Artigo de método

Ativação Mecânica de Macrófagos Induzida por Peristaltismo

39 vistas

⸱

DOI:

10.3791/72607

⸱

18 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta a configuração e operação de um biorreator patenteado para estudos de mecanoimunomodulação. Aqui, utilizando um biorreator personalizado que reproduz forças fisiológicas, demonstramos que macrófagos desenvolvem uma resposta nitidamente pró-inflamatória à estimulação mecânica.

Resumo

A inflamação é um processo complexo que contribui para doenças agudas e crônicas. Ela é modulada por uma cascata de sinais bioquímicos e biofísicos que resultam na ativação de células imunes. Os macrófagos são um tipo primário de célula imune envolvido em múltiplas condições inflamatórias, incluindo câncer, fibrose e doenças autoimunes. Os métodos tradicionais de investigação da ativação de macrófagos envolvem estimulação bioquímica com citocinas ou quimiocinas definidas, induzindo os macrófagos a estados pró- ou anti-inflamatórios extremos. Evidências emergentes sugerem que sinais biofísicos também desempenham um papel na ativação de macrófagos, além dos sinais bioquímicos presentes nos tecidos. Um desses estímulos mecânicos prevalentes é a peristalse, composta por tensão multiaxial e tensão de cisalhamento, que ocorre no trato gastrointestinal, útero, vias aéreas em desenvolvimento e ureteres. Neste estudo, testamos a hipótese de que a peristalse pode ativar macrófagos. Neste protocolo, descreve-se o uso de um biorreator peristáltico para investigar a ativação mecânica de macrófagos. Membranas de polidimetilsiloxano foram recobertas com fibronectina para aumentar a adesão dos macrófagos. Macrófagos derivados de medula óssea de camundongos imortalizados (iBMDM) foram semeados sobre membranas recobertas com fibronectina e mantidos como controles estáticos ou expostos à peristalse por 4 h. A peristalse ativou os macrófagos, com diferenças significativas na expressão gênica de Il6 (50,9 vezes acima dos controles estáticos; p < 0.0001, teste t) e Nos2 (19,8 vezes acima dos controles estáticos; p = 0,0046). Curiosamente, nenhuma alteração significativa foi observada em Chil3 (1,22 vezes acima dos controles estáticos; p = 0,9726) ou Mrc1 (1,16 vezes acima dos controles estáticos; p = 0.9810) em comparação com os controles estáticos, indicando que a ativação pró-inflamatória foi principalmente impulsionada por fatores mecânicos. Os achados atuais apoiam o conceito de mecano-imunomodulação de macrófagos, especialmente em resposta à mecânica da peristalse, prevalente em diversos tecidos baseados em músculo liso.

Introdução

Os macrófagos são células imunes inatas que desempenham papéis essenciais na defesa do hospedeiro, remodelação tecidual e regulação da inflamação por meio da fagocitose e secreção de citocinas1,2,3,4. Dependendo dos estímulos presentes no microambiente in vivo, macrófagos indiferenciados (M0) podem polarizar plasticamente para fenótipos pró-inflamatórios (M1) ou anti-inflamatórios/pro-regenerativos (M2)5,6. Modelos in vitro são tipicamente utilizados para isolar esses diferentes estímulos, a fim de compreender melhor os mecanismos complexos que conduzem à polarização dos macrófagos. Os macrófagos M1 classicamente ativados são geralmente induzidos in vitro por estímulos bioquímicos, como lipopolissacarídeo (LPS) e interferon gama (IFN-γ), resultando no aumento da expressão de mediadores inflamatórios, incluindo óxido nítrico sintase induzível (iNOS), interleucina-6 (IL6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)7,8. Os macrófagos M2 alternativamente ativados são comumente induzidos pela exposição à interleucina-4 (IL-4) e interleucina-13 (IL-13), promovendo respostas de remodelação tecidual e cicatrização de feridas8,9. Os macrófagos M2 são ainda subdivididos em fenótipos M2a, M2b e M2c com base em vias de ativação distintas e perfis de expressão de marcadores de superfície10,11. Embora a regulação bioquímica da polarização dos macrófagos tenha sido amplamente caracterizada em sistemas in vivo e in vitro, os macrófagos residem em microambientes altamente dinâmicos que também contêm estímulos biomecânicos significativos12. Além de citocinas e quimiocinas solúveis, os macrófagos estão expostos a interações com a matriz extracelular e entre células, rigidez do substrato, tensão de cisalhamento do fluido, pressão hidrostática e deformação cíclica do tecido12,13,14. Como células mecanossensíveis, os macrófagos podem alterar seus fenótipos inflamatórios em resposta a esses estímulos físicos, destacando a importância da mecanobiologia na regulação imunológica.

Um número crescente de estudos demonstrou que estímulos mecânicos isolados in vitro podem influenciar significativamente os estados de ativação dos macrófagos (Figura 1). A exposição a substratos mais rígidos aumentou a polarização M1 e a produção de citocinas inflamatórias em comparação com substratos mais macios, que induziram um fenótipo pró-regenerativo15,16,17,18,19,20. Da mesma forma, a tensão de cisalhamento do fluido modula o fenótipo dos macrófagos de maneira dependente da magnitude, sendo que níveis baixos de fluxo intersticial frequentemente promovem a ativação pró-regenerativa21,22, enquanto tensões de cisalhamento mais altas, semelhantes aos valores observados nas artérias, podem induzir respostas pró-inflamatórias23,24,25,26,27,28. Modelos in vitro de alongamento cíclico projetados para imitar a mecânica dos tecidos musculoesquelético, miocárdico, pulmonar e intestinal também demonstraram aumento na expressão de mediadores inflamatórios, embora os resultados variem conforme a magnitude, duração, frequência e dimensionalidade da força aplicada29,30,31,32. Além disso, a mecanossensibilidade dos macrófagos difere entre espécies e fontes celulares, enfatizando a importância de selecionar modelos experimentais apropriados para estudos de mecanobiologia13,14.

Diagrama de ativação de macrófagos; estímulos bioquímicos e biomecânicos; alterações fenotípicas; fatores de estresse.
Figura 1: Esquema que ilustra os estímulos bioquímicos e biomecânicos in vitro para ativação de macrófagos em estados pró-inflamatórios ou pró-regenerativos. Os macrófagos podem ser estimulados para um estado pró-inflamatório in vitro pela adição de estímulos químicos, como lipopolissacarídeo (LPS), interferon γ (IFN-γ), ou pela exposição a estímulos mecânicos, incluindo tensão de cisalhamento, aumento de rigidez, alongamento uniaxial cíclico e estático induzido por deformação, compressão e deformação induzida por compressão multiaxial. Os macrófagos podem ser estimulados para um estado pró-regenerativo pela adição in vitro de estímulos químicos, como interleucina-13 (IL-13) e IL-4. Eles também podem tornar-se pró-regenerativos quando expostos a estímulos mecânicos na forma de tensão de cisalhamento oscilante, fluxo intersticial, substratos macios ou baixos níveis de deformação cíclica uniaxial. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Além de investigar estímulos mecânicos isolados de forma independente, é importante aprimorar esse trabalho para começar a estudar o impacto de forças físicas combinadas, já que os macrófagos in vivo geralmente estão expostos a combinações de forças simultâneas. A peristalse representa um desses ambientes mecânicos complexos, constituído por deformação cíclica multiaxial e tensão de cisalhamento do fluido geradas pela contração do músculo liso33. Essas forças estão presentes em múltiplos sistemas orgânicos, incluindo o trato gastrointestinal, vias aéreas em desenvolvimento, sistema vascular, útero e ureteres34,35,36. É importante destacar que a função peristáltica é frequentemente desregulada em doenças inflamatórias, como fibrose, doença inflamatória intestinal, câncer e distúrbios de remodelação das vias aéreas, todas envolvendo inflamação significativa mediada por macrófagos33,37,38,39. Apesar do papel reconhecido dos macrófagos nessas doenças, ainda existe uma lacuna crítica na compreensão de como as forças mecânicas peristálticas influenciam diretamente a ativação dos macrófagos.

Este protocolo descreve o uso de um sistema de biorreator peristáltico para investigar a mecanoimunomodulação de macrófagos sob condições mecânicas fisiologicamente relevantes. Em comparação com sistemas convencionais de cultura estática ou plataformas de estímulo mecânico com força única, este método permite a aplicação simultânea de tensão cíclica multiaxial e tensão de cisalhamento fluida, recapitulando mais fielmente o microambiente mecânico in vivo de tecidos baseados em músculo liso. Neste protocolo, macrófagos derivados de medula óssea murina imortalizados (iBMDMs) cultivados em biorreatores sob condições peristálticas exibiram aumento nos marcadores de ativação M1, ao mesmo tempo em que não mostraram tendência à ativação M2. Esses achados demonstram que a mecânica peristáltica é suficiente para modular o comportamento inflamatório dos macrófagos e apoiam o conceito mais amplo de mecanoimunomodulação em tecidos expostos a forças dinâmicas impulsionadas pelo músculo liso. Este método é particularmente aplicável a pesquisadores que estudam mecanobiologia, inflamação, engenharia de tecidos, fisiologia gastrointestinal, desenvolvimento pulmonar, fibrose e outras doenças nas quais os macrófagos estão expostos a microambientes mecânicos complexos. Com montagem cuidadosa, calibração consistente e monitoramento contínuo, os usuários podem garantir desempenho reprodutível do biorreator e evitar limitações comuns desta técnica.

Protocolo

O protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema de biorreator patenteado40 para estudos de mecanoimunomodulação. Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura celular

  1. Mantenha macrófagos derivados da medula óssea de camundongos imortalizados (iBMDMs) em RPMI 1640 completo suplementado com 10% de SBF inativado pelo calor, 1% de tampão HEPES, 1% de piruvato de sódio e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C com suplementação de 5% de CO2.

2. Fabricação de polidimetilsiloxano (PDMS)

  1. Pese e misture a base e o agente de cura do kit de elastômero de silicone na proporção de 10:1 (p/p).
  2. Agite a mistura durante 5 min para garantir uma mistura uniforme.
  3. Despeje cuidadosamente o PDMS misturado em uma placa de Petri quadrada de 100 mm x 15 mm até que o PDMS atinja 3 mm de altura.
  4. Coloque as placas de Petri com PDMS em um dessecador.
  5. Desgaseifique sob vácuo durante 1 h para remover bolhas de ar.
  6. Retire o PDMS do dessecador e confirme que não restam bolhas de ar.
  7. Transfira as membranas de PDMS não curadas para uma estufa pré-aquecida a 60 ˚C e cure por 4 h.
  8. Retire as membranas de PDMS da estufa e deixe esfriar na bancada durante a noite.
  9. Após 18–24 h, desprenda cuidadosamente as membranas de PDMS curadas das placas de Petri e corte-as para obter membranas de PDMS de 70 mm x 40 mm x 3 mm.

3. Esterilização da membrana de PDMS

  1. Dentro de uma cabine de segurança biológica, lave as membranas de PDMS com etanol 70% e coloque-as diretamente sobre a superfície da cabine de segurança biológica (BSC) (Suplementar Figura 1).
  2. Sterilize com UV por 10 min, em seguida transfira a membrana de PDMS para uma placa de cultura de 90 mm não tratada para cultura de tecidos, com o lado exposto ao UV voltado para cima.
    NOTA: Certifique-se de segurar o PDMS pelas laterais e nunca cruze as mãos sobre a parte superior do PDMS para reduzir o risco de contaminação.
  3. Para experimentos de peristalse, utilize as membranas de PDMS nas suas dimensões originais.
  4. Para condições de cultura estática, corte cada membrana de PDMS de 70 mm x 40 mm em duas metades iguais de 35 mm x 40 mm.

4. Revestimento de membranas de PDMS com fibronectina

  1. Dentro de uma cabine de segurança biológica (BSC), prepare um volume suficiente de solução estéril de fibronectina a 0,5 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para adicionar 100 µL por membrana.
  2. Adicione 100 µL dessa solução de revestimento no centro de cada membrana de PDMS, garantindo que a região revestida esteja alinhada precisamente com a área de contato entre o PDMS e o parafuso.
    NOTA: Use uma ponteira de pipeta para espalhar suavemente a solução em uma camada fina e uniforme.
  3. Deixe as membranas de PDMS revestidas na placa de cultura, com a tampa aberta, por 45 min para permitir a adsorção.
    NOTA: Mantenha a janela da BSC aberta para manter o fluxo contínuo de ar.
  4. Após 45 min, aspire cuidadosamente a solução remanescente de fibronectina de cada membrana.
  5. Lave suavemente as membranas com 1 mL de PBS estéril.

5. Semeadura de células iBMDM na membrana de PDMS

  1. Quando atingirem 70%–80% de confluência, trypsinize as células iBMDM cultivadas em um frasco T25 para destacá-las da superfície.
  2. Determine a concentração celular utilizando um hemocitômetro e prepare uma densidade celular de 100.000 células/mL no meio de cultura.
  3. Em cada membrana de PDMS revestida com fibronectina, plaque 1 mL da suspensão celular preparada por membrana.
  4. Para cada experimento, plaque pelo menos uma membrana estática e uma membrana com peristalse para garantir uma comparação paralela entre as condições.
  5. Coloque as membranas de PDMS semeadas em um incubador umidificado a 37 °C com 5% de CO2 por pelo menos 24 h para permitir a adesão celular, tanto nas condições estáticas quanto peristálticas (Suplementar Figura 1B).

6. Biorreator

  1. Fabricar o biorreator utilizando arquivos de design auxiliado por computador (CAD) e especificações fornecidos na patente do biorreator (US12522795)40 ou obter uma unidade pré-montada dos autores.

7. Montagem e calibração do circuito Arduino

  1. Construção do circuito
    1. Monte o circuito de controle em uma placa de prototipagem usando potenciômetros, resistores, transistores e fiação condutiva conforme mostrado na Figura Suplementar 2.
    2. Instale a IDE Arduino no computador e abra um novo esboço.
    3. Defina a velocidade do motor como 5 rotações por minuto (RPM) e a bomba peristáltica como 28 mL/min.
    4. Conecte a placa Arduino ao computador por meio de USB e faça o upload do código fornecido no Arquivo Suplementar 1 usando o botão de upload na IDE.
      NOTA: O LED do Arduino ficará laranja durante o upload e retornará ao verde quando estiver pronto para funcionar. Após a conclusão do upload, o Arduino executará automaticamente o programa ao ser ligado.
  2. Calibração do motor
    1. Inicie o motor e conte as rotações durante 1 min usando um cronômetro.
      NOTA: Ajuste o parâmetro de velocidade do motor no código Arduino conforme necessário para atingir 5 RPM.
    2. Faça o upload novamente do código após cada ajuste até que a velocidade desejada seja alcançada.
  3. Calibração da bomba
    1. Execute a bomba por 30 s e meça a massa coletada para verificar uma vazão de 28 mL/min (~14 g em 30 s).
    2. Ajuste o potenciômetro e repita até que a saída em 30 s seja consistentemente próxima de 14 g.
  4. Após calibrar o motor e a bomba, acople-os a uma unidade de biorreator.
    NOTA: O conjunto calibrado de motor–bomba–biorreator está agora pronto para uso experimental (Figura 2).

Diagrama do biorreator para configuração do cultivo de macrófagos; análise de imagem e PCR para resultados do estudo celular.
Figura 2: Esquema da montagem do biorreator de peristalse e análise subsequente. Células iBMDM são semeadas em uma membrana de PDMS revestida com fibronectina, a qual é acomodada dentro do biorreator. Após 4 h de exposição à peristalse ou mantidas como controles estáticos, as células são colhidas para análises posteriores, incluindo qPCR, coloração por imunofluorescência e obtenção de imagens. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

8. Montagem e configuração do biorreator de peristalse

  1. Preparação dos componentes
    1. Reúna todos os componentes necessários, incluindo frasco de meio, tampa do meio, topo do frasco de meio impresso em 3D, topo do biorreator impresso em 3D, fundo do biorreator impresso em 3D, eixo de rosca impresso em 3D, abraçadeiras plásticas (três por biorreator), alicate de articulação móvel, alicate de corte, placas de cultura de tecidos de 150 mm, graxa de silicone e suporte do motor impresso em 3D. Pulverize cada item com etanol a 70% antes de colocá-lo dentro da cabine de segurança biológica (CSB).
    2. Coloque o motor CC, a bomba peristáltica e um comprimento adicional de tubo da bomba dentro da CAB.
    3. Feche a tampa da CAB e ligue a luz UV por 10 min para esterilizar todos os componentes (Figura Suplementar 1C).
  2. Verificação da adesão celular e viabilidade
    1. Examine ambas as membranas PDMS estáticas semeadas e com peristalse ao microscópio. Confirme >80% de adesão celular em superfícies de PDMS revestidas com fibronectina e análise da morfologia celular para avaliar viabilidade.
    2. Capture imagens representativas das células antes da montagem, conforme necessário.
  3. Preparação de controles estáticos
    1. Aspire 1 mL do meio RPMI completo de cada membrana estática.
    2. Adicione 1 mL de meio RPMI completo fresco a cada membrana.
    3. Rotule as placas como estáticas e devolva-as ao incubador.
  4. Montagem do biorreator de peristaltismo
    1. Adicione 15 mL de meio a cada frasco de meio designado para uso em biorreator.
    2. Acople as tampas de meio equipadas com os bicos impressos em 3D (contendo portas de entrada e saída) aos frascos de meio. Reserve-osSuplementar Figura 1D).
    3. Monte a base do biorreator.
      1. Insira a rosca helicoidal impressa em 3D no poço central do fundo do biorreator.
      2. Insira o motor CC na ranhura do motor na parte inferior do biorreator.
      3. Certifique-se de que o eixo do motor se encaixe firmemente no orifício central da engrenagem helicoidal impressa em 3D.
      4. Deslize o suporte do motor para a posição correta para estabilizar o motor.
  5. Coloque o biorreator parcialmente montado em uma placa de cultura de tecidos de 150 mm para facilitar a transferência da cabine de segurança biológica para o incubador após a montagem (Suplementar Figura 1E).
  6. Aplique uma camada fina de graxa de silicone nas ranhuras do parafuso onde a membrana de PDMS entrará em contato com o parafuso. Isso permite que o parafuso gire facilmente, reduzindo o atrito.
  7. Carregamento da membrana de PDMS com células semeadas
    1. Transfira cuidadosamente as membranas de PDMS semeadas com células e com peristalse do incubador para a cabine de segurança biológica.
    2. Aspire o meio de cada membrana e coloque a membrana no biorreator com a superfície semeadas com células voltada para cima, oposta à interface lubrificada do parafuso de acionamento.
    3. Posicione a parte superior do biorreator de modo que o entalhe da câmara celular esteja alinhado com a membrana de PDMS. Deslize a parte superior para dentro das ranhuras-guia da base do biorreator.
  8. Fixação do biorreator
    1. Fixe a parte superior e inferior do biorreator usando braçadeiras plásticas e alicate de corte diagonal.
    2. Corte o excesso de comprimento da braçadeira com alicate.
  9. Conexões fluidicas e configuração do sistema
    1. Alinhe a bomba peristáltica de modo que seu conector metálico fique voltado na mesma direção do conector do motor.
    2. Conecte o tubo da bomba mais próximo ao biorreator à porta de entrada mais próxima ao motor na parte superior do biorreator. Encaixe completamente o tubo sobre o bico de entrada.
    3. Mergulhe a extremidade oposta desta tubulação dentro do frasco do meio de cultura.
    4. Usando o trecho adicional de tubo da bomba, conecte uma extremidade ao bico de saída da tampa do biorreator e coloque a outra extremidade dentro do frasco do meio, acima do nível do meio, para permitir a recirculação sem refluxoSuplementar Figura 1F).
  10. Incubação e operação
    1. Coloque todo o conjunto do biorreator (dentro da placa de 150 mm) dentro do incubador (Suplementar Figura 1G) e mantenha a placa de circuito/Arduino do lado de fora, conectado à energia.
    2. Conecte as garras de jacaré
      1. Bomba: positivo com positivo, negativo com negativo.
      2. Motor: inverter a polaridade de acordo com o projeto do circuito.
    3. Coloque placas de Petri estéreis vazias no incubador para coleta posterior de amostras.
    4. Permita que o sistema de biorreator peristáltico funcione por 4 h (ou pelo tempo desejado)Suplementar Figura 1H) em condições padrão de cultivo no incubador.

9. Desmontagem do biorreator

  1. Abra a incubadora e levante o tubo de entrada do frasco do meio para permitir a entrada de ar no sistema e drenar completamente o meio residual do biorreator.
  2. Após cessar o fluxo de meio, desconecte os cabos do motor e/ou da bomba da placa de circuito para interromper o movimento mecânico.
  3. Transfira todo o conjunto do biorreator para a cabine de segurança biológica (CSB), remova os tubos, corte os prendedores plásticos e levante a tampa do biorreator.
  4. Aspire o meio residual da membrana de PDMS e transfira a membrana de volta para a mesma placa de Petri utilizada durante a preparação.
  5. Verifique a adesão e viabilidade celular avaliando a morfometria celular em um microscópio de cultura celular e, em seguida, prossiga com as análises complementares conforme necessário.

10. Análise posterior

  1. Coleta de amostras para qPCR
    1. Dentro da cabine de segurança biológica (BSC), rotule tubos microcentrífugos de 1,5 mL com identificadores das amostras, incluindo tipo celular e condição experimental.
    2. Verifique se as células ainda estão presentes no PDMS utilizando um microscópio de cultura celular, tanto para condições estáticas quanto de peristalse.
    3. Aspire o meio residual de cada membrana de PDMS.
    4. Prepare frescamente o tampão de lise de RNA adicionando β-mercaptoetanol ao Tampão RLT na proporção de 1:100.
    5. Adicione 370 µL do Tampão RLT + β-mercaptoetanol a cada membrana de PDMS para lisar as células.
    6. Utilizando uma espátula celular estéril, raspe firmemente a região do PDMS com células aderidas para destacar todas as células.
    7. Transfira aproximadamente 350 µL do lisado para o tubo de 1,5 mL correspondente.
    8. Prossiga com a extração de RNA ou armazene as amostras a -80 °C até uso posterior.
    9. Descontamine a BSC.
      OBSERVAÇÃO: O Tampão RLT e o β-mercaptoetanol devem ser manipulados conforme suas respectivas FISPQ e descartados nos recipientes apropriados para resíduos.
  2. Coloração por imunofluorescência
    1. Adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) a cada membrana e incube à temperatura ambiente por 20 minutos.
    2. Aspire o PFA e descarte-o no recipiente designado para resíduos perigosos.
    3. Adicione 1 mL de PBS a cada membrana para remover o fixador residual.
    4. Continue com o protocolo de coloração por imunofluorescência apropriado aos marcadores-alvo.

11. Limpeza de biorreatores e componentes associados

  1. Pulverize todos os componentes do biorreator que entram em contato com o meio, células ou membranas de PDMS com etanol a 70%, incluindo as portas de entrada e saída do biorreator.
  2. Aspire todo o meio remanescente da garrafa de meio, depois enxágue o interior pulverizando abundantemente etanol a 70% e aspire novamente.
  3. Remova todos os componentes sanitizados da cabine de segurança biológica (CSB) e armazene-os em uma área limpa designada.
  4. Para garrafas de meio:
    1. Limpe com água sanitária a 20%, agite e descarte o conteúdo na pia com água corrente.
    2. Esfregue com vinagre diluído na proporção de 1:10 e lave com sabão e água ultrapura, depois enxágue com etanol a 70% e seque de cabeça para baixo.
    3. Limpe as tampas das garrafas de meio e os insertos da bomba com etanol a 70%.
  5. Limpeza de bombas peristálticas
    1. Prepare béqueres de 250 mL contendo (1) etanol a 70%, (2) água ultrapura ou (3) um béquer vazio para resíduos.
    2. Conecte a bomba com tubos em um circuito fechado e ligue-a utilizando a placa de circuito controlada por Arduino.
    3. Execute a bomba com etanol a 70% por 1 minuto, depois com água ultrapura por 1 minuto para lavar o sistema, descartando o líquido no béquer vazio.

Resultados

Este protocolo teve como objetivo demonstrar um método reprodutível para determinar como forças mecânicas peristálticas modulam diretamente a ativação de macrófagos. Antes dos experimentos com o biorreator, confirmou-se que os iBMDMs polarizavam adequadamente em resposta a condições padrão de estimulação bioquímica. Após este protocolo, membranas de PDMS foram revestidas com fibronectina e semeadas com iBMDMs. As células foram deixadas aderirem por 24 h antes da inspeção visual para confirmar a adesão bem-sucedida, distribuição uniforme sobre a superfície da membrana e viabilidade, observadas pela morfologia irregular em "ovo frito", conforme descrito pelo fornecedor (Figura 3A,B). Membranas com adesão insatisfatória, semeadura irregular ou evidência de desprendimento celular foram excluídas dos experimentos, pois essas condições podem gerar estimulação mecânica inconsistente e sinalização variável downstream. As membranas com semeadura bem-sucedida foram montadas no sistema do biorreator para receber estimulação peristáltica ou mantidas como controles estáticos. Após 4 h de cultivo, as amostras foram reavaliadas para confirmar que as células permaneceram aderidas após a estimulação mecânica (Figura 3C,D). Após confirmar a retenção celular em todas as condições, a ativação dos macrófagos foi avaliada por meio de qPCR e coloração por imunofluorescência.

A análise de qPCR foi realizada para avaliar alterações na expressão dos genes associados ao fenótipo pró-inflamatório M1, Il6, Nos2, e Cd40, bem como genes associados ao M2, Chil3 e Mrc1 (Tabela 1). Esses resultados demonstraram que a estimulação peristáltica promoveu a ativação de macrófagos em direção a um fenótipo pró-inflamatório. O cultivo peristáltico aumentou significativamente Il6 expressão em 50,9 vezes em comparação com os controles estáticos (p < 0,0001, não pareado teste t) e Nos2 expressão em 19,8 vezes (p = 0,0046, teste t não pareado) (Figura 4A). Cd40 a expressão também foi aumentada em 7,7 vezes, embora essa alteração não tenha sido significativa (p = 0,1106, teste t não pareado)Figura 4A). Em contraste, nenhuma alteração significativa foi observada em Chil3 (1,22 vezes acima dos controles estáticos; p = 0,9726, não pareado teste t) ou Mrc1 (1,16 vezes em relação aos controles estáticos; p = 0,9810, não pareado teste t) (Figura 4B). Em conjunto, esses achados indicam que as forças peristálticas aplicadas promoveram preferencialmente a ativação de macrófagos pró-inflamatórios em vez de vias alternativas de ativação.

Para avaliar mais amplamente a polarização de macrófagos, foi realizada coloração por imunofluorescência utilizando anticorpos contra o marcador pan-macrófago F4/80 e contra o marcador associado ao M1 CD40 (Figura 5A) ou o marcador associado ao M2 YM1/YM2 (Figura 5B). As amostras foram contra-coloridas com DAPI e analisadas com configurações idênticas de aquisição para permitir comparação entre as condições. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi quantificada para cada marcador e normalizada em relação ao sinal correspondente de F4/80 na mesma imagem. Macrófagos peristálticos exibiram um valor de MFI de CD40 normalizado de 1,74 ± 0,72, representando um aumento de 64,80% em comparação com os controles estáticos, embora esse aumento não tenha sido estatisticamente significativo (Figura 5C). De acordo com os resultados de qPCR, nenhuma alteração significativa na expressão normalizada de YM1/YM2 foi observada após a estimulação peristáltica, com apenas um aumento de 5% em relação aos controles estáticos (Figura 5D). Esses resultados representativos demonstram que o protocolo induz reprodutivelmente uma resposta predominantemente pró-inflamatória de macrófagos exclusivamente por meio de estímulo mecânico.

Comparação da dispersão celular, estático versus peristalse, em 0 h e 4 h; análise de imagens de microscópio.
Figura 3: Imagens de campo claro mostram confirmação visual da adesão celular antes e após a peristalse. Imagens de campo claro de células em membranas de PDMS nas condições estática (A,C) e de peristalse (B,D), obtidas antes da montagem do biorreator (t = 0 h) e após a conclusão do experimento (t = 4 h). Barras de escala = 200 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras de expressão gênica; mudança de dobramento em M1 e M2 sob condições estáticas versus peristálticas.
Figura 4: A análise da expressão gênica mostra a ativação pró-inflamatória de macrófagos por meio de estimulação peristáltica. Mudança de dobramento na expressão gênica dos marcadores (A) M1 Il6, Nos2 e Cd40, e dos marcadores (B) M2 Chil3 e Mrc1. *p < 0,05, ****p < 0,0001, ns = não significativo. Todos os dados são representados como média ± DP; n = 3 para cada grupo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Experimento de polarização de macrófagos; marcadores CD40, YM1/2, microscopia de fluorescência, gráfico de análise de dados.
Figura 5: A coloração por imunofluorescência confirma a ativação pró-inflamatória de macrófagos após a ativação da peristalse. Imagens representativas de imunofluorescência de macrófagos corados para o marcador pan-macrófago F4/80 (verde) e para os marcadores (A) M1 CD40 (rosa) ou (B) M2 YM1/YM2 (vermelho). Barras de escala = 20 µm. (C) Quantificação da intensidade média de fluorescência (IMF) de CD40 normalizada para F4/80. (D) Quantificação da IMF de YM1/YM2 normalizada para F4/80. Todos os dados são representados como média ± DP; n = 3 para cada grupo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

GenePrimerSequência (5′–3′)
GapdhFAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GapdhRGGGGTCGTTGATGGCAACA
Chil3FCAG GTC TGG CAA TTC TTC TGA A
Chil3RGTC TTG CTC ATG TGT GTA AGT GA
Nos2FGGA GTG ACG GCA AAC ATG ACT
Nos2RTCG ATG CAC AAC TGG GTG AAC
Mrc1FCTC TGT TCA GCT ATT GGA CGC
Mrc1RTGG CAC TCC CAA ACA TAA TTT GA
Il-6FTCTATACCACTTCACAAGTCGGA
Il-6RGAA TTG CCA TTG CAC AAC TCT TT
Cd40FTTGTTGACAGCGGTCCATCTA
Cd40RGCCATCGTGGAGGTACTGTTT

Tabela 1: Sequências dos iniciadores para os genes analisados com qPCR.

Figura Suplementar 1: Fluxo de trabalho para a preparação de PDMS, montagem do biorreator e configuração de perfusão. (A) Preparação de PDMS na CAB. (B) Semeadura celular. (C) Esterilização por UV dos componentes do biorreator. (D) Montagem do biorreator. (E) Biorreator fixado. (F) Conexão da bomba. (G) Configuração no incubador às 0 h. (H) Configuração no incubador às 4 h. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Circuito do biorreator com protoboard, bomba, motor e fiação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Código Arduino do biorreator. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A compreensão atual sobre como as forças peristálticas influenciam a função dos macrófagos permanece limitada, apesar da prevalência de peristalse disregulada em doenças inflamatórias. Embora estímulos mecânicos individuais, como tensão de cisalhamento e deformação cíclica, sejam conhecidos por modular a ativação dos macrófagos, os efeitos da deformação multiaxial e do fluxo de fluido simultâneos, que juntos compõem a peristalse, não foram amplamente investigados no contexto da mecanobiologia dos macrófagos. O protocolo descrito aqui fornece uma plataforma reprodutível para estudar como essas forças mecânicas combinadas regulam o comportamento inflamatório dos macrófagos sob condições fisiologicamente relevantes. Utilizando este sistema, demonstrou-se que a exposição à estimulação peristáltica por 4 h promove um fenótipo de macrófago predominantemente pró-inflamatório, caracterizado pelo aumento significativo da expressão de Il6 e Nos2.

É importante destacar que a mecanossensibilidade dos macrófagos depende fortemente da magnitude, frequência e duração da força aplicada12,13,14. Estudos anteriores que investigaram estímulos mecânicos isolados demonstraram que os estados de ativação dos macrófagos variam significativamente conforme esses parâmetros. Portanto, estudos futuros devem investigar uma gama mais ampla de condições peristálticas, incluindo deformações e tensões cisalhantes alteradas, bem como maior tempo sob estimulação mecânica, a fim de definir melhor o espectro de respostas dos macrófagos induzidas pela mecânica peristáltica. Além disso, este estudo foi limitado pelo fato de termos optado por focar na peristalse como um estímulo mecânico, em vez de tensão cisalhante do fluido ou deformação cíclica isoladamente. Estudos futuros podem utilizar esta plataforma de biorreator para explorar a ativação dos macrófagos em função de diferentes entradas mecânicas, utilizando um único sistema com rigor. A ampliação desses estudos pode ajudar a identificar limiares mecânicos que promovam fenótipos inflamatórios ou pró-regenerativos em diferentes contextos teciduais.

A mecanossensibilidade dos macrófagos também depende fortemente da rigidez e da topografia do substrato. É importante observar que a rigidez do PDMS escolhido para este estudo pode ter um impacto na ativação dos macrófagos separado dos efeitos das forças peristálticas15,16,17,18,19. Para controlar a rigidez como variável, comparamos nossos macrófagos expostos à peristalse com macrófagos cultivados em PDMS de rigidez equivalente sob condições estáticas. Estudos futuros poderiam controlar ainda mais a rigidez como variável ao variar a proporção do PDMS, utilizar materiais adicionais para o substrato ou cultivar macrófagos em uma placa de cultura tecidual 2D para comparação. Além disso, embora não tenhamos alterado a topografia do PDMS, nosso dispositivo permite estudos futuros sobre essa variável.

Uma grande vantagem deste protocolo é sua adaptabilidade a uma ampla variedade de estudos de inflamação. Embora este trabalho utilize macrófagos derivados de medula óssea imortalizados (iBMDMs), o sistema pode ser facilmente modificado para acomodar macrófagos primários, monócitos, macrófagos residentes em tecidos ou sistemas de co-cultivo multicelulares. Por exemplo, células epiteliais, estromais ou musculares lisas poderiam ser incorporadas para melhor recapitular o microambiente celular do trato gastrointestinal, útero ou ureteres. Além disso, a composição da matriz extracelular pode ser ajustada ao tecido de interesse mediante modificação do revestimento aplicado à membrana de PDMS. Neste estudo, a fibronectina foi necessária para manter a adesão dos iBMDMs durante a estimulação peristáltica, enquanto revestimentos de colágeno I e colágeno IV resultaram em destacamento celular substancial. No entanto, os revestimentos de matriz ideais podem variar dependendo da origem dos macrófagos ou da configuração do co-cultivo. Consequentemente, uma cuidadosa validação da adesão celular nos pontos de controle recomendados é essencial para garantir estimulação mecânica reprodutível e análises subsequentes.

Várias considerações técnicas são essenciais para a implementação bem-sucedida deste protocolo, incluindo a manutenção rotineira, que ajuda a prevenir as falhas mais comuns. A montagem e vedação adequadas do biorreator utilizando braçadeiras plásticas são particularmente importantes, pois uma vedação incompleta pode resultar em vazamento do meio, perfis alterados de tensão e deformação de cisalhamento, risco de contaminação ou perda da viabilidade celular. Além disso, as bombas e motores exigem calibração estável para manter uma estimulação peristáltica reprodutível, e a limpeza regular dos tubos das bombas com etanol e água ultrapura evita o acúmulo de resíduos. Por fim, as células semeadas nas membranas de PDMS devem ser verificadas quanto à adesão adequada e a uma confluência de 80% antes da colocação no biorreator. Juntos, esses passos de solução de problemas e limitações do sistema destacam a necessidade de montagem cuidadosa, calibração consistente e monitoramento contínuo para garantir o desempenho reprodutível do biorreator.

No geral, este protocolo fornece uma plataforma versátil e fisiologicamente relevante para investigar a mecanoimunomodulação em ambientes mecânicos dinâmicos complexos. Ao permitir a aplicação simultânea de tensão cíclica multiaxial e tensão de cisalhamento do fluido, este sistema amplia os modelos tradicionais in vitro de força única e oferece uma ferramenta valiosa para estudar a inflamação em tecidos impulsionados pelo músculo liso. A abordagem pode ser amplamente aplicável a investigações de doenças gastrointestinais, fibrose, câncer e outras patologias nas quais macrófagos são expostos a microambientes mecânicos dinâmicos.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo prêmio número 2440798 da National Science Foundation. Figura 1 e Figura 2 foram criadas com uma versão licenciada do BioRender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tripsina-EDTA a 0,25%Fisher25200056
Tubos microcentrífugos de 1,5 mLUSA Scientific1615-5510
Placas de Petri de 100 mm x 15 mmFisher50-190-0276
Placas de cultura de 150 mmFisherFB012925
Paraformaldeído a 4%Santa Cruzsc-281692
Placas de cultura de 90 mmFisherFB012923
Anticorpo Alexa Fluor 488 Anti-F4/80Abcamab204266
Anticorpo Alexa Fluor 647 Anti-CD40Abcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
ProtoboardAmazon
Tampão RLTQiagen79216
Escova celularFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
DessecadorMilliporeSigmaZ119008
Alicate diagonalAmazon
Soro bovino fetalInnovative Biosciences11-01-500
FibronectinaMilliporeSigmaF1141-1MG
Tampão HEPESFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
Motor RobotshopFT-SPARK16-360
Anticorpo PE Anti-Ym-1 + Ym-2Abcamab211621
Penicilina-EstreptomicinaFisher15140122
Bomba peristálticaDigiKey1150
Solução salina tamponada com fosfatoFisher14190250
Filamento PLAAmazonB0D7ZYCVTY
Potenciômetro B1K 1K OhmAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
Graxa de siliconeAmazonB000XBH9HI
Alicate de junção móvelAmazon
Piruvato de sódioCytiva HycloneSH3023901
Kit de elastômero de silicone Sylgard 184FisherNC9285739
Frascos de cultura T-25Fisher229331
TransistorDigiKeyIRF520NPBF-ND
Fiação/Clipes de jacaréAmazon
Abraçadeiras plásticas de 18 polegadasAmazon
β-mercaptoetanolFisherAC125472500

Referências

  1. Mass E, Nimmerjahn F, Kierdorf K, Schlitzer A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 2023;23(9):563-579.
  2. Kumar V, Kumar V. Macrophages: the potent immunoregulatory innate immune cells. In: Macrophage Activation - Biology and Disease. London: IntechOpen; 2019. doi:10.5772/intechopen.88013.
  3. Ross EA, Devitt A, Johnson JR. Macrophages: the good, the bad, and the gluttony. Front Immunol. 2021;12:708186.
  4. Sreejit G, Fleetwood AJ, Murphy AJ, Nagareddy PR. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 2020;9(12):e1222.
  5. Locati M, et al. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annu Rev Pathol. 2020;15:123-147.
  6. Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008;8(12):958-969.
  7. Boutilier AJ, Elsawa SF. Macrophage polarization states in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6995.
  8. Orecchioni M, Ghosheh Y, Pramod AB, Ley K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) versus classically and M2 (LPS−) versus alternatively activated macrophages. Front Immunol. 2019;10:1084.
  9. Huang X, Li Y, Fu M, Xin HB. Polarizing macrophages in vitro. Methods Mol Biol. 2018;1784:119-126.
  10. Gharavi AT, et al. The role of macrophage subtypes and exosomes in immunomodulation. Cell Mol Biol Lett. 2022;27(1):83.
  11. Peng Y, et al. Regulatory mechanism of M1/M2 macrophage polarization in the development of autoimmune diseases. Mediators Inflamm. 2023;2023:8821610.
  12. Clevenger AJ, Jha A, Moore E, Raghavan SA. Manipulating immune activity of macrophages: a materials and mechanics perspective. Trends Biotechnol. 2025;43(1):33-49.
  13. Khanmohammadi M, Mirzaalikhan Y, Baratchi S. Immunity in motion: the role of mechanics in macrophage biology. Cell Chem Biol. 2025;32(12). doi:10.1016/j.chembiol.2025.11.004.
  14. Adams S, et al. Mechano-immunomodulation: mechanoresponsive changes in macrophage activity and polarization. Ann Biomed Eng. 2019;47(11):2213-2231.
  15. Meizlish ML, et al. Mechanosensing regulates tissue repair program in macrophages. Sci Adv. 2024;10(11):adk6906.
  16. Lee M, Du H, Winer DA, Clemente-Casares X, Tsai S. Mechanosensing in macrophages and dendritic cells in steady-state and disease. Front Cell Dev Biol. 2022;10:1044729.
  17. Chen M, et al. Substrate stiffness modulates bone marrow-derived macrophage polarization through NF-κB signaling pathway. Bioact Mater. 2020;5(4):880-890.
  18. Blakney AK, Swartzlander MD, Bryant SJ. The effects of substrate stiffness on the in vitro activation of macrophages and in vivo host response to poly(ethylene glycol)-based hydrogels. J Biomed Mater Res A. 2012;100A(6):1375-1386.
  19. Sridharan R, Cavanagh B, Cameron AR, Kelly DJ, O'Brien FJ. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 2019;89:47-59.
  20. Previtera ML, Sengupta A. Substrate stiffness regulates proinflammatory mediator production through TLR4 activity in macrophages. PLoS One. 2015;10(12):e0145813.
  21. Song C, et al. Microfluidic three-dimensional biomimetic tumor model for studying breast cancer cell migration and invasion in the presence of interstitial flow. Chin Chem Lett. 2019;30(5):1038-1042.
  22. Li R, et al. Interstitial flow promotes macrophage polarization toward an M2 phenotype. Mol Biol Cell. 2018;29(16):1927-1940.
  23. Son H, et al. Shear stress induces monocyte/macrophage-mediated inflammation by upregulating cell-surface expression of heat shock proteins. Biomed Pharmacother. 2023;161:114566.
  24. Zhou H, Scatena M, Tu LN, Giachelli CM, Nigam V. Monocyte adhesion to and transmigration through endothelium following cardiopulmonary bypass shearing is mediated by IL-8 signaling. Front Cardiovasc Med. 2024;11:1454302.
  25. Jui E, et al. Shear stress induces a time-dependent inflammatory response in human monocyte-derived macrophages. Ann Biomed Eng. 2024;52(11):2690-2705.
  26. Castro-Núñez L, Dienava-Verdooold I, Herczenik E, Mertens K, Meijer AB. Shear stress is required for the endocytic uptake of the factor VIII-von Willebrand factor complex by macrophages. J Thromb Haemost. 2012;10(9):1929-1937.
  27. Cheng C, et al. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 2006;113(23):2744-2753.
  28. Seneviratne AN, et al. Low shear stress induces M1 macrophage polarization in murine thin-cap atherosclerotic plaques. J Mol Cell Cardiol. 2015;89(Pt B):168-172.
  29. Bonito V, de Kort BJ, Bouten CVC, Smits AIPM. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Eng Part A. 2019;25(17-18):1312-1325.
  30. Ballotta V, Driessen-Mol A, Bouten CVC, Baaijens FPT. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 2014;35(18):4919-4928.
  31. Dziki JL, et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Eng Part A. 2018;24(1-2):128-139.
  32. Wehner S, et al. Mechanical strain and TLR4 synergistically induce cell-specific inflammatory gene expression in intestinal smooth muscle cells and peritoneal macrophages. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010;299(5):G1187-G1197.
  33. Clevenger AJ, et al. Rapid prototypable biomimetic peristalsis bioreactor capable of concurrent shear and multiaxial strain. Cells Tissues Organs. 2023;212(1):57-72.
  34. Huizinga JD. Gastrointestinal peristalsis: joint action of enteric nerves, smooth muscle, and interstitial cells of Cajal. Microsc Res Tech. 1999;47(4):239-247.
  35. Kunz G, Leyendecker G. Uterine peristaltic activity during the menstrual cycle: characterization, regulation, function and dysfunction. Reprod Biomed Online. 2002;4(Suppl 3):5-9.
  36. Hosseini G, et al. A computational model of ureteral peristalsis and an investigation into ureteral reflux. Biomed Eng Lett. 2018;8(1):91-101.
  37. Clevenger AJ, et al. Peristalsis-associated mechanotransduction drives malignant progression of colorectal cancer. Cell Mol Bioeng. 2023;16(4):315-330.
  38. Leyendecker G, Kunz G, Wildt L, Beil D, Deininger H. Uterine hyperperistalsis and dysperistalsis as dysfunctions of the mechanism of rapid sperm transport in patients with endometriosis and infertility. Hum Reprod. 1996;11(7):1542-1551.
  39. Iwakiri K, et al. Mechanisms underlying excessive esophageal acid exposure in patients with gastroesophageal reflux disease. Esophagus. 2017;14(3):213-218.
  40. Raghavan S, Crawford LZ. 3D rapid prototypable tunable peristalsis bioreactor. United States patent. 2022: US12522795.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Bioengineeringperistalsismacrophagesinnate immunitymechanobiology
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.