Plataforma de Tinta Sacrificial Impressa em 3D para Imagem de Alta Resolução da Função de Células Endoteliais em Vasos Tortuosos e Aneurismas

Resumo

O protocolo detalha como projetar e montar vasos sanguíneos in vitro com segmentos tortuosos ou aneurismáticos, utilizando uma impressora de extrusão ou aplicação manual de tinta sacrificável pasteurizada, e como realizar ensaios para avaliar o fluxo hemodinâmico e as respostas das células endoteliais.

Resumo

A tortuosidade vascular e os aneurismas representam riscos significativos à saúde em diversos tipos de tecidos humanos e vasos sanguíneos. Essas alterações na forma dos vasos causam anomalias na dinâmica do fluxo sanguíneo, o que impacta significativamente a função endotelial. Modelos animais dessas condições vasculares têm sido elucidativos em alguns casos, mas são onerosos para estabelecer e limitados à fisiologia da espécie animal. Em resposta a isso, modelos in vitro tridimensionais do tipo órgão-em-um-chip (OOC) tornaram-se uma poderosa ferramenta para avaliar a função vascular e as respostas endoteliais em células humanas. Embora cada um dos modelos OOC tenha suas vantagens, há necessidade de um sistema acessível para estudar a permeabilidade vascular, um indicador-chave da função vascular em vasos curvados e aneurismas sob taxas de cisalhamento e pressão fisiológicas. Aqui, a metodologia apresentada permite o estudo das respostas de células endoteliais humanas a anomalias de fluxo em um modelo econômico de vaso curvado, utilizando uma bioplotadora de nível básico que produz vasos compatíveis com taxas fisiológicas de fluxo de fluido, estudos de permeabilidade, microscopia óptica de alta resolução e suporte de matriz extracelular com rigidez fisiológica.

Introdução

A morfologia dos vasos sanguíneos é um indicador importante da função vascular, pois a tortuosidade vascular e os aneurismas são características principais de várias doenças e riscos à saúde. A tortuosidade vascular pode ser congênita, como em síndromes como Marfan¹, Turner² e Loeys-Dietz³, ou pode se desenvolver mais tarde na vida como uma característica de diversas doenças, incluindo hipertensão, diabetes, câncer e possivelmente aterosclerose^4,5,6. Aneurismas de tecidos arteriais, incluindo artérias carótidas⁷, coronárias⁸, femorais⁹, aórticas¹⁰ e cerebrais¹¹, estão associados à morbidade e riscos à saúde devido à dissecação espontânea ou ruptura. Além de causar irregularidades no fluxo e inflamação endotelial associada, a tortuosidade vascular e os aneurismas podem indicar disfunção tecidual subjacente e inflamação. Por exemplo, em recém-nascidos e crianças, a síndrome da tortuosidade arterial é clinicamente preditiva de acidente vascular cerebral na infância¹², hipertensão pulmonar persistente e dissecação aórtica^4,13. Em adultos, a vasculite retiniana apresenta-se com vasos retinianos tortuosos que se tornam menos acentuados à medida que a inflamação subjacente se resolve¹⁴. Como a tortuosidade é percebida e traduzida em sinais anômalos que impulsionam a progressão da doença permanece uma área ativa de pesquisa. Acredita-se que as células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos atuem como sensores primários nesse processo. O fluxo perturbado ou lento induzido pela tortuosidade vascular ou aneurismas altera a tensão de cisalhamento, provocando mudanças endoteliais na sinalização inflamatória¹⁵ e na função de barreira¹⁶. As células endoteliais são altamente sensíveis ao fluxo de fluidos por meio de mecanismos que envolvem cílios primários¹⁷, proteínas de adesão mecanossensíveis^18,19 e canais iônicos^20,21, que ativam sinalizações capazes de induzir vazamento, inflamação e reprogramação endotelial^22,23,24. Portanto, métodos para estudar as respostas endoteliais à geometria vascular tortuosa são importantes para o desenvolvimento de terapias vasculares.

As funções endoteliais em estados de doenças vasculares têm sido modeladas usando modelos animais in vivo, sistemas de órgão-em-um-chip (OOC) e abordagens de bioimpressão. Modelos de camundongos permitem o controle da expressão de genes conhecidos associados à doença e incorporam a complexidade da arquitetura tecidual e da fisiologia, incluindo o envolvimento de células murais e imunes. Modelos de camundongos de aterosclerose²⁵, síndrome de Marfan²⁶ e vários tipos de aneurismas^27,28,29 fornecem informações sobre as patologias associadas à disfunção vascular. Apesar dessas vantagens, a observação direta, manipulação experimental e quantificação de células endoteliais são difíceis de realizar, exceto por métodos em massa como o sequenciamento de RNA. Além disso, os modelos animais apresentam considerações éticas e de custo e são limitados pela fisiologia específica da espécie.

Várias abordagens in vitro com órgãos em chip (OOC) foram desenvolvidas para estudar as respostas endoteliais humanas ao fluxo laminar e perturbado^30,31,32 em sistemas 2D^33,34 e 3D^35,36,37. A extensa literatura sobre OOC³⁸ tem sido amplamente impulsionada pela engenharia biomédica, com características de design voltadas a questões biomédicas específicas. Muitos modelos vasculares em OOC utilizam suportes de polidimetilsiloxano (PDMS) para controlar a arquitetura dos vasos³⁸. Esses modelos permitem um controle de alta resolução de geometrias complexas e possibilitam a modelagem de interações entre órgãos e vasos, incluindo aquelas envolvendo o fígado³⁹, cérebro⁴⁰ e pulmão⁴¹. No entanto, ainda existem limitações. A baixa permeabilidade do PDMS e de polímeros semelhantes a macromoléculas pode restringir estudos da função de barreira vascular. Além disso, a maioria dos PDMS curados apresenta rigidez de aproximadamente 0,8–10 MPa⁴², embora formulações alternativas possam alcançar faixas mais fisiológicas de 8–200 kPa⁴³. As estimativas de rigidez da membrana basal vascular variam de ~350 Pa⁴⁴ a ~70 kPa⁴⁵, dependendo do tipo de vaso e da metodologia de medição, com a maioria das membranas basais vasculares saudáveis situando-se na faixa de 2–3 kPa⁴⁶. Como doenças vasculares como aterosclerose e hipertensão estão parcialmente associadas ao aumento da rigidez da matriz extracelular (ECM)^{47,48,49,50,51}, e as células endoteliais respondem à rigidez da ECM, controlar essa rigidez dentro de faixas fisiológicas é importante em modelos in vitro. Abordagens mais recentes de OOC utilizam substratos fisiológicos que permitem geometrias complexas^52,53, incorporam múltiplos tipos celulares para recapitular a função de órgãos^{39,54,55,56,57}, ou interações imune-vasculares⁵⁸, modelam estruturas vasculares específicas de pacientes^59,60 e apoiam o desenvolvimento pré-clínico de fármacos^61,62. Em muitos modelos microvasculares que envolvem interações com outros tipos celulares, as células endoteliais formam espontaneamente vasos com geometrias relativamente não controladas⁶³. Por outro lado, sistemas OOC que permitem geometrias vasculares definidas sob fluxo controlado frequentemente exigem infraestrutura, materiais e conhecimentos especializados consideráveis^53,64. Assim, são necessários métodos robustos e acessíveis a não especialistas para facilitar estudos do comportamento celular vascular sob condições fisiologicamente relevantes.

Plataformas de bioimpressão compatíveis com hidrogéis de matriz extracelular fisiológicos fornecem modelos in vitro versáteis para estudar a função endotelial em diferentes geometrias vasculares⁶⁵. Essas abordagens utilizam a deposição direcionada de géis contendo células endoteliais no formato de um vaso sanguíneo⁶⁶ ou tinta sacrificial para gerar lúmens tubulares abertos embutidos na matriz extracelular, que posteriormente podem ser dissolvidos, deixando um lúmen que pode ser semeado com células endoteliais⁵⁴. Substratos de matriz extracelular biologicamente compatíveis, incluindo gelatina, colágeno e fibrina, podem ser ajustados para rigidezes que se aproximam das da membrana basal vascular (1–3 kPa⁶⁷) e permitem ensaios de permeabilidade vascular semelhantes aos utilizados in vivo. Embora essas abordagens não alcancem a mesma resolução de forma e tamanho que a fabricação em PDMS, vasos curvos, ramificados e estenóticos podem ser gerados^52,66,68. Tais plataformas são, portanto, adequadas para modelar geometrias vasculares, incluindo vasos tortuosos e aneurismáticos.

O método apresentado aqui utiliza uma abordagem de impressão 3D baseada em extrusão pneumática, posicionamento tridimensional em escala micrométrica, controle de temperatura da plataforma de impressão e do cabeçote impressor contendo a tinta, e uma tinta sacrificável previamente desenvolvida para interações renais-vasculares em um chip^67,69. A tinta sacrificável é impressa na geometria vascular desejada e imediatamente embutida na MEC. Uma mudança de temperatura remove posteriormente a tinta, deixando um lúmen aberto na MEC que é semeado com células endoteliais humanas. A MEC base consiste em gelatina e fibrina, permitindo gelificação rápida e polimerização de fibrina mediada por trombina, ao mesmo tempo que fornece rigidez mecânica apropriada para muitas membranas basais vasculares. Componentes adicionais da MEC, incluindo laminina ou fibronectina, podem ser incorporados para melhor imitar a composição da membrana basal vascular^70,71,72 e promover a adesão endotelial. O sistema é montado em câmaras Rose reutilizáveis⁷³ contendo suportes metálicos, juntas de borracha de silicone e lamínulas de microscopia de alta resolução, permitindo a conexão a uma bomba de fluido por meio de agulhas com conexão Luer-lock. Alternativamente, as placas superior e inferior podem ser fabricadas por impressão 3D utilizando ácido polilático ou material reforçado com fibra de carbono. O sistema montado tolera pressões geradas por taxas de fluxo fisiológicas. Um procedimento de pasteurização também melhora a esterilidade da tinta sacrificável sem alterar suas propriedades físicas. Além disso, uma abordagem com molde de agulha e bio-tinta permite a fabricação de vasos retos contendo um aneurisma sem a necessidade de uma bioimpressora. Os vasos tortuosos ou aneurismáticos resultantes, agora endotelializados, podem ser examinados sob fluxo fisiológico utilizando microscopia óptica de alta resolução por aproximadamente uma semana, permitindo a investigação de respostas endoteliais agudas a alterações na geometria vascular.

Uma grande vantagem deste sistema é sua compatibilidade com microscopia de luz. Vasos gerados in vitro usando este protocolo são passíveis de diversas modalidades de imagem e são particularmente adequados para microscopia de fluorescência confocal com disco giratório ou com varredura a laser. A resolução espacial e temporal, a sensibilidade e a distância de trabalho da lente objetiva devem ser consideradas ao selecionar as condições de imagem. Para a maioria dos vasos gerados usando este sistema, a lente objetiva deve ter distância de trabalho suficiente para alcançar aproximadamente 100–300 µm do lamínula e imagens através do ponto médio do vaso. Lentes objetivas de alta abertura numérica são necessárias para a imagem de alta resolução de estruturas endoteliais, incluindo organelas e adesões celulares, e para imagens em tempo real que exigem alta resolução temporal, como o rastreamento de microesferas fiduciais sob fluxo. Alguns ensaios que exigem menor eficiência de captação de fótons, como medições da barreira endotelial baseadas em fluorescência, podem ser realizados usando objetivas de menor abertura numérica, como objetivas a ar de 10–20×.

O protocolo descreve a geração de vasos tortuosos e aneurismáticos compostos por células endoteliais humanas em um sistema in vitro que suporta fluxo fisiológico de fluidos e microscopia de alta resolução. O fluxo de trabalho inclui o design dos vasos, fabricação da câmara, preparação e impressão 3D da tinta sacrificial, preparação da matriz extracelular e remoção da tinta, semeadura e cultivo de células endoteliais sob fluxo, avaliação de vazamento vascular, mapeamento de fluxo e coloração por imunofluorescência (Figura 1).

Protocolo

1. Projete o vaso

1. Selecione um segmento de vaso que caiba dentro da câmara compatível com microscópio. Para uma câmara Rose, mantenha não mais do que 1,6 cm entre os reservatórios de entrada e saída.
2. Importe a imagem de angiografia por tomografia computadorizada com contraste (Figura 2A), angiografia por ressonância magnética ou angiografia fluoroscópica para o ImageJ/FIJI ou outro programa de análise de imagem.
3. Use a ferramenta de medição de pontos para definir as coordenadas XY ao longo do centro axial do vaso. Exporte as coordenadas para um programa de planilha eletrônica (Figura 2B).
   NOTA: arquivos STL derivados de angiografia por TC podem ser importados diretamente na maioria dos softwares de impressão; no entanto, a impressão baseada em polígonos pode exigir múltiplas passagens e produzir vasos trançados (Figura Suplementar 1). Use G-code direto para impressão de única passagem. Por esse motivo, a mapeamento de coordenadas e o design em G-code são preferidos. Veja exemplo de G-code nos Arquivos Suplementares.
4. Modifique as coordenadas XY na planilha para posicionar o centro do vaso na origem gráfica. Importe o contorno da câmara, se necessário, para confirmar que a impressão final caberá dentro da câmara.
5. Use as coordenadas XY do vaso para projetar o vaso na primeira camada de impressão (Figura 2C). Defina a altura da primeira camada, incluindo o vaso e os reservatórios de entrada e saída contíguos, em 200µm.
6. Crie reservatórios de entrada e saída que permitam a inserção conveniente de agulhas. Use reservatórios em formato de losango quando apropriado para direcionar o fluido eficientemente em direção à entrada do vaso, minimizando a turbulência de entrada (Figura 2).
7. Inclua os reservatórios na primeira camada de impressão para que permaneçam contíguos ao vaso. Adicione 5–9 camadas acima da camada base para fornecer volume suficiente para a colocação das agulhas de entrada e saída. Para o design em G-code, os seguintes detalhes são importantes:
   1. Defina a cabeça de impressão e a plataforma de impressão, quando o controle de temperatura estiver disponível, em 37°C usando o software da impressora ou comandos G-code apropriados no início do arquivo de impressão.
   2. Especifique a cabeça de impressão ou extrusora no G-code quando houver múltiplas cabeças de impressão disponíveis. Configure o G-code para usar coordenadas absolutas e distâncias de extrusão.
   3. Ajuste a altura da camada com base no tamanho e forma da agulha, pressão de fluxo da tinta e velocidade da cabeça de impressão. Use uma altura de camada de 200µm para cada camada de reservatório acima da primeira camada nos exemplos descritos aqui.
   4. Use uma pressão de contrapressão de 14–17 psi e uma velocidade da cabeça de impressão de 6 mm/s (G-code: F360) para os reservatórios. Aumente a velocidade da cabeça de impressão para 15 mm/s (G-code: F900) para o vaso.
8. Teste cada novo design de vaso em uma lâmina de vidro sem câmara antes de imprimir o vaso final.

2. Prepare a tinta sacrificial

1. Adicione 2,1 g de óxido de polietileno (PEO) a 60 mL de água estéril fria para preparar uma solução a 3,5% p/v em um recipiente estéril com tampa contendo um agitador magnético estéril. Agite a 4 °C por pelo menos 48 h, verificando periodicamente se todo o pó foi dissolvido.
   NOTA: Armazene a solução de PEO em um recipiente hermético a 4 °C por até 1 mês.
2. Adicione 17,5 g de Pluronic F-127 a 50 mL de água estéril fria para preparar uma solução a 35% em um recipiente estéril com tampa contendo um agitador magnético estéril. Agite a 4 °C por pelo menos 48 h, verificando periodicamente a incorporação completa do pó.
3. Misture 11,4 mL da solução fria de PEO a 3,5% com 28,6 mL da solução fria de Pluronic F-127 a 35% em um tubo cônico estéril de 50 mL. Misture por pelo menos 24 h a 4 °C em um agitador rotativo.
4. Coloque o tubo em posição vertical a 4 °C durante a noite para permitir que as bolhas subam e saiam da solução.
5. Coloque o tubo cônico contendo a tinta em um banho-maria e incube a 63 °C por 3 h. Mantenha a tampa ligeiramente aberta durante o aquecimento para permitir a saída do ar expandido.
6. Retire o tubo do banho-maria e deixe esfriar lentamente até a temperatura ambiente. Aperte a tampa após o resfriamento da solução.
7. Coloque a tinta pasteurizada sobre gelo por 2 h, agitando suavemente de vez em quando sem introduzir bolhas.
8. Remova o êmbolo da seringa, tampe a porta da agulha e encha a seringa com 60%–70% da sua capacidade. Insira o êmbolo, inverta a seringa, remova a tampa da porta da agulha e expulse todo o ar aprisionado.
   NOTA: Armazene as seringas carregadas à temperatura ambiente por até 1 mês.

3. Fabricar a câmara Rose e preparar a tubulação

1. Construa as placas de braçadeira superior e inferior em alumínio ou imprima em 3D as placas utilizando os arquivos CAD/STL fornecidos (Figura 2). Inclua uma porta inferior chanfrada suficientemente grande para permitir o acesso de objetivas de alta abertura numérica e uma borda de suporte para parafusos que comprimam firmemente as lamínulas contra a junta.
   NOTA: O alumínio proporciona melhor transferência de calor durante a microscopia com platina aquecida. Peças impressas em 3D em PLA ou reforçadas com fibra de carbono são adequadas para prototipagem, mas podem apresentar menor transferência térmica e podem empenar durante aquecimentos repetidos.
2. Corte a folha de silicone para corresponder às placas de braçadeira de 38 mm × 51 mm. Crie a janela central de visualização utilizando um furador de 18 mm.
3. Faça furos apropriados para o diâmetro dos parafusos selecionados. Lave extensivamente a junta pronta com água para remover resíduos de silicone.
4. Autoclave as placas de braçadeira metálicas, parafusos, porcas e juntas de silicone em um envelope fechado de papel alumínio utilizando um ciclo seco de 20 min.
5. Imersa as placas impressas em 3D em etanol 70% durante 1 min. Seque as placas em campo estéril.
6. Prepare comprimentos de tubo de 10–30 cm equipados com conectores Luer-lock e braçadeiras de tubo embutidas, tubo apropriado para bomba peristáltica, um torneira de três vias, um amortecedor de pulso e um reservatório de meio com dois orifícios (Figura 3).
7. Sterilize componentes de tubo e reservatório compatíveis com calor por autoclavação. Estérilize componentes que não podem ser autoclavados mediante exposição ao etanol.

4. Prepare os reagentes da matriz extracelular

1. Adicione 12,5 mL de PBS morno a 37 °C a 1 g de fibrinogênio de plasma humano para preparar uma solução estoque de 80 mg/mL. Incube a 37 °C e agite suavemente de vez em quando, sem usar vórtex.
2. Deixe de 1 a 2 h para que o fibrinogênio se dissolva, formando uma solução turva. Aliquote a solução em tubos estéreis e armazene a −20 °C por até 3 meses.
3. Adicione 22,5 g de gelatina a 135 mL de PBS estéril em um frasco estéril contendo uma barra de agitação magnética. Agite por 16 h a 70 °C, agitando periodicamente o frasco para garantir dissolução completa.
4. Ajuste a solução de gelatina ao pH 7,5 usando NaOH 1 M. Filtre a solução a vácuo enquanto estiver quente, faça alíquotas e armazene a 4 °C por até 6 meses.
   NOTA: Deixe a gelatina hidratar por pelo menos 16 h antes da filtração. Mantenha a solução e o aparato de filtração a 37 °C durante a filtração a vácuo para minimizar o entupimento do filtro.
5. Dissolva trombina de plasma humano em PBS estéril até obter 1.000 U/mL. Misture suavemente, faça alíquotas e armazene a −20 °C por até 1 ano.
6. Dissolva 300 mg de transglutaminase em 5 mL de PBS e incube a 37 °C por 1 h com mistura ocasional. Filtre esterilmente a solução em um tubo novo e mantenha-a à temperatura ambiente.
   NOTA: Prepare a solução de transglutaminase fresca a cada dia. Armazene a transglutaminase em pó dessecada a 4 °C.
7. Dissolva cloreto de cálcio em água para preparar uma solução 1 M. Filtre esterilmente a solução e armazene à temperatura ambiente por até 1 ano.

5. Preparar e ativar as lamínulas

1. Mergulhe lamínulas limpas em etanol, depois passe-as cuidadosamente pela chama de um bico de Bunsen para evaporar o etanol.
   CAUTION: O etanol é inflamável. Mantenha o etanol em grandes quantidades afastado da chama aberta e realize a esterilização por chama seguindo os procedimentos apropriados de segurança contra incêndios em laboratório.
2. Coloque as lamínulas em uma grade de aço inoxidável sem rachar ou lascar o vidro.
3. Imersa as lamínulas em silano (3-aminopropil) trimetoxissilano 0,5% diluído em água por 30–60 min à temperatura ambiente. Aplique agitação suave durante a incubação.
   CAUTION: Manipule o (3-aminopropil) trimetoxissilano utilizando equipamentos de proteção química apropriados e controles de engenharia.
4. Lave as lamínulas com seis trocas de água com agitação suave. Evite que as lamínulas se soltem ao transferir a grade.
5. Retire a grade da água, remova o excesso de água com papel absorvente e seque a 50°C por 30 min.
6. Deixe as lamínulas esfriarem até a temperatura ambiente enquanto prepara glutaraldeído 0,5% em PBS.
   CAUTION: O glutaraldeído é tóxico e irritante. Prepare e manipule a solução em uma capela de exaustão química apropriada, usando equipamento de proteção individual adequado.
7. Incube as lamínulas em glutaraldeído 0,5% por 60 min com agitação suave para minimizar o acúmulo de bolhas e promover ativação uniforme.
8. Lave as lamínulas com três trocas de água estéril e deixe secar ao ar à temperatura ambiente.
   NOTE: Armazene as lamínulas ativadas sob dessecação a vácuo por até 2 meses.

6. Revestir as lamínulas com a camada basal da matriz extracelular

1. Aqueça 1× PBS, estoque de gelatina e estoque de fibrinogênio a 37°C por 30–60 min.
2. Forre uma placa de Petri estéril de 15 cm com parafina limpa, pulverize a superfície com etanol 70%, remova o excesso e deixe a superfície secar ao ar em uma cabine de segurança biológica.
3. Adicione sequencialmente a um tubo cônico de 15 mL: 1,68 mL de PBS aquecido, 2,5 mL de estoque de gelatina, 12,5 µL de CaCl₂ 1 M, 625 µL de estoque de fibrinogênio e 167 µL de solução de transglutaminase.
4. Coloque a mistura de matriz extracelular (ECM) em banho-maria a 37°C por 30 min.
5. Prepare um tubo de 1,7 mL contendo 5 µL de estoque de trombina para cada lamínula.
6. Adicione 400 µL da preparação de ECM ao tubo de trombina e homogeneíze pipetando uma vez, minimizando a formação de bolhas.
7. Imediatamente, distribua 200 µL da mistura sobre a parafina estéril e coloque uma lamínula ativada sobre a gota usando pinça. Pressione suavemente para obter cobertura completa.
   NOTA: Complete esta etapa em aproximadamente 20 s após combinar a mistura de ECM com trombina.
8. Cubra a placa de Petri e incube as lamínulas revestidas por 10 min à temperatura ambiente, seguido de 2 h a 37°C em incubadora umidificada.
9. Remova cuidadosamente cada lamínula da parafina dobrando a parafina para longe da lamínula.
10. Coloque as lamínulas recém-revestidas com o lado do gel voltado para cima em uma placa de Petri limpa dentro de uma incubadora umidificada e utilize em até 1 dia.
11. Alternativamente, incube as lamínulas revestidas durante a noite em incubadora não umidificada e utilize em até 2 dias.

7. Bioprintar a tinta sacrificial e encapsulá-la na MEC

1. Realize impressões de teste antes de imprimir o vaso para confirmar que a tinta e os parâmetros de impressão produzem as dimensões desejadas do vaso. Carregue o arquivo de impressão no software da impressora.
   NOTA: Uma agulha dispensadora cônica de 32 G com tinta de Pluronic F127 a 25%/PEO a 1% produz confiavelmente diâmetros de vaso de até aproximadamente 150µm sob as condições descritas aqui. Otimize a velocidade da cabeça de impressão e a contrapressão utilizando impressões simples de linhas em vidro.
2. Monte a placa de fixação inferior, a lamínula inferior revestida com matriz extracelular (ECM), a junta de silicone, a placa de fixação superior sem lamínula superior e os dois parafusos. Coloque a montagem em uma placa de Petri de 100 mm tampada e mantenha-a a 37 °C até o uso no mesmo dia.
3. Conecte a agulha de impressão à seringa de tinta e instale a seringa na impressora pneumática de extrusão. Pré-aqueça a plataforma de impressão, a cabeça de impressão e uma placa de aquecimento adjacente a 37 °C.
4. Prepare a matriz ECM conforme descrito na Seção 6 e mantenha-a em banho-maria a 37 °C. Prepare 1,5 mL de matriz por câmara Rose em lotes de 5 mL.
5. Coloque 5 µL do estoque de trombina em um tubo estéril de 1,7 ou 2 mL para cada câmara. Mantenha lamínulas ativadas adicionais, não revestidas, disponíveis na cabine de segurança biológica.
6. Coloque a câmara contendo a lamínula revestida com ECM na plataforma da impressora e centralize-a na origem XY. Abaixe a agulha até que ela entre em contato com a superfície de ECM ou vidro no centro da janela da câmara e defina essa posição como a origem XYZ.
7. Levante a agulha e aplique pressão máxima para preenchê-la completamente com tinta e expelir quaisquer bolhas visíveis. Limpe a ponta da agulha com um lenço laboratorial estéril.
8. Imprima a geometria do vaso e do reservatório utilizando o arquivo G-code carregado. Levante imediatamente a agulha e remova a câmara após a impressão.
9. Examine o vaso impresso quanto a bolhas e descontinuidades. Descarte e reimprima qualquer estrutura que apresente qualquer um desses defeitos.
10. Coloque a câmara na placa de aquecimento a 37 °C, remova os parafusos e a placa de fixação superior e misture 1 mL da matriz ECM preparada com a alíquota de trombina pipetando uma vez.
11. Transfira a mistura de ECM ativada para a câmara do vaso sem introduzir bolhas e coloque imediatamente uma lamínula ativada com a face voltada para baixo sobre o ECM. Recoloque a placa de fixação superior e aperte os parafusos até ficarem firmes, sem superapertar.
12. Coloque a câmara concluída em uma placa de Petri de 100 mm tampada e incube a 37 °C por 2 h.

8. Gerar um aneurisma utilizando um molde de arame

1. Insira agulhas de 21 gauge pelos lados opostos da junta de silicone e alinhe-as.
2. Sonicar um fio de mandril médico de aço inoxidável 304 com diâmetro de 0,0190 polegadas em PBS contendo 1% de BSA em um tubo cônico de 15 mL. Remova o fio e deixe secar ao ar em uma placa de Petri estéril dentro de uma cabine de segurança biológica.
3. Passe o fio revestido com BSA através de ambas as agulhas na junta (Figura 2). Dobre levemente uma das extremidades salientes para facilitar a rotação subsequente.
4. Autoclave a montagem da junta, agulha, fio e placa de fixação em uma embalagem de folha de alumínio.
5. Posicione a montagem de agulha/junta sobre uma lamínula ativada e revestida com matriz extracelular (ECM).
6. Acople uma agulha de 21 G a uma seringa contendo tinta pasteurizada de Pluronic/PEO.
7. Dispense uma pequena gota de tinta sacrificável na lateral do fio, no centro da câmara. Aplique uma pequena gota de tinta em cada junção entre agulha e fio para criar um selo.
8. Prepare a mistura de ECM e monte a câmara conforme descrito nas Seções 7.10–7.12.
9. Após a gelificação do ECM, gire suavemente a extremidade dobrada do fio para liberá-lo do ECM e da tinta sacrificável. Retire lentamente o fio do dispositivo.
10. Encha a agulha de entrada com PBS usando uma pipeta de 200 µL e permita que o PBS escoe através da luz. Repita uma vez e prossiga para a Seção 9.

9. Lave a tinta sacrificial da câmara do vaso

1. Conecte uma tubulação a um reservatório contendo PBS frio (4 °C) suplementado com antibióticos, incorpore uma torneira de três vias e finalize a tubulação com uma conexão macho Luer-lock e agulha estéril de 23 G.
2. Encha a tubulação de suprimento com PBS frio usando a seringa na torneira de três vias até que o PBS saia pela ponta da agulha. Feche a tubulação com um clipe.
3. Encha um segundo trecho de tubulação com PBS e finalize-o com uma agulha de 23 G. Feche a tubulação com um clipe e remova a seringa de enchimento.
4. Insira a agulha de suprimento através da vedação até o reservatório de entrada e a agulha de drenagem até o reservatório de saída. Confirme a colocação correta usando um microscópio invertido ou estereomicroscópio.
5. Transfira o conjunto para 4 °C e posicione o reservatório de suprimento a 30 cm acima da entrada. Posicione a saída a 5–10 cm abaixo da agulha de saída do vaso, sobre um recipiente de resíduos.
6. Solte os clipes e lave com pelo menos 250 mL de PBS frio através da câmara. Verifique o sistema quanto a vazamentos e bolhas durante a lavagem.

10. Revestir e pré-tratar a luz do vaso com componentes adicionais da MEC

1. Dilua a fibronectina para 20 µg/mL, a laminina para 10 µg/mL ou a matriz da membrana basal para uma diluição de 1:30 em 3 mL de PBS.
2. Adicione transglutaminase recém-preparada ao reagente de MEC diluído.
3. Mantenha o tubo imediatamente próximo ao vaso conectado às entradas e saídas.
4. Injete lentamente a solução de MEC/transglutaminase através do vaso usando uma seringa de 1 mL. Repita até que os 3 mL tenham passado completamente pelo vaso.
5. Feche os conectores com grampos, tampe as entradas e saídas com tampas Luer estéreis e incube a 37 °C por 1 h até a noite.
6. Lave o vaso com 100 mL de meio endotelial completo contendo penicilina/estreptomicina. Feche os conectores do tubo com grampos e tampe as saídas.
   NOTA: Armazene o vaso preenchido com meio a 4 °C por até 1 semana. Certifique-se de que não permaneçam bolhas na luz.

11. Cellularizar o vaso

1. Incube a câmara contendo o molde do vaso de matriz extracelular a 37 °C por 2 h. Aqueça o meio endotelial completo contendo penicilina/estreptomicina até 37 °C.
2. Realize a tripsinização de células endoteliais de um único prato de cultura de 10 cm ou de um frasco T75 e neutralize a tripsina com meio completo. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL e retire uma alíquota para contagem celular.
3. Centrifugue as células a 1.000 × g durante 5 min. Re-suspenda o pellet para preparar 150 µL de suspensão celular a 5 × 10⁶ células/mL.
4. Conecte a tubulação de saída a um reservatório estéril de resíduos e mantenha o grampo da tubulação fechado.
5. Desconecte a tubulação de entrada e remova o meio residual do hub da agulha de entrada. Mantenha o vaso na posição vertical e pipete a suspensão celular dentro do hub da agulha.
6. Libere o grampo de saída para permitir que a suspensão celular entre no vaso. Feche novamente o grampo de saída após toda a suspensão ter entrado na luz do vaso.
7. Adicione meio completo aquecido ao hub da agulha de entrada, depois feche-o com uma tampa Luer estéril. Desconecte e tampe a saída.
8. Incube a câmara na posição correta (voltada para cima) a 37 °C por 3 h.
9. Repita as Seções 11.5–11.8 e incube a câmara de cabeça para baixo a 37 °C por 3 h.
10. Lave suavemente o vaso com 1 mL de meio completo e incube a 37 °C por 3 h.
11. Confirme a adesão endotelial por microscopia, remova suavemente com meio fresco as células não aderidas remanescentes e incube a 37 °C por 12–24 h.

12. Cultive o vaso sob fluxo

1. Aqueça 200 mL de meio completo por 1 h e desgaseifique-o sob vácuo usando uma unidade de filtro estéril. Reaqueça o meio em um incubador de CO₂ umidificado.
2. Em uma cabine de segurança biológica estéril, conecte sequencialmente a saída do reservatório de meio, a torneira de três vias, a tubulação da bomba, o amortecedor de pulso, o coletor de bolhas opcional, a tubulação de entrada, a câmara do vaso, a tubulação de saída e a tubulação de retorno ao reservatório de meio (Figura 3).
3. Priming do circuito de fluxo inteiro com o meio e confirme que não permaneçam bolhas ou bolsas de ar.
   NOTA: Encha os conectores e as conexões das agulhas com líquido antes da reconexão. Bolhas de ar que entram em um vaso celularizado podem causar perda de células endoteliais devido a forças de cisalhamento abruptas.
4. Transfira a montagem para um incubador a 37 °C e inicie uma taxa de fluxo de 1 dyn/cm² no vaso. Mantenha esse fluxo por 12 h.
5. Aumente o fluxo para produzir 12–16 dyn/cm² e mantenha-o por 18–24 h antes de realizar ensaios subsequentes. Para calcular a taxa de fluxo necessária para o seu vaso, determine o comprimento impresso do vaso e o diâmetro médio. Usando uma calculadora online, utilize os parâmetros determinados e insira uma seção transversal circular, meio com 10% de soro e resistência desprezível da tubulação (a tubulação possui diâmetro muito maior que o do vaso impresso).
   NOTA: Utilize o vaso o mais rápido possível após a condicionamento de fluxo. Cultivos por mais de 1 semana podem resultar em lacunas entre as células endoteliais, potencialmente associadas à perda celular ou modificação da matriz extracelular por proteases endoteliais.

13. Realize o ensaio de vazamento vascular

1. Adicione BSA marcado com Alexa 647 ou dextrana Alexa 647 de 10 kDa a 35 mL de meio completo para obter uma concentração final de 5 mg/mL. Aqueça a solução a 37 °C.
2. Pré-incube o vaso com o agente em teste, como 250 ng/mL de TNFα, por 1–2 h e inclua o mesmo agente no meio do ensaio.
3. Prepare um banho-maria a 37 °C e posicione a bomba próximo ao microscópio. Ligue o microscópio, o software de aquisição e o sistema de aquecimento da platina, e equilibre a platina a 37 °C por 30 min antes da aquisição de imagens.
4. Interrompa o fluxo no incubador, desconecte o reservatório de meio de cultura e transfira a câmara e os tubos associados para a platina do microscópio pré-aquecida.
5. Conecte a bomba a aproximadamente 20 cm de tubo equipado com uma micropipeta de vidro contendo meio não marcado. Insira o tubo da micropipeta no meio do marcador fluorescente e coloque o tubo de saída em um recipiente de coleta.
6. Configure a bomba para fornecer uma taxa de fluxo correspondente a 0,2 mL/min e não inicie o fluxo até que a aquisição de imagens esteja pronta.
7. Foque na linha média do vaso utilizando imagem de contraste de fase e mude para o canal de fluorescência 647. Inicie o fluxo na taxa estabelecida na Seção 13.6 e adquira imagens a cada 1–5 min, de acordo com o tempo de resposta esperado.
8. Gere quimógrafos a partir das imagens adquiridas e ajuste uma inclinação linear aos valores de intensidade com limiar definido. Relate o vazamento como a distância em µm percorrida pelo marcador a partir da superfície externa do vaso por minuto.

14. Mapear o fluxo de fluido

1. Vortex as microesferas fluorescentes de 10 µm por 1 min, depois sonique-as em um banho de ultrassom por 1 min. Dilua as microesferas para 1,8 × 10⁵ microesferas/mL em 10 mL de meio completo.
2. Configure o sistema de fluxo sobre a platina do microscópio conforme descrito na Seção 13 para o ensaio de vazamento vascular. Inclua um recipiente coletor de saída e ajuste a taxa de fluxo para 0,2 mL/min.
3. Foque no plano central do vaso usando uma objetiva com distância de trabalho apropriada. Adquira imagens na frequência máxima praticável permitida pelo tempo de exposição, sensibilidade do detector, intensidade de excitação e eficiência de coleta de luz.
4. Analise a sequência de imagens em lapso de tempo utilizando software de velocimetria por imagem de partículas.

15. Fixar e imunomarcar o vaso endotelializado

1. Prepare 40 mL de paraformaldeído a 4% em PBS contendo 10 mM de CaCl₂ e 10 mM de MgCl₂.
   CAUÇÃO: O paraformaldeído é tóxico. Prepare e manipule soluções contendo paraformaldeído em uma capela química apropriada, utilizando equipamento de proteção individual adequado.
2. Interrompa o fluxo, prenda o tubo de entrada com uma braçadeira, desconecte-o da bomba e conecte-o ao tubo de aspiração utilizado no ensaio de vazamento vascular. Insira o tubo de aspiração no fixador e permita que 35 mL passem através do vaso por gravidade.
3. Prenda o tubo com uma braçadeira e incube o vaso no fixador à temperatura ambiente por 30 min.
4. Lave o vaso por gravidade com 25 mL de tampão de permeabilização contendo 0,4% de Triton, 20 mM de PIPES em pH 6,1, 138 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl₂, 2 mM de EGTA e 5,5 mM de glicose. Prenda o tubo com uma braçadeira e incube por 10 min à temperatura ambiente.
5. Lave o vaso com tampão bloqueador contendo 1% de BSA, 0,05% de Tween 20, 20 mM de Tris em pH 7,4, 140 mM de NaCl e 5 mM de KCl. Incube por 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
6. Dilua o anticorpo primário escolhido na proporção de 1:50 a 1:500 em 100–500 µL de tampão bloqueador. Remova o tubo de entrada e introduza a solução de anticorpo utilizando o procedimento descrito na Seção 11 para semeadura celular.
7. Incube o vaso durante a noite a 4 °C.
8. Reconecte o tubo de entrada e lave o vaso com 20 mL de PBS.
9. Dilua os anticorpos secundários apropriados na proporção de 1:200 a 1:1.000 em tampão bloqueador e, quando necessário, adicione faloídimina fluorescente na proporção de 1:250. Introduza a solução utilizando o procedimento descrito na Seção 15.6 e incube por 2 h à temperatura ambiente.
10. Lave o vaso com 40 mL de PBS, feche as braçadeiras do tubo e tampe o tubo.
    NOTA: Armazene o vaso corado a 4 °C e realize a imagem em até 2 semanas.
11. Corar a F-actina com faloídimina fluorescente, o complexo de Golgi com anti-GM130 e os núcleos com DAPI.
12. Analise as imagens de faloídimina utilizando o FibrilTool⁷⁴ para determinar a orientação média das fibras de estresse de F-actina.
13. Determine o eixo entre os centros de massa de cada núcleo e o complexo de Golgi. Analise e plote as orientações resultantes em software de computação numérica conforme descrito anteriormente⁷⁵.

Resultados

O uso de tinta sacrificial para imprimir diversos tecidos tubulares já foi bem estabelecido por diversos grupos, notadamente o laboratório de Lewis, que fabricou túbulos renais juntamente com vasos sanguíneos^67,76. Abordagens semelhantes foram utilizadas para imprimir estruturas alveolares⁷⁷ e tumores vascularizados⁷⁸. Aqui, essas abordagens foram adaptadas para gerar geometrias vasculares com o objetivo de investigar as respostas endoteliais sob fluxo fisiológico de fluidos (Figura 2). As geometrias dos vasos foram convertidas a partir de uma imagem vascular em um mapa de coordenadas e, posteriormente, em código G para definir o trajeto de impressão (Figura 2A–C). A abordagem resultante permitiu a fabricação de moldes de vasos para estudar como a função endotelial e a organização do citoesqueleto são alteradas por vasos tortuosos e aneurismas (Figura 2D–G). Um design de câmara Rose passível de impressão 3D também foi incorporado, eliminando a necessidade de acesso a serviços de usinagem (Figura 2H). Um exemplo de arquivo de código G para impressão de vasos está disponível no Arquivo Suplementar 1, e os arquivos CAD correspondentes da câmara Rose e do suporte para microscópio estão disponíveis no Arquivo Suplementar 2 e no Arquivo Suplementar 3, respectivamente. A impressão baseada em STL pode exigir múltiplas passagens da cabeça de impressão, resultando em geometrias de vasos trançadas com lúmens separados (Figura Suplementar 1). A plataforma resultante foi projetada para ser acessível a biólogos celulares vasculares com conhecimento mínimo em bioengenharia, ao mesmo tempo em que suporta pressões e taxas de fluxo fisiológicas e permite acesso à microscopia de alta resolução (Figura 2I).

Após a fabricação do vaso e sua celularização, o dispositivo vascular foi incorporado a um sistema de perfusão em circuito fechado para permitir a circulação controlada do meio de cultura (Figura 3). O sistema era composto por uma bomba peristáltica, uma torneira de três vias conectada a uma seringa de escorvamento, um captador de bolhas, um amortecedor de pulsação, o dispositivo vascular e um reservatório de meio, dispostos sequencialmente no circuito de fluxo (Figura 3A). Essa configuração permitiu a circulação contínua do meio através do vaso engenharizado, incorporando componentes para escorvamento do sistema, remoção de bolhas e amortecimento das pulsações geradas pela bomba peristáltica. O sistema montado pôde ser operado com o dispositivo vascular posicionado na montagem experimental, conforme mostrado na Figura 3B, fornecendo uma configuração prática para a subsequente perfusão de vasos celularizados sob condições controladas de fluxo.

Uma modificação nos métodos anteriormente descritos de tintas sacrificáveis foi a pasteurização da tinta antes da impressão. Essa modificação foi necessária porque a aplicação dos protocolos publicados de preparação da tinta resultava em culturas contaminadas por fungos. Assim como outras tintas à base de Pluronic utilizadas para esta aplicação, a tinta composta por 25% de Pluronic F127 e 1% de PEO permanece líquida em baixas temperaturas e transiciona para um gel micelar compactado com o aumento da temperatura. Essa formulação apresenta uma temperatura de transição de 15°C, o que é conveniente para a confecção de estruturas em temperaturas de incubadora e para a remoção da tinta em 4°C. Semelhante ao Pluronic puro, este material também exibe uma considerável redução da viscosidade sob cisalhamento à temperatura de impressão (Figura 4A). No entanto, mesmo em baixas temperaturas, a tinta é muito viscosa para a esterilização por filtração utilizando filtros padrão de cultura de tecidos e vácuo. Embora a tinta possa ser esterilizada por pasteurização em 70°C ou superior por 20 s, essas temperaturas alteram irreversivelmente a tinta e reduzem sua viscosidade à temperatura de impressão (dados não mostrados). Pasteurização em temperaturas mais baixas e com maior duração em 63°C para >1 h reduz a contaminação por fungos e outros microrganismos sem alterar a viscosidade complexa da tinta em temperaturas adequadas para impressão. A caracterização reológica utilizando um reômetro equipado com geometria de cone e placa de 25 mm mostrou que a tinta crua e a pasteurizada apresentaram viscosidades semelhantes em uma faixa de velocidades de deformação nas temperaturas de impressão (Figura 4B), demonstrando que a pasteurização não compromete a capacidade de impressão. A tinta pasteurizada também permite o cultivo de vasos por períodos mais longos sem a necessidade de drogas antimicóticas, que podem alterar a função endotelial.

Uma vez que o vaso esteja celularizado, as células endoteliais confluentes devem revestir todo o vaso, conforme mostrado na Figura 5, com a projeção de intensidade máxima na Figura 5A e a seção transversal na Figura 5B. O fluxo do meio pode então ser aumentado para taxas de cisalhamento fisiológicas, que podem ser estimadas para vasos aproximadamente circulares utilizando a equação de Hagen-Poiseuille⁷⁹. Na prática, a taxa de fluxo necessária para atingir uma tensão de cisalhamento desejada pode ser estimada levando em conta a viscosidade do meio e a resistência microfluídica. Em um cultivo típico 2D in vitro, o fluxo do meio a 12 dyn/cm² induz a maioria dos tipos de células endoteliais a se orientarem ao longo do eixo do fluxo. Essa resposta pode ser visualizada por meio da coloração fluorescente com faloidina para F-actina (Figura 5D,E) ou pela análise do eixo Golgi-núcleo (Figura 5D,F), ambos mostrando orientação anisotrópica compatível com a polarização endotelial, conforme descrito anteriormente¹⁸. Embora tensões de cisalhamento superiores a 40 dyn/cm² ocorram in vivo, tais condições não foram modeladas aqui.

Uma consequência importante da alteração na geometria dos vasos é a alteração do fluxo de fluido, ao qual as células endoteliais respondem por meio de várias vias de sinalização^80,81. Vários métodos estão disponíveis para monitorar a velocidade do fluxo sanguíneo, incluindo ultrassonografia Doppler 4D⁸², imagem de fluxo 4D por ressonância magnética⁸³ e imagem de speckle a laser⁸⁴. Embora essas técnicas ofereçam vantagens importantes in vivo, pode ser desafiador detectar diferenças locais de fluxo ao longo de um único vaso. A capacidade de imagem de alta abertura numérica desta plataforma permite o rastreamento direto de partículas fluorescentes (Figura 6B) e a obtenção de mapas com alta resolução espacial de anomalias de fluxo induzidas pela curvatura do vaso, utilizando a técnica de velocimetria por imagem de partículas (Figura 6C). Por exemplo, observa-se um fluxo mais lento ao longo da curvatura interna do vaso em comparação com a curvatura externa (Figura 6C), o que pode contribuir para alterações nas respostas endoteliais⁸⁵.

Uma vez estabelecido um vaso confluinte, a patência e a função de barreira podem ser avaliadas pela perfusão de macromoléculas marcadas com fluoróforo, como dextranos ou proteínas, através da luz do vaso. Vasos pérvios revestidos com HUVECs resistem à passagem de dextranos marcados com fluoróforo (Figura 6D,F). Em contraste, a exposição a estímulos que rompem a barreira, como TNFα, aumenta o vazamento vascular (Figura 6H, J). As taxas locais de vazamento podem ser visualizadas utilizando análise de cimatograma (Figura 6E,G,I,K). Como o cimatograma representa distância no eixo X e tempo no eixo Y, as taxas relativas de vazamento podem ser comparadas pela quantificação das inclinações das linhas ajustadas às intensidades de fluorescência segmentadas (Figura 6E,G,I,K). Essas análises permitem avaliar como a geometria local do vaso influencia a função de barreira endotelial em resposta a estímulos definidos.

Uma vantagem fundamental desta plataforma é o acesso microscópico aprimorado em comparação ao possível in vivo. O sistema também facilita a análise imuno-histoquímica da organização molecular endotelial, particularmente do citoesqueleto de actina. As células endoteliais são muito finas e, in vivo, são rodeadas por células musculares lisas, o que pode complicar a localização de estruturas citoesqueléticas especificamente dentro do endotélio. Esta plataforma permite a coloração e a obtenção de imagens diretas de moléculas de adesão e actina filamentosa em células endoteliais (Figura 5) e suporta análises multicomponentes difíceis de realizar in vivo, incluindo a avaliação da polarização e divisão endoteliais sob fluxo fisiológico (Figura 5D–F). A combinação desses ensaios em uma única plataforma permite a análise direta das relações entre geometria vascular, alteração do fluxo, função de barreira, organização molecular endotelial e adesão intercelular.

Figura 1: Fluxograma para impressão e uso de vasos sanguíneos tridimensionais em chip. Fluxograma dos protocolos para geração e uso de vasos sanguíneos tridimensionais em chip. Círculos pretos indicam os números dos protocolos correspondentes. As cores das caixas indicam a temperatura na qual cada protocolo é realizado ou na qual a amostra é incubada. O fluxo de trabalho inclui modelagem da forma do vaso, preparação da tinta, preparação da matriz extracelular (ECM), preparação da câmara, impressão do vaso, lavagem e revestimento do vaso, celularização, cultivo com fluxo, ensaios funcionais e análise histológica. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2: Impressão de vasos e design da câmara. Vasos podem ser projetados a partir de imagens vasculares in vivo para reproduzir geometrias vasculares específicas de pacientes. (A) Pequeno vaso coronariano obtido por tomografia computadorizada (CT) com contraste, reproduzido com permissão de Parekh et al.⁸⁶ Barra de escala = 2 mm. (B) Mapa de coordenadas de pontos fiduciais de uma porção do vaso mostrado no painel A, gerado pelo registro de pontos no FIJI. (C) Saída de código G gerada a partir do mapa de coordenadas utilizando software de controle da impressora. As coordenadas X, Y e Z estão indicadas no canto inferior direito. (D) Esquema de uma câmara Rose contendo um vaso bioprintado. O design com porcas superiores manuais é compatível com a câmara de ácido polilático (PLA) impressa em 3D. (E) Câmara Rose contendo um vaso e reservatórios impressos com bio-tinta sacrificável sobre uma lamínula revestida com matriz extracelular (ECM). Barra de escala = 9 mm. (F) Esquema de uma câmara Rose configurada para o modelo de aneurisma. Um fio passado pelas agulhas de entrada e saída serve como molde do vaso, e a bio-tinta sacrificável depositada sobre o fio serve como molde do aneurisma. (G) Câmara Rose contendo o fio e o molde de bio-tinta sacrificável sobre uma lamínula revestida com ECM. (H) Adaptador de estágio microscópico de PLA impresso em 3D (à esquerda) e câmara Rose (à direita), oferecendo alternativas aos componentes usinados de alumínio. Grampos metálicos no adaptador de estágio são fixados à placa do adaptador. Barra de escala = 30 mm. (I) Vaso impresso e lavado em uma câmara Rose de alumínio montada sobre um estágio microscópico, com agulhas e tubos de entrada e saída acoplados. Barra de escala = 20 mm. Abreviações: CT = tomografia computadorizada; ECM = matriz extracelular; PLA = ácido polilático. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Sistema de fluxo de fluido para um vaso celularizado em uma câmara de Rose. (A) Esquema da configuração dos tubos utilizada para estabelecer o fluxo de fluido através de uma câmara de Rose contendo um vaso celularizado. As setas indicam a direção do fluxo. Os componentes numerados são: (1) bomba peristáltica, (2) torneira de três vias com seringa de escorvamento, (3) captador de bolhas, (4) amortecedor de pulsação, (5) dispositivo do vaso e (6) reservatório de meio. Todos os componentes que entram em contato com o meio de cultura são esterilizados antes do uso. (B) Sistema de fluxo de fluido contendo um vaso celularizado em uma câmara de Rose dentro de um incubador de cultura de tecidos. Os números correspondem aos componentes mostrados no painel A. As agulhas de entrada e saída são fixadas com fita para garantir estabilidade. Barra de escala = 40 mm. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Caracterização reológica da bio-tinta sacrificial. (A) Viscosidade ao cisalhamento da tinta de Pluronic F127 a 25% e óxido de polietileno (PEO) a 1%, não pasteurizada, em função da taxa de cisalhamento a 5 °C, 10 °C, 14,4 °C, 15 °C e 23 °C. (B) Viscosidade complexa em função da frequência angular para a tinta de Pluronic F127/PEO não pasteurizada e pasteurizada a 25 °C e 37 °C. Abreviação: PEO = óxido de polietileno. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagem e análise quantitativa de vasos endotelializados fixados e corados. (A) Projeção de intensidade máxima de imagens de fluorescência confocal de disco giratório de um vaso totalmente celularizado após semeadura inicial e cultivo sob baixo estresse cisalhante (1 dyn/cm²). O vaso foi corado para VE-caderina (verde), F-actina (vermelho) e DNA com DAPI (azul). Barra de escala = 50 µm. (B) Seção transversal xz reconstruída de um z-stack de imagens de fluorescência confocal de disco giratório de um vaso totalmente celularizado corado com faloideína fluorescente para marcar F-actina (vermelho). Barra de escala = 50 µm. (C) Projeção de intensidade máxima de um z-stack de imagens de fluorescência confocal de disco giratório de um vaso totalmente celularizado após 24 h de fluxo a 12 dyn/cm². A F-actina foi marcada com faloideína fluorescente (vermelho). Barra de escala = 100 µm. (D) Imagem de fluorescência confocal de disco giratório de uma região vascular após 24 h de cultivo sob um estresse cisalhante de 16 dyn/cm². O vaso foi corado para VE-caderina (amarelo), F-actina (magenta), o marcador do complexo de Golgi GM130 (verde) e DNA com DAPI (azul). A seta indica a direção do fluxo. Barra de escala = 30 µm. (E) Quantificação representativa da orientação média das fibras de estresse obtida a partir do canal de F-actina no painel D, utilizando o FibrilTool74. Uma grade de 45 regiões, cada uma com área de 1.600 µm², foi analisada, e as orientações médias das fibras são exibidas como um histograma radial em relação à direção do fluxo. (F) Quantificação representativa do eixo núcleo-Golgi a partir do painel D como medida da polarização das células endoteliais. Vetores do centro de cada núcleo até o centro do respectivo aparelho de Golgi são representados em um histograma radial em relação à direção do fluxo; n = 75 vetores. Abreviação: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise do fluxo de fluido e vazamento vascular. (A) Esquema da geometria do vaso utilizada nas análises dos painéis B–K. As letras indicam as regiões aproximadas do vaso correspondentes aos respectivos painéis. (B) Projeção temporal codificada por cores de uma sequência de imagens de fluorescência confocal de disco giratório com lapso de tempo, mostrando microesferas fluorescentes se movendo sob fluxo em uma região curva do vaso. A cor indica o número do quadro de 1 a 100; as curvaturas interna e externa são indicadas. (C) Análise de velocimetria por imagem de partículas (PIV) mostrando a velocidade relativa do fluxo na região curva do vaso. As cores representam a velocidade relativa, e as setas indicam a direção e magnitude do fluxo. Barra de escala = 50 µm. (D–G) Ensaio representativo da barreira vascular de um vaso não tratado perfundido com dextrano de 10 kDa marcado com Alexa 647. (D,D′,D″) Imagens de uma região reta do vaso adquiridas aos 0, 70 e 150 min, respectivamente. A linha branca indica a região utilizada para o quimógrafo no painel E. (E) Quimógrafo da região reta no painel D mostrando uma taxa de vazamento de 0,39 µm/min, que é a inclinação da linha tracejada. (F,F′,F″) Imagens da região curva do vaso adquiridas aos 0, 70 e 150 min. A linha branca indica a região utilizada para o quimógrafo no painel G. Barra de escala = 150 µm. (G) Quimógrafo da região curva no painel F mostrando uma taxa de vazamento de 1,01 µm/min, que é a inclinação da linha tracejada. (H–K) Ensaio representativo da barreira vascular após pré-incubação com 250 ng/mL de fator de necrose tumoral alfa (TNFα). (H,H′,H″) Imagens de uma região reta do vaso adquiridas aos 0, 200 e 400 min, respectivamente. A linha branca indica a região utilizada para o quimógrafo no painel I. Barra de escala = 250 µm. (I) Análise por quimógrafo da região reta do vaso no painel H mostra uma taxa de vazamento de 2,1 µm/min, que é a inclinação da linha tracejada. (J,J′,J″) Imagens da região curva do vaso adquiridas aos 0, 200 e 400 min. A linha branca indica a região utilizada para o quimógrafo no painel K. Barra de escala = 250 µm. (K) Análise por quimógrafo da região curva do vaso no painel J mostra uma taxa de vazamento de 6,7 µm/min, que é a inclinação da linha tracejada. Os asteriscos nos painéis D–K identificam as extremidades correspondentes das linhas utilizadas para gerar os quimógrafos. Abreviações: PIV = velocimetria por imagem de partículas; TNFα = fator de necrose tumoral alfa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Impressão de vaso utilizando programação da impressora baseada em STL. (A) Imagem de contraste de interferência diferencial de um vaso impresso gerado usando programação da impressora baseada em STL, que orienta a cabeça da impressora a fazer duas passagens, produzindo uma estrutura de vaso trançado. Barra de escala = 250 µm. (B) Representação tridimensional do vaso trançado lavado e preenchido com albúmina sérica bovina (BSA) marcada com Alexa 647. Uma lacuna é visível entre as luzes dos dois filamentos trançados. Barra de escala = 100 µm. Abreviações: BSA = albúmina sérica bovina; STL = linguagem de tesselação padrão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Código G para impressão do vaso. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Desenho CAD da câmara Rose. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Desenho CAD do adaptador de montagem para o estágio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Descreve-se um sistema robusto para modelar geometrias vasculares associadas ao fluxo perturbado, incluindo vasos tortuosos, aneurismas e pontos de bifurcação. O método permite imagens de alta resolução, mapeamento de fluxo e avaliação da função de barreira vascular em uma plataforma acessível a biólogos celulares com experiência limitada em bioengenharia. Embora a abordagem principal exija uma bioimpressora, impressoras comerciais baseadas em extrusão variam de sistemas de código aberto a plataformas mais avançadas com múltiplos cabeçotes de impressão. As capacidades essenciais da impressora incluem controle da temperatura do cabeçote e da tinta, regulação precisa da pressão e temperatura da plataforma de impressão. Além dos vasos tortuosos e ramificados produzidos por bioimpressão, o método também inclui um modelo de aneurisma que pode ser gerado sem o uso de uma bioimpressora. Em conjunto, essas abordagens facilitam a investigação da função de células endoteliais em vasos tortuosos utilizando métodos de microscopia comumente disponíveis em laboratórios de biologia celular.

Diversos sistemas de modelo in vitro estão disponíveis para o estudo da função vascular^87,88, cada um com pontos fortes e limitações distintos. O sistema descrito aqui, adaptado de trabalhos anteriores^54,67,69, é particularmente adequado para investigar os efeitos da tortuosidade vascular na função endotelial, pois permite a modelagem direta de geometrias de vasos derivados de pacientes e a variação sistemática da curvatura vascular dentro de um único dispositivo. Outras abordagens já modelaram vasos coronarianos de pacientes utilizando gelatina metacrilada fotopolimerizável para gerar estruturas de vasos em escala reduzida sob fluxo fisiológico⁶⁰. Tais sistemas oferecem modelagem precisa de vasos, análise de fluxo e a possibilidade de incorporar camadas da túnica média. No entanto, seu tamanho geral e requisitos de suporte em vidro podem limitar a imagem de alta resolução e ensaios localizados de vazamento. Por outro lado, sistemas menores baseados na autoagregação de células endoteliais derivadas de iPSCs permitem imagem de alta resolução e podem incorporar tanto células endoteliais quanto células musculares lisas vasculares⁸⁹. No entanto, esses modelos oferecem menor controle sobre a geometria dos vasos, e estabelecer altos fluxos e taxas de cisalhamento pode ser desafiador. O sistema atual representa, portanto, uma abordagem intermediária prática que combina geometria de vaso definida com imagem de alta resolução da tortuosidade vascular.

Uma grande vantagem dessa plataforma é a capacidade de gerar vasos contendo regiões curvas e retas, permitindo a comparação direta da geometria local dos vasos dentro da mesma amostra, enquanto outras variáveis experimentais permanecem constantes, conforme mostrado na Figura 6. Outra vantagem é a possibilidade de utilizar imagens de vasos derivadas de pacientes obtidas por angiografia ou tomografia computadorizada com contraste. A principal limitação para a reprodução de vasos de pacientes é o tamanho. Vasos com diâmetro menor que 150µm são difíceis de imprimir de forma reprodutível, enquanto segmentos de vasos que se estendem por vários centímetros exigem câmaras de montagem maiores. Os segmentos de vasos também devem permanecer relativamente planos na terceira dimensão, para que possam ser impressos sobre a camada da matriz base e mantidos dentro da distância de trabalho da lente objetiva durante a imagem microscópica.

Em trabalhos futuros, o sistema descrito aqui poderia ser modificado ainda mais para modelar doenças como a aterosclerose, na qual a geometria dos vasos pode contribuir para a fisiopatologia. Células endoteliais geneticamente modificadas ou tipos celulares adicionais, incluindo células musculares lisas e células imunes, poderiam ser incorporados para aumentar a complexidade fisiológica. A inclusão de células musculares lisas sob a camada endotelial, como demonstrado em sistemas mais simples, poderia fornecer informações adicionais sobre as interações entre músculo liso e endotélio na tortuosidade vascular e nas doenças⁹⁰. Modificações adicionais poderiam incluir células tumorais para investigar a intravasação^68,91 e a influência da tortuosidade nesse processo. A plataforma também poderia ser usada para examinar como o fluxo perturbado altera as respostas inflamatórias^92,93 e potencialmente contribui para complicações vasculares associadas a infecções como a COVID-19⁹⁴. Dado o amplo envolvimento da vasculatura na saúde e na doença humanas, sistemas acessíveis como este podem facilitar investigações adicionais da função endotelial em diversos contextos de doenças.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(3-Aminopropil)trimetoxissilano (APTMS), 97%	Sigma-Aldrich	281778	Utilizado para silanização e ativação de lamínulas de vidro antes da fixação da MEC.
Seringa estéril de 1 mL	Fisher Scientific	14-823-434	Utilizada para entrega de reagentes, revestimento de recipientes e manipulação de fluidos.
Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS)	Thermo Fisher Scientific	J61196.AP	Utilizada para preparação de reagentes, lavagem e lavagem de recipientes.
Seringa estéril de 10 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Utilizada para preparação de reagentes e transferência de fluidos.
Tubos cónicos de 15 mL com tampa	Fisher Scientific	05-538-59A	Utilizados para preparação de reagentes, manipulação de células e armazenamento de soluções.
Placa de Petri de poliestireno de 150 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Utilizada como recipiente estéril para trabalho ou incubação.
Agulha 21G	Fisher Scientific	14-817-227	Utilizada para preparação do molde do vaso e acesso à câmara.
Agulha 23G	Fisher Scientific	14-817-237	Utilizada para conexões de entrada e saída do vaso durante lavagem e perfusão.
Agulha dispensadora transparente cónica de 27G	Nordson	7018417	Utilizada para extrusão de tinta sacrificial e visualização de bolhas de ar durante a impressão.
Seringa estéril de 3 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Utilizada para transferência de fluidos e entrega de reagentes. Confirmar o número do catálogo, pois o número fornecido também está listado para a seringa de 10 mL.
Fio de mandril médico de aço inoxidável 304, diâmetro de 0,0190 pol.	Component Supply	GWX-0190-36	Utilizado como molde removível para o lúmen reto no modelo de aneurisma baseado em fio.
Tubos cónicos de 50 mL com tampa	Fisher Scientific	05-526B	Utilizados para preparação, mistura, pasteurização e armazenamento de reagentes.
Anticorpo secundário Alexa 488 anti-murino	Thermo Fisher Scientific	A32723TR	Anticorpo secundário fluorescente utilizado para imunomarcação.
Anticorpo secundário Alexa 555 anti-coelho	Thermo Fisher Scientific	A-21428	Anticorpo secundário fluorescente utilizado para imunomarcação.
Albumina de soro bovino marcada com Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A34785	Rastreador macromolecular fluorescente utilizado em ensaios de barreira vascular e vazamento.
Dextrano marcado com Alexa 647, 10 kDa	Thermo Fisher Scientific	D22914	Rastreador fluorescente utilizado para avaliar a função da barreira endotelial e vazamento vascular.
Faloidina Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A22287	Utilizada para rotular fluorescentemente a F-actina para imagem do citoesqueleto e análise de orientação.
Albumina, soro bovino, Fração V, livre de ácidos graxos	Sigma-Aldrich	126575-10GM	Utilizada para bloqueio e preparação de soluções contendo proteínas.
Antibiótico-Antimicótico, 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Suplemento antimicrobiano opcional para MEC e meio de cultura.
Anticorpo anti-GM130, clone 4A3	Sigma-Aldrich	MABT1363	Anticorpo primário utilizado para rotular o aparelho de Golgi para análise da polaridade endotelial.
Anticorpo primário monoclonal coelho anti-VE-caderina, D87F2	Abcam	65707	Anticorpo primário utilizado para visualizar as junções célula-célula endoteliais.
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C7902	Utilizado na preparação da MEC e tampões de fixação. Verificar se o reagente pretendido é cloreto de cálcio anidro ou hidratado.
Kit de conectores	World Precision Instruments	504954	Conectores Luér-para-tubo utilizados para montar o circuito de perfusão microfluídico.
Porta-lamínulas para coloração	Electron Microscopy Sciences	72240	Utilizado para segurar lamínulas durante limpeza, silanização, ativação e lavagem.
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G7021-100G	Componente do tampão de permeabilização utilizado durante imunomarcação.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	Corante nuclear fluorescente utilizado para imagem celular e análise de polaridade.
Placa quente digital	Fisher Scientific	11-475-028	Utilizada para manter a câmara do vaso e os reagentes a aproximadamente 37 °C durante a montagem.
Sais tetrasódicos de EGTA	Sigma-Aldrich	E8145-10G	Agente quelante utilizado no tampão de permeabilização.
Conector Luér fêmea com bico para tubo de 1/16 pol. de diâmetro interno	Scientific Commodities Inc.	BB330A	Utilizado para conectar tubos dentro do circuito microfluídico.
Luér fêmea com bico de 1/16 pol. de diâmetro interno, CrystalVu QC	Fisher Scientific	01-000-123	Utilizado para conexões de tubo e câmara de vaso.
Fibrinogênio	Sigma-Aldrich	F8630	Componente da MEC utilizado com gelatina e trombina para formar o hidrogel de suporte do vaso. Verificar a fonte: o manuscrito descreve fibrinogênio de plasma humano, enquanto a tabela fornecida indica plasma bovino.
Amortecedor de pulso de fluido	Darwin Microfluidics	SE-D1606-3NB-PC-31	Utilizado para reduzir flutuações pulsáteis geradas pela bomba peristáltica.
Fita de borracha de silicone de alta temperatura para indústria alimentícia	McMaster-Carr	8417K51	Utilizada para fabricar a junta da câmara Rose.
Gelatina de pele de suíno, força de gel 300, Tipo A	Sigma-Aldrich	G2500	Componente principal da MEC utilizado para formar o hidrogel ao redor do lúmen do vaso.
Lâmina de vidro, No. 1,5	VWR	EN-MAS-25X25-1-5-CS	Substrato de microscopia de alta resolução e superfície da câmara.
Glutaraldeído, 25%	Electron Microscopy Sciences	16220	Diluído para ativação de lamínulas antes da fixação da MEC.
Kit de crescimento-BBE	ATCC	PCS-100-040	Kit de suplementos utilizado com meio basal para células vasculares no cultivo de células endoteliais.
Kit de crescimento-VEGF	ATCC	PCS-100-041	Suplemento de crescimento endotelial utilizado com meio basal para células vasculares quando necessário.
Fibronectina de plasma humano	Sigma-Aldrich	FC010	Revestimento opcional da MEC luminal utilizado para promover a adesão endotelial.
Prendedor de tubo inline	Sigma-Aldrich	Z503371-1PAK	Utilizado para interromper e regular o fluxo através do tubo durante manipulação e incubação da câmara.
Bomba peristáltica digital Ismatec Reglo	Masterflex	78018-12	Utilizada para gerar fluxo de fluido controlado através de vasos celularizados.
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	Revestimento opcional da MEC luminal para modificação da adesão e polarização endoteliais.
Kit sortido de acopladores Luér-para-tubo	World Precision Instruments	504954	Utilizado para conectar tubos, seringas e componentes de entrada/saída da câmara. Duplicata do número de catálogo do kit de conectores; manter uma entrada se idêntica.
Cloreto de magnésio hexaidratado	Sigma-Aldrich	M2393-100G	Componente dos tampões de fixação e permeabilização.
Conector Luér macho com bico para tubo de 1/16 pol. de diâmetro interno	Scientific Commodities Inc.	BB329A	Utilizado para conexões de tubo microfluídico.
Conector Luér macho, 1/16 pol. de diâmetro interno	World Precision Instruments	13160-100	Utilizado para conectar tubos a seringas e componentes da câmara.
Matrigel	Sigma-Aldrich	CLS356234-1EA	Revestimento opcional da MEC luminal utilizado para adesão endotelial.
Tampas de frascos de meio	Fisher Scientific	05-719-310	Tampas com dois orifícios utilizadas para construir reservatórios estéreis de meio de cultura para o circuito de fluxo.
Tubo de silicone Nalgene Pharma-Grade, 1/16 pol. de diâmetro interno	Thermo Fisher Scientific	8600-0020	Tubo flexível utilizado nos circuitos de perfusão e lavagem microfluídicos.
Parafilm	Electron Microscopy Sciences	70990-125	Utilizado como superfície não aderente durante a polimerização de revestimentos de MEC em lamínulas.
PBS, 10x, pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	70011044	Tampão concentrado utilizado para preparar soluções de PBS de trabalho.
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Suplemento antibiótico utilizado no meio de cultura endotelial e soluções de lavagem.
PIPES	Sigma-Aldrich	P1851-25G	Componente tampão da solução de permeabilização.
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Componente termorresponsivo da tinta de impressão sacrificial.
Chave de três vias de policarbonato com Luér macho	Fisher Scientific	NC9593742	Utilizada para escorvamento, comutação e controle de trajetos de fluido no circuito de perfusão.
Óxido de polietileno (PEO)	Sigma-Aldrich	372781	Componente polimérico da formulação de tinta sacrificial.
Misturador rotativo	Fisher Scientific	88861050	Utilizado para misturar a tinta sacrificial PEO/Pluronic a 4 °C.
Bandeja de coloração para unidade deslizante	MSE Supplies	DWK90020	Utilizada para lavagem, coloração ou incubação de reagentes em lamínulas.
Lâmina de vidro quadrada, No. 2, 25 mm x 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS285525-1000EA	Lâmina da câmara; o vidro mais espesso No. 2 oferece maior resistência à quebra e é compatível com objetivas aéreas ou aquáticas adequadas.
Agulha dispensadora romba de aço inoxidável, 21 G, 1 pol.	Component Supply	NE-212PL	Utilizada para entrega de fluidos ou construção do modelo de vaso com molde de fio.
Unidades de filtro a vácuo Steriflip	MilliporeSigma	SE1M179M6	Utilizadas para filtrar esterilmente gelatina aquecida e outras soluções compatíveis.
Seringas plásticas estéreis de 5 mL	Allevi	PSYR5-S	Utilizadas para carregar tinta sacrificial para impressão por extrusão pneumática.
Trombina, plasma humano, alta atividade	Sigma-Aldrich	605195	Utilizada para iniciar a polimerização do fibrina durante a formação do gel da MEC.
Transglutaminase	Moo Gloo	1201	Enzima de reticulação utilizada durante a preparação e modificação da MEC de gelatina/fibrina.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648466	Detergente utilizado para permeabilização de células endoteliais antes da imunomarcação.
Enzima TrypLE Express, 1x, vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	12605010	Reagente de dissociação celular utilizado para colher células endoteliais antes do semeadura do vaso.
Tween 20	Sigma-Aldrich	11332465001	Componente detergente do tampão de bloqueio para imunomarcação.
Meio basal para células vasculares	ATCC	PCS-100-030	Meio basal utilizado para cultivo de células endoteliais e experimentos de perfusão.