Efeitos do Transplante de Microbiota Fecal nas Características Microbianas Intestinais e nos Fenótipos Clínicos em Pacientes com Doença de Parkinson

Resumo

Este estudo exploratório com seis pacientes com doença de Parkinson que realizaram transplante de microbiota fecal observou alterações temporais na diversidade microbiana intestinal, na composição taxonômica e nos perfis funcionais preditos, juntamente com melhorias nos sintomas motores e não motores. Esses achados fornecem evidências preliminares que apoiam a investigação adicional de intervenções baseadas na microbiota.

Resumo

Alterações na microbiota intestinal têm sido associadas à doença de Parkinson (DP), mas as mudanças microbianas longitudinais após o transplante de microbiota fecal (TMF) e suas associações clínicas permanecem pouco compreendidas. Este estudo observacional retrospectivo de centro único incluiu 6 pacientes com DP, estratificados em subgrupos de alta e baixa gravidade com base na duração da doença (>6 anos versus ≤6 anos). Trinta e seis amostras fecais foram coletadas antes do TMF e mensalmente durante cinco meses após o procedimento. A diversidade microbiana, a estrutura da comunidade, a composição taxonômica e os perfis funcionais preditos foram avaliados por meio do sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S. As análises incluíram diversidade alfa e beta, abundância taxonômica, tamanho do efeito da análise discriminante linear, predição funcional baseada no Tax4Fun2 e correlações de postos de Spearman entre características microbianas e indicadores clínicos. Análises descritivas indicaram diferenças na riqueza microbiana, diversidade, estrutura da comunidade e funções preditas entre os subgrupos de gravidade e ao longo dos pontos temporais pós-TMF. Na linha de base, o subgrupo de baixa gravidade apresentou maior riqueza e diversidade microbiana do que o subgrupo de alta gravidade, com abundâncias relativamente mais elevadas de táxons como Bifidobacterium e Lactobacillus. Um mês após o TMF, a riqueza e a diversidade aumentaram em relação à linha de base no subgrupo de alta gravidade, acompanhadas por alterações na composição taxonômica. Ambos os subgrupos mostraram variação associada ao tempo na diversidade microbiana e no enriquecimento predito de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes após o TMF. As funções preditas incluíram metabolismo de carboidratos e aminoácidos, biossíntese de metabólitos secundários, transporte de membrana e transdução de sinais. Várias unidades taxonômicas operacionais correlacionaram-se com indicadores de comprometimento motor, constipação, qualidade do sono, estado funcional e sintomas neuropsiquiátricos. Portanto, o TMF foi associado a mudanças longitudinais na diversidade, composição e funções microbianas intestinais preditas, e características microbianas específicas estiveram associadas a indicadores motores e não motores. Dado o pequeno tamanho da coorte retrospectiva, esses achados são preliminares e requerem confirmação em estudos controlados maiores. Estudos futuros devem determinar se essas alterações microbianas são reprodutíveis, persistem além de cinco meses, refletem a enxertia do doador e correspondem a melhora clínica mensurável após o transplante na DP.

Introdução

A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa progressiva comum, caracterizada por bradicinesia, rigidez, tremor de repouso e instabilidade postural¹. Embora sua patogênese permaneça incompletamente elucidada, múltiplos fatores, incluindo neuroinflamação, exposições ambientais e suscetibilidade genética, têm sido implicados no início e na progressão da doença². Evidências epidemiológicas indicam que a DP está entre os distúrbios neurológicos mais comuns em adultos mais velhos e está associada a uma carga substancial de incapacidade, com prevalência crescente com a idade³. Os tratamentos atuais, particularmente a terapia de reposição de dopamina, podem aliviar os sintomas motores até certo ponto, mas seus efeitos sobre a progressão da doença e muitos sintomas não motores permanecem limitados, e as respostas ao tratamento variam entre os indivíduos⁴. Portanto, a investigação adicional das alterações biológicas relacionadas à DP e de potenciais alvos terapêuticos permanece clinicamente importante.

A comunidade microbiana intestinal desempenha um papel importante na manutenção da integridade da barreira intestinal, na regulação das respostas imunes e no suporte à homeostase metabólica⁵. O transplante de microbiota fecal (FMT) envolve a transferência de microbiota fecal de um doador saudável para um receptor, com o objetivo de restaurar o equilíbrio microbiano intestinal^6,7. Vários estudos em animais sugeriram que o transplante de microbiota intestinal pode influenciar fenótipos neurocomportamentais^8,9. Dado que a microbiota de pacientes com depressão ou ansiedade pode induzir alterações comportamentais correspondentes em camundongos, a microbiota de doadores saudáveis pode melhorar os resultados comportamentais¹⁰. Além disso, observações clínicas preliminares relataram melhora dos sintomas após FMT em alguns pacientes com DP e autismo, sugerindo que intervenções baseadas na microbiota podem ter relevância potencial em distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos^11,12. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses efeitos permanecem pouco claros, e estudos clínicos são necessários para estabelecer a segurança e eficácia do FMT na DP.

Embora estudos anteriores tenham sugerido uma relação entre a microbiota intestinal e a DP, as alterações longitudinais na composição microbiana intestinal após TFM e suas associações com características clínicas ainda são pouco compreendidas. Permanece incerto se pacientes com diferentes gravidades clínicas apresentam respostas microbianas distintas após TFM.

Neste estudo observacional retrospectivo de centro único, revisamos pacientes com DP que realizaram TFM na prática clínica habitual. Foram analisadas pontuações clínicas antes e após a TFM, e amostras fecais disponíveis foram analisadas adicionalmente por meio de sequenciamento do gene 16S rRNA para explorar a diversidade microbiana intestinal, composição taxonômica, perfis funcionais preditos e correlações com indicadores clínicos. Este estudo teve como objetivo caracterizar os desfechos clínicos e os perfis da microbiota intestinal após a TFM na DP e fornecer evidências preliminares para futuros estudos prospectivos controlados.

Protocolo

O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque, e o protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing (número de aprovação: 2021-KY-100-01). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

Este estudo observacional retrospectivo de centro único foi conduzido no Departamento de Neurologia, Hospital Afiliado à Segunda Universidade Médica de Nanjing. De janeiro de 2022 a dezembro de 2023, foram incluídos um total de 32 pacientes com DP primária que atenderam aos Critérios Diagnósticos para a Doença de Parkinson (edição de 2020). No final, seis pacientes que atenderam a critérios rigorosos de seleção e completaram todos os procedimentos do estudo foram incluídos na análise subsequente. Os detalhes do processo de triagem, exclusão e acompanhamento são apresentados na Figura Suplementar 1.

Coleta de amostras fecais e análise da comunidade microbiana

O microbiota fecal foi obtido de voluntários saudáveis. O processo de triagem dos doadores foi rigorosamente conduzido de acordo com o Consenso Chinês de Especialistas sobre a Aplicação Clínica do Transplante de Microbiota Fecal. Critérios de inclusão dos doadores: Idade entre 18 e 40 anos, sem histórico de doenças crônicas; ausência de histórico de doenças gastrointestinais, distúrbios metabólicos, doenças autoimunes ou transtornos psiquiátricos; ausência de uso de antibióticos, probióticos, imunossupressores ou inibidores da bomba de prótons nos últimos 3 meses; ausência de viagens a áreas epidêmicas, transfusões sanguíneas ou histórico cirúrgico nos últimos 6 meses. A triagem sanguínea e fecal para exclusão de doenças infecciosas e patógenos inclui: vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), Treponema pallidum, Clostridium difficile, Salmonella, Shigella, Campylobacter, patogénico Escherichia coli, vírus entéricos e parasitas. O volume de uma única amostra de fezes válida deve ser de pelo menos 50 g. Utilizando um sistema automatizado de purificação de microbiota fecal (consulte Tabela de Materiais), foram adicionados 500 mL de soro fisiológico estéril a cada 100 g de fezes frescas, seguidos por três ciclos de centrifugação e lavagem padronizados (700 × g, 3 min), e imediatamente inoculados após o preparo de uma suspensão com solução salina estéril em uma proporção volumétrica de 1:2. Os indivíduos receberam uma única injeção de 150 mL da suspensão contendo aproximadamente 5 × 10^13 bactérias viáveis¹³.

Todos os receptores receberam TFM por colonoscopia, com o instrumento avançado até o ceco e o cólon ascendente; a suspensão foi infundida lentamente e de forma uniforme através do canal de biópsia para promover a colonização preferencial do cólon direito. Após a infusão, os pacientes permaneceram na posição decúbito lateral direito por pelo menos 2 h. Antes do procedimento, foi seguida uma dieta de baixo resíduo durante 3 dias, seguida por uma dieta líquida completa nas 24 h anteriores ao procedimento, com jejum de sólidos por 6 h e de líquidos por 2 h antes da infusão. Na noite anterior ao transplante, foi realizada uma limpeza completa do intestino com solução eletrolítica de polietilenoglicol até obtenção de efluente claro e livre de fezes. As restrições medicamentosas incluíram a suspensão de antibióticos sistêmicos por pelo menos 72 h antes da TFM e a sua evitação durante 1 semana após o procedimento. Inibidores da bomba de prótons (IBPs) são descontinuados entre 24 e 48 h antes do procedimento, e laxantes e probióticos são suspensos no dia do transplante.

Durante o procedimento, a frequência cardíaca, a pressão arterial e a saturação de oxigênio foram monitoradas continuamente, e quaisquer sintomas, como distensão abdominal, dor ou náusea, foram observados; a infusão foi interrompida imediatamente caso ocorresse dor abdominal grave ou hipotensão. Durante os primeiros 7 dias após o transplante, foi realizado acompanhamento diário para registrar a frequência das evacuações intestinais, a consistência das fezes e todos os eventos adversos, incluindo dor abdominal, diarreia, febre e hematocázia. O acompanhamento de longo prazo estendeu-se até 5 meses, com coleta programada de amostras fecais para análise da microbiota intestinal e avaliações clínicas utilizando a Escala Unificada de Avaliação da Doença de Parkinson (UPDRS) e o Índice de Constipação de Wexner, juntamente com o registro de alterações nos sintomas e do uso de medicações concomitantes, a fim de avaliar de forma abrangente tanto a eficácia quanto a segurança.

As amostras fecais foram coletadas em seis momentos: antes do TFM e aos 1, 2, 3, 4 e 5 meses após o TFM. Todos os participantes receberam instruções padronizadas para a coleta das amostras de fezes. Aproximadamente 10–20 g da porção mediana das fezes foram coletados utilizando pinças estéreis e colocados em recipientes estéreis para coleta. As amostras foram transportadas para o laboratório em até 2–3 h após a coleta e fracionadas em tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mL (ver Tabela de Materiais) por pesquisadores treinados em condições assépticas. Todas as alíquotas foram imediatamente armazenadas a −80 °C até a análise posterior.

Após a coleta das amostras fecais, todos os espécimes foram transportados em gelo seco para um fornecedor comercial de sequenciamento (consulte a Tabela de Materiais) para o sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S. A preparação das bibliotecas, o sequenciamento e o controle inicial de qualidade foram realizados de acordo com o protocolo padrão do fornecedor. O DNA genômico foi extraído de cada amostra fecal, e as regiões hipervariáveis V3–V4 do gene bacteriano do RNA ribossômico 16S foram amplificadas por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os iniciadores 341F e 805R. O sequenciamento foi realizado em uma plataforma de sequenciamento de leitura curta de bancada (consulte a Tabela de Materiais) utilizando química de leitura pareada 2 × 300 pb para caracterizar os perfis microbianos intestinais dos pacientes antes do TFM e em diferentes pontos temporais de acompanhamento pós-TFM. Após o sequenciamento, as leituras brutas foram processadas para obter sequências de alta qualidade para análises microbianas posteriores. A classificação taxonômica foi realizada utilizando um pacote comercial de atribuição taxonômica 16S e sua base de dados associada de identificação microbiana (consulte a Tabela de Materiais). Os perfis taxonômicos resultantes foram utilizados para análises subsequentes de diversidade microbiana, composição comunitária, abundância diferencial e função microbiana predita.

Avaliações clínicas e rótulos analíticos

Os pacientes com DP foram estratificados em dois grupos de gravidade de acordo com a duração da doença: um grupo de alta gravidade (>6 anos, designado como “_H”) e um grupo de baixa gravidade (≤6 anos, designado como “_L”). As amostras fecais coletadas antes do TFM foram definidas como amostras basais e rotuladas como FB_H ou FB_L de acordo com o grupo de gravidade correspondente. As amostras coletadas aos 1, 2, 3, 4 e 5 meses após o TFM foram rotuladas como FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H para o grupo de alta gravidade, e como FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L e FP5M_L para o grupo de baixa gravidade. Os parâmetros clínicos avaliados incluíram o escore de constipação de Wexner, Escala de Sintomas Não Motores (NMSS), Questionário de Sintomas Não Motores (NMSQ), Inventário Neuropsiquiátrico (NPI), estágio de Hoehn–Yahr, Escala de Atividades de Vida Diária (ADL), Índice de Qualidade do Sono de Pittsburgh (PSQI), a escala original (UPDRS I–VI) e o escore total da UPDRS. Uma combinação de métodos estatísticos descritivos e inferenciais foi utilizada para analisar as alterações nos indicadores clínicos dos pacientes com DP no grupo de alta gravidade (grupo _H) e no grupo de baixa gravidade (grupo _L) em seis pontos temporais. Para explorar preliminarmente as diferenças entre os grupos em todos os pontos temporais, as distribuições dos indicadores entre os grupos _H e _L foram comparadas em cada ponto temporal utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon, e aplicou-se um modelo linear misto (LMM) mais rigoroso com interceptos aleatórios específicos por paciente. Devido ao tamanho limitado da amostra, os resultados do modelo de efeitos mistos são fornecidos apenas como referências exploratórias. O desfecho primário deste estudo exploratório foi a alteração na diversidade e composição microbiana intestinal do ponto basal até os pontos temporais pós-transplante de microbiota fecal, sendo as alterações clínicas avaliadas como desfechos secundários.

Agrupamento de OTUs, análise de diversidade e abundância taxonômica

Unidades taxonômicas operacionais (OTUs) foram utilizadas para resumir a composição da comunidade microbiana, e sequências com ≥97% de similaridade foram agrupadas na mesma OTU. A profundidade de sequenciamento foi avaliada por meio de curvas de rarefação baseadas no índice de Shannon, cujos platôs indicam, em geral, cobertura suficiente para análises de diversidade subsequentes.

A diversidade alfa foi avaliada utilizando os índices Chao1 e estimador de cobertura baseado na abundância (ACE) para riqueza microbiana, e os índices de Shannon e Simpson para diversidade geral e equitatividade. A diversidade beta foi avaliada utilizando distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas, seguidas por análise de coordenadas principais (PCoA) para visualizar as diferenças na composição da comunidade microbiana entre grupos. As diferenças entre grupos na diversidade alfa e beta foram avaliadas usando testes não paramétricos e Análise de Variância Multivariada Permutacional (PERMANOVA), respectivamente, conforme descrito na seção de análise estatística.

A composição taxonômica foi resumida nos níveis de filo, classe, ordem, família e gênero com base em dados de sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S. Utilizando um pacote de análise de ecologia comunitária para R (veja Tabela de Materiais), identifique e visualize os 10 táxons mais abundantes em cada nível taxonômico. Os perfis taxonômicos foram exibidos usando gráficos de barras, e táxons selecionados foram comparados entre grupos utilizando gráficos de caixa.

Análise da abundância diferencial de táxons microbianos

Os táxons diferencialmente abundantes entre grupos pré-definidos foram identificados utilizando a análise linear do tamanho do efeito (LEfSe). O LEfSe integra o teste de Kruskal–Wallis, o teste de Wilcoxon e a análise discriminante linear (LDA) para identificar táxons com significância estatística e valor discriminatório. Considerou-se haver diferença na abundância para táxons com P < 0,05 e escore LDA (log₁₀) > 3. As abundâncias relativas dos táxons discriminatórios foram visualizadas utilizando gráficos de barras taxonômicos.

Previsão funcional e análise de correlação clínica

Os perfis funcionais previstos da microbiota intestinal foram inferidos a partir de dados de sequenciamento do gene 16S rRNA utilizando o Tax4Fun2 e anotados de acordo com a base de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). As vias previstas diferencialmente enriquecidas foram identificadas usando o LEfSe, com P < 0,05 e um escore LDA (log₁₀) > 3 como limiares. Como esses perfis funcionais foram inferidos em vez de diretamente medidos por abordagens metagenômicas ou metabolômicas, foram interpretados como diferenças funcionais previstas. Foi realizada análise de correlação de postos de Spearman para explorar associações entre características microbianas e indicadores clínicos.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software R (consulte a Tabela de Materiais). As variáveis clínicas foram resumidas como medianas e intervalos (mínimo–máximo). Os índices de diversidade alfa foram comparados entre grupos utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon, enquanto a diversidade beta foi avaliada por meio de PERMANOVA com 999 permutações. Os táxons e vias funcionais preditos com abundância diferencial foram identificados utilizando o LEfSe, com P < 0,05 e escore LDA (log₁₀) > 3 como limiares de significância. Para a análise longitudinal de abundância diferencial, foi aplicado um modelo de efeitos mistos com interceptos aleatórios específicos por paciente, seguido de comparações pareadas pós-hoc com correção da taxa de falsa descoberta de Benjamini-Hochberg. A análise de correlação de postos de Spearman foi utilizada para avaliar as associações entre características microbianas intestinais e indicadores clínicos, com aplicação da correção da taxa de falsa descoberta de Benjamini–Hochberg aos valores de P de correlação. Um valor de P bicaudal < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A correção para múltiplas comparações foi aplicada às análises de correlação e de abundância taxonômica. Dado o tamanho reduzido da amostra e o delineamento com amostragem longitudinal repetida, as análises estatísticas foram consideradas exploratórias, e os resultados foram interpretados com cautela.

Resultados

Seleção dos pacientes e características basais

Seis pacientes com DP foram incluídos na análise final, incluindo três homens e três mulheres. A idade mediana foi de 69,0 anos (intervalo, 61–75), e o índice de massa corporal mediano foi de 22,6 kg/m². A coorte incluiu dois fenótipos clínicos predominantemente rígidos, dois predominantemente tremorosos e dois mistos. As características clínicas basais estão apresentadas na Tabela 1.

Discussão

A TFM é uma intervenção baseada na microbiota que transfere a microbiota fecal de um doador saudável para o intestino do receptor, a fim de restaurar o equilíbrio microbiano intestinal¹⁴. Evidências crescentes sugerem que a microbiota intestinal desempenha um papel importante na manutenção da homeostase do sistema nervoso¹⁵. Evidências provenientes do eixo bidirecional intestino-cérebro indicam que a microbiota intestinal pode influenciar a inflamação do sistema nervoso cen...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema MiSeq	Illumina, Inc.	SY-410-1003	Plataforma de sequenciamento de leitura curta em bancada utilizada para o sequenciamento de amplicons V3–V4 do RNA ribossomal 16S com química pareada de 2 × 300 pb.
Metagenome@KIN	World Fusion Co., Ltd.	v2.2.1; https://www.w-fusion.com/metagenome	Software comercial utilizado para atribuição taxonômica do RNA ribossomal 16S e análise da comunidade microbiana.
Banco de dados de identificação microbiana (bacteriano)	TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd.	DB-BA, banco de dados v10.0; https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/	Banco de dados de referência de 16S rDNA bacteriano utilizado para identificação microbiana.
Primer 341F	BGI Genomics Co., Ltd.	Oligonucleotídeo personalizado; sem número de catálogo	Sequência do primer direto: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′.
Primer 805R	BGI Genomics Co., Ltd.	Oligonucleotídeo personalizado; sem número de catálogo	Sequência do primer reverso: 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′.
Serviço de sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S	BGI Genomics Co., Ltd. (Wuhan, China)	https://www.bgi.com/us/sequencing-services/rna-sequencing-solutions/16s18s-its-sequencing/	Prestador comercial de sequenciamento; realizou a preparação da biblioteca, o sequenciamento e o controle inicial de qualidade.
Tubos microcentrífugos Eppendorf Safe-Lock, Biopur, 1,5 mL	Eppendorf SE	'0030121589	Tubos estéreis de polipropileno utilizados para aliquotar amostras fecais para armazenamento a −80 °C.
LEfSe	Segata Lab/bioBakery	v1.1.2; https://github.com/SegataLab/lefse	Software de tamanho do efeito por análise discriminante linear utilizado para identificar táxons e vias preditas com abundância diferencial.
Tax4Fun2	Equipe de desenvolvimento do Tax4Fun2	v1.1.5; https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2	Pacote R utilizado para inferir perfis funcionais do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes a partir de dados de RNA ribossomal 16S.
Pacote R microeco	Chi Liu e colaboradores	v1.15.0; https://cran.r-project.org/package=microeco	Pacote para análise e visualização da ecologia comunitária em análises de abundância e diversidade microbianas.
Software R	R Foundation for Statistical Computing	Versão não informada; https://www.r-project.org/	Ambiente de computação estatística utilizado para análises clínicas e do microbioma; a versão exata deve ser confirmada pelos autores.
Sistema automatizado de purificação de microbiota fecal GenFMTer	Nanjing FMT Medical Co., Ltd.	Modelo: GenFMTer; https://en.fmtmed.com/	Sistema automatizado utilizado para centrifugação padronizada, lavagem e preparação da suspensão de microbiota fecal.