O miR‑486‑3p está subregulado em pacientes com infarto cerebral agudo e síndrome da apneia obstrutiva do sono, correlaciona-se negativamente com a gravidade da doença e marcadores inflamatórios e prediz um prognóstico ruim em 1 ano, sustentando seu potencial como biomarcador diagnóstico e prognóstico.
Artigo de investigação
Estudo de Coorte Retrospectivo dos Níveis de miR-486-3p no Sangue Periférico em Pacientes com Infarto Cerebral Agudo e Síndrome da Apneia Obstrutiva do Sono
Neste artigo
Resumo
Resumo
O infarto cerebral agudo (ICA) complicado com síndrome da apneia obstrutiva do sono (SAOS) confere alto risco de recorrência de acidente vascular cerebral e morte, embora biomarcadores eficazes para essa condição comórbida ainda sejam limitados. Este estudo de coorte retrospectiva incluiu 270 pacientes com ICA entre novembro de 2020 e dezembro de 2023, classificados no grupo ICA (n = 100, índice de apneia-hipopneia [IAH] < 5) e no grupo ICA com SAOS (n = 170, IAH ≥ 5), sendo este último subdividido em subgrupos leve (5 ≤ IAH < 15, n = 60), moderado (15 ≤ IAH < 30, n = 75) e grave (IAH ≥ 30, n = 35). A expressão sérica de miR-486-3p foi medida por RT-qPCR, e marcadores inflamatórios, incluindo fator de necrose tumoral-α (TNF-α), proteína C-reativa (PCR) e fator induzível por hipóxia-1α (HIF-1α), foram quantificados por ELISA. O valor diagnóstico do miR-486-3p foi avaliado por meio de análise da curva ROC (receiver operating characteristic), e sua significância prognóstica foi determinada por análise de sobrevida de Kaplan-Meier e modelos de regressão de Cox. O miR-486-3p foi significativamente menor no grupo comórbido e demonstrou alta capacidade diagnóstica (AUC = 0,927). Notavelmente, observou-se uma tendência clara dependente da dose nos subgrupos de gravidade da SAOS, com redução progressiva do miR-486-3p e aumento progressivo de TNF-α e PCR do estágio leve ao grave da SAOS. Análises de correlação de Spearman revelaram que o miR-486-3p apresentou correlação negativa com IAH, escore NIHSS, TNF-α e PCR. No acompanhamento de 1 ano, pacientes com baixa expressão de miR-486-3p apresentaram desfechos funcionais significativamente piores em comparação com aqueles com alta expressão. A regressão multivariada de Cox confirmou o miR-486-3p como fator protetor independente para o prognóstico em 1 ano. Esses achados sugerem que o miR-486-3p pode atuar como um novo biomarcador diagnóstico e prognóstico em pacientes com ICA e SAOS, possivelmente por meio de seu papel regulador na inflamação sistêmica, e justificam sua validação adicional em coortes prospectivas maiores.
Introdução
A síndrome da apneia obstrutiva do sono (SAOS) é uma condição comum caracterizada por interrupções repetidas na respiração durante o sono1. O SAOS está frequentemente associado a comorbidades como distúrbios metabólicos, cardiovasculares, renais, pulmonares e neuropsiquiátricos2. Além de suas associações gerais com doenças cardiovasculares e metabólicas, o SAOS representa uma ameaça específica e grave no acidente vascular cerebral isquêmico agudo, complicando até 70% dos casos e aumentando os riscos de declínio neurológico, mortalidade e recorrência de acidente vascular cerebral3,4,5. O infarto cerebral agudo (ICA) constitui a forma mais prevalente de acidente vascular cerebral. Embora tenham sido feitos progressos significativos no tratamento do ICA nos últimos anos, a maioria dos pacientes ainda sofre de incapacidade grave ou mesmo morte6. A interação sinérgica entre ICA combinado com SAOS agrava os danos isquêmicos e a inflamação sistêmica, elevando substancialmente os riscos de recorrência de acidente vascular cerebral, incapacidade e mortalidade. Consequentemente, identificar biomarcadores confiáveis para o diagnóstico precoce e o manejo dessa condição comórbida de alto risco é de importância fundamental.
Os microRNAs (miRNAs) têm demonstrado grande potencial como biomarcadores nos últimos anos. Dentre eles, o miR-486-3p possui grande importância nas doenças neurovasculares. Pesquisas anteriores mostraram que a expressão do miR-486-3p é inibida na apneia obstrutiva do sono (OSA)7. Além disso, o tratamento com exossomos do tipo glicoproteína do vírus da raiva-miR-486-3p pode aliviar distúrbios neurocomportamentais, edema cerebral, danos à barreira hematoencefálica e neurodegeneração8, indicando que o miR-486-3p desempenha um papel na lesão cerebral. Após o ACI, as microglías no tecido cerebral lesionado são ativadas, promovendo a secreção de citocinas inflamatórias5. A SAOS provoca sintomas de hipóxia intermitente, levando à ativação do sistema nervoso simpático e ao estresse oxidativo, desencadeando assim uma reação inflamatória sistêmica em cascata9. O miR-486-3p está fortemente relacionado à inflamação10. Essas evidências sugerem que o miR-486-3p pode atuar como uma ligação molecular entre a hipóxia relacionada à SAOS, a inflamação sistêmica e a recuperação pós-AVC.
No entanto, seu perfil de expressão, precisão diagnóstica e significado prognóstico em pacientes com ACI combinado com SAOS não foram sistematicamente investigados, e permanece desconhecido se ela se correlaciona com a gravidade do SAOS ou com mediadores inflamatórios de maneira dose-dependente. Para preencher essas lacunas, este estudo avaliou o valor diagnóstico do miR-486-3p para SAOS em pacientes com ACI, examinou sua relação dose-dependente com a gravidade do SAOS e marcadores inflamatórios (TNF-α, PCR e HIF-1α) e avaliou sua utilidade prognóstica para desfechos funcionais em um ano. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo abrangente a demonstrar que o miR-486-3p pode atuar como um novo biomarcador diagnóstico e prognóstico para a comorbidade ACI-SAOS, potencialmente por meio da regulação da inflamação sistêmica.
Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Afiliado da Universidade Médica de Xuzhou (número de aprovação: XYFY2024-KL238-01) e foi isento do requisito de obter consentimento informado adicional dos pacientes. Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
Pacientes e espécimes
Este estudo foi um estudo de coorte retrospectivo. De novembro de 2020 a dezembro de 2023, um total de 270 pacientes submetidos à IAC no Hospital Afiliado da Universidade Médica de Xuzhou foram recrutados consecutivamente. O processo de seleção dos pacientes é resumido na Figura Suplementar 1. Pacientes elegíveis foram identificados por meio da triagem diária de todas as novas admissões na unidade de acidente vascular cerebral. O início dos sintomas nas 72 horas anteriores à admissão foi verificado mediante revisão dos registros médicos de emergência e confirmado por um neurologista certificado por meio do histórico do paciente e entrevista com a família. O tamanho da amostra foi calculado com base na capacidade de detectar uma diferença significativa nos níveis de miR-486-3p entre os grupos. Assumindo um tamanho de efeito de 0,5, um α bilateral de 0,05 e um poder (1-β) de 0,80, foi necessário um mínimo de 64 pacientes por grupo. Os tamanhos finais dos grupos refletem o recrutamento real e a maior prevalência de SAOS na população com acidente vascular cerebral, e não uma alocação predeterminada. Pacientes com IAC combinada com SAOS foram acompanhados quanto ao seu prognóstico por 1 ano.
Os critérios de inclusão foram: (1) Acidente vascular cerebral isquêmico agudo com início dos sintomas nas últimas 72 h antes da admissão, confirmado por ressonância magnética. (2) Capacidade de compreender e preencher os questionários do estudo e avaliações neurológicas. (3) A gravidade do AVC foi avaliada pela Escala de Acidente Vascular Cerebral do National Institutes of Health (NIHSS) na admissão. Quando o escore NIHSS é <5, é classificado como AVC leve; quando o escore NIHSS está entre 5 e 20, é considerado AVC moderado. Os principais critérios de exclusão incluíram histórico de tumores malignos, deficiência física grave pré-existente ou transtornos psiquiátricos, insuficiência cardíaca, pulmonar ou renal grave, cirurgia importante ou trauma nos últimos 3 meses, infecções ativas ou doenças autoimunes; acidente vascular cerebral prévio nos últimos 6 meses; terapia imunossupressora; e diagnóstico ou tratamento prévio de SAOS (incluindo terapia com pressão positiva contínua nas vias aéreas).
Para confirmação por RNM, todos os pacientes realizaram RNM cerebral padrão em um sistema de 3,0 T, incluindo as seguintes sequências: ponderada em T1, ponderada em T2, recuperação de inversão com supressão de líquido (FLAIR), imagem de difusão (DWI) e mapeamento do coeficiente de difusão aparente (ADC). A infarto agudo foi definido pela presença de sinal hiperalintenso na DWI com sinal hipointenso correspondente no ADC. Todas as RNM foram interpretadas por dois neurorradiologistas experientes, cegos em relação aos dados clínicos, com as discrepâncias resolvidas por consenso. A pontuação na escala NIHSS foi realizada na admissão por neurologistas certificados, antes de qualquer tratamento trombolítico ou endovascular.
O sangue venoso em jejum foi coletado entre 24 h e 48 h após o início do acidente vascular cerebral, após um jejum noturno de pelo menos 8 h. As coletas de sangue foram realizadas entre 6:00 e 8:00 para minimizar variações circadianas. Um total de 5 mL de sangue venoso periférico foi coletado em tubos a vácuo revestidos com EDTA. Dentro de 2 h após a coleta, as amostras de sangue foram centrifugadas a 1.500 × g por 15 min a 4 °C, utilizando uma centrífuga refrigerada. O sobrenadante sérico foi cuidadosamente alíquotado em tubos microcentrífugos livres de RNase de 1,5 mL e armazenado imediatamente a −80 °C até a extração de RNA. Ciclos repetidos de congelamento-descongelamento foram estritamente evitados; todas as alíquotas foram submetidas a no máximo um ciclo de congelamento-descongelamento antes da análise.
Agrupamento dos pacientes
Os participantes foram agrupados com base em seus escores de IAH obtidos pela polissonografia. Todos os registros foram realizados no laboratório de sono do hospital entre 22h e 6h, com duração mínima de 7 h. Os canais fisiológicos monitorados incluíram: eletroencefalografia (EEG; seis canais), eletrooculografia (EOG; dois canais), eletromiografia (EMG; região submentoneana e tibiais anteriores bilaterais), eletrocardiografia (ECG; derivação única), fluxo aéreo nasal (termistor e transdutor de pressão), esforço respiratório torácico e abdominal (plestimografia por indução respiratória) e oximetria de pulso (SpO2). O técnico de estudo do sono calculou o IAH. A pontuação dos estágios do sono e dos eventos respiratórios foi realizada manualmente por um técnico de sono certificado, de acordo com o manual de pontuação da American Academy of Sleep Medicine (AASM) de 2012, utilizando o software Somnolyzer 24×7. De acordo com os critérios diagnósticos amplamente aceitos da American Academy of Sleep Medicine, um IAH igual ou superior a 5 eventos por hora é o limiar padrão para o diagnóstico de SAOS. Assim, os participantes com IAH < 5 foram classificados como grupo ACI (n = 100), enquanto aqueles com IAH ≥ 5 foram classificados como grupo ACI combinado com SAOS (n = 170). Entre os indivíduos com IAH ≥ 5 (grupo ACI combinado com SAOS, n = 170), os pacientes foram ainda estratificados em três subgrupos de gravidade com base em critérios estabelecidos: SAOS leve (5 ≤ IAH < 15, n = 60), SAOS moderado (15 ≤ IAH < 30, n = 75) e SAOS grave (IAH ≥ 30, n = 35). Essa estratificação permitiu a avaliação da relação dose-dependente entre a carga hipóxica, a expressão de miR‑486‑3p e os marcadores inflamatórios. Pacientes com tratamento prévio de SAOS (por exemplo, CPAP) não foram incluídos no estudo, a fim de evitar interferência na medição basal do IAH.
Avaliação do prognóstico
O ponto temporal de 1 ano permite que os efeitos agudos se resolvam e que a carga hipóxica cumulativa da SAOS se manifeste, fornecendo uma janela robusta para avaliar seu impacto prognóstico. O prognóstico clínico de pacientes com AVE isquêmico combinado com SAOS foi avaliado pela Escala de Rankin Modificada (mRS) após o início da doença. Todas as avaliações pela mRS foram realizadas por neurologistas certificados que passaram por treinamento padronizado antes do estudo, utilizando o formulário estruturado de entrevista mRS. A confiabilidade entre avaliadores foi avaliada com um coeficiente kappa >0,85. A avaliação de acompanhamento foi realizada por meio de uma consulta agendada em ambulatório. Para pacientes incapazes de comparecer pessoalmente, foi realizada uma entrevista telefônica estruturada por uma enfermeira pesquisadora treinada, utilizando um roteiro padronizado. Todos os avaliadores estavam cegos quanto aos níveis de miR-486-3p e ao estado de SAOS dos pacientes. Para manter a consistência entre as avaliações ambulatoriais e por telefone, ambos os formatos utilizaram o mesmo questionário estruturado, e todos os avaliadores realizaram um exercício de calibração pré-estudo. Pacientes com escores de 0–2 foram incluídos no grupo de bom prognóstico, e aqueles com escores de 3–6 foram incluídos no grupo de mau prognóstico. Nenhum paciente foi perdido durante o acompanhamento. O SAQLI, ESS, TNF-α e HIF-1α foram avaliados como variáveis prognósticas, em vez de serem utilizados para definir os grupos prognósticos. O NIHSS, SAQLI e ESS foram aplicados por equipe de pesquisa treinada. O SAQLI e o ESS foram aplicados como questionários administrados por entrevistador em uma sala silenciosa.
Índice de pontuação
A NIHSS é uma escala quantitativa para acidente vascular cerebral11, em que pontuações mais altas indicam maior gravidade do AVC. A SAQLI é um questionário sobre qualidade de vida para SAOS numa escala de 1 a 7, em que pontuações mais altas indicam pior qualidade de vida, abrangendo atividades diárias, interações sociais, estados emocionais, sintomas e sintomas relacionados ao tratamento12. A ESS é utilizada para avaliar a sonolência diurna auto-relatada pelos pacientes, com uma pontuação variando de 0 a 24, e uma pontuação > 10 indica sonolência diurna13.
Extração de RNA e transcrição reversa
O RNA total foi extraído de 200 µL de soro utilizando o reagente TRIzol. Resumidamente, as amostras de soro foram misturadas com 800 µL de TRIzol, incubadas à temperatura ambiente por 5 min e centrifugadas a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C. Adicionou-se clorofórmio (200 µL), a mistura foi agitada vigorosamente por 15 s, incubada por 3 min e centrifugada a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C. A fase aquosa foi transferida para um tubo novo e o RNA foi precipitado com 500 µL de isopropanol, incubado a −20 °C por 1 h e centrifugado a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. O pellet de RNA foi lavado com etanol 75%, seco ao ar e dissolvido em 20 µL de água livre de RNase. A concentração e pureza do RNA foram avaliadas utilizando um espectrofotômetro de microvolume, sendo aceito para análises subsequentes uma razão A260/A280 entre 1,8 e 2,0. A integridade do RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose.
A transcrição reversa foi realizada utilizando 500 ng de RNA total com o Kit de Transcrição Reversa em um volume de reação total de 20 µL, usando primers hexaméricos aleatórios de acordo com o protocolo do fabricante. A reação de transcrição reversa foi realizada a 25 °C por 10 min, 42 °C por 60 min e 70 °C por 5 min. O cDNA resultante foi armazenado a −20 °C até o uso.
RT-qPCR
A expressão de miR-486-3p foi detectada utilizando um kit de PCR em tempo real baseado em SYBR Green para quantificação de microRNAs em um sistema de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). A mistura de reação continha 10 µL de Master Mix SYBR Green 2×, 2 µL de molde de cDNA (diluído 1:5), 1 µL de cada par de primers (10 µM) e água livre de nucleases até um volume final de 20 µL. As sequências dos primers são as seguintes (de 5'-3'): miR-486-3p-sentido: TCGGCAGCGGGGCAGCUCAGU, antissentido: CTCAACTGGTGTCGTGGA; e U6-sentido: CTCGCTTCGGCAGCACA, antissentido: AACGCTTCACGAATTTGCGT. As condições de ciclagem da qPCR foram: 95 °C por 2 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 30 s, 60 °C por 30 s e 72 °C por 60 s. Cada amostra foi analisada em triplicata, e um controle sem molde foi incluído em cada corrida. A especificidade da amplificação foi confirmada por análise da curva de dissociação de 60 °C a 95 °C. O limiar de ciclo (Ct) foi determinado automaticamente pelo software QuantStudio 6 Pro (v1.5) utilizando a configuração de limiar padrão. O nível de miR-486-3p foi calculado pelo método 2-ΔΔCT e normalizado em relação ao U6. O gene U6 foi validado como gene de referência estável em nossas amostras de soro utilizando o algoritmo NormFinder para garantir consistência entre os grupos. Os coeficientes de variação entre ensaios e dentro de ensaios foram <5%.
ELISA
As concentrações séricas de proteína C-reativa (PCR), TNF-α e HIF-1α foram detectadas utilizando o kit de ELISA. Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as amostras de soro foram descongeladas em gelo e diluídas 1:2 com o tampão de diluição fornecido. Amostras e padrões foram adicionados a placas de 96 poços pré-revestidas (100 µL/poço) e incubados por 2 h a 37 °C. Após quatro lavagens com 300 µL de tampão de lavagem, adicionou-se 100 µL de anticorpo de detecção conjugado com biotina e incubou-se por 1 h a 37 °C. Após nova etapa de lavagem, adicionou-se 100 µL de estreptavidina conjugada com peroxidase do rabo-de-cavalo e incubou-se por 30 min a 37 °C no escuro. O substrato cromogênico (tetrametilbenzidina, 100 µL) foi adicionado e incubado por 15 min a 37 °C, protegido da luz. A reação foi interrompida com 50 µL de solução de parada, e a absorbância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. As concentrações foram calculadas a partir de curvas-padrão geradas com concentrações conhecidas de proteínas recombinantes. Cada amostra foi medida em duplicata, e o valor médio foi utilizado para análise. Amostras de controle de qualidade fornecidas pelo fabricante foram incluídas em cada placa; os resultados foram aceitos somente quando os valores de controle de qualidade estavam dentro da faixa especificada pelo fabricante.
Controle de qualidade e reprodutibilidade
Todos os ensaios laboratoriais foram realizados conforme as diretrizes MIQE (Informações Mínimas para Publicação de Experimentos de PCR em Tempo Real Quantitativa) para RT-qPCR e as normas apropriadas de relato para ELISA. Os principais instrumentos foram calibrados de acordo com as programações dos fabricantes. Amostras controle negativo e positivo foram incluídas em cada lote de ensaios de RT-qPCR e ELISA para monitorar a variabilidade entre placas. Todos os dados foram registrados e gerenciados usando o Microsoft Excel, e o autor correspondente fornecerá protocolos experimentais detalhados e dados brutos mediante solicitação razoável.
Análise estatística
Os dados foram analisados utilizando o SPSS 23.0 e um software estatístico e de geração de gráficos. A distribuição normal foi avaliada pelo teste de Shapiro–Wilk. As variáveis contínuas são apresentadas como média ± DP ou mediana (IIQ) e foram comparadas pelo teste t ou teste U de Mann–Whitney, conforme apropriado. As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste χ2. As correlações foram examinadas por meio de análises de Pearson ou Spearman, com base na distribuição dos dados. O valor preditivo foi determinado utilizando a curva ROC e verificado com validação cruzada de 5 dobras. O valor de corte ótimo para o miR-486-3p foi determinado maximizando o índice de Youden. Foram utilizadas análises de correlação de Pearson e Spearman para avaliar as correlações. Para a análise prognóstica, os pacientes foram estratificados pela expressão mediana de miR‑486‑3p; curvas de Kaplan–Meier com o teste log-rank foram utilizadas para comparar os desfechos de sobrevida entre os grupos. As variáveis com P < 0,1 na regressão de Cox univariada foram incluídas no modelo multivariado de Cox. Considerou-se estatisticamente significativo P < 0,05.
Resultados
Características basais nos grupos ACI e ACI combinado com SAOS
Conforme mostrado na Tabela 1, o grupo ACI era composto por 68 homens e 32 mulheres, com idade média de 62,84 ± 12,65 anos, e o grupo ACI combinado com SAOS incluía 116 homens e 54 mulheres, com idade média de 61,31 ± 11,25 anos. O grupo ACI combinado com SAOS apresentou valores significativamente mais elevados de IAH, escores NIHSS e níveis de PCR. No entanto, os dois grupos apresentaram distribuições comparáveis de idade, sexo, IMC, hipertensão, DM, cardiopatia, dislipidemia, tabagismo, consumo de álcool, trombólise e classificação TOAST.
Alterações em miR-486-3p e marcadores inflamatórios entre subgrupos de gravidade da SAOS
Para avaliar a relação dose-dependente entre a gravidade da SAOS e alterações moleculares, estratificamos os 170 pacientes com AIC e SAOS em subgrupos leve (5 ≤ IAH < 15, n = 60), moderado (15 ≤ IAH < 30, n = 75) e grave (IAH ≥ 30, n = 35) com base nos critérios de IAH. Conforme mostrado nas Figuras 1A–C, observou-se um padrão claramente gradativo entre os quatro grupos (AIC, leve, moderado e grave SAOS). Especificamente, a expressão de miR-486-3p diminuiu progressivamente do grupo com AIC ao subgrupo com SAOS grave (Figura 1A, P < 0,001 vs. grupo AIC). Em contraste, os níveis séricos de TNF-α e PCR aumentaram progressivamente com a gravidade da SAOS (Figuras 1B,C, P < 0,001 vs. grupo AIC). Esses achados indicam que a carga hipóxica imposta pela SAOS está associada à supressão gradativa de miR-486-3p e ao aumento paralelo da inflamação sistêmica.
Valor diagnóstico do miR-486-3p para SAOS em pacientes com AVE isquêmico
O miR-486-3p pode ter valor diagnóstico significativo na combinação de AVE isquêmico e SAOS, com uma AUC de 0,927 (valor de corte ótimo foi 0,845), e sensibilidade e especificidade de 92,94% e 79,00%, respectivamente (Figura 1D). Para avaliar a robustez do modelo diagnóstico e excluir possíveis casos de superajuste, foi realizada uma validação cruzada de 5 dobras para a análise ROC do miR-486-3p. Conforme mostrado na Tabela Suplementar 1, a AUC média nas cinco dobras foi de 0,928 (variando de 0,847 a 0,969), o que é altamente consistente com a AUC aparente de 0,927 da análise original. A sensibilidade e especificidade médias foram de 88,83% e 87,00%, respectivamente.
Correlações de miR-486-3p com a gravidade do acidente vascular cerebral e marcadores inflamatórios na ACI combinada com SAOS
No grupo de ACI com SAOS, análises de correlação de Spearman revelaram que a expressão de miR-486-3p apresentou correlação negativa significativa com o escore NIHSS (Figura 2A), TNF-α (Figura 2B) e PCR (Figura 2C).
Indicadores prognósticos nos grupos de bom e mau prognóstico
Pacientes com AVE isquêmico combinado com SAOS foram divididos em um grupo de bom prognóstico e um grupo de mau prognóstico de acordo com os escores de mRS. Conforme demonstrado na Tabela 2, os escores de mRS, escore de SAQLI, escore de ESS, HIF-1α e TNF-α estavam aumentados no grupo de mau prognóstico.
Valor prognóstico do miR-486-3p para os desfechos em 1 ano em pacientes com ACI combinado à SAOS
Os resultados da curva de Kaplan-Meier indicaram que níveis elevados de miR-486-3p estavam associados a um bom prognóstico, enquanto níveis baixos estavam associados a um prognóstico ruim (Figura 2D). Na análise univariada, a expressão do miR-486-3p e a pontuação NIHSS estavam associadas aos desfechos clínicos. Outras variáveis, incluindo a pontuação SAQLI (P = 0,078), HIF-1α (P = 0,086), TNF-α (P = 0,072), idade (P = 0,082), DM (P = 0,067), cardiopatia (P = 0,065) e AHI (P = 0,069), mostraram associações marginalmente significativas com o prognóstico, sendo também incluídas na análise multivariada de Cox. Na análise multivariada, o miR-486-3p manteve-se como fator protetor independente (HR = 0,437, IC 95%: 0,278–0,684, P < 0,001), enquanto a cardiopatia (HR = 1,822, IC 95%: 1,070–3,104, P = 0,027) e a pontuação NIHSS (HR = 1,597, IC 95%: 1,008–2,529, P = 0,046) emergiram como fatores de risco independentes para desfechos clínicos ruins (Tabela 3).
Resumo dos achados
Em resumo, o presente estudo demonstrou que o miR‑486‑3p está significativamente subregulado em pacientes com AVE isquêmico (ACI) e SAOS comórbida, e apresenta alta precisão diagnóstica para identificar SAOS nessa população. Foi observada uma relação clara dependente da dose entre os subgrupos de gravidade do SAOS, com redução progressiva do miR‑486‑3p e aumento gradativo dos marcadores inflamatórios (TNF‑α e PCR) do SAOS leve ao grave. Análises de correlação confirmaram ainda que o miR‑486‑3p apresenta associação negativa tanto com a gravidade do acidente vascular (NIHSS) quanto com a inflamação sistêmica. Importante, baixa expressão de miR‑486‑3p predisse desfechos funcionais ruins após 1 ano, e a regressão de Cox multivariada identificou o miR‑486‑3p como fator protetor independente após ajuste para possíveis fatores de confusão, incluindo NIHSS e IAH. Em conjunto, esses achados sustentam a hipótese de que o miR‑486‑3p pode atuar como um novo biomarcador diagnóstico e prognóstico para a comorbidade ACI‑SAOS, potencialmente por meio de seu papel regulador na inflamação sistêmica.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os dados brutos que apoiam as descobertas deste estudo estão disponíveis no Arquivo Suplementar 1, que inclui as características basais, níveis de expressão de miR‑486‑3p, medições por ELISA e dados de acompanhamento de mRS após 1 ano para todos os pacientes incluídos.
Figura 1: Alterações na expressão de miR-486-3p e marcadores inflamatórios nos subgrupos de gravidade de ACI combinada com SAOS e desempenho diagnóstico de miR-486-3p para SAOS. (A) Expressão relativa de miR-486-3p no grupo de ACI e nos subgrupos de ACI combinada com SAOS. (B) Concentração sérica combinada de TNF-α. (C) Concentração sérica de PCR no grupo de ACI (IAH < 5, n=100) e nos subgrupos de SAOS leve (5 ≤ IAH < 15, n=60), moderado (15 ≤ IAH < 30, n=75) e grave (IAH ≥ 30, n=35). (D) Curva ROC de miR-486-3p para discriminar pacientes com ACI e SAOS daqueles sem SAOS. ***P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Correlações da miR-486-3p com gravidade do acidente vascular cerebral e marcadores inflamatórios, e seu valor prognóstico para desfechos em 1 ano. (A–C) Análises de correlação de Spearman entre a expressão de miR-486-3p e escore NIHSS, TNF-α e PCR. (D) Curvas de sobrevida de Kaplan-Meier para probabilidade de bom prognóstico no acompanhamento de 1 ano, estratificadas pela mediana da expressão de miR-486-3p. ***P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Variável | ACI (n=100) | ACI e OSAS (n=170) | Valor de P | |
| Idade (anos) | 62,84 ± 12,65 | 61,31 ± 11,25 | 0,303 | |
| Gênero (masculino/feminino) | 68/32 | 116/54 | 0,968 | |
| IMC (kg/m2) | 24,74 ± 3,57 | 25,02 ± 3,47 | 0,531 | |
| Hipertensão, n (%) | 74 (74%) | 134 (78,82%) | 0,365 | |
| DM, n (%) | 22 (22%) | 43 (25,29%) | 0,543 | |
| Cardiopatia, n (%) | 13 (13%) | 25 (14,71%) | 0,698 | |
| AHI (vezes/h) | 2,07 ± 1,42 | 19,95 ± 9,19 | < 0,001*** | |
| Pontuação NIHSS | 1,70 ± 1,18 | 4,05 ± 1,73 | < 0,001*** | |
| PCR (ng/mL) | 2,03 ± 0,17 | 3,01 ± 0,27 | < 0,001*** | |
| Gravidade do ACI (leve/moderada) | 99/1 | 69/101 | < 0,001*** | |
| Dislipidemia (sim/não) | 52/48 | 96/74 | 0,478 | |
| Tabagismo (sim/não) | 48/52 | 91/79 | 0,382 | |
| Consumo de álcool (sim/não) | 40/60 | 87/83 | 0,076 | |
| Trombólise (sim/não) | 38/62 | 81/89 | 0,124 | |
| TOAST | 0,487 | |||
| Cardioembolismo (n) | 22 | 36 | ||
| Oclusão de vaso pequeno (n) | 18 | 28 | ||
| Aterosclerose de artéria grande (n) | 13 | 25 | ||
| AVC de etiologia indeterminada (n) | 5 | 19 | ||
| AVC de outra etiologia determinada (n) | 42 | 62 | ||
Tabela 1: Características basais de pacientes com ACI com e sem SAOS. Os dados são apresentados como média ± DP para variáveis contínuas ou n (%) para variáveis categóricas. Os valores de P foram calculados utilizando o teste t independente para variáveis contínuas e o teste qui-quadrado para variáveis categóricas. ACI, infarto cerebral agudo; SAOS, síndrome da apneia obstrutiva do sono; IMC, índice de massa corporal; DM, diabetes melito; IAH, índice de apneia-hipopneia; NIHSS, Escala de Acidente Vascular Encefálico dos Institutos Nacionais de Saúde; PCR, proteína C-reativa; TOAST, Estudo do Org 10172 no Tratamento do Acidente Vascular Encefálico Agudo.
| Variável | Prognóstico favorável (n=97) | Prognóstico desfavorável (n=73) | Valor P |
| Pontuação mRS | 0.88 ± 0.84 | 4.55 ± 1.08 | < 0.001*** |
| Pontuação SAQIL | 2.59 ± 1.17 | 3.12 ± 1.48 | 0.009** |
| Pontuação ESS | 8.69 ± 2.76 | 10.05 ± 2.79 | 0.002** |
| HIF-1α (pg/mL) | 1159.94 ± 277.86 | 1283.88 ± 445.15 | 0.027* |
| TNF-α (pg/mL) | 121.4 ± 12.87 | 128.4 ± 11.67 | < 0.001*** |
Tabela 2: Indicadores prognósticos nos grupos de bom e mau prognóstico de pacientes com AVE isquêmico e SAOS. Os pacientes foram divididos em grupos de bom prognóstico (mRS 0–2, n = 97) e mau prognóstico (mRS 3–6, n = 73) com base nos escores de mRS após 1 ano. Os dados são apresentados como média ± DP. Os valores de P foram calculados utilizando o teste t independente. mRS, Escala de Rankin Modificada; SAQLI, Índice de Qualidade de Vida na Apneia do Sono de Calgary; ESS, Escala de Sonolência de Epworth; HIF‑1α, fator induzível por hipóxia‑1α; TNF‑α, fator de necrose tumoral‑α.
| Variável | HR | IC 95% univariado | P | HR | IC 95% multivariado | P | ||
| Inferior | Superior | Inferior | Superior | |||||
| miR-486-3p | 0.442 | 0.228 | 0.679 | <0.001 | 0.437 | 0.278 | 0.684 | <0.001 |
| Pontuação SAQLI | 0.628 | 0.375 | 1.053 | 0,078 | 0.713 | 0.416 | 1.22 | 0,217 |
| Pontuação ESS | 0.922 | 0.595 | 1.429 | 0,718 | ||||
| HIF-1α | 0.694 | 0.457 | 1.053 | 0,086 | 0.802 | 0.523 | 1.229 | 0,311 |
| TNF-α | 1.469 | 0.966 | 2.233 | 0,072 | 1.494 | 0.978 | 2.284 | 0,063 |
| Idade | 1.445 | 0.955 | 2.188 | 0,082 | 1.29 | 0.845 | 1.97 | 0,238 |
| Gênero | 0.829 | 0.534 | 1.285 | 0,401 | ||||
| IMC | 1.196 | 0.786 | 1.821 | 0,402 | ||||
| Hipertensão | 0.754 | 0.465 | 1.222 | 0,252 | ||||
| DM | 1.512 | 0.972 | 2.351 | 0,067 | 1.246 | 0.79 | 1.965 | 0,343 |
| Cardiopatia | 1.611 | 0.971 | 2.673 | 0,065 | 1.822 | 1.07 | 3.104 | 0,027 |
| AHI | 1.468 | 0.97 | 2.222 | 0,069 | 1.125 | 0.734 | 1.725 | 0,588 |
| Pontuação NIHSS | 1.588 | 1.027 | 2.455 | 0,037 | 1.597 | 1.008 | 2.529 | 0,046 |
| Dislipidemia | 1.178 | 0.776 | 1.788 | 0,442 | ||||
| Tabagismo | 0.895 | 0.593 | 1.35 | 0,596 | ||||
| Consumo de álcool | 1.116 | 0.738 | 1.689 | 0,603 | ||||
| Trombólise | 1.259 | 0.834 | 1.902 | 0,272 | ||||
Tabela 3: Análises de regressão de Cox univariada e multivariada para prognóstico ruim em 1 ano em pacientes com ACV e SAOS. HR, razão de risco; CI, intervalo de confiança; SAQLI, Índice de Qualidade de Vida por Apneia do Sono de Calgary; ESS, Escala de Sonolência de Epworth; HIF‑1α, fator induzível por hipóxia‑1α; TNF‑α, fator de necrose tumoral‑α; BMI, índice de massa corporal; DM, diabetes melito; AHI, índice de apneia‑hipopneia; NIHSS, Escala de Acidente Vascular Cerebral dos Institutos Nacionais de Saúde. Variáveis com P < 0,1 na análise univariada foram incluídas no modelo de Cox multivariado.
Figura Suplementar 1: Fluxograma da seleção de pacientes e estratificação em subgrupos.Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 1: Validação cruzada cinco vezes para validação interna do valor diagnóstico do miR-486-3p. AUC, área sob a curva; IC, intervalo de confiança. A AUC média, sensibilidade e especificidade foram calculadas como a média aritmética ao longo das cinco partições.Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Os dados brutos que sustentam os achados deste estudo.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Pacientes com SAOS apresentam colapsos e obstruções repetidos das vias aéreas, levando à hipóxia intermitente (HI) e sonolência diurna excessiva (SDE), o que pode causar dano neuronal14A SAO é altamente prevalente após AVC, afetando aproximadamente 72% dos pacientes, e agravada significativamente o risco cardiovascular.15A ACI constitui um espectro de déficits neurológicos decorrentes da isquemia cerebral localizada e hipóxia secundária à perfusão inadequada16. A hipóxia intermitente central na fisiopatologia da SAOS provavelmente age em sinergia com o insulto isquêmico do AVE, amplificando a lesão cerebral. No entanto, pesquisas focadas especificamente nesse estado comórbido de alto risco são escassas. Evidências crescentes indicam que os miRNAs desempenham papéis fundamentais na patogênese tanto da SAOS quanto do AVE17,18. Observou-se previamente que o miR-486-3p pode estar associado à SAOS e à AVEI. Assim, investigamos o miR-486-3p como uma possível ligação molecular entre SAOS e AVEI. É importante destacar que esta coorte foi recrutada de novembro de 2020 a dezembro de 2023, período que abrange a pandemia de COVID-19. Evidências acumuladas sugerem que a inflamação sistêmica persistente desencadeada pela infecção por SARS-CoV-2 pode agravar a lesão neuronal e promover a progressão de lesões neurodegenerativas.19,20No entanto, o presente estudo não se concentra na infecção por SARS-CoV-2/COVID-19, e nossos objetivos e desenho da pesquisa não estão relacionados à COVID-19. Foi observada uma redução significativamente menor do miR-486-3p sérico na ICAs combinada com SAOS, oferecendo evidências clínicas iniciais para seu papel nessa comorbidade e destacando a necessidade de estudos adicionais.
A pontuação da NIHSS pode avaliar a gravidade de um acidente vascular cerebral11. O AHI na polissonografia é comumente usado para diagnosticar a SAOS, e quanto maior a pontuação de AHI, mais grave é a SAOS21. Diante dos desafios clínicos e logísticos da polissonografia, identificar biomarcadores acessíveis para apneia obstrutiva do sono em pacientes com acidente vascular cerebral é fundamental22. Os achados atuais indicaram que o miR-486-3p apresenta grande potencial diagnóstico para SAOS combinada com AVE isquêmico, pois seus níveis apresentam correlação inversa com as pontuações de AHI e NIHSS, refletindo a gravidade da doença.
Metodologicamente, este estudo demonstra a viabilidade de integrar perfis moleculares com fenotipagem clínica quantitativa em uma única coorte para avaliar simultaneamente a precisão diagnóstica, relações dose-resposta e valor prognóstico. Esse arcabouço integrado pode servir como referência para futuros estudos de descoberta de biomarcadores em comorbidades relacionadas ao acidente vascular cerebral, onde interações complexas entre múltiplas vias fisiopatológicas frequentemente complicam análises tradicionais baseadas em um único desfecho.
A HI é uma característica marcante da SAOS e induz inflamação e dano tecidual ao ativar vias de sinalização pró-inflamatórias23. Criticamente, esse estado inflamatório se intersecciona com e exacerba a patogênese do AVE, no qual a inflamação pós-isquêmica media a lesão cerebral secundária24,25. Mediadores inflamatórios-chave, como TNF-α e PCR, estão elevados em ambas as condições, posicionando-se no ponto de convergência das cascatas inflamatórias induzidas pela hipóxia e desencadeadas pelo isquemia, tornando-os moléculas centrais na patologia comórbida do AVE e da SAOS26,27,28. Assim, foram detectadas as concentrações séricas de TNF-α e PCR em pacientes com AVE combinado à SAOS. Neste estudo, as correlações negativas observadas entre os níveis séricos de miR-486-3p e os níveis de TNF-α e PCR no AVE combinado à SAOS sugerem uma possível ligação entre este miRNA e o estado inflamatório sistêmico característico dessa condição comórbida.
A SAOS tem um efeito muito adverso sobre a qualidade de vida, e o SAQLI é um questionário específico para a qualidade de vida em SAOS29. A sonolência diurna excessiva (SDE) é um sintoma comum da SAOS, e a SAOS acompanhada de SDE leva a eventos adversos mais frequentes e pior prognóstico30. A escala ESS é comumente usada para determinar a gravidade da sonolência diurna31. Na SAOS, episódios recorrentes de HI são considerados um fator de risco independente para doenças vasculares32. Além disso, o estresse oxidativo derivado da HI pode levar a complicações como osteoporose, aumento do risco cardiovascular e alterações neurológicas33. Portanto, este estudo também examinou a expressão de HIF-1α. A descoberta de níveis elevados de HIF-1α no grupo de mau prognóstico de ACI combinada com SAOS está de acordo com a fisiopatologia da hipóxia intermitente crônica na SAOS. Além disso, os resultados mostraram que miR-486-3p e TNF-α estavam correlacionados com o prognóstico na ACI combinada com SAOS, e níveis baixos de miR-486-3p foram associados a mau prognóstico. Isso sugere uma cascata potencial na qual o HIF-1α induzido pela HI suprime o miR-486-3p, contribuindo assim para a superexpressão de mediadores inflamatórios como o TNF-α, agravando ainda mais a lesão cerebral na ACI.
Este estudo ainda apresenta limitações. Este estudo é limitado pela ausência de grupos controle (saudáveis, apenas SAOS), o que impede a definição de uma faixa normal para o miR-486-3p e a distinção entre alterações específicas da comorbidade e aquelas provocadas apenas pelo SAOS. Portanto, trabalhos futuros devem incluir esses grupos para mapear completamente o perfil de expressão do miR-486-3p. Além disso, é insuficiente inferir o mecanismo regulador específico do miR-486-3p apenas com base em correlação. Verificaremos seu mecanismo molecular em experimentos futuros.
Do ponto de vista translacional, a alta precisão diagnóstica e o valor prognóstico independente do miR‑486‑3p sugerem diversas aplicações clínicas potenciais. Como biomarcador baseado em sangue, ele poderia ser integrado à avaliação rotineira de AVC para identificar pacientes com ACI que tenham OSAS subjacente, facilitando a encaminhamento precoce para polissonografia e intervenção oportuna. O monitoramento dos níveis de miR‑486‑3p nas fases aguda e subaguda pode ajudar a acompanhar a dinâmica inflamatória e estratificar pacientes quanto ao risco prognóstico, permitindo estratégias personalizadas de reabilitação. Essas possibilidades translacionais exigem investigação adicional em estudos prospectivos e multicêntricos. Em geral, o miR-486-3p pode participar da ACI combinada com OSAS por meio da regulação de fatores inflamatórios e possui valor diagnóstico e prognóstico nessa condição.
Divulgações
Este estudo foi financiado por ‘Pesquisa sobre Tecnologias de Prevenção e Tratamento de Acidente Vascular Cerebral’ (nº WKZX2023CZ0143).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Scanner de RM 3,0 T | Siemens Healthineers, Alemanha | MAGNETOM Skyra | Imagem cerebral para confirmação de infarto cerebral agudo |
| Placas microplacas de ELISA de 96 poços | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., China | XBS-PLATE | Reação antígeno-anticorpo para detecção por ELISA |
| Diretrizes Clínicas da AASM para Distúrbios Respiratórios do Sono | Academia Americana de Medicina do Sono | diretriz completa de 2020 | Critérios padronizados de diagnóstico de AHI e estratificação da gravidade de SAOS |
| Índice de Qualidade de Vida da Apneia do Sono de Calgary (SAQLI) versão chinesa validada | Universidade de Calgary | edição traduzida de 2021 | Avaliação da qualidade de vida em pacientes com ACI complicada por SAOS |
| Tubos de coleta de sangue a vácuo com EDTA-K2 5 mL | BD Biosciences, EUA | 367863 | Coleta de sangue venoso periférico para separação de soro |
| Escala de Sonolência de Epworth (ESS) versão chinesa validada | Universidade Johns Hopkins | edição revisada de 2018 | Avaliação da sonolência diurna em pacientes com acidente vascular cerebral |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Software, EUA | Versão 9.4.1 | Gráficos de dispersão, gráficos de caixa, visualização da curva ROC |
| Kit ELISA para PCR humana | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, China | XBS-H001 | Detecção quantitativa de proteína C-reativa sérica |
| HIF-1 humanoα Kit ELISA | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, China | XBS-H007 | Detecção quantitativa do fator induzível por hipóxia-1 séricoα |
| TNF humanoα Kit ELISA | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, China | XBS-H003 | Detecção quantitativa de TNF séricoα fator inflamatório |
| IBM SPSS Statistics 23.0 | IBM, Armonk, NY, EUA | Versão 23.0 | Todas as análises estatísticas (teste t, correlação, ROC, Kaplan–Meier, regressão de Cox |
| Espectrofotômetro de Placa de Microtitulação | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA) | Multiskan FC | Leitura da absorbância em placas de ELISA a 450 nm |
| miR-486-3p & Primeres de qPCR para U6 | Sangon Biotech, Xangai, China | Síntese personalizada | Amplificação de genes alvo e de referência para qPCR |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha | 218073 | Amplificação por PCR quantitativa em tempo real de miR-486-3p e U6 |
| Escala de Acidente Vascular Cerebral do NIH (NIHSS) - Versão Chinesa Validada | Instituto Nacional de Transtornos Neurológicos e Derrames (NINDS), EUA | Edição clínica padrão | Avaliação de gravidade neurológica basal para pacientes com AVC isquêmico |
| Software de Classificação do Sono PSG | BMC Medical Co., Ltd., China | v3.2 | Pontuação automatizada preliminar de eventos respiratórios durante o sono |
| Sistema de PCR em Tempo Real QuantStudio 6 Pro | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA) | QuantStudio 6 Pro | Amplificação por RT-qPCR, aquisição da curva de dissociação, registro dos valores de Ct |
| Software QuantStudio de PCR em Tempo Real | Applied Biosystems, EUA | v1.7 | Exportação de dados brutos de qPCR, análise dos valores de Ct |
| Centrífuga de Bancada Refrigerada | Xiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., Hunan, China | TDZ5-WS | Separação de soro a partir de sangue total (2700 × g 4 °C) |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | K1691 | Transcrição reversa de miARN sérico em cDNA |
| Tubos microcentrífugos de 1,5 mL livres de RNase | Axygen, EUA | MCT-150-C | Aliquotagem e armazenamento do soro separado |
| Reagente TRIzol para Isolamento de RNA | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | 15596026 | Extração de RNA total de amostras de soro humano |
| Congelador de Temperatura Ultra-baixa | Haier Biomedical, Shandong, China | DW-86L388 | Armazenamento prolongado de amostras de soro a −80 °C |
| Monitor de Polissonografia YH-600B | BMC Medical Co., Ltd., Pequim, China | YH-600B | Monitoramento do sono durante a noite e cálculo do IAH para o diagnóstico de SAOS |
Referências
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