Este estudo foi conduzido de acordo com os padrões éticos do Hospital Municipal Quarto de Xangai, Escola de Medicina da Universidade Tongji, e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (Número de Aprovação 2026013-001). Os dentes humanos extraídos utilizados neste estudo foram coletados de pacientes submetidos à extração dentária por razões ortodônticas ou periodontais. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da coleta das amostras. Nenhuma intervenção clínica adicional foi realizada com o objetivo deste estudo. O estudo foi conduzido de acordo com os requisitos institucionais para o uso de dentes humanos extraídos.
Preparação e Critérios de Seleção dos Espécimes
Um total de 141 dentes permanentes com raiz única (incisivos mandibulares e pré-molares) recém-extraídos foi recebido do Departamento de Estomatologia, vinculado ao Hospital Municipal Quarto de Xangai da Universidade Tongji. Todos os dentes foram removidos por razões ortodônticas ou periodontais. O consentimento informado foi obtido de cada paciente. Foram incluídos neste estudo dentes com raízes de pelo menos dez milímetros, conforme determinado por uma sonda periodontal, dentes íntegros sem lesões cariosas ou trincas, formação radicular completa e curvatura radicular inferior a dez graus de acordo com o método de Schneider. Foram excluídos deste estudo dentes com múltiplos canais, calcificação do canal, reabsorção interna ou tratamento endodôntico prévio. Após a extração, todos os cálculos visíveis e remanescentes de tecido mole foram removidos utilizando um escalador periodontal. Os dentes foram então armazenados em solução salina a 0,9% a 4°C até o uso, para prevenir desidratação, e todos os experimentos foram realizados dentro de três meses após a extração. Os espécimes foram alocados aos grupos experimentais utilizando uma sequência predefinida de alocação alternada. Especificamente, os espécimes foram alocados sequencialmente a cada grupo de maneira alternada até que o tamanho amostral necessário para cada grupo fosse alcançado. Nenhum cálculo formal de poder a priori foi realizado. O tamanho da amostra foi determinado com base em estudos ex vivo comparáveis anteriores, no número de combinações de parâmetros de irradiação avaliadas e na disponibilidade de dentes extraídos elegíveis.
Preparação e Esterilização do Canal Radicular
A coroa de cada dente foi removida na junção cemento-esmalte utilizando uma serra diamantada de baixa velocidade com refrigeração contínua por água, a fim de obter um segmento radicular padronizado de 10 mm. O comprimento de trabalho foi determinado com 1 mm antes do forame apical, utilizando uma lima K tamanho 10. Os canais radiculares foram preparados utilizando o sistema rotatório de níquel-titânio ProTaper Universal, conforme instruções do fabricante, seguindo a sequência S1, S2, F1, F2 e F3, até alcançar o tamanho apical F3. Durante a instrumentação, os canais foram irrigados com aproximadamente 2 mL de hipoclorito de sódio a 5,25% após a utilização de cada lima rotatória, resultando em um volume total de irrigação de aproximadamente 10 mL por canal. Uma irrigação final foi realizada com 5 mL de EDTA a 17% durante 1 minuto, seguida por 5 mL de solução salina estéril. O forame apical foi selado com resina composta fluída para criar um sistema de canal fechado. As raízes preparadas foram esterilizadas em autoclave a 121°C por 20 minutos, armazenadas em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a 4°C e inoculadas com bactérias dentro de 24 horas após a esterilização.
Estirpe Bacteriana e Condições de Cultivo
E. faecalis ATCC 29212 foi utilizada para estabelecer o modelo de canal radicular infectado. A estirpe foi cultivada em ágar infusão cérebro-coracão (BHI) a 37°C por 24 h em condições aeróbicas. Uma única colônia foi transferida para caldo BHI e incubada a 37°C por 18–24 h. A suspensão bacteriana foi ajustada para aproximadamente 1,5 × 108 UFC/mL, equivalente ao padrão McFarland 0,5, utilizando um valor de densidade óptica a 600 nm (OD600) entre 0,08 e 0,10.
Estabelecimento de E. faecalis Modelo de Canal Radicular Infectado
Para estabelecer um modelo de biofilme em canal radicular infectado, a superfície externa de cada raiz esterilizada foi revestida com duas camadas de esmalte incolor para unhas, a fim de impedir a penetração bacteriana através do cemento. A região apical foi revestida após o forame apical ter sido selado com resina composta fluída, enquanto a abertura do canal permaneceu sem revestimento para permitir a inoculação bacteriana. Utilizando uma micropipeta estéril, 10 µL do E. faecalis a suspensão foi transferida para cada canal radicular individual para preencher todo o comprimento do canal sem derramar. As amostras inoculadas foram então colocadas individualmente em placas de cultura estéreis de 24 poços, com 1,5 mL de caldo BHI adicionado a cada poço. As amostras foram cultivadas em 37°C em condições aeróbicas por 21 dias. O meio de crescimento foi removido e substituído por caldo BHI estéril fresco a cada 2 dias para fornecer nutrientes para o crescimento bacteriano contínuo e para remover detritos celulares acumulados. Nenhuma inoculação adicional com E. faecalis foi realizada durante a troca do meio. Após a conclusão do período de incubação, todas as amostras viáveis foram lavadas uma vez com PBS para remover bactérias planctônicas fracamente aderidas antes dos testes experimentais. Duas amostras selecionadas aleatoriamente foram utilizadas para visualizar a formação de biofilme maduro e a penetração bacteriana nos túbulos dentinários por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os espécimes foram fixados em glutaraldeído 2,5% em 4°C por 24 h, lavadas três vezes com PBS, desidratadas em série crescente de etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90% e 100%), com cada etapa durando 10 min, em seguida divididas longitudinalmente, secas ao ar, montadas em suportes de alumínio, metalizadas com ouro por pulverização catódica e examinadas por MEV.
Grupos Experimentais e Protocolos de Irradiação com Laser
As 135 amostras de raízes infectadas foram divididas em três grupos experimentais principais de acordo com o sistema a laser utilizado: o Grupo de Laser de Diodo de 808 nm, o Grupo de Laser de Túlio de 1940 nm e o Grupo de Laser de Érbio de 2940 nm. Havia 45 amostras em cada grupo a laser, que foram posteriormente subdivididas de acordo com os parâmetros de irradiação. O laser de diodo foi operado com potências médias de 1,0, 1,5 ou 2,0 W, e cada ajuste de potência foi aplicado por 10, 20 ou 30 s, resultando em nove subgrupos com três amostras por subgrupo. O laser de túlio foi operado com potências médias de 1,5, 2,5 ou 3,5 W, e cada ajuste de potência foi aplicado por 10, 20 ou 30 s, também resultando em nove subgrupos com três amostras por subgrupo. O laser de érbio operou em modo de pulso supercurto com uma frequência fixa de 15 Hz. Energias de pulso de 10, 20 ou 30 mJ foram aplicadas por 10, 20 ou 30 s, gerando nove subgrupos com três amostras por subgrupo. Tanto o laser de diodo de 808 nm quanto o laser de túlio de 1940 nm foram operados em modo contínuo.
No total, seis amostras adicionais foram incluídas, com três amostras atribuídas a cada um dos grupos controle negativo e controle positivo. O grupo controle negativo foi tratado com solução salina estéril, enquanto o grupo controle positivo foi tratado com hipoclorito de sódio a 5,25% (NaOCl) durante 30 s.
Para os grupos com laser, seguiu-se um protocolo padronizado de irradiação. A fibra óptica foi introduzida no canal radicular até o comprimento de trabalho e movimentada em movimento espiral lento e contínuo, da direção apical para a coronal, durante todo o período de irradiação. Foram utilizadas fibras ou pontas de entrega específicas para cada laser, em vez de uma única fibra intercambiável. O laser de diodo de 808 nm foi aplicado por meio de uma fibra emissora terminal de 200 µm, o laser de túlio de 1940 nm por uma fibra emissora terminal de 200 µm, e o laser de érbio de 2940 nm por uma ponta radial de 400 µm. A fibra ou ponta de entrega foi retirada a uma velocidade aproximada de 1 mm/s. Após atingir o orifício do canal, foi retornada ao comprimento de trabalho, e o movimento espiral de apical para coronal foi repetido até que a duração de irradiação estipulada fosse completada.
Para os lasers de túlio e érbio, os canais foram mantidos preenchidos com solução salina estéril durante a irradiação, a fim de simular a ativação a laser assistida por água. Cerca de 10 µL de solução salina estéril foram introduzidos em cada canal para preenchê-lo até o nível do orifício canalicular antes da irradiação. A solução salina foi reposta antes de cada ciclo de irradiação, quando necessário, para manter o canal preenchido com líquido durante todo o tratamento. Para o grupo do laser de diodo, os canais foram secos com pontas de papel estéreis antes da irradiação, pois o laser de diodo de 808 nm apresenta absorção relativamente baixa na água e foi utilizado para produzir um efeito fototérmico antibacteriano direto dentro do canal. Em contraste, os lasers de túlio em 1940 nm e de érbio em 2940 nm possuem absorção significativamente maior na água e, portanto, foram aplicados em canais preenchidos com solução salina para facilitar efeitos fototérmicos e fotomecânicos mediados pela água. O tratamento a laser foi repetido uma vez ao dia durante três dias consecutivos.
Medição da Temperatura da Superfície Radicular Externa
As alterações de temperatura em tempo real na superfície radicular externa foram medidas durante o primeiro dia de irradiação a laser. Cada espécime radicular foi fixado verticalmente em um suporte universal à temperatura ambiente (22°C ± 1°C). Um termopar do tipo K conectado a um termômetro digital foi colocado em contato firme com o terço médio da superfície radicular externa, perpendicular ao eixo longo da raiz. A sonda do termopar foi posicionada com uma braçadeira ajustável e fixada à superfície radicular com fita adesiva resistente ao calor para manter um contato firme e constante durante toda a medição. A sonda do termopar foi calibrada antes de cada sessão de medição utilizando água em ebulição (100°C) e uma mistura de gelo e água (0°C). As leituras de temperatura foram registradas em intervalos de 50 ms durante todo o período de irradiação (10, 20 ou 30 s). Tanto a temperatura basal quanto a temperatura máxima registrada durante ou imediatamente após a irradiação a laser foram medidas para cada espécime. O aumento de temperatura da temperatura basal até a temperatura de pico foi calculado como ΔT. Um ΔT superior a 10°C foi considerado o limiar para possível dano aos tecidos periodontais.
Avaliação Microbiológica: Contagem de Colônias e Taxa de Inibição
Para determinar o efeito antibacteriano dos tratamentos a laser, amostras foram coletadas após cada tratamento a laser. O canal foi secado com pontas de papel estéreis. Um novo arquivo estéril tamanho 40 Hedström foi utilizado para cada espécime para obter fragmentos de dentina das paredes do canal, evitando assim a contaminação cruzada entre as amostras. Cada fragmento de dentina foi transferido para um tubo microcentrífugo separado contendo 1 mL de PBS estéril. Os tubos foram agitados vigorosamente em vórtex por 30 s para liberar as bactérias dos fragmentos de dentina. Diluições seriadas de 10 vezes, variando de 10−1 a 10−6, foram preparadas transferindo-se 100 µL da suspensão bacteriana para 900 µL de PBS estéril em cada etapa de diluição. Alíquotas (30 µL) de cada diluição foram espalhadas em placas separadas de ágar infusão cerebral-coração, as quais foram incubadas a 37°C por 24 h. As colônias foram contadas e registradas como unidades formadoras de colônia (UFC). Cada diluição foi plaqueada em triplicata, e a contagem média de colônias das três placas foi utilizada para análise. As placas foram codificadas antes da contagem, e o pesquisador responsável pela contagem das colônias estava cego quanto às atribuições de tratamento.

Aqui, C é a contagem média de UFC do grupo controle negativo (solução salina) e T é a contagem média de UFC do grupo experimental.
Análise da Curva de Crescimento Bacteriano
O efeito de diversos tratamentos a laser sobre a cinética de crescimento bacteriano foi investigado por meio da construção de curvas de crescimento. No terceiro dia após o tratamento a laser final, os canais foram lavados com 5 mL de solução salina estéril. O conteúdo dos canais foi coletado utilizando pontas de papel estéreis, que foram então transferidas para um tubo de centrífuga contendo 5 mL de caldo BHI. O tubo foi agitado em vórtex para suspender as bactérias no caldo. A suspensão bacteriana foi ajustada para 1 × 106 UFC/mL. A concentração bacteriana foi ajustada com base em medições de OD600, utilizando uma curva de calibração previamente estabelecida para E. faecalis ATCC 29212, e posteriormente verificada por contagem de colônias viáveis. Uma alíquota de 200 µL da suspensão foi adicionada a cada poço de uma microplaca estéril de 96 poços. Adicionalmente, 20 µL de óleo mineral estéril foram adicionados a cada poço para minimizar a evaporação. A microplaca foi colocada em um espectrofotômetro/incubadora mantido a 37°C, e a OD600 foi medida a cada hora durante 24 h. Antes de cada medição de OD600, a microplaca foi submetida a agitação orbital a aproximadamente 300 rpm por 10 s para garantir uma suspensão bacteriana homogênea. Cada amostra foi testada em cinco poços replicados.
Análise Estatística
Todos os dados numéricos são apresentados como média ± desvio padrão (DP). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o SPSS Versão 26.0. A distribuição dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro–Wilk. A análise de variância (ANOVA) foi utilizada para comparar mais de dois grupos, seguida pelo teste de diferença significativa honesta (HSD) de Tukey para comparações aos pares. As comparações entre dois grupos foram realizadas utilizando o teste t para amostras independentes. A homogeneidade da variância foi avaliada pelo teste de Levene antes da aplicação dos testes paramétricos. Quando o pressuposto de homogeneidade da variância foi violado, a correção de Welch foi aplicada, conforme apropriado. A significância estatística foi definida como P < 0,05. Os gráficos foram gerados utilizando o GraphPad Prism Versão 9.0.