biblioteca de DNA de alta eficiência, resultando em taxas de transformação consistentemente acima de 109 CFU. Para validar esse protocolo, realizamos uma campanha abrangente de evolução dirigida para projetar TEVp com especificidade de clivagem alterada ao longo de quatro rodadas de seleção e enriquecimento baseadas em FACS. O sequenciamento de variantes enriquecidas da protease confirmou diversificação substancial em resíduos-alvo dentro do bolso de ligação ao substrato da protease, demonstrando que o protocolo fornece cobertura suficiente de biblioteca do espaço de sequência para apoiar campanhas produtivas de evolução. Este protocolo será de ampla utilidade para pesquisadores que utilizam EBY100 para evolução dirigida baseada em exibição de superfície de levedura e triagem de alto rendimento compatível com FACS de proteases,anticorpos 9, quinases11 e receptores12, entre outras proteínas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo S. cerevisiae recombinante foram conduzidos de acordo com as políticas e procedimentos do Comitê Institucional de Biossegurança e Segurança Química da Universidade do Texas em Dallas. Cepas de levedura recombinantes foram manuseadas sob contenção de Biossegurança Nível 1 (BSL-1) de acordo com práticas institucionais microbiológicas estabelecidas. Eletroporação, cultura e separação celular ativada por fluorescência (FACS) foram realizadas de acordo com procedimentos institucionais aprovados de biossegurança. Culturas de levedura e consumíveis contaminados foram descontaminados e descartados como resíduos bio-perigosos, de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Preparação de vetores e inserções

  1. Geração de bibliotecas de proteases potívirais via mutagênese por saturação de sítios
    1. Projetar usando software de design de sequências que sobrepõe oligonucleotídeos diretos e reversos de 30 a 50 mer, para gerar uma biblioteca mutante de proteases. Substitua o códon do tipo selvagem no oligonucleotídeo correspondente por um codon degenerado NNS, onde N representa A, T, G ou C, e S representa G ou C, para posições alvo da mutagênese.
    2. Projete a sobreposição de 3′ entre cada par de oligonucleotídeos direto e reverso com uma temperatura de fusão (Tm) de 55–60 °C. Projete o primeiro e o último oligonucleotídeo para conter uma sobreposição de 50-nt com o vetor de exibição da superfície da levedura além dos sítios de restrição.
    3. Certifique-se de que pelo menos uma extremidade do inserto se sobreponha exatamente a uma extremidade do vetor linearizado para facilitar a recombinaçãohomóloga 13. Evite lacunas entre oligonucleotídeosadjacentes 14.
    4. Resuspenda os oligos a 100 μM com H2Odeionizado. Em um tubo estéril de 1,5 mL, combine 0,5 μL de cada olígono para um volume final de 200 μL (concentração final de 250 nM para cada oligô).
    5. Configure uma reação de PCR com os componentes listados na Tabela 1 para montar a biblioteca de proteases, usando as condições de termociclagem da Tabela 2.
    6. Configure uma segunda reação de PCR usando os oligos mais externos para frente e para trás (Tabela 3) usando o primeiro produto de PCR montado como modelo. Amplifique o produto conforme mostrado na Tabela 4.
    7. Execute o segundo produto de PCR em um gel de agarose a 1% com brometo de etídio (0,5 μg/mL) a 240 V por 30 minutos. Retirar a faixa correspondente ao comprimento esperado do DNA.
      NOTA: ATENÇÃO: O brometo de etídio é um mutagênico e deve ser manuseado com equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jaleco, luvas de nitrilo e óculos de segurança. Evite contato com a pele e a inalação. Descarte géis, tampões e consumíveis contendo brometo de etídio como resíduos químicos perigosos, de acordo com as diretrizes institucionais de segurança.
    8. Purifique usando um kit de extração em gel. Elute em 50 μL deH2Odeionizado.
    9. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro. Armazene o DNA a −20 °C.
      NOTA: Cada reação de 50 μL dasegunda PCR resultaria em cerca de 0,5–1,0 μg de DNA total. Como cada eletroporação requer 12 μg da biblioteca de protease (ou seja, inserir), aumente as reações de acordo.
  2. Conjunto de cassete de substrato
    1. Prepare placas de ágar LB e meios líquidos de cloranfenicol LB. Veja as receitas na Tabela 5.
    2. Projetar um conjunto de oligonucleotídeos sobrepostos de 30 meros nas direções direta e reversa para a montagem do cassete do substrato. Projete as extremidades 5′ de cada oligonucleotídeo reverso e o oligonucleotídeo direto do próximo fragmento para corresponderem em 4 nucleotídeos.
    3. Resuspenda oligos liofilizados a 100 μM usandoH2Odesionizado.
    4. Misture os reagentes conforme na Tabela 6.
    5. Use o programa de ciclagem na Tabela 7 para recozer e fosforilar a mistura de oligo.
    6. Diluir oligos recozidos 4 vezes em H2Odesionizado para atingir uma concentração final de 1,25 μM.
    7. Combine a mistura de oligo recozido com o vetor (por exemplo, pDD1523), seguindo a Tabela 8.
    8. Realize a montagem Golden Gate, seguindo o programa de ciclismo na Tabela 9.
      NOTA: Por exemplo, o plasmídeo pDD1523 possui um sítio de restrição tipo IIS (BsmBI) a jusante do promotor GAL1/10. A montagem bem-sucedida permite a indução de galactose do substratocassete 7.
    9. Transforme o plasmídeo resultante em E. coli.
    10. Células de placa em ágar LB com o antibiótico correspondente. Incubar por 16–18 horas a 37 °C.
    11. Escolha colônias isoladas e inocule-as em 5 mL de meio LB. Incubar durante a noite (16–18 h) a 37 °C com agitação (220 rpm).
    12. Extraia plasmídeos de culturas durante a noite usando um kit de minipreparação de plasmídeos.
    13. Meça a concentração de plasmídeos usando um espectrofotômetro e então peça para sequenciamento.
  3. Linearização do vetor de exibição de leveduras
    1. Linearize o plasmídeo de exibição da levedura, por exemplo, digera pDD1524 com enzimas de restrição SphI e PstI para preparar o vetor de exibição da levedura contendo o cassete substrato para eletroporação. Misture os reagentes listados na Tabela 10 e incube a 37 °C por 1 hora.
    2. Administre o produto de digestão de restrição em um gel de agarose a 1% a 240 V por 30 minutos. Retire a faixa correspondente ao comprimento esperado de DNA e purifique usando um kit de extração em gel.
      NOTA: Cada 50 μL de digestão de restrição geraria cerca de 0,5–1,0 μg de DNA total. Como cada eletroporação requer 4 μg de vetor linearizado, aumente as reações de digestão de acordo.

2. Eletroporação

Nota: Siga os procedimentos institucionais de segurança para o manuseio de materiais biológicos e reagentes, use EPIs adequados e descarte resíduos biológicos e químicos de acordo com as diretrizes institucionais.

  1. Preparação de tampões, placas e meios (2 dias antes da eletroporação)
    1. Preparar meios de cultivo (1 × YPD; 2 × YPD; Dextrose Sintética de Ácidos Casamino, SDCAA+; e Ácidos Casamino de Galactose Sintético, SGCAA+), placas (YPD e SDCAA), amortecedor de eletroporação e água estéril, seguindo as receitas da Tabela 5. Armazene a 4 °C.
  2. Preparação de uma placa riscada de EBY100.
    1. Faça uma estria de levedura EBY100 em ágar YPD a partir de um estoque de glicerol. Cultive a 30 °C por 2 dias.
    2. Armazene o prato a 4 °C após o crescimento.
      NOTA: Uma placa riscada permanece utilizável por até 1 mês; Marque a data da sequência no prato.
  3. Preparação da pré-cultura do EBY100 (1 dia antes da eletroporação)
    1. Prepare 125 mL de 1 × YPD em um frasco Erlenmeyer de 500 mL.
    2. Prepare 25 mL de 1 × YPD em um tubo cônico de 50 mL. Usando uma ponta de micropipeta, colete células EBY100 da placa cultivada por 2 dias. Depois, transfira as células de levedura da ponta da pipeta para o tubo cônico contendo 1 × YPD.
      NOTA: A faixa de células deve formar uma mancha de aproximadamente 1–2 mm de comprimento.
    3. Remova a ponta da micropipeta e faça um vórtice no tubo cônico para garantir uma mistura adequada.
    4. Prepare uma pré-cultura de 150 mL transferindo 25 mL de 1 × YPD contendo as células da levedura para o frasco de 500 mL contendo 125 mL de 1 × YPD. Gire para misturar.
    5. Usando um espectrofotômetro, meça o OD600 preparando duas microcuvetas com comprimento de caminho de 1 cm: uma com 1 mL de 1 × YPD como controle em branco e outra com 1 mL da pré-cultura
    6. Cultive 150 mL de pré-cultura durante a noite (16–20 h) a 30 °C com agitação orbital a 270 rpm.
  4. Preparação da subcultura no ODinicial desejado 600 (no dia da eletroporação)
    1. Prepare o tampão de condicionamento e o meio de crescimento, conforme descrito na Tabela 5.
    2. Meça o OD600 da pré-cultura da noite anterior (o OD₆₀₀ esperado é 17–22). Para estar dentro da faixa linear do espectrofotômetro, meça uma diluição de 1:20 da pré-cultura.
    3. Calcule o volume de pré-cultura necessário para inocular uma subcultura de 100 mL. Recomenda-se uma subcultura inicial OD600 de 3,0–4,0.
    4. Dilua a cultura até o OD inicialdesejado de 600 em 100 mL de 2 × YPD em um frasco Erlenmeyer de 500 mL.
    5. Incube a subcultura de 100 mL a 30 °C com tremores orbitais a 270 rpm por 4 horas.
  5. Preparação do meio durante incubação de 4 horas
    1. Mantenha o buffer de eletroporação gelado e a água estéril prontos (a partir da etapa 2.1.1).
    2. Prepare o tampão de condicionamento (100 mL), seguindo a receita da Tabela 5. Use 20 mL de buffer de condicionamento por transformação; Aumente conforme a escala. Armazene em temperatura ambiente (20–23 °C).
      NOTA: ATENÇÃO: O tampão condicionador contém ditiotreitol (DTT) e acetato de lítio (LiAc), que são irritantes químicos que podem causar irritação na pele e nos olhos. Use EPI adequado, incluindo jaleco, luvas de nitrilo e óculos de segurança, e manuseie esses reagentes de acordo com os procedimentos institucionais de segurança química. Descartar soluções não utilizadas e tampões usados como resíduos químicos, de acordo com as diretrizes institucionais.
    3. Prepare o meio de crescimento (50 mL): Misture 25 mL de 2 × YPD e 25 mL de 1 M de sorbitol. Use 8 mL de meio de crescimento por transformação. Armazene em temperatura ambiente (20–23 °C).
  6. Preparação de células de levedura eletrocompetentes após incubação de 4 horas.
    1. Divida a subcultura de 100 mL em dois tubos cônicos de 50 mL. Colete as células por centrifugação a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos, depois decante o meio. Mantenha as células no gelo até que a etapa 2.6.4 seja concluída.
    2. Suspenda suavemente cada pellet celular com 25 mL de água estéril gelada. Centrifuge a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos, depois decante o meio.
    3. Repita o passo 2.6.2.
    4. Ressuspenda suavemente cada pellet celular com 25 mL de tampão de eletroporação gelado. Centrifuge a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos, depois decante o meio.
    5. Retire as células do gelo e ressuspenda suavemente cada pellet celular com 10 mL de tampão de condicionamento em temperatura ambiente (20–23 °C). Depois, acumule em um único frasco Erlenmeyer de 125 mL e incube a 30 °C com agitação orbital a 270 rpm por 30 minutos.
    6. Despeje as células em um tubo de 50 mL. Centrifuge a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos. Decante a mídia.
    7. Resuspenda suavemente o pellet celular com 50 mL de tampão de eletroporação gelado. Centrifuge a 4 °C e 1.500 × g por 3 minutos, depois decante o meio.
    8. Resuspenda a pastilha da célula até um volume final de 1 mL adicionando aproximadamente 100–200 μL de tampão de eletroporação. Mantenha as células no gelo até a eletroporação.
      NOTA: Células eletrocompetentes podem ser congeladas (ou seja, colocadas em um freezer a –80 °C) e usadas posteriormente sem perda significativa de eficiência de eletroporação.
  7. Eletroporação, crescimento e revestimento
    1. Pré-resfriar cuveta de eletroporação com espaço de 0,2 cm sobre gelo.
    2. Transfira 380 μL do pellet ressuspenso para um tubo estéril de 1,5 mL. Misture com 4 μg de DNA plasmídico ou com 4 μg de vetor plasmídico linearizado e 12 μg de inserção. Misture suavemente pipetando.
      NOTA: Para maximizar o número de células eletroporadas, as concentrações de vetor e DNA inserido devem idealmente ser de 700–800 ng/μL. Se as concentrações forem menores que isso, use um concentrador a vácuo.
    3. Transfira a suspensão para a(s) cubeta(s) de eletroporação pré-resfriada. Fique no gelo por 5 minutos.
    4. Limpe as laterais da cuvette após 5 minutos com um lenço de laboratório sem fiapos para eliminar a umidade residual, que pode causar arcos durante a eletroporação. Evite bolhas ou células acima das placas metálicas da cubeta, pois elas também podem causar arcos elétricos. Para manter a temperatura fria da cubeta, não toque nos eletrodos da placa.
    5. Prepare 8 mL de meio de crescimento em um tubo cônico de 50 mL.
    6. Eletropore as células com as seguintes configurações: tensão de 2,5 kV, capacitância de 25 μF e resistência de 200 Ω9. A faixa de constantes de tempo aceitável é de 2,8–4,5 ms.
      NOTA: CUIDADO: A eletroporação envolve pulsos elétricos de alta voltagem. Certifique-se de que as cuvetas estejam bem encaixadas e siga as instruções de operação do fabricante. Descarte as cuvetas de eletroporação usadas como resíduos bio-perigosos conforme as diretrizes institucionais.
    7. Inunde imediatamente a cuveta com aproximadamente 200 μL de meio de crescimento do tubo cônico e transfira as células eletroporadas para o tubo cônico de 50 mL. Adicione mais 200–350 μL de meio de crescimento até que não reste mais líquido visível na cubeta.
    8. Incubar o tubo cônico de 50 mL das células eletroporadas em 8 mL de meio de crescimento a 30 °C sem agitar por 1 hora. Inverta o tubo a cada 15 minutos para misturar.
    9. Colete as células por centrifugação a 1.500 × g, 25 °C por 3 minutos. Depois, decante a mídia.
    10. Resuspenda as células em meios adequados de dropout para leveduras para manter a seleção das células transformadas. Para plasmídeos contendo o marcador de seleção TRP1, ressuspendam células em 250 mL de SDCAA+ (que não contém triptofano) para recuperar seletivamente leveduras que retiveram o plasmídeo.
    11. Incubar durante a noite (16–20 h) a 30 °C com tremores orbitais a 270 rpm.

3. Indução, coloração e separação citométrica de fluxo de células de levedura

  1. Indução da biblioteca de protease e do cassete substrato (1 dia antes da separação)
    1. Meda OD600 como no passo 2.4.2 após o crescimento da noite dos transformantes em meios de dropout.
    2. Aliquota 12 mL de transformantes de levedura e centrífuga a 3.200 × g por 5 minutos.
    3. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em meio indução SGCAA+ até um OD600 de 0,5. Calcule o volume de resuspensão necessário usando a equação de diluição, C1V1 = C2V2.
    4. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 125 mL e cresça durante a noite por 18–24 horas a 30 °C com tremores orbitais a 270 rpm.
  2. Coloração por anticorpos fluorescentes (no dia da seleção)
    1. Meça OD600 de células após a indução. Use duas cubetas: uma com 1 mL de SGCAA+ e outra com 950 μL de SGCAA+ misturado com 50 μL de células. Multiplique o valor medido deOD 600 por 20 para obter o verdadeiro OD600 das células pós-indução.
    2. Normalize cada amostra para 3 × 107 células para coloração de anticorpos e classificação FACS. Use C1V1 = C2V2 para calcular o volume de células a serem transferidas do frasco de indução.
      NOTA: Para mutagênese por saturação de NNS em quatro sítios, o tamanho teórico da biblioteca é de 106 variantes. Para amostrar suficientemente a biblioteca, faça uma triagem pelo menos 10 vezes maior que o tamanho da biblioteca, ou seja,10 células 7 . Exemplo: se desejadoC 1V1 = 3 × 107 células e C2 = pós-induçãoOD 600 de 6 (ou seja, 6 × 107 células/mL), então aliquota 500 μL de células induzidas (ou seja, V2 = 3 × 107 células / 6 × 107 células/mL = 500 μL).
    3. Transfira o volume calculado das células para um tubo de 1,5 mL e centrifuge a 5.000 × g por 5 min.
    4. Remova o sobrenadante e resuspenda em 500 μL de soro tampão fosfatado (PBS) + 0,5% de albumina sérica bovina (BSA).
    5. Centrifuge a 5.000 × g por 5 minutos e repita o passo 3.2.4.
    6. Centrifuge a 5.000 × g por 5 minutos e, enquanto isso, complete o passo 3.2.7.
    7. Prepare uma mistura de coloração de anticorpos em um tubo de 1,5 mL contendo isotiocianato de fluoresceína anti-HA (FITC) (0,5 μg/107 células), anti-FLAG ficoeritrina (PE) (0,05 μg/107 células) e PBS + 0,5% de BSA (100 μL/107 células). Mantenha o tubo no gelo.
    8. Remova o sobrenadante e ressuspenda com a mistura de mancha. Use 300 μL da mistura de corante por 3 × 107 células. Não faça vórtice no tubo; Apenas inverta ou faz um flick.
    9. Mantenha as células no gelo no escuro por 1 hora após a ressuspensão.
  3. Lavagem pós-mancha
    1. Tinga células com centrifugação a 5.000 × g por 5 minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em PBS contendo 0,5% de BSA usando 0,5 mL por 1 × 107 células (por exemplo, 500 μL para 1 × 107 células ou 1,5 mL para 3 × 107 células).
    2. Centrifuge a 5.000 × g, 5 min. Remova o sobrenadante, resuspenda em 750 μL de PBS + 0,5% de BSA.
    3. Transfira mais 750 μL de PBS + 0,5% de BSA para um tubo coletor de 10 mL.
  4. FACS
    1. Realize a inicialização e preparação necessárias do citômetro para um novo experimento.
    2. Crie três dot-plots. No primeiro gráfico de pontos, selecione o nome do eixo X para exibir o canal de área de dispersão frontal (FSC-A) e o nome do eixo Y para exibir o canal de área de dispersão lateral (SSC-A).
      NOTA: Isso facilitará a seleção de células vivas.
    3. Mantenha o nome do eixo X para exibir o canal FSC-A enquanto altera o canal do eixo Y para mostrar a altura de dispersão direta (FSC-H) no segundo ponto gráfico.
      NOTA: Isso facilitará a seleção de singlets.
    4. Selecione o nome do eixo X para exibir o canal PE e o nome do eixo Y para exibir o canal FITC no terceiro dot-plot.
    5. Execute controle negativo no citômetro usando os canais de 530/30 nm (FITC) e 585/42 nm (PE). Realize a separação usando um bico de 70 μm a 70 psi de pressão de bainha. Adquira amostras a uma velocidade de 4000–5000 eventos/s.
    6. Desenhe uma porta de polígonos ao redor da população principal de células de levedura intactas para excluir detritos e pequenas partículas com sinais baixos de FSC-A e SSC-A no primeiro ponto gráfico (FSC-A versus SSC-A).
    7. Singlets de porta em um gráfico FSC-H versus FSC-A dentro desse portal, selecionando a população linear que exibe uma relação proporcional entre FSC-H e FSC-A. Exclua eventos que se desviam da distribuição linear e correspondem a doublets e agregados de células.
      NOTA: O terceiro dot-plot para PE versus FITC exibirá um aglomerado diagonal de pontos para o controle negativo (ou seja, células de levedura expressando o cassete do substrato intacto).
    8. Faça amostras e separe as células de levedura com base nos valores desejados de PE/FITC em um(s) tubo(s) coleta. Analise um número total de células correspondente a pelo menos 10 vezes o tamanho teórico da biblioteca para garantir uma representação adequada de todas as variantes (por exemplo, analise ~1 ×10 7 células para uma biblioteca com diversidade teórica de ~1 × 106 variantes).
    9. Posicione a porta de classificação abaixo da diagonal PE/FITC da população controle negativa.
      NOTA: Portas mais rigorosas melhoram o enriquecimento das variantes desejadas, mas reduzem a recuperação celular.
  5. Pós-FACS
    1. Válvula(s) de coleta de centrífuga a 3.200 × g por 5 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando 1 mL, e resuspenda 5 mL de PBS.
      NOTA: Deixe 1 mL de sobrenadante, pois a célula na parte inferior não será visível após a centrifugação.
    2. Centrifuge as células novamente a 3.200 × g por 5 minutos. Remova o sobrenadante, restando 1 mL. Resuspenda com 4 mL de SDCAA+.
    3. Em um frasco Erlenmeyer de 250 mL, adicione 15 mL de SDCAA+. Transfira as células ressuspensas do passo 3.5.2 para este frasco.
    4. Incube durante a noite por 18–24 horas a 30 °C com tremores orbitais a 270 rpm.
    5. Repita os passos 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 em cada rodada de evolução direcionada.

4. Recuperação de plasmídeos e sequenciamento de clones individuais

  1. Cultivar colônias individuais
    1. Faça um estoque de glicerol misturando 500 μL da cultura líquida após a etapa 3.5.4 e 500 μL de glicerol estéril de 50%, resultando em uma solução de estoque de glicerol a 25%. Vórtice para misturar bem as células.
    2. Armazene no freezer a –80 °C durante a noite. Para armazenamento a longo prazo, transfira para nitrogênio líquido.
    3. Raspe o material de glicerol usando uma ponta estéril de 1000 μL e misture em 100 μL de SDCAA+. Coloque essa mistura em uma placa SDCAA e incube-a de cabeça para baixo a 30 °C.
    4. Colha as colônias após 3 dias e cultive-as durante a noite em 1,5 mL de SDCAA+ em tubos de 14 mL.
  2. Realize o miniprep de levedura para extrair plasmídeos
    1. Granule a cultura durante a noite centrifugando a 16.000 × g por 1 minuto e ressuspenda 200 μL da Solução 1 de um kit de purificação de plasmídeos de levedura.
    2. Adicione 5 μL de solução enzimática lítica (5 U/μL).
    3. Incube em uma incubadora a 37 °C por 4 horas em uma batedeira ponta a ponta.
    4. Realize um ciclo de congelamento-descongelamento congelando a -80 °C por 20 minutos e descongelando a 42 °C por 10 minutos em banho-maria.
    5. Adicione 200 μL da Solução 2 de um kit de purificação de plasmídeos de levedura, misture invertendo 2–3 vezes e deixe agir por 5 minutos.
    6. Adicione 400 μL da Solução 3 de um kit de purificação de plasmídeos de levedura e misture invertendo 2–3 vezes. Centrifuge a 16.000 × g por 5 minutos.
    7. Purifique o DNA plasmídico usando um kit de purificação com uma coluna de alta capacidade de ligação ao DNA.
      NOTA: Devido à grande quantidade de DNA genômico de levedura cisalhado proveniente das células lisadas, é necessário usar uma coluna à base de sílica com maior capacidade de ligação ao DNA (35 μg) em vez de uma coluna de purificação de DNA plasmídico de levedura de menor capacidade (5 μg)15.
    8. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro. Os rendimentos de DNA são de 10–30 ng/μL.
  3. Transformar plasmídeos purificados em células de E. coli quimicamente competentes
    1. Prepare o meio SOC, seguindo a receita da Tabela 5, e placas de LB-cloranfenicol. Além disso, pré-aqueça um banho-maria a 42 °C.
    2. Aqueça uma placa de LB-cloranfenicol para cada plasmídeo a 37 °C por 20 minutos.
    3. Pegue um tubo de células quimicamente competentes do freezer a –80 °C e descongele no gelo.
    4. Aliquota 30 μL de células competentes para cada plasmídeo em um tubo de 1,5 mL sobre gelo.
    5. Pipete 3 μL de plasmídeo em células competentes. Mexa para misturar e deixe descansar por 5 minutos no gelo.
    6. Realize choque térmico incubando brevemente as células no banho-maria a 42 °C por 40 segundos.
    7. Incube no gelo por 2 minutos.
    8. Adicione 300 μL de meio SOC às células e incube por 15 minutos a 37 °C a 220 rpm.
    9. Placa 50–100 μL de células competentes transformadas em placas pré-aquecidas.
    10. Incube as placas a 37 °C de cabeça para baixo por 18 horas.
  4. Colheita de colônias
    1. Adicione 5 mL de meio líquido de LB-cloranfenicol em tubos de cultura de fundo redondo de 14 mL.
    2. Escolha uma colônia usando uma ponta estéril de 1000 μL e coloque-a em um tubo de cultura.
    3. Coloque os tubos em um shaker (220 rpm, ângulo de 30°–45° para maximizar a aeração) a 37 °C por 18 horas.
  5. Extração de plasmídeos a partir de cultura líquida bacteriana
    1. Centrifuge as culturas líquidas a 3.200 × g por 4 minutos. Decante o sobrenadante.
    2. Extraia plasmídeos de culturas durante a noite usando um kit de purificação de plasmídeos.
    3. Meça a concentração de plasmídeos purificados usando um espectrofotômetro.
  6. Submeter plasmídeos para sequenciamento
    NOTA: Use serviços como sequenciamento de nanoporos de plasmídeos inteiros ou, alternativamente, sequenciamento Sanger com um primer flanqueando a região mutagenizada.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A construção eficiente da biblioteca é fundamental para garantir cobertura suficiente do espaço mutacional. Para evitar a perda de variantes funcionais raras, o número de transformantes deve atingir pelo menos 10× a 100× o tamanho teórico da biblioteca. Como a eficiência da transformação em S. cerevisiae é influenciada pela concentração celular e é maior nas células de fase logarítmica iniciala média 16, otimizamos a densidade inicial da célula antes da e...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A evolução dirigida é um método de alto rendimento que utiliza ciclos iterativos de diversificação e seleção para identificar proteínas com função bioquímica aprimoradaou nova 17. Neste protocolo, detalhamos um fluxo de trabalho otimizado para evoluir o reconhecimento de substrato protease usando um sistema de exibição de superfície celular em S. cerevisiae. O sistema de exibição de superfície mapeia a atividade de protease para um fenótipo detectável bas...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes. Os dados brutos que suportam esse protocolo, incluindo arquivos FASTQ de sequenciamento nanopore, arquivos de citometria de fluxo (FCS) e dados de origem usados para gerar as figuras e tabelas, e plasmídeos pDD1523 e pDD1524, foram depositados no Zenodo e estão disponíveis publicamente em 10.5281/zenodo.20746804

Agradecimentos

Agradecemos a todos os membros do laboratório Dingal por seus conselhos, expertise e discussões. Também agradecemos ao UTD Flow Cytometry Core pela infraestrutura e apoio. O M.B.L. é apoiado pela Bolsa de Pós-Graduação Eugene McDermott da UTD. Essa pesquisa foi apoiada por um Fundo de Startups da UTD e prêmios do Instituto Nacional de Saúde - NIGMS ao laboratório do P.C.D.P.D. (R35GM150967).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
10 mM dNTP MixNEBN0447SPCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4FisherBP3994Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction BufferNEBB9027SSold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, BactoBD Difco281230-500gSDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagentsBP160-500Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE AntibodyBioLegend637309FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]GenScriptA01621FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino AcidsBD Difco223120SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / TryptoneRPIT60060-10000.0LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction VSigma-Aldrich126575-10GM0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SGolden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)Sigma-Aldrich21115-100mLElectroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating BeadsSigma-Aldrich71013-3Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-GalactoseThermo FisherA12813.30250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-SorbitolThermo Fisher1327300.10Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrousSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsSigmaY0626-250G6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)BD242820-500gPre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GConditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification KitOmega Bio-tekD6492-02PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmega Bio-tekD2500-01Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)FisherBP229-450% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate FisherBP906-5SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme MixNEBM0554SKinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction BufferNEBB0554AUsed with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGE. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)RPIL24020-2000.0E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino AcidsSigma2240-500GMAlternative casamino acids source
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SVector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA PolymeraseNEBM0492SHigh-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC EnhancerNEBB9028AFor high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA PolymeraseNEBM0491LPCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)NEBB6004SSupplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HFNEBR3138LAdditional restriction enzyme
SOC MediumNEBB9020SPost-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)FisherS271-1LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)FisherS318-500Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)Sigma-AldrichS9763-500GSDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrousVWR (BDH)BDH4542-1KGPSD

Referências

  1. Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471–487.
  2. Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.
  3. Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312–318.
  4. Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108–115.
  5. Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284–2301.
  6. Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167–174.
  7. Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63–71.
  8. Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31–34.
  9. Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155–159.
  10. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553–557.
  11. Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22–28.
  12. Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651–5656.
  13. Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201–216.
  14. Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893–901.
  15. Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.
  16. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163–168.
  17. Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995–10000.
  18. Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229–7234.
  19. Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.
  20. Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510–518.
  21. Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.
  22. Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474–1483.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

BioengenhariaEdi o 234Edi o 234Valor VazioEdi oproteasemutag nesePotyviridaeSaccharomyces cerevisiaeelectropora ocitometria de fluxo

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.