Este estudo integra genes-alvo de fármacos relacionados à anestesia perioperatória com dados multi-ômicos de câncer de ovário para construir e validar um modelo prognóstico e caracterizar as características imunológicas, espaciais e regulatórias associadas.
Artigo de investigação
Modelagem Prognóstica do Câncer de Ovário Baseada em Genes Alvos de Fármacos Relacionados à Anestesia Perioperatória: Uma Abordagem Bioinformática
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A heterogeneidade do câncer de ovário (OV) representa desafios significativos para a classificação de subtipos da doença, a estratificação de risco e o manejo clínico preciso. Portanto, este estudo desenvolveu um modelo prognóstico baseado em genes-alvo de fármacos relacionados à anestesia perioperatória (PARDTGs) para identificar o significado clínico dos PARDTGs em pacientes com OV. Este estudo analisou de forma abrangente os PARDTGs no OV por meio da integração de dados multi-ômicos, incluindo dados transcriptômicos em massa, dados de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) e dados de transcriptômica espacial. Com base nas características de expressão dos PARDTGs, desenvolvemos uma assinatura prognóstica utilizando um modelo de riscos proporcionais de Cox com seleção de variáveis por stepAIC. Esse modelo foi construído com base no conjunto de dados TCGA-OV e validado utilizando os conjuntos de dados GSE26193, GSE30161 e GSE63885. Além disso, construímos nomogramas combinando características dos PARDTGs e fatores clínicos. Analisamos a correlação entre os escores de risco e a enriquecimento funcional, vias de sinalização e o microambiente imune tumoral. Identificamos 17 PARDTGs fortemente associados ao prognóstico do OV. A assinatura prognóstica, validada nos grupos TCGA-OV, GSE26193, GSE30161 e GSE63885, demonstrou alta precisão preditiva para a sobrevida global (OS). Em comparação com a assinatura gênica isolada, o nomograma que integra o modelo prognóstico e parâmetros clínicos apresentou desempenho prognóstico superior. Adicionalmente, a análise do microambiente tumoral revelou enriquecimento significativo de vias relacionadas ao sistema imunológico e escores TIDE mais baixos em pacientes de baixo risco, indicando que esses pacientes podem ter maior probabilidade de se beneficiar da imunoterapia. O estudo demonstra a relevância prognóstica e a utilidade clínica dos PARDTGs no câncer de ovário. A integração de características genéticas nos testes clínicos apresenta potencial para melhorar o tratamento clínico e o prognóstico.
Introdução
O OV é uma neoplasia prevalente e agressiva caracterizada por sintomas iniciais discretos, forte invasividade e sinais clínicos precoces não específicos. Estudos mostraram que a maioria dos pacientes já se encontra em estágios clínicos avançados no momento do diagnóstico, com uma taxa de sobrevida global inferior a 45% em cinco anos1. Apesar dos avanços na cirurgia, quimioterapia e terapias direcionadas, desafios como recorrência tumoral, quimiorresistência e escape imunológico persistem, limitando a eficácia terapêutica2. Assim, a identificação de novos biomarcadores moleculares e o desenvolvimento de ferramentas robustas de avaliação de risco são urgentemente necessários para enfrentar a heterogeneidade tumoral e apoiar estratégias clínicas personalizadas.
A ressecção cirúrgica e o manejo perioperatório continuam sendo a pedra angular do tratamento de OV. No entanto, evidências crescentes sugerem que o estresse fisiológico perioperatório, as respostas inflamatórias e a modulação imunológica podem influenciar o comportamento biológico e, por sua vez, afetar o prognóstico a longo prazo3. Como componente fundamental da intervenção perioperatória, os efeitos dos agentes anestésicos vão além da supressão do sistema nervoso central. Estudos atuais indicam que as técnicas anestésicas e as drogas anestésicas podem modular as respostas neuroendócrinas, as cascatas inflamatórias e a atividade das células efetoras imunes, remodelando assim o microambiente tumoral pós-operatório e influenciando o potencial migratório das células tumorais, a vigilância imunológica e os processos relacionados à metástase4. Notavelmente, anestésicos específicos alteram diretamente o destino das células tumorais: o propofol aumenta a sobrevivência de células tumorais circulantes por meio da supressão mediada por Nrf2 da ferroptose, promovendo assim a metástase5. A cetamina induz ferroptose em células de carcinoma hepatocelular controlando o eixo lncPVT1/miR-214-3p/GPX4, sugerindo que agentes anestésicos podem influenciar diretamente a determinação do destino das células tumorais6. Além disso, as benzodiazepinas, como moduladores alostéricos positivos dos receptores de GABA, podem atenuar a eficácia antitumoral de combinações quimioimunoterápicas7. No entanto, a pesquisa atual concentra-se principalmente em agentes anestésicos individuais, faltando uma análise sistemática de seus efeitos potenciais no nível da rede de alvos genéticos.
Genes-alvo de fármacos relacionados à anestesia perioperatória (PARDTGs), como substratos moleculares diretos da ação anestésica, participam de várias vias de sinalização-chave, incluindo a regulação de receptores de neurotransmissores, a manutenção da homeostase de cálcio, a dinâmica do citoesqueleto de actina e o feedback no eixo endócrino de estresse8,9. Sob estresse cirúrgico perioperatório, essas vias podem ser ativadas ou suprimidas, influenciando a polarização de células imunes e a remodelação do microambiente associado ao tumor8,10. No entanto, em OV, a paisagem de expressão, as características funcionais e a relevância clínica dos PARDTGs permanecem pouco caracterizadas. Paralelamente, o surgimento da sequenciação de RNA em nível de célula única (scRNA-seq) e da transcritômica espacial tem permitido o perfilhamento da expressão gênica com resolução celular e localização espacial, proporcionando novas perspectivas sobre a distribuição espacial, as preferências microambientais e os efeitos célula-específicos dos genes-alvo anestésicos em tecidos tumorais11.
Neste estudo, integramos PARDTGs com conjuntos de dados multi-ômicos de OV, identificamos sistematicamente genes diferencialmente expressos e construímos um modelo prognóstico de risco generalizável. Em seguida, analisamos a base biológica da estratificação de risco a partir das perspectivas da infiltração imune, características de stemness, paisagens mutacionais e vias funcionais. Combinando dados de sequenciamento multimodal, delimitamos as origens dos tipos celulares e os nichos ecológicos espaciais, construímos redes regulatórias de miRNA/fatores de transcrição e realizamos validação pan-cancer para demonstrar a significância transversal a tumores. Este trabalho fornece evidências mecanicistas para compreender o papel potencial das redes-alvo de anestésicos em OV e oferece implicações translacionais para a estratificação clínica de risco, predição prognóstica e estratégias de manejo perioperatório.
Protocolo
Coleta de dados
Selecionamos 120 genes-alvo relacionados à anestesia perioperatória a partir da literatura anterior12 e os listamos na Tabela Suplementar S1. Posteriormente, os perfis de expressão gênica, informações clínicas e dados de sobrevida foram obtidos do recurso UCSC Xena TCGA TARGET GTEx Toil recompute (http://xena.ucsc.edu/). O conjunto de dados de expressão consistia em 420 amostras primárias de cistadenocarcinoma séreo ovariano do The Cancer Genome Atlas (TCGA-OV) e 88 amostras normais de ovário do projeto Genotype-Tissue Expression (GTEx). Os valores de expressão gênica foram obtidos como valores FPKM por gene gerados pelo pipeline Toil13. Uma descrição detalhada do fluxo de amostras ilustrando a inclusão das amostras do TCGA para cada análise subsequente é fornecida na Tabela Suplementar S2. Além disso, para validação externa, baixamos os conjuntos de dados GSE2619314 (n = 107 amostras), GSE3016115 (n = 58 amostras) e GSE6388516 (n = 70 amostras) do banco de dados GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) para analisar os perfis de expressão gênica e a sobrevida dos pacientes correspondentes. Para garantir a consistência dos dados, os identificadores gênicos ENSEMBL foram convertidos em símbolos gênicos oficiais. Genes com expressão em menos da metade das amostras foram filtrados. Adicionalmente, obtivemos do banco de dados GEO o conjunto de dados de transcriptoma de célula única de câncer de ovário humano GSE15460017 e o conjunto de dados de transcriptoma espacial de câncer de ovário GSE211956-GSM6506110-SP118.
Processamento de dados de sequenciamento do transcriptoma espacial de câncer de ovário
Os dados de transcriptômica espacial foram processados usando o Seurat19 (versão 5.4.0). Os spots foram filtrados utilizando os mesmos critérios de controle de qualidade da análise de sequenciamento de RNA em célula única (nFeature_RNA: 200–5.000; porcentagem de genes mitocondriais < 10%). Após a normalização e identificação de genes altamente variáveis, foi realizada uma redução de dimensionalidade baseada em PCA, e o agrupamento foi conduzido utilizando o algoritmo de agrupamento baseado em grafos do Seurat. Subgrupos e padrões de expressão gênica foram visualizados utilizando a função SpatialFeaturePlot. Adicionalmente, os níveis de expressão gênica no nível do transcriptoma espacial foram visualizados e analisados usando “AUCell”19 (versão 1.32.0).
Análise de dados de scRNA-seq
Dados de sequenciamento de RNA de célula única do GSE154600 foram analisados utilizando o pacote Seurat (versão 5.4.0)19. Células de baixa qualidade foram removidas com base em critérios de controle de qualidade. Células com menos de 200 ou mais de 5.000 genes detectados, ou com proporções de genes mitocondriais superiores a 10%, foram excluídas. Após a normalização utilizando a função NormalizeData, os 2.000 genes altamente variáveis foram identificados utilizando o método VST. A PCA foi realizada com base nos genes variáveis, e os primeiros 15 componentes principais foram utilizados para agrupamento e redução de dimensionalidade. Os agrupamentos celulares foram identificados utilizando FindNeighbors e FindClusters com uma resolução de 0,5, seguidos pela visualização UMAP e t-SNE. A função FindAllMarkers foi utilizada para identificar genes marcadores para diferentes agrupamentos celulares. Além disso, anotamos os agrupamentos celulares utilizando a base de dados CellMarker 2.020 e realizamos análise quantitativa da atividade gênica utilizando a função ssGSEA do pacote GSVA (versão 2.4.9).
Análise de genes diferencialmente expressos (GDE) e análises funcionais
A análise de expressão diferencial foi realizada utilizando o pacote “limma”21 (versão 3.56.2) com base nos perfis de expressão dos PARDTGs entre tecidos de câncer de ovário e tecidos ovarianos normais. Antes da análise, os valores de expressão FPKM foram transformados por log2 utilizando a fórmula log2(FPKM+1). O modelo linear padrão implementado no pacote limma foi aplicado para identificar PARDTGs diferencialmente expressos. Consideraram-se significativamente diferencialmente expressos os genes com uma taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,05 e |log2 da razão de variação (FC)| > 1. As enriquecimentos GO e KEGG foram realizados nos PARDTGs diferencialmente expressos utilizando o ClusterProfiler22 (versão 4.8.3). Gráficos em cascata foram gerados utilizando o “maftools”23 (versão 2.16.0) para detectar mutações somáticas nos PARDTGs no câncer de ovário. Em seguida, a rede de interação proteína-proteína (PPI) dos PARDTGs foi estabelecida utilizando o repositório STRING (versão 12.0) com parâmetros padrão.
Desenvolvimento de um sistema de pontuação de risco baseado em PARDTG
Para identificar os PARDTGs ótimos, foi realizada uma análise de regressão de riscos proporcionais de Cox em etapas para triar genes com significância prognóstica entre os PARDTGs diferencialmente expressos e determinar suas contribuições para a sobrevida global no câncer de ovário (OV). A suposição de riscos proporcionais do modelo final de regressão multivariada de Cox foi avaliada utilizando testes de resíduos de Schoenfeld implementados na função cox.zph do pacote survival do R (versão 3.5.5). Um escore de risco prognóstico foi calculado com base nos níveis de expressão dos genes da assinatura e seus respectivos coeficientes de regressão de Cox. Considerando a heterogeneidade entre plataformas transcriptômicas, os modelos prognósticos foram avaliados independentemente nos cohorts TCGA-OV, GSE26193, GSE30161 e GSE63885. Para cada cohort, os perfis de expressão dos genes da assinatura foram utilizados para calcular escores de risco específicos do cohort, e os pacientes foram estratificados em categorias de alto e baixo risco utilizando a mediana do escore de risco como ponto de corte. A sobrevida global (OS) foi comparada entre os dois grupos utilizando análise de Kaplan–Meier, com significância estatística avaliada pelo teste log-rank. O valor prognóstico independente do escore de risco foi então avaliado por meio de análises de regressão de riscos proporcionais de Cox univariada e multivariada.
Desenvolvimento de um modelo clínico prognóstico para câncer de ovário
Para determinar se o escore de risco fornecia informações prognósticas além das variáveis clínicas convencionais, foram realizadas análises de regressão de Cox univariada e multivariada de riscos proporcionais, incorporando o escore de risco juntamente com características clinicopatológicas. Posteriormente, foram construídos nomogramas prognósticos utilizando o escore de risco molecular e variáveis clinicamente relevantes, como estágio e grau do tumor, como parâmetros de entrada. As variáveis foram selecionadas com base em sua relevância clínica e no objetivo de desenvolver um modelo prognóstico integrado, e não apenas pela significância estatística. Os nomogramas foram gerados usando o pacote “rms”24 (versão 6.7.1) para estimar as probabilidades de sobrevida global em 1, 3 e 5 anos com base nos escores totais derivados das variáveis individuais.
Caracterização das propriedades imunológicas
A infiltração de células imunes foi estimada utilizando o algoritmo CIBERSORT com a matriz de assinatura LM22. A análise foi realizada com 1.000 permutações, e amostras com valor P de desconvolução < 0,05 foram consideradas estatisticamente confiáveis. Diagramas em cascata foram gerados com o maftools (versão 2.16.0) para ilustrar a prevalência de genes altamente mutados no câncer de ovário. A análise de enriquecimento de conjuntos de genes (GSEA) foi realizada por meio do ClusterProfiler (versão 4.8.3) com um limiar de significância de p < 0,05.
Construção da rede CeRNA
Neste estudo, o NetworkAnalyst 3.0 (https://www.networkanalyst.ca/)25 foi utilizado para analisar a interação entre genes prognósticos e fatores de transcrição. A rede co-regulatória de miRNA-TF foi construída utilizando o NetworkAnalyst 3.0.
Amostras de tecido de câncer de ovário
Tecidos de carcinoma ovariano e amostras normais adjacentes pareadas (N = 6) foram coletadas de pacientes submetidas a ressecção cirúrgica eletiva. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Obstetrícia & Hospital de Ginecologia da Universidade Fudan (2024-54-X1), e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Este estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque.
Análise por Western blot
Proteínas totais foram extraídas de espécimes de tecido humano utilizando tampão de lise RIPA contendo fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF), coquetel de inibidores de protease e inibidores de fosfatase. As concentrações proteicas foram determinadas por meio de ensaio de proteína com ácido bicinconínico (BCA). Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) antes de serem transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após a transferência, as membranas foram bloqueadas por 90 min à temperatura ambiente com leite desnatado a 5% preparado em TBS-T. Em seguida, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra Citoqueratina 81 (coelho policlonal, 1:2.000) ou GAPDH (rato monoclonal, 1:10.000). Após lavagem, os anticorpos secundários apropriados foram aplicados por 90 min à temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas utilizando um reagente de detecção por quimioluminescência aprimorada (ECL) e capturadas com um sistema de imagem comercial. A análise densitométrica foi realizada no ImageJ, e a expressão de KRT81 foi normalizada em relação ao controle de carga GAPDH. As diferenças na expressão proteica entre amostras pareadas foram avaliadas utilizando o teste t pareado, com P < 0,05 considerado estatisticamente significativo.
Análise pan-câncer
Neste estudo, utilizou-se o TCGAplot26 (versão 5.0.0) para identificar as relações entre os níveis de expressão de KRT81. A análise de correlação de Pearson foi empregada para calcular as correlações estatísticas. O perfil mutacional de KRT81 em diversos tipos de câncer foi examinado por meio da plataforma cBioPortal (http://www.cbioportal.org/) (versão 7.0.6).
Análises estatísticas
Todas as análises de dados foram realizadas utilizando o software R (versão 4.3.1). As comparações entre dois grupos foram conduzidas com o teste de soma de postos de Wilcoxon, enquanto as diferenças entre três ou mais grupos foram avaliadas utilizando o teste de Kruskal–Wallis. A sobrevida global foi analisada utilizando o método de Kaplan–Meier, e a significância estatística entre as curvas de sobrevida foi determinada com o teste log-rank. Salvo indicação em contrário, um valor P bicaudal < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os níveis de significância são indicados da seguinte forma: P < 0,05 *, P < 0,01 **, P < 0,001 ***, e P < 0,0001 ****.
Resultados
Características imunes de genes-alvo de fármacos relacionados à anestesia perioperatória em análises transcritômicas espaciais e de célula única
Utilizou-se o SCTransform para corrigir a profundidade de sequenciamento e implementar procedimentos, identificando-se, por fim, 11 tipos celulares diferentes. Para avaliar a importância dos genes-alvo de fármacos relacionados à anestesia perioperatória (PARDTGs) em cada subpopulação celular, utilizamos o pacote R AUCell para determinar as atividades relacionadas aos PARDTGs em cada subpopulação celular (Figura 1A,B). Posteriormente, calculamos a correlação entre a abundância celular e as atividades associadas aos PARDTGs em todos os loci, utilizando a correlação de postos de Spearman. Notavelmente, as atividades relacionadas aos PARDTGs apresentaram correlação negativa com as células tumorais (Figura 1C). Obtivemos dados de sequenciamento de RNA de célula única provenientes de 5 pacientes com OV, contendo um total de 41.367 células. Com base na expressão dos genes marcadores, as células foram categorizadas em 11 agrupamentos principais (Figura 1D). As redes e forças de interação para o tipo celular são apresentadas na Figura 1E. Avaliamos a atividade dos PARDTGs em todas as células individuais, pontuando a expressão de 120 PARDTGs utilizando o ssGSEA no Seurat (Figura 1F). De forma marcante, as células tumorais exibiram atividade significativamente menor do que todos os demais tipos celulares (Figura 1G).
Identificação e caracterização molecular de genes-alvo de fármacos relacionados à anestesia perioperatória no câncer de ovário
A partir do banco de dados TCGA, identificamos 68 PARDTGs diferencialmente expressos, que são mostrados na Figura 2A (veja também a Tabela Suplementar S3). A Figura 2B descreve a expressão desses 68 DEGs associados à anestesia perioperatória na coorte TCGA-OV. Posteriormente, construímos uma rede PPI para elucidar as relações complexas entre as proteínas associadas aos DEGs. Identificamos cinco genes centrais potenciais — SLC6A4, CHRNA4, DRD2, SLC6A3 e GRIN2A — que podem ter efeitos importantes na patogênese do câncer de ovário (Figura 2C). Além disso, investigamos o perfil de alterações moleculares de 120 PARDTGs no câncer de ovário, sendo as mutações sem sentido o tipo de variante mais comum (Figura 2D). Os genes mais frequentemente mutados foram SCN10A, DNMT1, GRIN2A, LTF e SCN11A. Exploramos a prevalência de mutações por variação no número de cópias (CNV), e os resultados revelaram que os 20 principais PARDTGs com mutações exibiram alterações significativas de CNV (Figura 2E). O enriquecimento GO e KEGG indicou que os PARDTGs estão associados à sinalização de ligantes neuroativos, vias de sinalização do cálcio, sinalização hormonal, dependência de anfetamina, dependência de cocaína e interações entre ligantes neuroativos e receptores (Figura 2F,G).
Construção e validação de um modelo prognóstico baseado em genes-alvo relacionados à anestesia no período perioperatório
Para minimizar a complexidade do modelo, o StepAIC foi utilizado para reduzir o conjunto de genes, e 17 PARDTGs foram finalmente mantidos para construir o modelo prognóstico (Tabela Suplementar S4). O teste global de resíduos de Schoenfeld não revelou desvios significativos da suposição de riscos proporcionais (p = 0,265), o que sustenta a confiabilidade do modelo prognóstico baseado em 17 genes. O escore de risco foi calculado usando a seguinte equação: escore de risco = ADRA1D*(0,4452) + ADRB1*(-0,5347) + CHRNA4*(0,3495) + DBH*(-0,5765) + EPHA4*(0,2827) + EPHA7*(-0,5707) + EPHA8*(0,8765) + GABRB2*(0,5979) + GRIN2A*(-0,1750) + GRIN2D*(0,2746) + KCNA1*(2,2753) + KRT81*(0,1101) + OPRD1*(-3,2372) + SLC6A2*(1,4901) + SLC18A1*(4,2170) + SLC18A2*(-1,4600) + CHRNA1*(-0,1723). Os pacientes foram subsequentemente divididos em categorias de risco baixo e alto com base em seus escores de risco, sendo que o grupo de baixo risco apresentou sobrevida global (OS) significativamente melhorada em comparação com o grupo de alto risco nas coortes TCGA-OV (Figura 3A, p < 0,0001), GSE26193 (Figura 3B, p = 0,00021), GSE30161 (Figura 3C, p = 0,0017) e GSE63885 (Figura 3D, p = 0,0041). Além disso, Figura 3E–H ilustram as distribuições do status de sobrevida e dos escores de risco nas coortes TCGA-OV, GSE26193, GSE30161 e GSE63885, fornecendo evidências independentes da estabilidade e confiabilidade preditiva do modelo prognóstico em OV.
Estabelecimento e avaliação de um modelo de sobrevida baseado em nomograma
As análises de regressão de Cox univariada e multivariada demonstraram que o escore de risco atuou como um preditor independente de prognóstico em pacientes com câncer de ovário (Figura 4A,B). A distribuição da expressão gênica do modelo, dos escores de risco correspondentes e das características clínico-patológicas na coorte TCGA-OV é apresentada na Figura 4C. Para melhorar a aplicabilidade clínica, foi estabelecido um nomograma prognóstico que incorpora o escore de risco juntamente com idade, estágio tumoral e grau, com o objetivo de estimar a sobrevida global (OS) (Figura 4D). Em comparação com a assinatura gênica isolada, o nomograma integrado alcançou desempenho preditivo superior. A análise de sobrevida mostrou ainda uma OS significativamente maior no grupo de baixo risco em comparação ao grupo de alto risco (Figura 4E; P < 0,0001). O modelo combinado gerou valores de AUC dependentes do tempo de 0,769, 0,690 e 0,728 para a predição da sobrevida global (Figura 4F). A análise de curva de decisão apoiou a utilidade clínica potencial do nomograma, demonstrando maior benefício líquido em uma variedade de probabilidades de limiar (Figura 4G). Além disso, os gráficos de calibração indicaram boa concordância entre as probabilidades de sobrevida previstas e observadas, sugerindo uma calibração adequada do modelo (Figura 4H). Em conjunto, esses resultados indicam que o nomograma proposto possui forte capacidade preditiva para avaliação do prognóstico de pacientes com OV.
Associação do modelo prognóstico baseado em PARDTG com a infiltração imune e o microambiente imune tumoral
Para caracterizar a infiltração imune, a abundância de células imunes foi quantificada ao longo das amostras. Dezessete genes foram identificados como estando significativamente associados a células imunes infiltrantes no tumor, dentre os quais ADRA1D, KCNA1 e SLC18A2 apresentaram correlações positivas com macrófagos M2 (Figura 5A). Em seguida, investigamos os padrões de localização celular desses genes. A análise de gráfico de pontos revelou que KRT81 era predominantemente expresso nas células CD8Tex e Tprolif, enquanto a expressão de EPHA4 estava principalmente enriquecida em células endoteliais e fibroblastos, sugerindo seu possível envolvimento em compartimentos celulares distintos dentro do microambiente tumoral (Figura 5B). Além disso, avaliamos os escores TIDE dos pacientes e observamos que o subgrupo de alto risco apresentava escores TIDE mais elevados e uma correlação positiva (Figura 5C). Além disso, os escores de enriquecimento de potencial de células-tronco foram significativamente mais altos no grupo de alto risco do que no grupo de baixo risco (Figura 5D). A análise de mutação somática revelou uma alta frequência geral de mutações em ambos os grupos de risco (Figura 5E,F). Dentre eles, as frequências de mutação de CSMD3 e MUC16 foram mais altas nas amostras de alto risco.
A análise de enriquecimento gênico (GSEA) revelou que vias relacionadas à imunidade, incluindo processamento e apresentação de antígenos e rejeição de aloenxerto, foram significativamente enriquecidas no grupo de baixo risco, enquanto vias associadas à invasão e motilidade tumoral, como regulação do citoesqueleto de actina, proteoglicanos no câncer e proteínas motoras, foram predominantemente enriquecidas no grupo de alto risco (Figura 5G,H). Esses achados sugerem que pacientes no grupo de alto risco podem apresentar resposta limitada à imunoterapia.
Identificação e análise de rede de PARDTGs prognósticos no câncer de ovário
Para elucidar o mecanismo, identificamos 490 miRNAs e 17 redes regulatórias potenciais de biomarcadores (Figura 6A). Entre eles, hsa-miR-27a-3p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-106b-5p e hsa-miR-20b-5p possuem potencial para regular a maioria dos genes. Por fim, nossos resultados de pesquisa identificaram 37 fatores de transcrição que regularam os genes diagnósticos candidatos (Figura 6B). Adicionalmente, FOXC1 também foi encontrado com múltiplas funções regulatórias.
Análise pan-cancer da expressão de KRT81
Dados de RNA-seq do TCGA foram obtidos para avaliar KRT81 expressão. Os resultados sugeriram que era altamente expresso na maioria dos cânceres, mas expresso em níveis baixos em GBM, LGG, SKCM, TGCT e THCA (Figura 7A). Para verificar o resultado de que KRT81 é altamente expresso no câncer de ovário, conforme determinado por análise de bioinformática, realizamos um experimento de western blot. Os resultados indicaram que KRT81 a expressão foi significativamente elevada nos tecidos tumorais em comparação com os tecidos normais e foi amplamente consistente com os dados transcriptômicos do TCGA (Figura 7B, Suplementar Figura S1, e Tabela Suplementar S5). Para ilustrar as relações entre KRT81 e câncer, examinamos a expressão gênica e as infiltrações de células imunes (Figura 7C). A análise revelou que KRT81 a expressão foi positivamente correlacionada com a infiltração de linfócitos T, Tregs e macrófagos M2 na maioria dos cânceres. Além disso, a expressão de KRT81 foi positivamente associada aos escores estromal e imune na maioria dos cânceres (Figura 7D). Além disso, analisamos a correlação entre KRT81 expressão e Pontuação de Aneuploidia, e o gráfico de radar mostrou que KRT81 foi correlacionado com a Pontuação de Aneuploidia em UCEC, SARC, LUAD, LIHC e KIRP (Figura 7E). Em seguida, analisamos a correlação entre KRT81 e Ploidia Tumoral, e o gráfico de radar mostrou que KRT81 foi correlacionado com a Ploidia do Tumor em THCA, TGCT, SARC, MESO, LIHC e CESC (Figura 7F). Em seguida, o gráfico de radar mostrou que KRT81 estava correlacionado com neoantígenos SNV em UCEC, THYM, LUAD, LIHC, GBM e BRCA (Figura 7G). Além disso, a análise online do cBioPortal revelou que a maior frequência de KRT81 a mutação gênica foi em UCEC, cujo tipo majoritário foi "mutação" e "amplificação" (Figura 7H, I). Por meio da análise de regressão univariada de risco proporcional de Cox, identificamos que KRT81 foi um preditor para a sobrevida global (OS) em KIRC, LUAD e STAD (Figura 7J).
Disponibilidade de dados:
Os conjuntos de dados disponibilizados publicamente e analisados neste estudo estão acessíveis no TCGA, UCSC Xena e GEO. As imagens originais dos western blots e os dados quantitativos correspondentes gerados durante este estudo são fornecidos nos Materiais Suplementares (Supplementary Figure S1 e Supplementary Table S5).
Figura 1. Características associadas ao PARDTG na transcriptômica espacial e na scRNA-seq. (A,B) Mapeamento espacial da intensidade da expressão de PARDTG (C), correlação de Spearman da atividade associada ao PARDTG. (D) Análise dos tipos celulares. (E) Análise do número e da força de interação entre os tipos celulares. (F) Valor de enriquecimento do PARDTG nas células. (G) Distribuição do PARDTG. Abreviações: PARDTG = genes-alvo de fármacos relacionados à anestesia perioperatória; scRNA-seq = sequenciamento de RNA em única célula. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2. Panorama das alterações genéticas dos PARDTGs em pacientes com OV. (A) Visualização em gráfico de vulcão dos genes diferencialmente expressos (DEGs) em OV (azul: DEGs subexpressos; vermelho: DEGs superexpressos; cinza: genes estáveis), FDR< 0,05 e |log2FC| > 1. (B) Mapa de calor ilustrando as características diferencialmente expressas entre os grupos OV e normais. O azul representa o grupo normal, o vermelho representa o grupo OV, o quadrado azul indica baixa expressão e o quadrado amarelo indica alta expressão. (C) Rede de interação proteína-proteína (PPI) dos DEGs relacionados à anestesia perioperatória, obtida a partir do site String. (D) Os 20 principais PARDTGs na coorte TCGA. (E) Frequências de ganho de CNV, perda de CNV e não-CNV entre os 20 principais PARDTGs. (F) Gráfico de pontos (dotplot) de termos GO enriquecidos. (G) Gráfico de barras das vias KEGG enriquecidas. OV = câncer de ovário; GO = Ontologia Genética; KEGG = Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas; PPI = interação proteína-proteína. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3. Construção e validação de uma assinatura prognóstica baseada em PARDTG para câncer de ovário. (A-D). SO nos pacientes de baixo e alto risco em (A) TCGA-OV, (B) GSE26193, (C) GSE30161, (D) GSE63885. (E-H) Distribuição do escore de risco associado ao PARDTG utilizando o status de sobrevida e o tempo em (E) TCGA-OV, (F) GSE26193, (G) GSE30161, (H) GSE63885. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4. Construção e validação de um nomograma prognóstico baseado na assinatura de risco derivada do PARDTG. (A,B) Características clínico-patológicas e escores de risco na coorte TCGA-OV. (C) Distribuição das características clínicas e expressão dos genes do modelo por escore de risco. (D) Um nomograma para prever o prognóstico em pacientes com OV. (E) Análises de Kaplan-Meier para dois grupos de OV. (F) Análise da curva ROC na coorte TCGA-OV. (G) A DCA mostra os benefícios líquidos do nomograma e de outras características clínicas. (H) Gráficos de calibração mostram a sobrevida global (OS) na coorte TCGA-OV. Abreviações: ROC = característica de desempenho do receptor; DCA = análise da curva de decisão. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5. Análise do microambiente tumoral em pacientes de baixo e alto risco. (A) Correlação entre células imunes infiltrantes no tumor e genes no modelo prognóstico relacionado ao PA. (B) Gráfico de bolhas mostrando a expressão média e a proporção de biomarcadores prognósticos em diferentes subtipos celulares. (C) Gráfico de violino dos escores TIDE. (D) Gráfico de violino dos escores de enriquecimento de stemness tumoral. (E,F) Gráfico de cascata mostrando as características das mutações somáticas nas categorias de escore (E) de baixo risco e (F) de alto risco. (G,H) Resultados da GSEA das vias KEGG no subgrupo de (G) baixo risco e no subgrupo de (H) alto risco. Abreviaturas: TIDE = Disfunção e Exclusão Imune no Tumor; GSEA = Análise de Enriquecimento de Conjunto de Genes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 6. Análise da rede de interação de marcadores prognósticos. (A) Rede coregulatória de marcadores prognósticos por miRNA. (B) Rede coregulatória de marcadores prognósticos por fator de transcrição. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 7. Nível de expressão, características imunológicas e alterações genéticas de KRT81 em tumores humanos. (A) Expressão de KRT81 em tumores do TCGA e tecidos adjacentes. (B) Análise por Western blot da expressão proteica de KRT81 em tecidos normais adjacentes pareados e tecidos tumorais de seis pacientes com câncer de ovário (n = 6). As intensidades relativas das bandas foram normalizadas em relação à GAPDH, e os dados foram analisados utilizando o teste t pareado. Os dados são apresentados como média ± DP. (C) Correlação entre KRT81 e a proporção de células imunes exibida em um mapa de calor. (D) Correlação entre KRT81 e os escores imune, estromal e ESTIMATE, exibidos em um mapa de calor. (E-G) Correlação entre a expressão de KRT81 e (E) Escore de Aneuploidia, (F) Ploidia do Tumor, (G) Neoantígenos de SNV nos bancos de dados do TCGA. (H) Mutação de KRT81 em diferentes tipos de câncer provenientes do banco de dados cBioPortal. (I) Distribuição dos sítios de mutação de KRT81 em pân-câncer. (J) Análise de regressão de Cox pan-câncer de KRT81 em cânceres do TCGA. *p < 0,05; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Abreviações: SNV = Variante de Nucleotídeo Único; N = normal; T = tumor. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Tabela Suplementar S1: Genes-alvo de fármacos relacionados à anestesia perioperatória. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S2: Descrição do fluxo de amostras.Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S3: Genes-alvo de fármacos relacionados à anestesia com expressão diferencial no período perioperatório. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S4: Genes-alvo prognósticos relacionados a anestésicos perioperatórios.Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S5: Dados brutos de Western blot.Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S1: Dados originais de western blotting.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Como componente inevitável dos fluxos de trabalho no tratamento do câncer, a anestesia perioperatória tem atraído crescente atenção devido aos seus possíveis efeitos imunomoduladores, capacidade de remodelar o microambiente e potencial promoção da disseminação tumoral. Com o câncer sendo cada vez mais reconhecido como uma doença sistêmica e ecológica, e não apenas uma lesão focal estritamente impulsionada por genes27, a desregulação fisiológica perioperatória, as respostas inflamatórias e o estresse metabólico podem remodelar nichos microambientais e influenciar as trajetórias evolutivas do tumor. Por meio da integração de transcriptomas em múltiplas camadas, este estudo descreveu sistematicamente os padrões de expressão, as associações biológicas e o valor prognóstico dos PARDTGs no OV, fornecendo pistas potenciais para anestesia de precisão no período perioperatório.
Os perfis transcriptômicos espaciais e de célula única destacaram uma acentuada variação espacial da atividade de PARDTG, mostrando atividade reduzida em células epiteliais tumorais e atividade aumentada em células imunes, endoteliais e fibroblastos. Esse padrão de "enriquecimento em células não tumorais" sugere que a rede alvo da anestesia pode exercer seus efeitos principalmente pela modulação dos estados das células estromais e imunes, ao invés de mecanismos intrínsecos diretos nas células tumorais. Essa observação está de acordo com o conceito de que a progressão tumoral é moldada conjuntamente pelas células tumorais e pelo seu microambiente hospedeiro28. Notavelmente, a inflamação aguda induzida pela cirurgia, a imunossupressão transitória e a remodelação tecidual podem gerar um microambiente de cicatrização de curta duração que os tumores podem explorar para aumentar o risco de disseminação e recorrência29.
A análise adicional da coorte TCGA identificou 68 genes diferencialmente expressos do PARDTG significativamente enriquecidos nas interações de ligantes e receptores neuroativos, sinalização de cálcio e vias relacionadas ao vício. A rede PPI construída destacou diversos genes centrais relacionados a transportadores e receptores de neurotransmissão, como DRD2, SLC6A3 e SLC6A430, sugerindo entrada regulatória adicional proveniente da sinalização perioperatória de neurotransmissores na progressão do OV. Trabalhos recentes demonstraram que o antagonista de DRD2, ONC206, suprime a proliferação e invasão em células de OV e modelos de camundongos transgênicos, induzindo parada do ciclo celular e apoptose, destacando o potencial terapêutico desse eixo. CHRNA4 e GRIN2A codificam proteínas relacionadas ao receptor colinérgico e ao receptor NMDA, respectivamente; a ativação desses receptores facilita a entrada intracelular de Ca2⁺31,32, enquanto a perturbação do cálcio pode remodelar o citoesqueleto e ativar programas transcricionais que promovem tumores33. Além disso, receptores associados ao vício (por exemplo, receptores µ-opioides) foram associados à ativação do mTORC1 e à evasão imunológica34. Em conjunto, esses achados sugerem uma possível interação entre as vias-alvo dos anestésicos e a rede neuroimunológica de estresse perioperatório, influenciando assim a plasticidade tumoral e o risco de recorrência dentro de uma janela perioperatória curta.
O modelo de risco com 17 genes demonstrou desempenho prognóstico estável em múltiplas coortes independentes. Pacientes de alto risco apresentaram enriquecimento em vias como "Regulação do citosqueleto de actina" e "Proteoglicanas no câncer", indicando remodelamento citosquelético e potencial metastático aumentados. O perfil imunológico revelou maiores proporções de macrófagos M2, superexpressão de genes relacionados a pontos de controle imunológico e escores TIDE elevados no grupo de alto risco. Os macrófagos M2 promovem a evasão imunológica, e a ativação inflamatória pós-operatória pode induzir o recrutamento de células supressoras derivadas de linhagem mieloide (MDSCs)35. Notavelmente, EPHA4 foi predominantemente expresso em subconjuntos endoteliais e fibroblásticos, sugerindo seu possível envolvimento na regulação vascular, remodelamento estromal e interações no microambiente tumoral. EPHA4 é um membro da família de tirosina quinases receptoras Eph e atua como mediador importante da comunicação célula-célula por meio da sinalização Eph/ephrina. A ativação de EPHA4 pode regular vias downstream envolvidas no rearranjo citosquelético, adesão celular, migração e organização da matriz extracelular36. No microambiente tumoral, a sinalização desregulada de EPHA4 tem sido implicada na promoção da invasão de células tumorais, respostas angiogênicas, ativação estromal e interações entre células malignas e componentes estromais circundantes37. Esses achados sugerem que EPHA4 pode contribuir para as características biológicas agressivas de pacientes de alto risco por meio da modulação da comunicação vascular-estromal e do remodelamento ecológico tumoral. Concomitantemente, pacientes de alto risco exibiram frequências maiores de mutações em genes como MUC16 e CSMD3, que estão implicados nas interações estromais e na evasão imunológica38,39. Em conjunto, pacientes de alto risco parecem apresentar características ecológicas malignas caracterizadas por dinâmica citosquelética desregulada, microambientes imunossupressores e remodelamento da matriz, sugerindo que os PARDTGs podem estar associados a alterações na ecologia tumoral e na progressão da doença.
Agentes anestésicos também podem reprogramar a expressão de múltiplos genes por meio da modulação de redes de RNA não codificantes, afetando a adesão celular tumoral, migração, resistência à apoptose e manutenção da capacidade de autorrenovação, alterando potencialmente o risco de recorrência pós-operatória40,41. Em nossa rede reguladora principal de miRNA–fator de transcrição, miR-27a-3p, miR-34a-5p e miR-106b-5p foram identificados como possíveis centros reguladores, e há amplas evidências que apoiam seu envolvimento na progressão do OV e nas respostas farmacológicas relacionadas a anestésicos42,43,44. FOXC1, como fator de transcrição central, desempenha um papel crítico na promoção da migração, invasão e fenótipos de EMT no OV e é regulado a montante por múltiplos RNAs não codificantes45.
Foi realizada uma análise pan-câncer para explorar mais a fundo as características biológicas da KRT81 em diferentes neoplasias malignas, e não para validar o modelo prognóstico do câncer de ovário. Na nossa análise, KRT81 apresentou significativa superexpressão na maioria dos tipos de câncer e correlacionou-se com aneuploidia, infiltração imune e escores estromais, sugerindo envolvimento na remodelação do nicho ecológico e na evasão imune. Como membro da família das queratinas do tipo II, a KRT81 participa da manutenção da integridade do citoesqueleto epitelial, da estabilidade mecânica celular e da adaptação ao estresse. A expressão desregulada da KRT81 pode afetar a plasticidade das células tumorais ao influenciar a organização do citoesqueleto, a diferenciação epitelial e as interações entre as células tumorais e o microambiente circundante. Além disso, a remodelação anômala das queratinas tem sido implicada na progressão do câncer por meio da modulação da proliferação celular, migração, invasão e comunicação imune-estromal. Estudos anteriores relataram que KRT81 atua como biomarcador para subtipagem imune e estratificação prognóstica no OV46 e contribui para a formação de um microambiente imunossupressor e para a predição da resposta à imunoterapia no câncer de mama triplo negativo47. Assim, KRT81 pode representar um nó central nas redes de plasticidade tumoral perioperatória, com relevância mecanicista e translacional.
Coletivamente, este estudo fornece a primeira caracterização em nível espacial e de única célula da ecologia de expressão de PARDTG no OV e ilustra suas associações com microambientes imunes, características de potênciação e instabilidade genômica, sugerindo que genes-alvo relacionados à anestesia perioperatória podem estar associados às trajetórias evolutivas tumorais. No entanto, várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiramente, este estudo baseou-se principalmente em conjuntos de dados transcriptômicos publicamente disponíveis, e diferenças nas origens das amostras, plataformas de sequenciamento e características das coortes podem introduzir efeitos de lote potenciais e influenciar a robustez dos achados. Em segundo lugar, embora coortes externas tenham sido utilizadas para validação, o modelo prognóstico foi desenvolvido a partir de conjuntos de dados retrospectivos, e o superajuste potencial devido às abordagens de seleção de características não pode ser completamente descartado. Terceiro, embora as análises transcriptômicas de única célula e espaciais tenham fornecido insights sobre os papéis biológ游戏副本
Este estudo revelou que os PARDTGs exercem importantes funções ecológicas transcricionais no OV e podem participar da invasão induzida pelo microambiente pós-operatório e da evasão imune, fornecendo novas evidências moleculares para anestesia de precisão no período perioperatório, estratificação de risco e prevenção de recorrência.
Divulgações
Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes
Agradecimentos
Agradecemos sinceramente aos pesquisadores que compartilharam seus valiosos conjuntos de dados nos bancos de dados TCGA e GEO, incluindo TCGA-OV, GSE26193, GSE30161, GSE63885, GSE154600 e GSE211956.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-Citoceratina 81 (policlonal de coelho) | Proteintech, USA | 11342-1-AP | |
| Anticorpo anti-GAPDH (monoclonal de camundongo) | Proteintech, USA | 60004-1-Ig | |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Thermo Fisher, USA | 23225 | |
| CIBERSORT | Universidade de Stanford | https://cibersort.stanford.edu | Infiltração imune | Matriz de assinatura LM22 | Análise de infiltração de células imunes |
| Características clínicas de pacientes com OV | UCSC Xena | http://xena.ucsc.edu/ | Dados clínicos | 341 pacientes | Análise de correlação clínica |
| Pacote clusterProfiler | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler | Análise de enriquecimento funcional | Versão 4.8.3 | Análises GO, KEGG e GSEA |
| Pacote ggplot2 | CRAN | https://cran.r-project.org/package=ggplot2 | Visualização de dados | Versão 4.0.2 | Visualização de dados |
| GSE26193 | Banco de dados GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE26193 | Conjunto de dados de validação | 107 amostras | Validação externa |
| GSE30161 | Banco de dados GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE30161 | Conjunto de dados de validação | 58 amostras | Validação externa |
| GSE63885 | Banco de dados GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE63885 | Conjunto de dados de validação | 70 amostras | Validação externa |
| Pacote GSVA | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/GSVA | Análise de enriquecimento de conjunto de genes | Versão 2.4.9 | Análise ssGSEA |
| Pacote limma | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/limma/ | Análise de expressão diferencial | Versão 3.56.2 | Análise de DEG |
| Informações sobre sobrevida global de pacientes com OV | UCSC Xena | http://xena.ucsc.edu/ | Dados de sobrevida | 353 pacientes | Construção de modelo prognóstico |
| Membrana PVDF | Millipore, USA | IPVH00010 | |
| R | Foundation R para Computação Estatística | https://www.r-project.org/ | Software bioinformático | Versão 4.3.1 | Análises estatísticas |
| Tampão RIPA | Beyotime, China | P0013B | |
| Pacote Seurat | CRAN | https://satijalab.org/seurat/ | Análise de célula única | Versão 5.4.0 | Análise de RNA-seq de célula única |
| Banco de dados STRING | Consortium STRING | https://string-db.org | Banco de dados de interação proteica | Versão 12.0 | Construção de rede PPI |
| Pacote survival | CRAN | https://cran.r-project.org/package=survival | Análise de sobrevida | Versão 3.5.5 | Análise de sobrevida |
| Dados de expressão gênica ovariana TCGA TARGET GTEx (Toil) | UCSC Xena | http://xena.ucsc.edu/ | Conjunto de dados de treinamento | 420 amostras tumorais do TCGA | Coorte de treinamento |
| Dados de tecido normal ovariano TCGA TARGET GTEx (Toil) | UCSC Xena | http://xena.ucsc.edu/ | Conjunto de dados normal de referência | 88 amostras normais do GTEx | Análise de expressão diferencial |
Referências
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