Artigo de investigação

N-Lactoil-fenilalanina Melhora a Função Cardíaca em um Modelo Murino de Cardiomiopatia Diabética por meio da Regulação do Metabolismo Lipídico

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DOI:

10.3791/72633

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1 de setembro de 2026

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1Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 3Institute of Advanced Synthesis, School of Chemistry and Molecular Engineering, Nanjing Tech University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve abordagens in vivo e in vitro para investigar como o N-lactoil-fenilalanina afeta a cardiomiopatia diabética, o metabolismo lipídico cardíaco e a síntese de colesterol, com foco na via da proteína quinase ativada por monofosfato de adenosina alfa 1/3-hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase.

Resumo

A cardiomiopatia diabética (DCM) é uma das complicações mais graves do diabetes. A N-lactoil-fenilalanina (Lac-Phe), um metabólito endógeno, pode promover a perda de peso e melhorar a homeostase glicêmica. Este estudo teve como objetivo investigar o efeito terapêutico da Lac-Phe sobre a DCM e explorar ainda mais o mecanismo subjacente. Camundongos diabéticos tipo 2 com DCM foram tratados com Lac-Phe. A Lac-Phe melhorou a função contrátil cardíaca, atenuou o remodelamento patológico e reduziu o acúmulo lipídico no coração. In vitro, os efeitos da Lac-Phe foram investigados em células H9c2 estimuladas com glicose alta e ácido palmítico. A Lac-Phe reduziu o acúmulo lipídico ao diminuir a síntese de colesterol nas células H9c2. Mecanicamente, a Lac-Phe promoveu a fosforilação e ativação da proteína quinase ativada por monofosfato de adenosina alfa 1 (AMPKα1). Posteriormente, a AMPKα1 ativada fosforilou e inibiu seu alvo downstream, a 3-hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMGCR), levando à redução da síntese de colesterol e, por fim, à melhora do desequilíbrio do metabolismo lipídico nas células H9c2. Esses achados indicam que a Lac-Phe melhora o metabolismo lipídico em células H9c2 na DCM por meio da via AMPKα1/HMGCR, melhorando assim a função contrátil cardíaca e atenuando o remodelamento patológico. A Lac-Phe pode representar uma abordagem terapêutica potencial para a cardiomiopatia diabética.

Introdução

O diabetes é uma doença metabólica caracterizada por hiperglicemia persistente1. Nas últimas duas décadas, o diabetes tornou-se uma das dez principais causas de morte no mundo, com mais de seis milhões de pessoas morrendo anualmente de diabetes e suas complicações.2. A cardiomiopatia diabética (DCM), uma condição cardíaca patológica resultante do diabetes, representa uma das complicações mais graves associadas ao diabetes3,4. Atua como um fator de risco independente para insuficiência cardíaca e é caracterizada por alterações estruturais e funcionais do miocárdio5,6, incluindo fibrose cardíaca e hipertrofia de cardiomiócitos, que acabam levando a disfunção diastólica e sistólica. Embora diversas terapias cardiovasculares convencionais, como βbloqueadores, inibidores da enzima conversora da angiotensina e bloqueadores do receptor do tipo 1 da angiotensina II são atualmente empregados no tratamento da miocardiopatia dilatada7,8, sua eficácia permanece subótima em ambientes clínicos. Como os mecanismos subjacentes à miocardiopatia dilatada (DCM) não foram amplamente estudados9, atualmente não existe uma estratégia de tratamento clara direcionada a esta doença10,11. As manifestações clínicas da miocardiopatia dilatada progridem de disfunção diastólica assintomática no estágio inicial até disfunção sistólica e insuficiência cardíaca clínica no estágio avançado, podendo levar inclusive à morte12,13Portanto, existe uma necessidade urgente de explorar e desenvolver opções de tratamento eficazes para esta condição.

O metabolismo lipídico desequilibrado é uma característica-chave da miocardiopatia diabética (DCM)14. Na DCM, níveis elevados de ácidos graxos livres (AGLs) no sangue podem levar à captação excessiva de ácidos graxos pelos cardiomiócitos15,16. O metabolismo de ácidos graxos nos cardiomiócitos depende principalmente da oxidação de ácidos graxos. Com o tempo, a oxidação de ácidos graxos nos cardiomiócitos é insuficiente para metabolizar completamente todos os ácidos graxos ingeridos, e ácidos graxos em excesso e seus metabólitos intermediários se acumulam nos cardiomiócitos17. Essa sobrecarga lipídica excessiva induz lipotoxicidade, interrompe o suprimento energético miocárdico e promove estresse oxidativo cardíaco e respostas inflamatórias, causando, em última instância, danos graves aos cardiomiócitos18,19. Portanto, regular ativamente o metabolismo lipídico cardíaco pode representar um alvo terapêutico potencial para a DCM20.

N-lactoil-fenilalanina (Lac-Phe) é um metabólito endógeno cuja concentração aumenta rapidamente após o exercício21. Mecanicamente, o Lac-Phe é sintetizado pela enzima citosólica carnosina dipeptidase 2 (CNDP2) por meio da condensação de lactato e fenilalanina. Esta via biossintética está amplamente distribuída entre diversos tipos celulares, incluindo macrófagos, células epiteliais e células-tronco mesenquimais, que secretam Lac-Phe na circulação após atividade física22. A administração crônica de Lac-Phe demonstrou reduzir efetivamente a ingestão alimentar, diminuir a obesidade e o peso corporal e melhorar a homeostase da glicose21. Um estudo recente mostrou que o Lac-Phe pode melhorar a capacidade de metabolismo lipídico das micróglias/macrófagos após lesão medular23. Curiosamente, estudos indicam que tanto a administração aguda quanto a crônica da metformina, um medicamento de primeira linha para diabetes tipo 2, podem elevar os níveis de Lac-Phe e que o Lac-Phe media os efeitos antiobesidade da metformina22. Além disso, Sha et al. demonstraram recentemente que o Lac-Phe atenua a morte celular miocárdica ao aliviar a disfunção mitocondrial, melhorando assim a insuficiência cardíaca induzida por constrição aórtica transversa (TAC)24. A hiperglicemia prolongada e a obesidade são fatores importantes que contribuem para a desregulação do metabolismo lipídico na miocardiopatia diabética (DCM)25. Em conjunto, essas evidências sugerem que o Lac-Phe pode ter um efeito terapêutico potencial na DCM. No entanto, até o momento, o papel específico do Lac-Phe na DCM não foi investigado.

Neste estudo, descobrimos que a administração exógena de Lac-Phe em camundongos com cardiomiopatia diabética melhorou efetivamente a função contrátil cardíaca e atenuou o remodelamento patológico cardíaco. Verificamos que o Lac-Phe melhorou a função cardíaca em camundongos com miocardiopatia dilatada (DCM) por meio da regulação do desequilíbrio do metabolismo lipídico. O Lac-Phe reduziu o acúmulo de gotículas lipídicas (LD) em cardiomiócitos de camundongos com DCM e diminuiu o conteúdo de colesterol no coração. Mecanicamente, o Lac-Phe promoveu a fosforilação e ativação da proteína quinase ativada por monofosfato de adenosina alfa 1 (AMPKα1), promovendo assim a fosforilação da 3-hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMGCR). A fosforilação da HMGCR reduz sua atividade, resultando na diminuição da produção de colesterol e, consequentemente, na melhora do desequilíbrio do metabolismo lipídico em cardiomiócitos. Esses resultados fornecem uma base teórica para o potencial tratamento da DCM com Lac-Phe.

Protocolo

The animal study protocol was approved by the Institutional Ethics Committee of Nanjing Drum Tower Hospital (Approval Number: 2025AE1065, 26 September 2025) and was conducted in accordance with the guidelines outlined in the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition), published by the National Institutes of Health of the United States.

Animals

Thirty 5-week-old male C57BL/6J mice were used in this study. After 1 week of adaptive feeding, all mice were housed with access to food and water under an alternating 12 h day-night cycle at a temperature of 22°C ± 2°C and humidity of 40%–60%. An HFD combined with low-dose STZ was used to establish the DCM mouse model (Figure 1A). Four weeks after initiation of high-fat diet (HFD; 60% fat, 20% protein, and 20% carbohydrate) feeding, mice were fasted overnight and subsequently administered streptozotocin (STZ; 8 mg/mL dissolved in citrate buffer, pH 4.5) via intraperitoneal injection at a dosage of 35 mg/kg/day for three consecutive days. Control group mice were fed a control diet (10% fat, 20% protein, and 70% carbohydrate) and received equivalent volumes of citrate buffer. Following 15 additional weeks of high-fat diet maintenance, mice meeting both criteria, random blood glucose of ≥13.3 mmol/L and left ventricular ejection fraction (LVEF) of <55%, were defined as successfully established DCM models. These validated DCM mice were numbered and randomly assigned to the DCM and DCM + Lac-Phe groups using a random number table. Approximately half of the mice failed to develop the model; these animals were euthanized in accordance with animal ethics requirements. In brief, mice were divided into three groups: Control, DCM, and DCM + Lac-Phe (n = 10 for each group). All 10 mice per group underwent echocardiography, body weight measurement, and OGTT. Following the 28-day treatment period, hearts were collected for subsequent analyses. There were 10 mice in each group. Of these, three mice per group were used for transcriptome sequencing, three were used for transmission electron microscopy and histological staining, and three were used for protein expression analysis. The remaining mouse in each group was reserved as a backup. After successful establishment of the DCM model, Lac-Phe was dissolved in normal saline to a final concentration of 10 mg/mL. Mice in the DCM + Lac-Phe group received intraperitoneal Lac-Phe at 50 mg/kg/day in an injection volume of 5 mL/kg, once daily for 28 consecutive days. Mice in the Control and DCM groups were administered an equivalent volume of normal saline as vehicle control.

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Figure 1. Lac-Phe improves cardiac function and pathological remodeling in mice with diabetic cardiomyopathy. (A) Schematic of the HFD/STZ-induced DCM mouse model and Lac-Phe treatment protocol. (B) Body weights of mice in the Control, DCM, and DCM + Lac-Phe groups during the 4-week treatment period; n = 10 per group. (C) Oral glucose tolerance test (OGTT) in the indicated groups; n = 10 per group. (D) Representative echocardiographic images at 0, 2, and 4 weeks of treatment. (E,F) Quantification of left ventricular ejection fraction (LVEF) (E) and fractional shortening (FS) (F); n = 10 per group. (G) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained heart sections. Scale bar = 1 mm. (H,I) Representative Masson’s trichrome staining of heart sections (H) and quantification of fibrotic area (I); n = 3 per group. Scale bar = 50 μm. (J,K) Representative wheat germ agglutinin (WGA) staining of heart sections (J) and quantification of relative cardiomyocyte area (K); n = 3 per group. Scale bar = 20 μm. Data are presented as the mean ± standard deviation. P < 0.05, **P < 0.001. Please click here to view a larger version of this figure.

Cardiac function

Following anesthesia with isoflurane inhalation, mice were secured in a supine position on a temperature-controlled platform (37°C). Left ventricular dimensions and mitral valve blood flow velocity during diastole and systole were measured using an echocardiography machine equipped with a 40 MHz transducer, from which LVEF and shortening fraction (FS) were calculated. Three consecutive cardiac cycles were collected from each mouse.

Cell treatment

H9c2 cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin–streptomycin at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO₂. Cells were passaged every 2–3 days upon reaching 70%–80% confluence. For experiments, cells were seeded in 10 cm dishes and then divided into three groups: Control, high glucose/palmitic acid (HG/PA), and HG/PA + Lac-Phe. Cells in the HG/PA and HG/PA + Lac-Phe groups were first exposed to 0.25 mM palmitic acid and 50 mM glucose for 24 h. Thereafter, cells in the HG/PA + Lac-Phe group were treated with 10 μg/mL Lac-Phe for an additional 24 h while HG/PA exposure was maintained; cells in the HG/PA group received an equivalent volume of PBS under the same HG/PA conditions. In the p-AMPK inhibition experiments, 10 μM AMPK-IN-3 (dissolved in DMSO) was added simultaneously with Lac-Phe for 24 h, and the corresponding control groups received an equal volume of DMSO. For the atorvastatin experiments, H9c2 cells under HG/PA conditions were treated with 10 μM atorvastatin for 24 h, either alone or in combination with 10 μg/mL Lac-Phe.

Histological staining

After 28 days of Lac-Phe administration, mouse hearts were harvested and immersion-fixed in 4% paraformaldehyde (pH 7.4) for 24 h. Fixed cardiac tissues were paraffin-embedded and sectioned into 6-μm-thick slices. Tissue sections were stained with hematoxylin and eosin, wheat germ agglutinin, and Masson’s trichrome. All staining procedures were performed strictly following the manufacturers’ protocols. Whole-slide imaging was performed at 20× magnification using a high-resolution brightfield microscope equipped with a digital camera system.

Western blot analysis

Protein concentration was determined using the Bradford assay. Tissue lysates were resolved by SDS-PAGE on 10% (w/v) acrylamide gels and electrophoretically transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Nonspecific binding sites were blocked with 5% bovine serum albumin for 2 h at room temperature. Membranes were then incubated overnight at 4°C with primary antibodies (diluted 1:1,000), followed by six washes with TBST (5 min each) on a shaker. The membranes were then incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (diluted 1:5,000) for 2 h at room temperature, followed by another six washes with TBST (5 min each). Protein bands were visualized using an enhanced chemiluminescence reagent kit. Quantification of western blot results was performed by densitometric analysis using ImageJ software. All antibodies used in this study are listed in the Table of Materials.

Transcriptomics

Total RNA was isolated from cardiac tissue of C57BL/6J mice using TRIzol Reagent and RNeasy mini kits. RNA quality was evaluated using a 2100 bioanalyzer, demonstrating high RNA purity and integrity. RNA-seq libraries were prepared according to the VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit and sequenced using an Illumina NovaSeq 6000 System (single-read, 150 bp). Differentially expressed genes were identified using DESeq2, with an adjusted P value < 0.05 and an absolute log₂ fold change > 1 considered statistically significant. Gene Ontology (GO) enrichment analysis was conducted on differentially expressed genes, and the significance of enrichment of differentially expressed genes in GO terms was calculated using the hypergeometric distribution algorithm.

Oil Red O staining and LD540 lipid staining

Cardiac tissue was embedded in OCT compound and then cut into 10-μm-thick sections. The frozen sections were equilibrated at room temperature for 30 min and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min. After washing with PBS, the sections were placed in 60% isopropyl alcohol for 15 s and covered with Oil Red O working solution for 30 min. The sections were then treated with 60% isopropyl alcohol for 15 s and washed three times with PBS. For LD540 lipid staining, H9c2 cells were washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min at room temperature. The cells were then incubated with 10 μM LD540 for 30 min at room temperature.

Transmission electron microscopy (TEM)

Fresh mouse heart tissues were cut into 1–2 mm3 pieces, fixed in electron microscope fixative at 4°C for 4 h, then washed with double-distilled water and immersed in ethanol solutions of progressively increasing concentrations. The samples were embedded, sectioned, and then observed under a transmission electron microscope.

Total cholesterol (TC) content

Total cholesterol (TC) levels in serum and H9c2 cell samples were measured using the Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit according to the manufacturer’s instructions.

Oral Glucose Tolerance Test (OGTT)

Mice were fasted for 14 h (from 19:00 to 9:00) and gavaged with glucose (20% stock, 2 g/kg). Blood glucose levels were determined using blood collected from the tail vein at 0, 15, 30, 60, and 120 min after gavage.

Cell counting kit-8 (CCK-8) measurement

CCK-8 was used to measure cell viability. H9c2 cells were seeded into 96-well plates at an initial density of 3 × 104 cells/well. After treatment with different concentrations of Lac-Phe under HG/PA conditions for 24 h, 10 μL of the kit reagent was added to 100 μL of culture medium per well, followed by incubation at 37°C for 4 h. The absorbance was measured at 450 nm using a multimode microplate reader to obtain the optical density (OD) value.

Molecular docking

The crystal structures of Lac-Phe and AMPKα1 were downloaded from PubChem26. The molecular docking process was carried out using CB-DOCK227.

Statistical analysis

All echocardiographic measurements, histological staining, and image quantifications were performed by investigators blinded to group assignment. All data analyses were performed using Prism and SPSS 20.0. Each experiment was repeated at least three times, and the data were presented as the mean ± standard deviation. Homogeneity of variance was assessed using Levene’s test. Normality was confirmed by graphical inspection of residuals. Comparisons among multiple groups were conducted using one-way analysis of variance, followed by Tukey's post hoc test for pairwise comparisons. For OGTT data, two-way repeated-measures ANOVA was used, with group as the between-subjects factor and time as the within-subjects factor, followed by Bonferroni's post hoc test. P < 0.05 was considered statistically significant.

Resultados

Lac-Phe melhora a função cardíaca em camundongos com cardiomiopatia diabética

Induzimos DCM em camundongos C57BL/6J utilizando uma dieta rica em gordura combinada com injeções de STZ (Figura 1A) e atribuiu aleatoriamente os camundongos com DCM bem-sucedidos a um grupo não tratado (grupo DCM) e a um grupo tratado com Lac-Phe, utilizando camundongos C57BL/6J controle como controle negativo. De acordo com o estudo de Li et al.21, selecionamos 50 mg/kg como a dose terapêutica de Lac-Phe. Após o estabelecimento bem-sucedido do modelo, o grupo tratado com Lac-Phe recebeu injeções exógenas de Lac-Phe por quatro semanas, enquanto o grupo não tratado recebeu injeções de volume equivalente de solução salina. Em comparação com o grupo DCM, os camundongos com cardiomiopatia diabética tratados com Lac-Phe exibiram uma redução significativa do peso corporal após quatro semanas (Figura 1B). O TOTG revelou que, em comparação com o grupo controle negativo, os camundongos no grupo DCM apresentaram níveis significativamente elevados de glicose sanguínea em todos os pontos temporais medidos, indicando tolerância à glicose prejudicada. Em contraste, camundongos com DCM tratados com Lac-Phe mostraram melhora na tolerância à glicose (Figura 1C). A análise ecocardiográfica revelou que, em comparação com os camundongos do controle negativo, os camundongos com miocardiopatia dilatada exibiram fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF) e fração de encurtamento (FS) significativamente reduzidas (Figura 1D–F). O tratamento com Lac-Phe aumentou a FEVE e a SF em camundongos com DCM. Análise histopatológica utilizando H&A coloração #38;E mostrou hipertrofia patológica no tecido cardíaco de camundongos com MDC em comparação com camundongos controle (Figura 1G). O tratamento com Lac-Phe aliviou acentuadamente a hipertrofia miocárdica. A coloração com tricrômio de Masson demonstrou ainda que o Lac-Phe aliviou significativamente a fibrose miocárdica em corações com miocardiopatia dilatada (DCM)Figura 1H, I). A coloração com WGA indicou que o Lac-Phe reduziu significativamente a área da seção transversal dos cardiomiócitos em corações com miocardiopatia dilatada (DCM)Figura 1J,K). Esses experimentos demonstram que a administração exógena de Lac-Phe melhora efetivamente a função cardíaca e atenua o remodelamento patológico em camundongos com miocardiopatia dilatada.

Lac-Phe melhora o metabolismo lipídico disregulado na DCM

Para elucidar mais detalhadamente o mecanismo da Lac-Phe na DCM, realizamos análise transcriptômica de tecidos cardíacos de camundongos. Após a aquisição dos dados, foram realizadas análises de enriquecimento de vias GO e KEGG. A análise GSEA do processo metabólico de ácidos graxos e a análise de enriquecimento de vias KEGG indicaram alterações em vias relacionadas ao metabolismo de lipídios (Figura 2A,B). Para investigar mais profundamente como a Lac-Phe atua nos corações de camundongos com DCM, realizamos análise por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (Figura 2C,D) para verificar se o tratamento com Lac-Phe alterou a morfologia ultraestrutural dos corações de camundongos com DCM. As imagens de TEM revelaram um aumento significativo na densidade de gotículas lipídicas (LD) nos corações de camundongos com DCM em comparação com camundongos controle, enquanto a administração de Lac-Phe reduziu efetivamente essa densidade de LD. Considerando a importância bem estabelecida da desregulação do metabolismo de lipídios na DCM, avaliamos ainda a acumulação cardíaca de lipídios utilizando coloração com Óleo Vermelho O (Figura 2E,F). A análise histológica demonstrou aumento acentuado na acumulação de lipídios nos corações de camundongos com DCM, enquanto o tratamento com Lac-Phe reduziu essa acumulação lipídica. O tratamento com Lac-Phe também reduziu o nível de colesterol total (TC) no soro de camundongos com DCM (Figura 2G). Para selecionar uma dose apropriada de Lac-Phe para os experimentos in vitro, utilizamos o ensaio CCK-8 para medir a viabilidade de células H9c2 tratadas com diferentes concentrações de Lac-Phe sob condições de HG/PA (Figura 2H). As células H9c2 tratadas com Lac-Phe na concentração de 10 μg/mL sob condições de HG/PA exibiram a maior taxa de sobrevivência entre as concentrações testadas. Assim, optamos por utilizar Lac-Phe na concentração de 10 μg/mL nos experimentos subsequentes. Células H9c2 expostas a HG/PA apresentaram significativa acumulação de lipídios, conforme demonstrado pela coloração com LD540 e quantificação da fluorescência (Figura 2I,J), e o conteúdo de TC também foi aumentado (Figura 2K). O tratamento com Lac-Phe reverteu essas alterações, reduzindo significativamente tanto a acumulação de lipídios quanto os níveis de TC nas células H9c2. Em conjunto, esses resultados experimentais demonstram que a Lac-Phe atenua efetivamente a acumulação cardíaca de lipídios e melhora a desregulação do metabolismo de lipídios em camundongos com DCM, além de reduzir a acumulação de lipídios e os níveis de TC em células H9c2 tratadas com HG/PA.

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Figura 2. Lac-Phe melhora o metabolismo lipídico disregulado na cardiomiopatia diabética. (A) Análise de enriquecimento de conjuntos de genes (GSEA) do processo metabólico de ácidos graxos nos grupos Controle e DCM. (B) Análise de enriquecimento de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) comparando os grupos DCM e DCM + Lac-Phe. (C) Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de tecidos cardíacos, com setas vermelhas indicando gotículas lipídicas (GL). Barra de escala = 2 μm. (D) Quantificação do número médio de GL por 100 μm2; n = 3 por grupo. (E,F) Coloração representativa com Óleo Vermelho O de tecidos cardíacos (E) e quantificação da área positiva relativa ao Óleo Vermelho O (F); n = 3 por grupo. Barra de escala = 20 μm. (G) Níveis relativos de colesterol total (CT) no soro dos grupos indicados; n = 3 por grupo. (H) Viabilidade celular medida pelo ensaio CCK-8 em células H9c2 tratadas com 0, 1, 5, 10 ou 20 μg/mL de Lac-Phe sob condições de HG/PA. (I,J) Coloração representativa com LD540 em células H9c2 (I) e quantificação da intensidade média de fluorescência LD540 (J); n = 3 por grupo. Barras de escala = 200 μm. (K) Níveis de CT em células H9c2 dos grupos indicados; n = 3 por grupo. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Lac-Phe aumenta a fosforilação de HMGCR nos corações de camundongos com DCM e em células H9c2

Para identificar alvos potenciais pelos quais o Lac-Phe melhora o metabolismo lipídico, realizamos triagem de proteínas associadas à DCM utilizando o GeneCards28 e previmos proteínas que potencialmente interagem com o Lac-Phe usando o SwissTargetPrediction29 (Figura 3A). Ao comparar os resultados, identificamos seis genes-alvo potenciais (Figura 3B). A análise desses seis genes revelou que a HMGCR é um regulador central do metabolismo do colesterol e também desempenha um papel fundamental na DCM (Figura 3C)30. Para determinar se o Lac-Phe regula o metabolismo lipídico por meio da HMGCR, primeiramente examinamos a razão p-HMGCR/HMGCR em corações de camundongos. A análise por Western blot revelou que a razão p-HMGCR/HMGCR estava reduzida nos corações de camundongos com DCM, enquanto o tratamento com Lac-Phe aumentou essa razão (Figura 3D,E). Esses achados são compatíveis com o aumento da fosforilação da HMGCR e com a redução da atividade da HMGCR após o tratamento com Lac-Phe. Experimentos in vitro mostraram que, sob condições de HG/PA, a razão p-HMGCR/HMGCR estava diminuída em células H9c2, enquanto o tratamento com Lac-Phe aumentou essa razão (Figura 3F,G). Esses resultados demonstram que o Lac-Phe aumenta a fosforilação da HMGCR nos corações de camundongos com DCM e em células H9c2 tratadas com HG/PA, apoiando a participação da HMGCR nos efeitos do Lac-Phe sobre o metabolismo lipídico.

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Figura 3. Lac-Phe aumenta a fosforilação de HMGCR nos corações de camundongos com cardiomiopatia diabética e em células H9c2. (A) Diagrama de Venn mostrando a sobreposição entre proteínas associadas à DCM e proteínas associadas ao Lac-Phe previstas. (B) Seis proteínas sobrepostas associadas à DCM e ao Lac-Phe. (C) Rede de interação proteína-proteína mostrando HMGCR dentro da rede de proteínas associadas à DCM. (D,E) Imagens representativas de blotagens ocidentais de p-HMGCR e HMGCR em tecidos cardíacos dos grupos indicados (D) e quantificação da razão p-HMGCR/HMGCR (E); n = 3 por grupo. (F,G) Imagens representativas de blotagens ocidentais de p-HMGCR e HMGCR em células H9c2 dos grupos indicados (F) e quantificação da razão p-HMGCR/HMGCR (G); n = 3 por grupo. β-Tubulina foi utilizada como controle de carga. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. *P < 0,05. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Lac-Phe combinado com atorvastatina melhora o metabolismo lipídico em células H9c2

Para avaliar mais detalhadamente o efeito do Lac-Phe no metabolismo lipídico por meio da HMGCR, utilizamos a atorvastatina como controle. Experimentos in vitro mostraram que, sob condições de HG/PA, o tratamento combinado com Lac-Phe e atorvastatina produziu uma redução maior no acúmulo lipídico do que o tratamento com atorvastatina isoladamente. A coloração com LD540 e a quantificação da fluorescência demonstraram que o tratamento combinado com Lac-Phe e atorvastatina reduziu o acúmulo de gotículas lipídicas em células H9c2 (Figura 4A,B). A medição do conteúdo de TC mostrou um efeito semelhante (Figura 4C). A análise por Western blot mostrou que o tratamento combinado com Lac-Phe e atorvastatina aumentou significativamente a razão p-HMGCR/HMGCR (Figura 4D,E). Esses resultados indicam que o tratamento combinado com Lac-Phe e atorvastatina está associado à redução do acúmulo lipídico e dos níveis de TC, bem como ao aumento da fosforilação da HMGCR em células H9c2.

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Figura 4. Lac-Phe combinado com atorvastatina melhora o metabolismo lipídico em células H9c2. (A,B) Coloração representativa com LD540 em células H9c2 dos grupos tratados indicados (A) e quantificação da intensidade média de fluorescência do LD540 (B); n = 3 por grupo. Barra de escala = 200 μm. (C) Níveis de colesterol total (CT) em células H9c2 dos grupos tratados indicados; n = 3 por grupo. (D,E) Imagens representativas de western blot de p-HMGCR e HMGCR em células H9c2 dos grupos tratados indicados (D) e quantificação da razão p-HMGCR/HMGCR (E); n = 3 por grupo. β-Tubulina foi utilizada como controle de carga. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Lac-Phe aumenta a fosforilação de AMPKα1

Para explorar mais a fundo o mecanismo molecular pelo qual o Lac-Phe regula a HMGCR, reanalisamos os dados do transcriptoma cardíaco de camundongos. Por meio da análise KEGG dos dados transcriptômicos, identificamos 160 vias enriquecidas diferencialmente entre os grupos DCM e Controle e 89 vias enriquecidas diferencialmente entre os grupos DCM e DCM + Lac-Phe (Figura 5A). Sessenta vias apresentaram sobreposição entre essas duas comparações. Dentre essas 60 vias sobrepostas, selecionamos a via da AMPK. A AMPK desempenha um papel crítico na regulação do metabolismo lipídico na DCM31. Além disso, a AMPK está localizada a montante da HMGCR (Figura 5B). Formulamos a hipótese de que o Lac-Phe poderia regular a HMGCR por meio da modulação da AMPK, melhorando, em última instância, o metabolismo lipídico. Para testar essa hipótese, realizamos primeiramente o encaixe molecular entre a AMPKα1 e o Lac-Phe utilizando o CB-DOCK2. Os resultados do encaixe molecular mostraram que a melhor conformação de ligação prevista entre o Lac-Phe e a AMPKα1 apresentou uma afinidade de −7,6 kcal/mol (Figura 5C). Esses resultados sugerem uma possível interação entre o Lac-Phe e a AMPKα1, mas não comprovam o ligamento direto intracelular. Para determinar se o Lac-Phe afeta a via da AMPK na DCM, analisamos a fosforilação da AMPKα1 nos corações de camundongos com DCM. A análise por Western blot revelou que a razão p-AMPKα1/AMPKα1 estava reduzida nos corações de camundongos com DCM, enquanto o tratamento com Lac-Phe aumentou essa razão (Figura 5D,E). Experimentos in vitro mostraram que, sob condições de HG/PA, a razão p-AMPKα1/AMPKα1 estava reduzida em células H9c2, enquanto o tratamento com Lac-Phe aumentou essa razão (Figura 5F,G). Esses achados indicam que o Lac-Phe aumenta a fosforilação da AMPKα1 em corações de camundongos com DCM e em células H9c2 tratadas com HG/PA.

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Figura 5. Lac-Phe aumenta a fosforilação de AMPKα1 nos corações de camundongos com cardiomiopatia diabética e em células H9c2. (A) Diagrama de Venn mostrando a sobreposição entre os resultados de enriquecimento de vias para as comparações DCM/Controle e DCM + Lac-Phe/DCM. (B) Esquema ilustrando a fosforilação de AMPK e HMGCR e a inibição associada da síntese de colesterol. (C) Interação prevista de acoplamento molecular tridimensional entre Lac-Phe e AMPKα1; afinidade de ligação = −7,6 kcal/mol. (D,E) Imagens representativas de blotagens ocidentais de p-AMPKα1 e AMPKα1 em tecidos cardíacos dos grupos indicados (D) e quantificação da razão p-AMPKα1/AMPKα1 (E); n = 3 por grupo. (F,G) Imagens representativas de blotagens ocidentais de p-AMPKα1 e AMPKα1 em células H9c2 dos grupos indicados (F) e quantificação da razão p-AMPKα1/AMPKα1 (G); n = 3 por grupo. GAPDH foi utilizado como controle de carga. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. *P < 0,05, **P < 0,01. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

A inibição da AMPK atenua a fosforilação do HMGCR mediada por Lac-Phe e a melhora do metabolismo lipídico em células H9c2

Em seguida, adicionamos um inibidor da p-AMPK a células H9c2 submetidas ao tratamento com Lac-Phe. O inibidor da p-AMPK reduziu a razão p-AMPKα1/AMPKα1 (Figura 6A,B) e diminuiu a razão p-HMGCR/HMGCR (Figura 6C,D). Esses achados indicam que a inibição da fosforilação da AMPK é acompanhada por redução na fosforilação da HMGCR durante o tratamento com Lac-Phe. O inibidor da p-AMPK também diminuiu o efeito do Lac-Phe sobre o metabolismo lipídico. A coloração com LD540 e a quantificação da fluorescência mostraram aumento no acúmulo lipídico em células H9c2 tratadas com o inibidor da p-AMPK em comparação com células submetidas ao tratamento com Lac-Phe sem inibição da AMPK (Figura 6E,F). Os níveis de TC nas células H9c2 também aumentaram após a inibição da AMPK (Figura 6G). Conjuntamente, esses resultados sustentam a participação da sinalização AMPKα1/HMGCR nos efeitos do Lac-Phe sobre o metabolismo lipídico. O Lac-Phe aumentou a fosforilação da AMPKα1, o que esteve associado ao aumento da fosforilação da HMGCR e à redução do acúmulo lipídico e dos níveis de TC. A inibição da AMPK atenuou esses efeitos em células H9c2, corroborando a hipótese de que o Lac-Phe melhora o metabolismo lipídico por meio da regulação da via AMPKα1/HMGCR.

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Figura 6. A inibição da AMPK atenua os efeitos do Lac-Phe na fosforilação da HMGCR e no acúmulo lipídico em células H9c2. (A,B) Imagens representativas de blot ocidental de p-AMPKα1 e AMPKα1 em células H9c2 tratadas com HG/PA, Lac-Phe e/ou AMPK-IN-3 conforme indicado (A) e quantificação da razão p-AMPKα1/AMPKα1 (B); n = 3 por grupo. (C,D) Imagens representativas de blot ocidental de p-HMGCR e HMGCR em células H9c2 dos grupos de tratamento indicados (C) e quantificação da razão p-HMGCR/HMGCR (D); n = 3 por grupo. GAPDH e β-tubulina foram utilizadas como controles de carga em (A) e (C), respectivamente. (E,F) Coloração representativa com LD540 em células H9c2 dos grupos de tratamento indicados (E) e quantificação da intensidade média de fluorescência LD540 (F); n = 3 por grupo. Barra de escala = 200 μm. (G) Níveis de colesterol total (TC) em células H9c2 dos grupos de tratamento indicados; n = 3 por grupo. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Coletivamente, os achados dos experimentos in vivo e in vitro apoiam um mecanismo proposto no qual o Lac-Phe aumenta a fosforilação de AMPKα1 e HMGCR, o que está associado à redução dos níveis de colesterol e do acúmulo de lipídios, além de melhora da função cardíaca e do remodelamento patológico na DCM. O caminho proposto de AMPKα1/HMGCR que sustenta os efeitos do Lac-Phe é resumido esquematicamente na Figura 7.

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Figura 7. Mecanismo proposto pelo qual o Lac-Phe melhora o metabolismo lipídico na cardiomiopatia diabética por meio da via AMPK/HMGCR. Esquema ilustrando o mecanismo proposto pelo qual o Lac-Phe promove a fosforilação da AMPKα1, seguida pela fosforilação da HMGCR, o que está associado à redução do acúmulo de gotículas lipídicas e da lipotoxicidade na cardiomiopatia diabética. AMPK, proteína quinase ativada por AMP; HMGCR, redutase HMG-CoA; LD, gotícula lipídica. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Disponibilidade de Dados:

Os dados brutos que sustentam as descobertas deste estudo foram depositados no Zenodo e estão disponíveis publicamente em https://zenodo.org/records/21991371 

Discussão

Neste estudo, apresentamos evidências que apoiam um efeito terapêutico do Lac-Phe na MCD. O Lac-Phe melhorou o remodelamento cardíaco e a disfunção cardíaca na MCD, ao mesmo tempo em que reduziu a produção de colesterol em cardiomiócitos e atenuou o desequilíbrio do metabolismo lipídico. Mecanicamente, o Lac-Phe aumentou a fosforilação de AMPKα1. Posteriormente, o aumento da fosforilação de AMPKα1 esteve associado ao aumento da fosforilação e inibição de seu alvo downstream HMGCR, levando à redução da síntese de colesterol e, por fim, à melhora do desequilíbrio do metabolismo lipídico em cardiomiócitos. Em resumo, este estudo demonstra que o Lac-Phe melhora o metabolismo lipídico cardíaco na MCD por meio da via de sinalização AMPK/HMGCR. Um resumo esquemático dos principais achados e do mecanismo proposto é apresentado na Figura 7.

O desequilíbrio do metabolismo lipídico é um dos principais fatores que contribuem para a lesão miocárdica na miocardiopatia diabética (DCM)15. O acúmulo excessivo de lipídios em cardiomiócitos leva à lipotoxicidade, resultando em disfunção dos cardiomiócitos e remodelamento cardíaco patológico16. A hiperglicemia prolongada e a obesidade são fatores importantes que levam a distúrbios do metabolismo lipídico25. Lac-Phe demonstrou ser uma substância endógena capaz de reduzir efetivamente a ingestão alimentar, diminuir a obesidade e o peso corporal, além de melhorar a homeostase da glicose21. Relatos recentes também mostraram que Lac-Phe pode regular o metabolismo lipídico em micróglias/macrófagos durante lesão medular23, demonstrando que Lac-Phe pode modular o metabolismo lipídico em outro modelo de doença. Como um metabólito endógeno, o papel de Lac-Phe nas doenças metabólicas tem atraído grande interesse. No entanto, o papel de Lac-Phe na DCM ainda não foi plenamente investigado. Nosso estudo revelou um papel para Lac-Phe no metabolismo lipídico de cardiomiócitos na DCM. Por meio de análise transcriptômica, descobrimos que o tratamento com Lac-Phe estava associado a alterações em vias relacionadas ao metabolismo lipídico nos corações de camundongos com DCM. A coloração com Óleo Vermelho O e observações por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) confirmaram a redução do acúmulo lipídico nos corações de camundongos com DCM tratados com Lac-Phe. Esses achados sugerem que Lac-Phe exerce efeitos cardioprotetores na DCM ao reduzir o acúmulo lipídico cardíaco e atenuar o remodelamento patológico. Experimentos in vitro também demonstraram que a administração de Lac-Phe aliviou o acúmulo lipídico em células H9c2 expostas a condições de alta glicose/ácido palmítico (HG/PA).

A HMGCR é uma enzima dependente de NADPH e limitante da taxa na via do mevalonato30. A HMGCR catalisa a conversão de HMG-CoA em mevalonato, uma etapa crítica na biossíntese do colesterol30,31,32. A HMGCR representa um alvo terapêutico relevante para doenças cardiovasculares e miocardiopatia diabética (DCM)33. Clinicamente, a inibição da HMGCR é uma abordagem estabelecida para reduzir o risco cardiovascular34. Nossos dados experimentais demonstram que o Lac-Phe aumenta a fosforilação da HMGCR nos corações de camundongos com diabetes tipo 2, o que é compatível com a inibição da atividade da HMGCR e com a redução da síntese de colesterol. Estudos in vitro também mostraram que a administração de Lac-Phe aumentou a fosforilação da HMGCR em células H9c2 expostas a condições de alta glicose/ácido palmítico (HG/PA), acompanhada por níveis reduzidos de colesterol. A combinação de Lac-Phe com o medicamento redutor de colesterol anfinitastatina produziu efeitos ainda maiores do que a anfinitastatina isoladamente nas condições experimentais analisadas. Em células H9c2 tratadas com anfinitastatina, a adição de Lac-Phe aumentou a fosforilação da HMGCR e diminuiu o acúmulo de lipídios. Esses achados apoiam a viabilidade de modular a fosforilação da HMGCR por meio do Lac-Phe para reduzir a produção de colesterol e restaurar o equilíbrio do metabolismo lipídico na DCM. No entanto, se o Lac-Phe pode oferecer uma estratégia terapêutica segura e eficaz para pacientes com DCM requer investigação adicional.

AMPK, uma enzima-chave no metabolismo energético mitocondrial, é central no estudo de doenças metabólicas como o diabetes35,36. Por meio da regulação da fosforilação e desfosforilação, a AMPK desempenha um papel fundamental no metabolismo lipídico cardíaco. A AMPK fosforilada representa sua forma ativa37. A p-AMPK promove a entrada de ácidos graxos nas mitocôndrias para a oxidação de ácidos graxos (FAO) por meio da regulação da CPT-138. Em consonância com estudos anteriores39, nossos resultados mostraram que o aumento da fosforilação da AMPK estava associado ao aumento da fosforilação da HMGCR e à redução da síntese de colesterol. Em camundongos com miocardiopatia diabética (DCM) induzida por STZ e dieta rica em gordura (HFD), a hiperglicemia persistente pode levar a alterações nos níveis cardíacos de p-AMPK40. No estágio inicial do diabetes, quando a função cardíaca ainda não se alterou, os níveis cardíacos de p-AMPK podem permanecer inalterados10,37,41. No diabetes avançado, com hiperglicemia persistente por mais de 8 semanas, começa o remodelamento cardíaco patológico e os níveis de p-AMPK podem diminuir10. A manutenção da ativação da AMPK tem sido proposta como uma estratégia eficaz para prevenir a DCM10,42. A metformina, um medicamento amplamente utilizado no tratamento do diabetes tipo 2, demonstrou ativar a via da AMPK, mas tem sido relatada como tendo efeito neutro sobre o coração43,44. Curiosamente, tanto a administração aguda quanto a crônica de metformina podem aumentar os níveis de Lac-Phe22. Essas observações levantam a possibilidade de que o Lac-Phe possa contribuir para a sinalização metabólica associada à ativação da AMPK; no entanto, o presente estudo não estabelece que o Lac-Phe exógeno produza um efeito mais específico ou seguro do que a metformina.

Em nosso estudo, a fosforilação de AMPKα1 foi acentuadamente reduzida no modelo de DCM em estágio avançado, conforme mostrado nas Figuras 5D,E, um achado consistente com pesquisas anteriores42. A análise transcriptômica revelou alterações envolvendo a via AMPK nos corações de camundongos diabéticos tipo 2 tratados com Lac-Phe, e a análise por western blot mostrou aumento da fosforilação de AMPKα1 após o tratamento com Lac-Phe. A ancoragem molecular sugeriu uma possível interação entre Lac-Phe e AMPKα1, o que é consistente com um estudo recente23. É importante ressaltar que a ancoragem molecular isoladamente não comprova a ligação intracelular direta entre Lac-Phe e AMPKα1. Experimentos in vitro mostraram que o tratamento com o inibidor de AMPK suprimiu a fosforilação de AMPKα1 e foi acompanhado pela redução da fosforilação de HMGCR. Após a adição do inibidor de AMPK, os efeitos do Lac-Phe foram atenuados, coincidindo com o aumento do acúmulo lipídico e do teor de colesterol em células H9c2. Em conjunto, esses resultados sustentam a participação da sinalização AMPKα1/HMGCR nos efeitos do Lac-Phe sobre o metabolismo lipídico. Lac-Phe aumentou a fosforilação de AMPKα1, o que esteve associado ao aumento da fosforilação de HMGCR, redução dos níveis de colesterol e diminuição do acúmulo lipídico; a inibição de AMPK atenuou esses efeitos.

Há várias limitações neste estudo. Primeiro, todos os experimentos com animais foram realizados em camundongos machos. Embora tenhamos demonstrado o efeito terapêutico do Lac-Phe na miocardiopatia dilatada (DCM) em camundongos C57BL/6J machos, o sexo é um fator importante que influencia as doenças cardiovasculares45. Portanto, permanece desconhecido se o Lac-Phe exerce os mesmos efeitos em camundongos fêmeas. Segundo, o sequenciamento do transcriptoma foi realizado em amostras de coração inteiro, o que pode ter mascarado alterações específicas de tipo celular no coração após o tratamento com Lac-Phe. O sequenciamento de célula única poderia fornecer uma compreensão mais profunda da heterogeneidade celular e molecular subjacente aos efeitos observados46,47 e representa uma abordagem alternativa para investigar mais a fundo essa hipótese. Por fim, devido às limitações do equipamento de ultrassom utilizado neste estudo, não foi possível avaliar a função diastólica cardíaca em camundongos. Estudos adicionais são, portanto, necessários para esclarecer os efeitos terapêuticos do Lac-Phe na DCM, avaliar possíveis efeitos dependentes do sexo, investigar respostas específicas por tipo celular, analisar a função diastólica e elucidar mais completamente os mecanismos subjacentes aos efeitos observados. Em resumo, este estudo fornece evidências que apoiam o Lac-Phe como um possível metabólito endógeno de interesse para o tratamento da DCM. Além disso, nossos achados sustentam um mecanismo proposto pelo qual o Lac-Phe reduz o acúmulo de lipídios em cardiomiócitos durante a DCM por meio da via AMPKα1/HMGCR. Especificamente, o Lac-Phe aumentou a fosforilação de AMPKα1, que esteve associada ao aumento da fosforilação de HMGCR, redução da síntese de colesterol e do acúmulo de lipídios, e melhora do remodelamento patológico. São necessárias investigações adicionais para estabelecer a interação molecular entre Lac-Phe e AMPKα1 e para determinar as possíveis aplicações translacionais desses achados.

Divulgações

Conflito de Interesse:

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Gostaríamos de expressar nossa sincera gratidão aos pesquisadores e funcionários do Hospital Clínico Colégio Nanjing Drum Tower e do Hospital Afiliado da Escola de Medicina da Universidade de Nanjing, pelo apoio técnico. Esta pesquisa foi financiada por concessões da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Números de concessão 81870291 e 82300384), da Fundação Chinesa de Ciências Pós-Doutorais (Número de concessão 2023M731625) e da Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (Número de concessão BK20220175). Agradecemos também os recursos e o apoio colaborativo fornecidos pelo Instituto de Síntese Avançada da Universidade de Tecnologia de Nanjing.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AMPK-IN-3 (inibidor da p-AMPK)MedChemExpress (MCE)HY-132921Utilizado em 10 μM durante experimentos de inibição de AMPK para inibir a sinalização de AMPK em células tratadas com Lac-Phe.
Kit de Ensaios Amplex Red para Colesterol e Éster de ColesterolBeyotimeS0211SUtilizado para determinar os níveis totais de colesterol em amostras de soro e células H9c2.
Anti-AMPKα1Cell Signaling Technology2532; RRID: AB_330331Anticorpo primário utilizado para análise por western blot de AMPKα1.
Anti-GAPDHCell Signaling Technology5174; RRID: AB_10622025Anticorpo primário utilizado para análise por western blot de GAPDH.
Anti-HMGCRAbcamab174830; RRID: AB_2749818Anticorpo primário utilizado para análise por western blot de HMGCR.
Anti-p-AMPKα1 (Thr172)Cell Signaling Technology2535; RRID: AB_331250Anticorpo primário utilizado para análise por western blot de AMPK fosforiladaα1.
Anti-p-HMGCR (Ser872)Abcamab124350Anticorpo primário utilizado para análise por western blot de HMGCR fosforilada.
anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado à HRPCell Signaling Technology7074; RRID: AB_2099233Utilizado em diluição de 1:5.000 para detecção em blot de Western.
Anti-β-tubulinaCell Signaling Technology2128; RRID: AB_823664Anticorpo primário utilizado para análise por western blot de β-tubulina
AtorvastatinaMedChemExpress (MCE)HY-17379Utilizado isoladamente ou em combinação com Lac-Phe para avaliar os efeitos sobre o acúmulo de lipídios, níveis totais de colesterol e fosforilação de HMGCR em células H9c2 tratadas com HG/PA.
Albumina sérica bovinaSigma-AldrichA7906Utilizado a 5% para bloquear a ligação inespecífica durante a análise por western blot.
reagente/kits de ensaio de BradfordThermo Fisher Scientific23200Utilizado para determinar a concentração de proteína antes da análise por western blot.
Camundongos C57BL/6J (5 semanas de idade, machos)Centro de Pesquisa com Animais Modelo da Universidade de NanquimN/AUtilizado para estabelecer o modelo murino de cardiomiopatia diabética induzida por dieta rica em gordura (HFD) e estreptozotocina (STZ).
Kit de Contagem de Células-8 (CCK-8)SharebioSB-CCK8SUtilizado para medir a viabilidade de células H9c2 após o tratamento.
Tampão citratoPreparado internamenteN/APreparado em pH 4,5 e utilizado para dissolver STZ e como controle veicular correspondente.
Dieta controle (10% gordura, 20% proteína, 70% carboidrato)Research Diets, Inc.D12450JUtilizado como dieta para os camundongos do grupo controle.
D-(+)-GlicoseSigma-AldrichN/AUtilizado para o tratamento de células HG/PA e para o teste de tolerância à glicose oral.
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Utilizado como solvente para o AMPK-IN-3 e como controle veicular correspondente.
Dulbecco’s modificado de Eagle’meio sGibco, Thermo Fisher Scientific11965092Utilizado como meio de cultura basal para células H9c2.
Máquina de ecocardiografia com transdutor de 40 MHzFUJIFILM VisualSonicsVevo 3100 LT; transdutor de 40 MHzUtilizado para medir as dimensões do ventrículo esquerdo e a velocidade do fluxo sanguíneo na válvula mitral e para derivar a FEVE e a SS.
Fixador para microscopia eletrônicaServiceBioG1102Utilizado para fixar tecido cardíaco fresco de camundongo para microscopia eletrônica de transmissão.
EtanolSigma-AldrichE7023Utilizado em concentrações progressivamente crescentes para desidratação durante o preparo de amostras para microscopia eletrônica de transmissão.
soro bovino fetalGibco, Thermo Fisher Scientific10099141Utilizado a 10% para suplementar o meio de cultura de células H9c2.
Linha celular H9c2SunncellRRID: CVCL_0286Utilizado como modelo celular cardíaco in vitro para experimentos de tratamento com HG/PA e Lac-Phe.
Coloração com hematoxilina e eosinaServiceBioG1005-1/2Utilizado para avaliação histológica de tecido cardíaco.
Dieta rica em gordura (60% de kcal provenientes de gordura)Research Diets, Inc.D12492Utilizado com STZ em baixa dose para estabelecer o modelo de camundongo de cardiomiopatia diabética.
Microscópio de campo claro de alta resoluçãoLeicaDM2500Utilizado para a imagem de lâmina inteira de tecido cardíaco corado em 20× ampliação
ImageJInstitutos Nacionais de SaúdeN/AUtilizado para a quantificação densitométrica dos resultados de western blot.
IsofluranoSigma-Aldrich792632Utilizado para anestesia durante ecocardiografia em camundongos.
álcool isopropílicoSigma-AldrichI9516Utilizado a 60% durante a coloração com Óleo Vermelho O de cortes cardíacos congelados.
Corante lipídico LD540BeyotimeC2050S-1Utilizado em 10 μM para corar lipídios intracelulares.
Masson’coloração com tricrômio de MassonServiceBioG1006Utilizado para coloração histológica de tecido cardíaco.
N-lactoil-fenilalanina (Lac-Phe)MedChemExpress (MCE)HY-146098Administrado a camundongos com miocardiopatia dilatada e utilizado para tratar células H9c2 expostas a glicose alta/ácido palmítico.
Solução de trabalho de Óleo Vermelho OServiceBioG1015-100MLUtilizado para corar lipídios em cortes congelados de tecido cardíaco.
Kit Omni-ECL de Quimioluminescência EficienteEpiZymeSQ203LUtilizado para a visualização quimioluminescente de bandas proteicas após o western blot.
Ácido palmíticoSigma-AldrichP0500Utilizado a 0,25 mM com glicose alta para estabelecer o modelo de células H9c2 tratadas com HG/PA.
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148Preparado como uma solução a 4% e utilizado para fixar tecido cardíaco e células antes de coloração histológica ou de lipídios.
Penicilina-estreptomicinaGibco, Thermo Fisher Scientific15140122Utilizado a 1% no meio de cultura de células H9c2.
Salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10010023Utilizado para lavagem durante procedimentos de coloração e como veículo correspondente em experimentos de tratamento celular.
PrismGraphPad SoftwareVersão 8.0Utilizado para análise estatística de dados experimentais.
membrana de transferência de PVDF, 0.45 μmThermo Fisher Scientific88518Utilizado para a transferência eletroforética de proteínas durante a análise de western blot.
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Utilizado para o isolamento/purificação de RNA total de tecido cardíaco de camundongo.
Solução de cloreto de sódio, 0,9% (soro fisiológico)Sigma-AldrichS8776Utilizado para dissolver Lac-Phe e como controle do veículo para camundongos Controle e DCM.
SPSSIBMVersão 20.0Utilizado para análise estatística de dados experimentais.
Streptozotocina (STZ)Sigma-AldrichS0130Administrado com dieta rica em gordura (HFD) para estabelecer o modelo de camundongo de cardiomiopatia diabética.
Tampão TBS Tween-20 (20×)Thermo Fisher Scientific28360Utilizado para lavar membranas após a incubação com anticorpos primário e secundário durante a análise de western blot.
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583Utilizado para embutir tecido cardíaco antes do preparo de cortes congelados para coloração com Óleo Vermelho O.
Microscópio eletrônico de transmissãoHITACHIHT7800Utilizado para examinar alterações ultraestruturais no tecido cardíaco de camundongos.
Reagente TRIzolInvitrogen15596026Utilizado para o isolamento de RNA total de tecido cardíaco de camundongo.
Kit VAHTS Universal V10 de Preparação de Biblioteca para RNA-seqVazymeNR616-01Utilizado para preparar bibliotecas de RNA-seq para análise transcriptômica.
Lectina de germe de trigo (WGA)ServiceBioW7024Utilizado para avaliação histológica de tecido cardíaco.

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