Artigo de método

Medindo a Reparo de Quebras Dupla-Fita do DNA Utilizando o Ensaio DR-white em Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/72635

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14 de agosto de 2026

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

Neste artigo

Resumo

O ensaio DR-white é um ensaio genético versátil com repórter para detectar os resultados da reparação de quebras de dupla fita no DNA no organismo multicelular Drosophila melanogaster.

Resumo

Estudos tradicionais sobre reparo de quebras duplas na fita de DNA (DSB) frequentemente se limitam a investigações bioquímicas ou sistemas unicelulares (por exemplo, células, leveduras). Para facilitar estudos sobre reparo de DSB em um organismo multicelular, utilizamos o ensaio DR-white em Drosophila melanogaster. O ensaio DR-white é um ensaio repórter simples, porém versátil, para reparo de DSB, que contém uma única sequência de reconhecimento I-SceI, a qual pode ser clivada pela expressão da meganuclease I-SceI. A expressão de I-SceI pode ser induzida constitutivamente, por choque térmico ou por meio de outros promotores, permitindo investigações sobre reparo específicos de tecido ou de desenvolvimento. Uma vantagem principal do ensaio é a capacidade de distinguir os resultados do reparo envolvendo recombinação homóloga (HR), junção de extremidades não homólogas (NHEJ) e emparelhamento de fita simples (SSA). Este artigo fornece um protocolo detalhado para o ensaio DR-white já estabelecido, incluindo um fluxo de trabalho passo a passo para induzir DSBs na linhagem germinativa pré-meiótica e analisar fenotipicamente os eventos de reparo por meio da contagem da prole. Também descreve a análise molecular dos eventos de reparo por reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento e o script R Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). Este protocolo fornece uma ferramenta útil para investigar os mecanismos genéticos e moleculares do reparo do DNA em um modelo de organismo.

Introdução

A integridade genômica é frequentemente comprometida por lesões no DNA, dentre as quais as quebras de dupla fita (DSBs) são particularmente tóxicas. Se não forem reparadas, essas quebras podem levar à perda genética, rearranjos cromossômicos e morte celular.1. Assim, as células desenvolveram múltiplos mecanismos para reparar quebras de dupla fita (DSBs). A junção não homóloga de extremidades (NHEJ) liga diretamente as duas extremidades da DSB, podendo introduzir inserções ou deleções (indels) no local da quebra; fita simples a recombinação por sequências complementares (SSA) explora sequências complementares adjacentes ao local da quebra para reparo, resultando em deleções no local da quebra; enquanto a recombinação homóloga (HR) utiliza uma sequência homóloga como molde para o reparo2,3.

Historicamente, os estudos sobre reparo de quebras de dupla fita (DSB) foram limitados a ensaios bioquímicos4 ou sistemas unicelulares, como bactérias5,6, leveduras7,8 e culturas de células de mamíferos9,10. Embora esses modelos tenham sido fundamentais para identificar as proteínas centrais do reparo e seus mecanismos, eles carecem da complexidade biológica de um organismo multicelular. Drosophila melanogaster tornou-se um sistema modelo multicelular amplamente utilizado para o estudo da reparação do DNA. No entanto, muitos ensaios atuais são adaptados para vias de reparo específicas11; utilizam grandes aberrações cromossômicas, como a excisão de elementos P12; ou exigem análises moleculares demoradas13. O ensaio DR-white supera esses desafios ao fornecer um repórter genético simples para a reparação do DNA em Drosophila14. Este estudo apresenta um fluxo de trabalho completo, prático e detalhado, passo a passo, para realizar ensaios genéticos e moleculares destinados a medir o reparo de DSBs no DNA utilizando o bem estabelecido ensaio DR-white.

O ensaio utiliza duas repetições diretas do gene Drosophila white (w), que confere a cor vermelha selvagem dos olhos (Figura 1). Ambas as cópias são não funcionais: a primeira, Sce.white, contém uma inserção que carrega a sequência de reconhecimento da meganuclease I-SceI em um sítio SacI selvagem e introduz um códon de parada prematuro; a segunda, iwhite, está truncada nas extremidades 5’ e 3’ e serve como molde para reparo por recombinação homóloga (HR). Um transgene Drosophila yellow (y+), que confere a cor marrom selvagem do corpo, está presente entre as duas repetições de white. Como o cassete DR-white está integrado em um background mutante y w, as moscas DR-white são fenotipicamente selvagens quanto à coloração marrom do corpo e mutantes quanto à cor branca dos olhos.

As quebras de dupla fita (DSBs) podem ser induzidas em Sce.white cruzando moscas DR-white com moscas que carregam um transgene I-SceI. A reparação de DSBs na linhagem germinativa pré-meiótica pode ser medida por meio da análise da prole de um cruzamento-teste. A reparação por NHEJ resulta no fenótipo parental de corpo marrom e olhos brancos (Figura 1A), enquanto a reparação por HR restaura a sequência selvagem de white e produz descendentes com corpo marrom e olhos vermelhos (Figura 1B). A reparação por SSA da DSB ou uma troca mitótica resulta na perda do transgene yellow intercalado, gerando moscas com corpo amarelo e olhos brancos (Figura 1C). Para analisar os resultados da reparação em células somáticas, adaptamos o algoritmo Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) para detectar especificamente reparação por NHEJ com processamento e reparação por HR no ensaio DR-white15,16.

O ensaio DR-white oferece diversas vantagens em comparação com ensaios de reparo de DNA previamente estabelecidos em Drosophila. Como as quebras são geradas e reparadas na linhagem germinativa, os resultados do reparo podem ser detectados facilmente por meio de análise fenotípica. Ao mesmo tempo, o ensaio é extremamente versátil. Embora tenha sido projetado principalmente para medir o reparo por RH, ele pode detectar as três vias de reparo. Também desenvolvemos dois modelos de reparo funcionais adicionais (Figura 2). O modelo iwhite.mu contém 28 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) silenciosos e também produz descendentes com olhos vermelhos (Figura 2A), facilitando estudos sobre os comprimentos dos segmentos de conversão gênica (GCT) e o reparo por RH entre sequências divergentes14. O modelo iwhiteΔ9 contém uma deleção de nove pares de bases no sítio SacI do tipo selvagem e resulta em descendentes com olhos laranja (Figura 2B). Esse recurso permite aos pesquisadores acompanhar o reparo por RH a partir de modelos distintos, uma característica exclusiva do ensaio DR-white15.

Protocolo

1. Ensaio DR-white

  1. Cruzamentos genéticos (Figura 3A)
    NOTA: Para protocolos padrão de cultivo e genética de Drosophila, consulte "Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics" por Ralph J. Greenspan17. As informações sobre genótipos das linhagens estão fornecidas na Tabela de Materiais.
    1. Mantenha as moscas a 25 °C com ciclos de 12 h luz/escuro em alimento padrão para Drosophila, polvilhado com levedura ativa.
    2. Monte cinco frascos para choque térmico cruzando 8–10 fêmeas virgens DR-white com 3–5 machos portadores de um transgene I-SceI (Cruzamento 1, Figura 3A) por frasco.
      NOTA: Diferentes transgenes I-SceI podem ser utilizados dependendo da aplicação. Neste protocolo, o transgene hsp70-I-SceI foi utilizado para indução por choque térmico11. Para evitar expressão vazia de I-SceI em gerações anteriores, é importante garantir que os transgenes DR-white e I-SceI sejam combinados na mesma mosca apenas nesta geração.
    3. No mesmo dia, monte frascos de ampliação de uma linhagem y w. Estas serão as moscas-teste. Três frascos de ampliação são suficientes para aproximadamente 60–80 cruzamentos-teste.
    4. Cultive os frascos de choque térmico e os frascos de ampliação y w a 25 °C por 3 dias.
    5. No terceiro dia, transfira os frascos de choque térmico e os frascos de ampliação y w para alimento fresco para servir como conjunto reserva.
  2. Choque térmico/indução de quebras de dupla fita (DSB)
    NOTA: Se não estiver utilizando um transgene I-SceI induzível por choque térmico, pule para a etapa 1.2.5, que geralmente é realizada 3 dias após a etapa 1.1.5.
    1. Envelheça os frascos de choque térmico por 3 h a 25 °C para garantir que toda a prole tenha passado pela transição materno-zigótica.
    2. Submeta os frascos originais a choque térmico em banho-maria a 38 °C por 1 h. Certifique-se de que o nível da água esteja pelo menos na altura da base da bola de algodão para que as larvas não subam acima da linha d’água.
    3. Monitore a temperatura do banho-maria a cada 15 min e mantenha-a dentro de 38 ± 0,5 °C, pois os resultados de indução e reparo dependem da duração e da temperatura do choque térmico.
    4. Retorne os frascos a 25 °C.
    5. No dia seguinte, adicione 1/3 de um papel toalha de laboratório dobrado ao alimento para absorver o excesso de umidade. Se o alimento estiver seco, adicione aproximadamente 100 µL de água ao papel toalha. Adicione uma bola de algodão aos frascos de ampliação y w.
    6. Cultive os frascos submetidos ao choque térmico por mais 6 dias a 25 °C, ou até que as moscas comecem a emergir.
    7. Descarte os frascos reserva e os frascos de ampliação 3 dias após a transferência. Adicione uma bola de algodão aos frascos de ampliação y w reserva aproximadamente 4 dias após o descarte.
      NOTA: Se necessário, os frascos reserva podem ser submetidos ao choque térmico conforme as etapas 1.2.1 a 1.2.6 e processados conforme descrito abaixo.
  3. Cruzamentos-teste
    1. Colete moscas submetidas ao choque térmico portadoras dos transgenes DR-white e I-SceI durante 4–5 dias após o início da emergência para reduzir o viés de estágio de desenvolvimento.
      NOTA: Moscas submetidas com sucesso ao choque térmico portadoras dos transgenes DR-white e I-SceI apresentam olhos em mosaico devido a eventos de reparo embrionários e larvais que se desenvolveram em tecidos adultos. O grau de mosaicismo nem sempre está correlacionado com eventos de reparo na linhagem germinativa e, portanto, não deve ser um fator determinante na seleção de moscas experimentais para cruzamentos-teste (etapa 1.3.3).
    2. Colete fêmeas virgens y w durante 5 dias. Colete 5 fêmeas virgens por número esperado de amostras. Colete dos frascos de ampliação reserva assim que começarem a emergir.
    3. Monte os frascos-teste cruzando um macho submetido ao choque térmico com 4–5 fêmeas virgens y w (Cruzamento 2; Figura 3A). Selecione machos aleatoriamente a partir do conjunto coletado na etapa 1.3.1 para reduzir o viés de estágio de desenvolvimento. Cultive os cruzamentos-teste a 25 °C.
      NOTA: Para evitar a ocorrência de crossing over entre DR-white e I-SceI, geralmente analisa-se a linhagem germinativa de machos; no entanto, a prole fêmea também pode ser analisada. Se a prole fêmea for analisada, os frascos-teste do Cruzamento 2 são montados na proporção de 2 fêmeas:5 machos y w e cultivados por 5–6 dias (próxima etapa) para garantir produtividade.
    4. Verifique a produtividade 4 dias após montar os frascos-teste para avaliar quando devem ser descartados.
      NOTA: Confirme que foram postos ovos suficientes para garantir pelo menos 20 descendentes analisáveis, mas evite o supercrescimento das culturas, pois as moscas podem ficar presas no alimento.
    5. Quando os frascos-teste estiverem prontos (até 4–5 dias após o estabelecimento dos cruzamentos-teste), descarte as moscas e adicione 1/3 de um papel toalha de laboratório dobrado ao alimento para absorver o excesso de umidade.
      NOTA: Os machos podem ser coletados neste momento se análises adicionais (por exemplo, genotipagem molecular) forem necessárias.
    6. Cultive os frascos-teste por mais 5–6 dias a 25 °C.
  4. Análise fenotípica
    NOTA: Aproximadamente 25 frascos-teste são montados para cada condição em cada experimento genético (por exemplo, mutantes homozigotos e controles heterozigotos). Cada experimento genético é repetido 2–3 vezes, e os dados individuais de cada frasco são agrupados.
    1. Analise a prole do Cruzamento 2 (Figura 3A) por aproximadamente 9 dias após o início da emergência das primeiras moscas.
    2. Anestesie as moscas usando CO2 ou transferindo-as para um frasco vazio sem alimento e congelando a -20 °C por pelo menos 30 min.
      NOTA: Se as moscas forem congeladas, podem ser analisadas até vários dias depois.
    3. Coloque as moscas em uma placa para moscas e analise os fenótipos apropriados (Figura 3A). Inclua apenas frascos com pelo menos 20 moscas analisadas no conjunto de dados.
      1. Para análise, primeiro separe as moscas portadoras do cassete DR-white (utilizando fluorescência positiva para proteína fluorescente vermelha [RFP+] como marcador), depois analise a cor dos olhos e do corpo.
      2. O transgene y+ ligado ao cassete DR-white resulta em uma cor marrom intermediária do corpo que não é totalmente selvagem. Para distinguir entre ausência de DSB/NHEJ (corpo marrom; y+ w-) e SSA (corpo amarelo; y- w-), compare as moscas com a prole y w que não possui o cromossomo DR-white (RFP-). Eventos de SSA terão a mesma coloração amarela dessas moscas. Classifique como ausência de DSB/NHEJ as moscas mais escuras (mais marrons) do que essas.
        NOTA: Desvios dos fenótipos descritos na Figura 3A podem indicar contaminação, e o frasco não deve ser analisado. Embora moscas mortas inteiras possam ser analisadas, moscas danificadas devem ser descartadas se os fenótipos não puderem ser determinados.

2. Análise TIDE (Figura 4)

  1. Extração de DNA genômico (gDNA)18
    1. Coletar moscas (ou larvas) submetidas ao choque térmico que carreguem ambos os DR-branco e I-SceI transgénio, como na prole do Cruzamento 1 (Figura 3A).
    2. Coloque moscas individuais em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e congele rapidamente (por exemplo, em banho de gelo seco/etanol ou nitrogênio líquido).
      ATENÇÃO: Manipule gelo seco, nitrogênio líquido, etanol, isopropanol e outros produtos químicos utilizando equipamentos de proteção individual apropriados e seguindo os procedimentos de segurança institucionais.
      PONTO DE PAUSA:  As amostras podem ser armazenadas a -80 °C e processadas posteriormente, se necessário. Se estiver analisando moscas ou larvas, utilize uma única mosca ou larva por amostra. Se estiver analisando tecidos menores (por exemplo, cérebros, discos imaginais), reúna várias amostras para aumentar o rendimento de DNA.
    3. Homogeneíze cada amostra em 50 µL do Tampão A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM ácido etilenodiaminotetraacético [EDTA]; 100 mM cloreto de sódio; 0,5% dodecilsulfato de sódio [SDS]) utilizando um homogeneizador elétrico.
    4. Incubar as amostras em banho-maria a 65 °C por 30 min.
    5. Adicione 100 µL do Tampão B (1,4 M acetato de potássio, 4,3 M cloreto de lítio) a cada amostra e misture brevemente invertendo os tubos.
      OBSERVAÇÃO: Se estiverem sendo utilizadas moscas inteiras, podem ser necessários volumes maiores para homogeneizar completamente as amostras. Nesse caso, mantenha uma proporção volumétrica de 1:2 Tampão A:Tampão B.
    6. Incube as amostras no gelo por pelo menos 30 min.
    7. Centrifugue as amostras a aproximadamente 16.000 x g por 15 min a 4 °C.
    8. Transfira 125 µL do sobrenadante clarificado para novos tubos microcentrífugos de 1,5 mL. Evite qualquer precipitado.
    9. Adicione 100 µL de isopropanol a 100% e temperatura ambiente por 125 µL de sobrenadante e misture brevemente invertendo os tubos.
    10. Centrifugue as amostras a aproximadamente 16.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.
    11. Aspire o sobrenadante, tendo cuidado para não perturbar o pellet de DNA.
      OBSERVAÇÃO: O pellet de DNA pode não ser visível nesta etapa. Anote a orientação dos tubos ao colocá-los na microcentrífuga e aspire na face oposta àquela onde o pellet seria esperado.
    12. Lave os pellets com 250 µL de etanol a 70% gelado, misturando brevemente mediante inversão suave dos tubos.
    13. Centrifugue as amostras a aproximadamente 16.000 x g por 5 min a 4 °C.
    14. Aspire o sobrenadante, tendo cuidado para não perturbar o pellet.
      OBSERVAÇÃO: O pellet pode ficar mais visível após a lavagem com etanol. Caso contrário, consulte Observação para a Etapa 2.1.11.
    15. Deixe os tubos destampados à temperatura ambiente para evaporar qualquer etanol remanescente. Evite a secagem excessiva do pellet, pois ele pode não se reconstituir completamente.
    16. Adicione 20 µL de água livre de nucleases e deixe os pellets reconstituírem durante a noite a 4 °C.
      PONTO DE PAUSA: Se o pellet de DNA não tiver se dissolvido completamente, pode-se adicionar água adicional.
    17. No dia seguinte, inverta suavemente os tubos e meça a concentração de DNA. Armazene as amostras a -20 °C se não forem processadas imediatamente.
      OBSERVAÇÃO: Para a extração de uma única mosca, os rendimentos são tipicamente de aproximadamente 100 ng/µL. Amostras de alta qualidade são importantes. A260/A280 a absorbância deve estar entre 1,7 e 2,0. Valores fora dessa faixa sugerem contaminantes, como proteínas. A260/A230 deve estar entre 2,0 e 2,2. Valores fora dessa faixa indicam contaminantes, como etanol e sais do tampão. Amostras com rendimento mais baixo e baixa qualidade podem resultar em amplificação PCR insatisfatória.
  2. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
    1. Amplificar em todo o trecho Sce.white por PCR usando 100 ng de DNAg e os iniciadores DR-branco_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) e DR-branco_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) seguindo as instruções do fabricante. Inclua um DR-branco controle de amostra de drosófila (ou seja, DR-branco estoque parental, sem I-SceI transgene presente). Utilize as seguintes condições de ciclagem: 94 °C por 3 min; {94 °C por 30 s; touchdown a 66 °C (-0,5 °C/ciclo) por 30 s; 72 °C por 30 s} x 16 ciclos; {94 °C por 30 s; 58 °C por 30 s; 72 °C por 30 s} x 20 ciclos; 72 °C por 5 min; mantido a 12 °C.
      OBSERVAÇÃO: Se utilizar um reagente diferente, as condições de ciclagem podem precisar ser ajustadas.
    2. Rode aproximadamente 2 µL do produto de PCR em um gel diagnóstico de agarose a 1% em tampão tris-acetato-EDTA (TAE) para confirmar a amplificação de Sce.brancoO tamanho esperado do amplicon é aproximadamente 1,7 kb.
    3. purificação por PCR Sce.white amplicons e medir a concentração de DNA.
    4. Sequenciar o produto PCR purificado usando a iniciadora DR-branco_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      OBSERVAÇÃO: Normalmente sequenciamos 40 ng de produto de PCR purificado, mas isso pode variar conforme as instruções do serviço de sequenciamento.
  3. Análise TIDE
    OBSERVAÇÃO: A maioria dos erros resultantes do uso do script R do TIDE pode ser atribuída à formatação incorreta do código.
    1. Baixe os pacotes R necessários (ou seja, sangerseqR e Biostrings) do Bioconductor.org. Utilize a barra de pesquisa para localizar a versão mais recente de cada pacote.
    2. Analise os cromatogramas de sequência para garantir que sejam de boa qualidade. Analise apenas cromatogramas com pouco ou nenhum fundo precedendo o sítio de quebra.
    3. Baixe os arquivos de sequência de eletroferograma (com extensão .ab1) e coloque todos os arquivos em uma única pasta no computador. Simplifique ao máximo os nomes dos arquivos de sequência (por exemplo, F1, Het2, Hom3) para facilitar as edições de script nos passos seguintes.
    4. Abra o script R do TIDEArquivo Suplementar 1) no ambiente de desenvolvimento integrado do RStudio (IDE; consulte o Tabela de Materiais). No painel Fonte, localize a linha que começa com Control <- (Arquivo Suplementar 2A) e digite o nome do arquivo de sequência controle exatamente como foi salvo, incluindo a extensão .ab1, entre aspas.
      OBSERVAÇÃO: A "sequência controle" é a sequência da PCR do DR parentalbranco estoque sem I-SceI transgene ou indução
    5. Localize a linha que começa com samplename <- c( e insira o nome de arquivo de cada sequência de amostra dentro dos parênteses (Arquivo Suplementar 2A). Inclua a extensão .ab1, coloque cada nome de arquivo entre aspas separadas e separe os nomes de arquivos com vírgulas.
    6. Salve o arquivo editado do script TIDE R na mesma pasta das sequências a serem analisadas. Mantenha o nome do arquivo simples para evitar erros nas etapas seguintes.
    7. No IDE, navegue até a pasta TIDE usando a guia Arquivos no painel de Saída (Arquivo Suplementar 2B).
    8. Clique no Mais menu suspenso e selecione Abrir Novo Terminal Aqui (Arquivo Suplementar 2C). Um novo terminal será aberto no painel do Console (inferior esquerdo).
    9. No terminal recém-aberto, digite “R” e pressione Entrar (Arquivo Suplementar 2D).
    10. Uma vez que o R esteja em execução no terminal, execute o script TIDE R digitando source("TIDE_analysis.R") e pressione Entrar (Arquivo Suplementar 2E). O terminal executará o script e produzirá uma representação gráfica (Arquivo Suplementar 2F) e um arquivo .csv contendo os dados brutos de cada amostra (Arquivo Suplementar 2G e Arquivo Suplementar 3). Os arquivos de saída são salvos na mesma pasta do script R e dos arquivos de sequência.
      OBSERVAÇÃO: Se o mesmo script R for executado novamente, quaisquer novos arquivos .csv gerados sobrescreverão os anteriores. Se forem realizadas múltiplas análises nos mesmos arquivos, faça uma cópia da pasta.
    11. Analise os dados abrindo cada arquivo .csv.
      1. Interprete os dados brutos como proporções de inserções e deleções (indels) na sequência da amostra. A conversão gênica por recombinação homóloga da sequência de reconhecimento I-SceI para a sequência selvagem SacI produz a deleção canônica de 23 pb; o script relata esse valor de RH em uma linha separada na parte inferior da saídaArquivo Suplementar 2G). O valor de 0-indel representa ausência de quebra dupla da fita (DSB) ou reparo por NHEJ sem indels. Some todos os demais valores de indel para obter o NHEJ com processamento. A soma do NHEJ com processamento e do reparo por HR corresponde ao número total de eventos de reparo de DSB detectáveis.
      2. Calcule as proporções das vias de reparo entre os eventos de reparo de quebras de dupla fita (DSB) detectáveis utilizando as seguintes equações:
        Proporção de NHEJ com processamento = (NHEJ com processamento) / (NHEJ com processamento + RH)
        Proporção de RH = (RH) / (NHEJ com processamento + RH)
        OBSERVAÇÃO: Aproximadamente 10–15 amostras são utilizadas para cada condição em cada experimento genético (por exemplo, mutantes homozigóticos e controles heterozigóticos). Cada experimento genético é repetido 2–3 vezes, e os dados individuais são agrupados.

Resultados

Requisito de Rad51 em Drosophila para reparo por recombinação homóloga

Experimentos bem-sucedidos na linhagem germinativa produzem as classes fenotípicas esperadas mostradas na Figura 3A e pelo menos 20 descendentes analisáveis por frasco. Fenótipos inesperados ou menos de 20 descendentes analisáveis indicam contaminação ou produtividade insuficiente e devem ser excluídos conforme especificado na etapa 1.4.3. Para análise TIDE, amostras bem-sucedidas produzem um amplicon de aproximadamente 1,7 kb e cromatogramas com pouco ruído antes do local da quebra; DNA de baixo rendimento ou contaminado e cromatogramas ruidosos são subótimos e não devem ser analisados.

Ao usar o DR-branco ensaio com fonte de I-SceI indutível por choque térmico, a frequência de reparo por RH em moscas selvagens é de 38,5 ± 1,2% (média ± erro padrão da média), enquanto a SSA ocorre em cerca de 3,2 ± 0,35%Figura 3B e Arquivo Suplementar 4). Rad51 (codificado pelo homólogo spnA em Drosophilaé necessário para a etapa de invasão da fita na recombinação homóloga14,19. Assim, a perda de Rad51 deve resultar em uma RH ineficiente. De fato, em um DmRad51-/- o reparo HR é reduzido para 1,3 ± 0,4%, com aumento concomitante do reparo SSA (34,5 ± 1,8%; Figura 3B e Arquivo Suplementar 4)14. Isso provavelmente ocorre porque eventos de reparo direcionados à recombinação homóloga são reparados alternativamente por meio do emparelhamento de fita simples do branco sequências repetidas

Contribuição do CtIP de Drosophila para a reparação eficiente por RH em tecidos somáticos

O algoritmo TIDE permite a medição da escolha da via de reparo em células somáticas. Em um contexto não mutante, a NHEJ com processamento ocorre em 59,0% dos eventos de reparo detectáveis, e a RH ocorre em 41,0% (Figura 4B e Arquivo Suplementar 4). A CtIP desempenha um papel importante na iniciação do reparo por RH, promovendo a retificação das extremidades do DNA20. Assim, em um contexto DmCtIP-/-, a escolha da via de RH é acentuadamente reduzida em células somáticas, passando de 41,0% em controles heterozigotos para 10,9% em mutantes homozigotos (Figura 4B e Arquivo Suplementar 4)16. Isso sugere que, em Drosophila, a CtIP contribui para, mas não é essencial ao reparo por RH.

Diagrama do ensaio DR-white mostrando vias de reparo do DNA; métodos HR, NHEJ, SSA com elementos do gene Sce.white.
Figura 1: Ensaio repórter de quebra de dupla fita (DSB) DR-white e seus resultados de reparo. O ensaio de repetição direta do gene white contém duas cópias não funcionais do gene white: Sce.white (com inserção de 23 pb contendo o sítio de reconhecimento I-SceI e introduzindo um códon de parada prematuro) e iwhite (sequência doadora truncada nas extremidades 5′ e 3′). Cruzar moscas contendo DR-white e um transgene I-SceI produz uma quebra de dupla fita (DSB) em local específico, que pode ser analisada fenotipicamente ou molecularmente. Os fenótipos resultantes são: (A) descendentes com olhos brancos (y+ w−), indicando ausência de DSB, reparo por HR entre cromátides-irmãs ou NHEJ; (B) descendentes com olhos vermelhos (y+ w+), indicando recombinação homóloga intracromossômica que restaura a sequência selvagem SacI a partir da doadora iwhite; e (C) descendentes com corpo amarelo e olhos brancos (y− w−), indicando annealing de fita simples (SSA) ou crossing-over mitótico. Figura adaptada de Do et al.14. Abreviações: CO = crossing-over; DR-white = Repetição Direta do gene white; DSB = quebra de dupla fita; HR = recombinação homóloga; NHEJ = junção de extremidades não homólogas; SSA = annealing de fita simples. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Diagrama de edição gênica: recombinação homóloga, clivagem por I-SceI, DR-white.mu, DNA, iwihiteΔ9, sítios SacI.
Figura 2: Derivados do ensaio DR-white. (A) O ensaio DR-white.mu contém 28 SNPs silenciosos na sequência doador iwhite.mu, gerando 1,4% de divergência de sequência entre as repetições diretas. A conversão gênica de polimorfismos individuais varia entre os eventos de RH e pode ser determinada por sequenciamento. (B) DR-white com o doador iwhiteΔ9 distingue a recombinação inter-homóloga da intracromossômica. A RH a partir do doador intracromossômico iwhite restaura a sequência selvagem de SacI e produz descendentes com olhos vermelhos. A RH a partir do doador inter-homóloga iwhiteΔ9 produz descendentes com olhos laranja, pois a deleção de 9 pb reduz a expressão de white. A figura adaptada de Do et al.14 e Fernandez et al.15. Abreviações: DSB = quebra de dupla fita; HR = recombinação homóloga; SNP = polimorfismo de nucleotídeo único. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Rotas de reparo gênico em Drosophila, diagrama de cruzamentos genéticos, análise gráfica de distribuição de progênie.
Figura 3: Fluxo experimental para detecção dos resultados do reparo de quebras de dupla fita na linhagem germinativa pré-meiótica. (A) O Cruzamento 1 combina o repórter DR-white (ou um derivado) com um transgene I-SceI (neste exemplo, no cromossomo dois). A progênie que contém tanto o ensaio DR-white quanto o transgene I-SceI mantém os eventos de reparo em seus tecidos germinativos e somáticos. Para analisar eventos individuais de reparo na linhagem germinativa pré-meiótica, a progênie portadora de ambos os transgenes é cruzada com moscas-teste y w (Cruzamento 2), e a progênie é pontuada conforme descrito na Figura 1. (B) Eventos individuais de reparo de quebras de dupla fita na linhagem germinativa de moscas selvagens (n = 106 linhagens germinativas) e mutantes homozigotos para DmRad51 (n = 46 linhagens germinativas). **P < 0,01; ****P < 0,0001 por ANOVA de dois fatores seguido pelo teste de comparações múltiplas de Sidak. As barras representam as médias; as barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Os dados foram reanalisados de Do et al.14. Abreviaturas: ANOVA = análise de variância; CO = recombinação cruzada; DSB = quebra de dupla fita; HR = recombinação homóloga; NHEJ = junção de extremidades não homólogas; SEM = erro padrão da média; SSA = emparelhamento de fita simples. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Processo de edição gênica por meio de sequenciamento Sanger com análise TIDE; inclui gráfico comparativo de métodos de reparo.
Figura 4: Fluxo experimental para detecção dos resultados do reparo de quebras de dupla fita utilizando o rastreamento de inserções e deleções por decomposição (TIDE). (A) Moscas portadoras de DR-white e um transgene induzido I-SceI são analisadas por extração de DNA genômico, amplificação por PCR no local da quebra de dupla fita, sequenciamento Sanger e análise TIDE com o script em R. (B) Dados representativos de mutantes DmCtIP-/- (n = 23) e controles heterozigotos DmCtIP+/- (n = 31). Os eventos de reparo detectáveis são calculados como recombinação homóloga somada ao reparo por junção de extremidades não homólogas com processamento, excluindo-se a ausência de quebra de dupla fita ou junção de extremidades sem indels. ****P < 0,0001 por ANOVA de dois fatores seguida pelo teste de comparações múltiplas de Sidak. As barras representam as médias; as barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Os dados foram reanalisados de Thomas et al.16. Abreviações: ANOVA = análise de variância; DSB = quebra de dupla fita; gDNA = DNA genômico; HR = recombinação homóloga; NHEJ = junção de extremidades não homólogas; PCR = reação em cadeia da polimerase; SEM = erro padrão da média; TIDE = rastreamento de inserções e deleções por decomposição. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Script R do TIDE para identificar inserções e deleções em cromatogramas de sequência em relação a um controle sem DSB. O nome do arquivo de controle editável pelo usuário, os nomes dos arquivos de amostra e a sequência-alvo do I-SceI estão indicados próximo ao final do script. As entradas necessárias, arquivos de saída e sua interpretação são descritos na seção 2.3. São necessários os pacotes sangerseqR e Biostrings.Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Guia com capturas de tela passo a passo do fluxo de trabalho do script R do TIDE. Os painéis ilustram as ações do software descritas na seção 2.3.Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Exemplo de saída do TIDE e cálculos de eventos de reparo. O valor 0-indel representa ausência de quebra de dupla fita (DSB) ou NHEJ sem indels; a linha HR separada representa o produto canônico de deleção de 23 pb; e todas as demais porcentagens de indel são somadas como NHEJ com processamento. O reparo detectável total é calculado como HR mais NHEJ com processamento.Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Dados brutos subjacentes às Figuras 3B e 4B, organizados em planilhas editáveis separadas. Esses dados foram reanalisados a partir dos estudos previamente publicados citados nas legendas correspondentes das figuras.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A versatilidade do sistema DR-white é um fator crucial que contribui para o seu impacto passado e futuro no campo da reparação do DNA. Primeiro, a sequência de integração attB dentro do construto repórter DR-white permite aos pesquisadores direcionar o repórter a diversas localizações no genoma de Drosophila21, com várias linhagens direcionadas já disponíveis22. Segundo, a disponibilidade de diferentes transgenes I-SceI, como expressão induzida por choque térmico por meio do promotor hsp70 (este estudo), expressão constitutiva por meio do promotor ubiquitin23 e expressão na linhagem germinativa pré-meiótica por meio do promotor Bam24, fornece diversos contextos desenvolvimentais e tecido-específicos para explorar a reparação de quebras de dupla fita (DSB). Independentemente do transgene I-SceI utilizado, os cruzamentos genéticos devem ser cuidadosamente planejados para garantir que o transgene I-SceI seja introduzido apenas no cruzamento final, assegurando a indução adequada das DSBs. É importante observar que as frequências de reparação podem variar significativamente dependendo da localização genômica do DR-white e/ou do transgene I-SceI utilizado. Experimentos futuros poderiam comparar ainda mais localizações genômicas e transgenes I-SceI para determinar se o contexto genômico ou a especificidade tecidual orienta a reparação de DSB.

Uma vantagem particular do ensaio DR-white e de seus derivados é que eles podem identificar a reparação de quebras de dupla fita (DSBs) por meio de recombinação homóloga, NHEJ com processamento e, na maioria dos casos, SSA. Embora projetado para detectar eventos de reparação na linhagem germinativa por meio de fenótipos, o sistema também permite a análise de tecidos somáticos por meio da análise algorítmica TIDE. Apesar desses benefícios, existem algumas limitações desse ensaio que devem ser consideradas. Notavelmente, o ensaio DR-white pode subestimar as frequências de RH. Como em outros ensaios com repórteres genéticos que utilizam DSBs induzidos por nucleases, a reparação por RH a partir de uma cromátide-irmã (RH entre cromátides-irmãs) é indistinguível de um evento sem DSB ou de NHEJ sem processamento. Assim, ao menos parte da classe Sem DSB/NHEJ pode corresponder a eventos de RH. Considerando essa limitação, os resultados que comparam fatores genéticos (como linhagens mutantes) devem ser interpretados com cautela. Outras limitações do ensaio incluem a incapacidade de quantificar eventos pré-meióticos que não geraram descendentes viáveis. Por exemplo, eventos de DSB que podem não ter sido reparados e que resultaram em morte celular não serão detectados na prole. Embora a fertilidade geral possa ser uma medida qualitativa da morte de células da linhagem germinativa, ensaios baseados em células (como TUNEL) podem ser necessários. Além disso, a análise por script R do TIDE fornece apenas a proporção de eventos detectáveis em uma população celular. Para determinar os resultados específicos de sequências de inserções e deleções (indels), é necessário o sequenciamento de eventos individuais de reparação por meio de sequenciamento de DNA multiplex.

O ensaio DR-white já teve um impacto profundo no estudo da reparação de quebras duplas na fita de DNA (DSB). Sua aplicação identificou fatores que contribuem para a reparação de DSB em organismos multicelulares, incluindo idade25, sexo26, localização da DSB22,26, localização da sequência doadora15, ciclo celular e tipo de tecido26. Além disso, empregamos o ensaio para identificar várias proteínas que também influenciam a escolha da via de reparação e/ou a reparação de sequências divergentes em Drosophila, incluindo Msh627, Blm28, Rif116 e CtIP16,29. De fato, o uso bem estabelecido de Drosophila como organismo modelo genético com proteínas conservadas de reparação do DNA fornece um sistema simples e multicelular para investigar os fatores genéticos, celulares e do organismo que contribuem para a reparação de DSB em contextos biológicos complexos.

Divulgações

Os autores não têm conflitos financeiros ou não financeiros a divulgar.

Agradecimentos

Este método foi desenvolvido enquanto J.R.L. era beneficiário de uma bolsa de pesquisa da AFAR (American Federation for Aging Research). Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (1R15GM110454 e 1R15GM129628) concedido a J.R.L. As figuras foram elaboradas com a ajuda do BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Moedores de RNAse/DNAse-free de 0,5 mLFisher Scientific12141363Para homogeneização de amostras para extração de gDNA
Bolas de algodãoGenesee Scientific51-101para cultivo padrão de Drosophila
Incubadora refrigerada por Peltier para DrosophilaShel LabSRI6PFpara cultivo padrão de Drosophila
Estirpe de Drosophila: y[1] w[1]Bloomington Drosophila  Stock CenterRRID:BDSC 1495
Estirpe de Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} LaRocque LabN/Acriada pelo laboratório LaRocque por meio de recombinação padrão da estirpe RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) do Bloomington Drosophila Stock Center; disponível mediante solicitação ao autor correspondente
Estirpe de Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/Aensaio DR-white integrado na estirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); disponível mediante solicitação ao autor correspondente
Estirpe de Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/Aensaio DR-white.mu integrado na estirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); disponível mediante solicitação ao autor correspondente
Estirpe de Drosophila: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]LaRocque LabN/Adoador iwhiteΔ9 integrado na estirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); disponível mediante solicitação ao autor correspondente
Tampas para frascos de Drosophila FlugsGenesee Scientific49-100para cultivo padrão de Drosophila
Stereo microscópio fluorescente (RFP)TriTech ResearchSMT1-FLpara manipulação e classificação padrão de "moscas" com base na fluorescência
Almofada FlyStuff para DrosophilaGenesee Scientific59-172para manipulação padrão de "moscas"
KimwipesKimberly-Clarke06-666A
Banho-maria MyBath 4LMidwest ScientificMB-2000-4para  choque térmico
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYpara quantificação de DNA
Mídia Nutri-fly Bloomington FormulationGenesee Scientific66-121para cultivo padrão de Drosophila
Homogeneizador motorizado sem fio Pellet PestleDWK Life SciencesK749540-0000Para homogeneização de amostras para extração de gDNA
Frasco de polipropilenoGenesee Scientific32-130para cultivo padrão de Drosophila
Frascos de poliestirenoGenesee Scientific32-116para cultivo padrão de Drosophila, incluindo choque térmico
Primer/oligonucleotídeo DR-white_8fN/A; qualquer serviço de síntese de oligonucleotídeos é suficienteN/A5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
Primer/oligonucleotídeo DR-white_8aN/A; qualquer serviço de síntese de oligonucleotídeos é suficienteN/A5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
Primer/oligonucleotídeo DR-white_9fN/A; qualquer serviço de síntese de oligonucleotídeos é suficienteN/A5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R StudioPositVersion 2023.06.1+524Versão gratuita para download; qualquer versão do R Studio é aceitável, embora os dados apresentados tenham sido analisados usando  a versão 2023.06.1+524
Pacotes do R Studio: BiostringsBioconductor.org (Version 3.24)Version 2.76.0O script R solicitará ao usuário a instalação deste pacote
Pacotes do R Studio: sangerseqRBioconductor.org (Version 3.24)Version 1.44.0O script R solicitará ao usuário a instalação deste pacote
SapphireAMP Fast PCRTakaraRR350B
Stereo microscópioLeicaM60para manipulação padrão de "moscas"
Wizard SV Gel and PCR Clean up PromegaA9281

Referências

  1. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.
  2. Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.
  3. Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.
  4. Figueroa-González G, Pérez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.
  5. Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.
  6. Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.
  7. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.
  8. Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.
  9. Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.
  10. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.
  11. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.
  12. Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.
  13. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.
  14. Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.
  15. Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.
  16. Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.
  17. Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.
  18. Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.
  19. McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.
  20. Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.
  21. Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.
  22. Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.
  23. Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.
  24. Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.
  25. Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.
  26. Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.
  27. Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.
  28. Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.
  29. Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.

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