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Artigo de investigação

Análise Correlacional do Grânulo Qiming com a Rede Centrada em CMKLR1 e Inflamação Sistêmica via Eixo Intestino-Retina na Retinopatia Diabética

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DOI:

10.3791/72700

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15 de setembro de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este estudo demonstra que o Granulado Qiming (QMG) melhora a retinopatia diabética (DR) por meio da modulação do eixo intestino-retina. O QMG reestruturou a microbiota intestinal, suprimiu a inflamação sistêmica e restaurou a rede reguladora centrada em CMKLR1, revertendo assim os danos histopatológicos retinianos. Esses achados posicionam o QMG como uma estratégia terapêutica promissora direcionada ao eixo intestino-retina para a DR.

Resumo

A retinopatia diabética (RD) é uma complicação neurovascular provocada pela hiperglicemia crônica e inflamação sistêmica, com evidências emergentes destacando o eixo intestino-retina como um alvo terapêutico crítico, porém subutilizado. Este estudo investiga se o Granulado Qiming (QMG) exerce sua eficácia protetora contra a RD por meio da modulação do eixo intestino-retina. Camundongos C57BL/6 foram randomizados em grupos experimentais e submetidos a intervenções distintas. As alterações histopatológicas da retina foram avaliadas por coloração com hematoxilina-eosina (HE). Os níveis séricos de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α) foram medidos por ensaio imunoenzimático (ELISA). A expressão de proteínas reguladoras-chave (CMKLR1, Wnt5a, PPAR-γ, AP-1, TP53) nos tecidos retiniano e colônico foi detectada por Western blot (WB). A composição e diversidade da microbiota intestinal foram caracterizadas por sequenciamento completo do gene 16S de rDNA. Análises de correlação foram realizadas para avaliar as relações entre a microbiota intestinal e fatores inflamatórios ou proteínas-chave. O tratamento com QMG melhorou as anormalidades histopatológicas da retina, evidenciado pela restauração da arquitetura laminar retiniana, recuperação parcial do número de células ganglionares da retina (P < 0,001) e reversão do afinamento retiniano (P < 0,01). Também reduziu significativamente os níveis séricos de IL-1β, IL-6 e TNF-α (P < 0,0001). Ao longo do eixo intestino-retina, o QMG reverteu a expressão anormal de proteínas reguladoras-chave, notadamente a rede centrada em CMKLR1 (Wnt5a, PPAR-γ, AP-1, TP53). Além disso, o QMG restaurou a composição, diversidade e função da microbiota intestinal, e as análises de correlação revelaram que o QMG acopla a inflamação sistêmica a essas proteínas reguladoras para modular o eixo intestino-retina. Este estudo fornece evidências farmacológicas preliminares de que o QMG atenua a RD acoplando a rede reguladora centrada em CMKLR1 (incluindo Wnt5a, PPAR-γ, AP-1 e TP53) à inflamação sistêmica por meio do eixo intestino-retina, posicionando o QMG como uma promissora estratégia terapêutica direcionada ao eixo intestino-retina para a RD.

Introdução

A retinopatia diabética (DR), uma das complicações microvasculares mais comuns do diabetes melito (DM), é uma das principais causas de cegueira entre adultos em idade ativa em todo o mundo1. Globalmente, a DR afeta aproximadamente 20–30% da população com DM2. A hiperglicemia crônica impulsiona a patogênese da DR ao desencadear uma cascata de eventos patológicos, incluindo acoplamento neurovascular prejudicado, respostas inflamatórias acentuadas e estresse oxidativo3. Recentemente, foram observadas alterações na diversidade e composição da microbiota intestinal em pacientes diabéticos com retinopatia, em comparação com aqueles sem a condição4,5. Consequentemente, o eixo intestino-retina — uma rede de comunicação bidirecional que liga a homeostase intestinal à saúde da retina — emergiu como um novo fator contribuinte para a progressão da DR. No entanto, os mediadores moleculares específicos que traduzem os sinais do eixo intestino-retina em patologia retiniana ainda são pouco caracterizados, limitando a identificação de biomarcadores confiáveis e alvos terapêuticos.

O eixo intestino-retina delineia uma rede complexa de comunicação bidirecional entre a microbiota intestinal e seus metabólitos com os tecidos retinianos por meio de vias imunológicas, metabólicas, neuroendócrinas e vasculares, modulando assim seu equilíbrio homeostático6. Molecularmente, o eixo intestino-retina caracteriza-se pela desregulação de proteínas-chave responsivas ao estresse e determinantes do destino celular, especificamente AP-1 e TP537,8,9. Além disso, CMKLR1, um receptor de quimiocina chave, surge como mediador essencial da disfunção endotelial e da desregulação metabólica, estabelecendo uma ligação crítica entre alterações na microbiota intestinal e a patogênese da retinopatia diabética10. Importante, a sinalização Wnt coordena papéis reguladores duplos na manutenção da homeostase vascular retiniana e na função da barreira epitelial intestinal11, enquanto a sinalização PPAR atua como reguladora mestra das respostas inflamatórias e processos metabólicos em tecidos oculares e intestinais12,13. Esses componentes moleculares constituem coletivamente uma rede de sinalização interconectada dentro do eixo intestino-retina, oferecendo novas perspectivas mecanicistas e oportunidades terapêuticas para complicações relacionadas ao diabetes. Assim, direcionar as alterações estruturais e funcionais ao longo desse eixo representa uma estratégia promissora para o manejo da RD.

A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) desempenhou historicamente um papel significativo no tratamento da diabetes e da retinopatia relacionada, com decisões terapêuticas baseadas na diferenciação de síndromes14. O Granulado Qiming (QMG), composto por Astragalus membranaceus, Pueraria lobata, Rehmannia glutinosa, Lycium barbarum, Senna obtusifolia, Leonurus japonicus, Typha angustifolia e Whitmania pigra, é amplamente utilizado no tratamento da DR. Aprovado pela Administração Nacional de Produtos Médicos da China (Nº de Aprovação Z20090036), o QMG concluiu com sucesso ensaios clínicos e obteve autorização para comercialização. O QMG exibe efeitos protetores ao prevenir o espessamento da membrana basal nos capilares retinianos, reduzir os danos aos pericitos e à microvasculatura retiniana e manter a morfologia patológica local do olho15, tornando-se uma terapia promissora para o tratamento da DR. Ao atuar sobre proteínas-chave e fatores inflamatórios, os componentes ativos do QMG exercem efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e antiapoptóticos, fornecendo uma base mecanicista para sua modulação do eixo intestino-retina16. Essas propriedades fornecem uma base mecanicista para o potencial do QMG de modular o eixo intestino-retina, embora poucos estudos tenham explorado essa ligação. Portanto, este estudo tem como objetivo validar a eficácia do QMG na modulação do eixo intestino-retina, fornecendo evidências experimentais sobre seu potencial terapêutico na DR.

Este estudo integra previsões teóricas com dados experimentais in vivo para validar a eficácia do QMG na modulação do eixo intestino-retina. Esses achados demonstram que o QMG atenua a DR ao acoplar a rede reguladora centrada em CMKLR1 (incluindo Wnt5a, PPAR-γ, AP-1 e TP53) à inflamação sistêmica por meio do eixo intestino-retina, posicionando o QMG como uma promissora estratégia terapêutica direcionada ao eixo intestino-retina para a DR. O resumo gráfico está apresentado na Figura 1.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com as diretrizes ARRIVE. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Ética da Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd. (IACUC ISSUE SYST-2024-011).  Um cronograma experimental detalhado, resumindo o desenho do estudo, está fornecido na Figura Suplementar 1.

Preparação e tratamento dos animais

Os camundongos foram profundamente anestesiados por inalação de isoflurano a 2%. Sob anestesia profunda, o sangue foi coletado por enucleação retro-orbital. Imediatamente após a coleta de sangue, os bulbos oculares foram enucleados para a obtenção do tecido retiniano. Posteriormente, foi realizada a dislocação cervical sob anestesia profunda para garantir a eutanásia. Os tecidos do cólon foram então dissecados imediatamente. Os animais que apresentaram eventos adversos foram imediatamente retirados do estudo e receberam cuidados veterinários apropriados.

Randomização e mascaramento

Camundongos machos C57BL/6, com idade de 5 semanas e peso entre 20 e 30 gramas, foram acomodados em condições estritamente reguladas, incluindo temperatura e umidade. Após uma semana de aclimatação, os camundongos C57BL/6 foram aleatorizados em três grupos (grupo branco, grupo modelo e grupo de intervenção) utilizando uma sequência de números aleatórios gerada por computador. A sequência de aleatorização foi gerada por um pesquisador não envolvido no manejo dos animais ou na avaliação dos desfechos.

Para garantir a cegagem, todos os cuidados com os animais, administração de fármacos e coleta de dados foram realizados por pesquisadores que desconheciam a alocação dos grupos. Os códigos de alocação dos grupos foram revelados somente após a conclusão de todos os experimentos e análises estatísticas. A cegagem foi aplicada a: o técnico que realizou a gavagem oral; o patologista que avaliou a histologia da retina; e o analista que quantificou as bandas de Western blot (WB).

Cálculo do tamanho da amostra

O tamanho da amostra foi determinado com base em um experimento preliminar que avaliava a contagem de células ganglionares da retina (RGC) nas mesmas condições experimentais. Assumindo um nível de significância bilateral (α) de 0,05 e um poder estatístico (1-β) de 0,80, foi necessário um mínimo de 5 camundongos por grupo para detectar uma diferença clinicamente relevante na contagem de RGC entre os grupos modelo e de intervenção. Considerando uma taxa de perda potencial de aproximadamente 20%, cada grupo foi definido com 6 camundongos.

Estabelecimento de animais diabéticos

O grupo controle recebeu uma dieta padrão, enquanto os grupos de intervenção e modelo foram submetidos a uma dieta rica em gordura e açúcar (HFHSD) durante um período de quatro semanas. Após esse período alimentar, os grupos de intervenção e modelo receberam injeção intraperitoneal com uma solução de 1% de estreptozotocina (STZ) na dose de 35 mg/kg17,18,19,20. Após setenta e duas horas da injeção, os camundongos que apresentaram níveis de glicose sanguínea em jejum superior a 16,7 mmol/L foram considerados como tendo induzido com sucesso um modelo de DM e foram selecionados para experimentação adicional. Os animais com DM continuaram com a dieta rica em gordura e açúcar por mais quatro meses, enquanto o grupo controle manteve sua dieta padrão.

Validação taxonômica e avaliação da qualidade

Os oito ingredientes na QMG foram validados taxonomicamente utilizando a Pesquisa de Nomes de Plantas Modernizada (MPNS, http://mpns.kew.org/mpns-portal/). A qualidade da apresentação da composição da QMG foi avaliada utilizando a ferramenta ConPhYMP.

Métodos de administração

No grupo de intervenção, os animais receberam QMG por via oral. O QMG foi adquirido da Zhejiang Sansheng Mandi Pharmaceutical Co., Ltd. (número de aprovação nacional de medicamento chinês Z20090036). A suspensão de QMG foi preparada misturando-se uniformemente o QMG com água destilada. Os camundongos do grupo de intervenção receberam a suspensão por gavagem oral em volume equivalente aos grupos modelo e controle. A dose foi calculada com base na dose terapêutica clínica única de 4,5 g por adulto de 60 kg (dose unitária padrão da formulação comercializada), utilizando o método de normalização pela área da superfície corporal (ASC) recomendado pela FDA e Reagan-Shaw21. O fator de conversão entre humanos adultos (Km = 37) e camundongos (Km = 3) foi de 12,33, resultando em uma dose de 0,9 g/kg de peso corporal para camundongos. O grupo modelo e o grupo controle receberam volume equivalente de solução salina por gavagem oral. A administração foi realizada diariamente entre 9h e 11h durante um período consecutivo de 3 meses.

Observação e indicadores de teste

Monitoramento geral dos sinais vitais

Os sinais vitais gerais e indicadores fisiológicos, incluindo peso corporal, níveis de glicose no sangue, consumo de água e alimento, volume urinário, níveis de atividade e comportamento, temperatura corporal, bem como a condição da pelagem e da pele, foram sistematicamente observados e registrados para avaliar de forma abrangente as intervenções terapêuticas e detectar possíveis complicações.

Observação de alterações morfológicas na retina por meio da análise de coloração HE

Todos os espécimes foram processados em um desidratador automático utilizando uma série de soluções de etanol e xilol após a fixação, seguido de inclusão em parafina. Posteriormente, cortes de 4 µm em parafina foram realizados e corados com HE e então montados com goma neutra. As imagens da retina foram digitalizadas usando um escâner 3DHISTECH Pannoramic SCAN. A análise de imagens e a mensuração dos dados foram realizadas pelo Image-Pro Plus.

Detecção de IL-6, TNF-α e IL-1β séricos por análise de ELISA

As amostras de sangue foram coletadas por enucleação retro-orbital. O soro foi separado por centrifugação a 1.000 × g durante 15 min a 4 °C e armazenado a -80 °C até a análise. Os níveis séricos de IL-1β, IL-6 e TNF-α foram medidos conforme procedimentos padrão, incluindo equilibração de reagentes, adição de amostras, incubação, lavagem, adição de conjugado e substrato, interrupção da reação, medição da densidade óptica e cálculo da concentração com base em uma curva padrão. A densidade óptica foi lida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas, e as concentrações de citocinas foram calculadas com base nas curvas padrão.

Detecção das principais proteínas reguladoras na retina e no cólon por meio de análise de WB

Três réplicas biológicas independentes foram realizadas em uma única membrana e sinalizadas sequencialmente para as proteínas-alvo. Todas as réplicas foram obtidas de uma única coorte de animais sacrificados simultaneamente. Quando o peso molecular de uma proteína-alvo era muito próximo ao da GAPDH (<5 kDa de diferença), elas foram analisadas em membranas independentes para evitar sobreposição de sinais. Cada membrana foi sinalizada exclusivamente para a proteína-alvo ou para a GAPDH, garantindo quantificação precisa. Os seguintes anticorpos primários foram utilizados: anticorpo policlonal contra GAPDH policlonal anticorpo (1:5000), anticorpo policlonal contra CMKLR1 (1:1000), anticorpo policlonal contra Wnt5a (1:1000), anticorpo policlonal contra TP53 (1:1000), anticorpo monoclonal contra AP-1 (1:5000) e anticorpo policlonal contra PPAR gama (PPAR-γ) (1:1000). As proteínas totais foram obtidas por lise celular seguida de centrifugação. As concentrações proteicas foram determinadas utilizando o ensaio BCA. As proteínas extraídas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS com gel separador a 12% e posteriormente transferidas para membranas. As membranas foram bloqueadas em TBST contendo 5% de leite desnatado e incubadas com os anticorpos primários apropriados durante a noite a 4 °C. Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados à peroxidase do rabojo (HRP) anti-coelho ou anti-rato na diluição de 1:10.000. Por fim, as bandas proteicas foram visualizadas e analisadas por meio de imagem quimioluminescente. Durante a visualização e o processamento dos dados, as membranas foram recortadas horizontalmente para remover regiões irrelevantes de peso molecular, mantendo-se todas as amostras sem remoção de áreas entre as faixas. Pode ocorrer leve distorção nas bordas durante o recorte para remoção de regiões irrelevantes do gel.

Detecção da microbiota intestinal por meio de análise de sequenciamento de rDNA 16S

Amostras frescas de fezes foram coletadas de cada camundongo antes dos procedimentos terminais. Os camundongos foram colocados individualmente em gaiolas estéreis por 10–15 min para permitir a defecação espontânea. Os pellets fecais foram imediatamente coletados com pinças estéreis, transferidos para tubos estéreis de 1,5 mL, congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C até a extração de DNA. Todos os procedimentos foram realizados em condições estéreis para minimizar contaminação cruzada. O intervalo entre a defecação e o congelamento foi mantido dentro de 10 min para garantir a integridade microbiana. As amostras de DNA genômico fecal (gDNA) foram purificadas utilizando o kit de extração de gDNA fecal, seguido da amplificação completa do gene 16S rDNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) com os primers universais 8F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’) e 1492R (5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’). Os produtos de PCR foram subsequentemente analisados por eletroforese em gel de agarose, purificados e quantificados para aplicações posteriores. O sequenciamento de alto rendimento foi realizado no sequenciador Nanopore GridION. O processo de análise de dados incluiu chamada de bases, controle de qualidade dos dados, anotação de espécies, construção de árvore filogenética, análise da comunidade, análise de diversidade Alfa e Beta e análise de espécies diferencialmente abundantes e predição da função da comunidade. Diversas ferramentas e bancos de dados, como NanoFilt, Usearch, a linguagem de programação R, Python e o banco de dados SILVA, foram utilizados durante a análise.

Análise de correlação do eixo intestino-retina com inflamação sistêmica e microbiota intestinal em múltiplos níveis

Para explorar as possíveis associações entre microbiota intestinal em múltiplos níveis e citocinas inflamatórias séricas e proteínas reguladoras-chave, foi realizada uma análise de correlação utilizando a plataforma Luoning Bio-Cloud. Inicialmente, os dados de abundância de espécies nos níveis de Reino, Filo, Classe, Ordem, Família, Gênero e Espécie foram extraídos dos resultados de sequenciamento. Fatores físico-químicos, incluindo citocinas inflamatórias séricas e níveis de expressão proteica, foram compilados em um arquivo de fatores ambientais. Para garantir a confiabilidade e a visualização das correlações, os dados foram normalizados para eliminar as diferenças de escala entre a abundância microbiana e as unidades de medição clínicas. Os coeficientes de correlação (valores R) e os respectivos níveis de significância (P-valores) foram calculados. Os resultados foram visualizados por meio de um mapa de calor de correlação, em que gradientes de cor indicam a intensidade e a direção da correlação (vermelho representando correlação positiva, azul representando correlação negativa), e asteriscos (**) indicam significância estatística (P < 0,01).

Métodos estatísticos

Todas as análises estatísticas e visualizações foram realizadas utilizando o GraphPad Prism. O teste t para comparar médias foi empregado para dados que seguiram a distribuição normal. Nos casos em que os dados desviaram da normalidade, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis. A correlação de Spearman ou de Pearson foi realizada para avaliar as relações entre variáveis. Todos os testes estatísticos foram conduzidos como bicaudais, com significância estatística definida em 0,05.

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Resultados

General situation of experimental animals

Blood glucose levels were significantly elevated in the model group (27.21 ± 6.03 mmol/L) compared with the blank group (P < 0.001), indicating the successful induction of the DM model. During the study period, the experimental animals showed stable body weight, continuous water and food intake, normal urine output, body temperature, healthy fur and skin condition, and normal behavior during the experiment.

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Discussão

A retinopatia diabética (RD) é uma complicação neurovascular complexa causada pela hiperglicemia crônica, inflamação e desregulação metabólica22. A Academia Americana de Oftalmologia classifica a RD em RD não proliferativa e RD proliferativa, caracterizada pelo início da neovascularização23. Diante das limitações das estratégias terapêuticas atuais, a exploração de novos mecanismos surgiu como uma abordagem promissora para o tratamento da RD. Notavelmente, avanços recentes ...

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Divulgações

Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que poderiam parecer ter influenciado o trabalho descrito neste artigo.

Agradecimentos

O autor gostaria de agradecer a todos os membros de sua equipe que forneceram grande apoio e assistência para concluir esta pesquisa.

Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Número do Convênio: 82474580) e pelo Projeto de Exploração Livre da Fundação Hospitalar do Hospital da Universidade de Medicina Chinesa de Chengdu (Nº 23ZYTS1601).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo monoclonal AP-1Proteintech66313-1-IG1:5000
Anticorpo policlonal CMKLR1AffinityAF52911:1000
Anticorpo policlonal GAPDHAffinityAF70211:5000
GoatAnti-Mouse IgG(H+L) HRPMULTI SCIENCESGAM00721:10000
GoatAnti-Rabbit IgG(H+L) HRPMULTI SCIENCESGAR00721:10000
GraphPad Prism/versão 9.5
Image-Pro PlusMedia Cybernetics, Inc., Rockville, MD, EUAversão 6.0
Plataforma Luoning Bio-Cloud http://www.biomediv.cn/login.html
Kit ELISA para IL-1β de camundongo (Interleucina 1 Beta)ElabscienceE-EL-M0037Detecção de citocinas séricas
Kit ELISA para IL-6 (Interleucina-6) de camundongoElabscienceE-EL-M0044Detecção de citocinas séricas
Kit ELISA para TNF-α de camundongo (Fator de Necrose Tumoral Alfa)ElabscienceE-EL-M3063Detecção de citocinas séricas
NanoFilt/versão 2.7.1
Sequenciador Nanopore GridIONOxford Nanopore Technologieshttps://store.nanoporetech.com/gridion.html
Pannoramic SCAN IIScanner 3DHISTECH Pannoramic SCAN https://www.3dhistech.com/scanners/pannoramic-scan-ii-digital-scanner/
Anticorpo policlonal PPAR gama (PPAR-γ) ImmunoWaybs-0530R1:1000
Python/versão 3.7.4
Granulado QimingZhejiang Sansheng Mandi Pharmaceutical Co., Ltd.Nº de Registro Nacional de Medicamentos da China Z200900360,9 g/kg, por gavagem oral
Linguagem de programação R/versão 4.0.3
Banco de dados SILVA/versão 138
Estreptozotocina (STZ)Sigma-AldrichS013035 mg/kg, i.p.
Anticorpo policlonal TP53Abcamab1314421:1000
Usearch/versão 10.0.240
Anticorpo policlonal Wnt5aProteintech55184-1-AP1:1000
Kit Zymo Research BIOMICS DNA MicroprepZymo ResearchD4301Extração de DNA genômico fecal

Referências

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