Este estudo exploratório com seis pacientes com doença de Parkinson que realizaram transplante de microbiota fecal observou alterações temporais na diversidade microbiana intestinal, na composição taxonômica e nos perfis funcionais preditos, juntamente com melhorias nos sintomas motores e não motores. Esses achados fornecem evidências preliminares que apoiam a investigação adicional de intervenções baseadas na microbiota.
Artigo de investigação
Efeitos do Transplante de Microbiota Fecal nas Características Microbianas Intestinais e nos Fenótipos Clínicos em Pacientes com Doença de Parkinson
Neste artigo
Resumo
Resumo
Alterações na microbiota intestinal têm sido associadas à doença de Parkinson (DP), mas as mudanças microbianas longitudinais após o transplante de microbiota fecal (TMF) e suas associações clínicas permanecem pouco compreendidas. Este estudo observacional retrospectivo de centro único incluiu 6 pacientes com DP, estratificados em subgrupos de alta e baixa gravidade com base na duração da doença (>6 anos versus ≤6 anos). Trinta e seis amostras fecais foram coletadas antes do TMF e mensalmente durante cinco meses após o procedimento. A diversidade microbiana, a estrutura da comunidade, a composição taxonômica e os perfis funcionais preditos foram avaliados por meio do sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S. As análises incluíram diversidade alfa e beta, abundância taxonômica, tamanho do efeito da análise discriminante linear, predição funcional baseada no Tax4Fun2 e correlações de postos de Spearman entre características microbianas e indicadores clínicos. Análises descritivas indicaram diferenças na riqueza microbiana, diversidade, estrutura da comunidade e funções preditas entre os subgrupos de gravidade e ao longo dos pontos temporais pós-TMF. Na linha de base, o subgrupo de baixa gravidade apresentou maior riqueza e diversidade microbiana do que o subgrupo de alta gravidade, com abundâncias relativamente mais elevadas de táxons como Bifidobacterium e Lactobacillus. Um mês após o TMF, a riqueza e a diversidade aumentaram em relação à linha de base no subgrupo de alta gravidade, acompanhadas por alterações na composição taxonômica. Ambos os subgrupos mostraram variação associada ao tempo na diversidade microbiana e no enriquecimento predito de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes após o TMF. As funções preditas incluíram metabolismo de carboidratos e aminoácidos, biossíntese de metabólitos secundários, transporte de membrana e transdução de sinais. Várias unidades taxonômicas operacionais correlacionaram-se com indicadores de comprometimento motor, constipação, qualidade do sono, estado funcional e sintomas neuropsiquiátricos. Portanto, o TMF foi associado a mudanças longitudinais na diversidade, composição e funções microbianas intestinais preditas, e características microbianas específicas estiveram associadas a indicadores motores e não motores. Dado o pequeno tamanho da coorte retrospectiva, esses achados são preliminares e requerem confirmação em estudos controlados maiores. Estudos futuros devem determinar se essas alterações microbianas são reprodutíveis, persistem além de cinco meses, refletem a enxertia do doador e correspondem a melhora clínica mensurável após o transplante na DP.
Introdução
A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa progressiva comum, caracterizada por bradicinesia, rigidez, tremor de repouso e instabilidade postural1. Embora sua patogênese permaneça incompletamente elucidada, múltiplos fatores, incluindo neuroinflamação, exposições ambientais e suscetibilidade genética, têm sido implicados no início e na progressão da doença2. Evidências epidemiológicas indicam que a DP está entre os distúrbios neurológicos mais comuns em adultos mais velhos e está associada a uma carga substancial de incapacidade, com prevalência crescente com a idade3. Os tratamentos atuais, particularmente a terapia de reposição de dopamina, podem aliviar os sintomas motores até certo ponto, mas seus efeitos sobre a progressão da doença e muitos sintomas não motores permanecem limitados, e as respostas ao tratamento variam entre os indivíduos4. Portanto, a investigação adicional das alterações biológicas relacionadas à DP e de potenciais alvos terapêuticos permanece clinicamente importante.
A comunidade microbiana intestinal desempenha um papel importante na manutenção da integridade da barreira intestinal, na regulação das respostas imunes e no suporte à homeostase metabólica5. O transplante de microbiota fecal (FMT) envolve a transferência de microbiota fecal de um doador saudável para um receptor, com o objetivo de restaurar o equilíbrio microbiano intestinal6,7. Vários estudos em animais sugeriram que o transplante de microbiota intestinal pode influenciar fenótipos neurocomportamentais8,9. Dado que a microbiota de pacientes com depressão ou ansiedade pode induzir alterações comportamentais correspondentes em camundongos, a microbiota de doadores saudáveis pode melhorar os resultados comportamentais10. Além disso, observações clínicas preliminares relataram melhora dos sintomas após FMT em alguns pacientes com DP e autismo, sugerindo que intervenções baseadas na microbiota podem ter relevância potencial em distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos11,12. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses efeitos permanecem pouco claros, e estudos clínicos são necessários para estabelecer a segurança e eficácia do FMT na DP.
Embora estudos anteriores tenham sugerido uma relação entre a microbiota intestinal e a DP, as alterações longitudinais na composição microbiana intestinal após TFM e suas associações com características clínicas ainda são pouco compreendidas. Permanece incerto se pacientes com diferentes gravidades clínicas apresentam respostas microbianas distintas após TFM.
Neste estudo observacional retrospectivo de centro único, revisamos pacientes com DP que realizaram TFM na prática clínica habitual. Foram analisadas pontuações clínicas antes e após a TFM, e amostras fecais disponíveis foram analisadas adicionalmente por meio de sequenciamento do gene 16S rRNA para explorar a diversidade microbiana intestinal, composição taxonômica, perfis funcionais preditos e correlações com indicadores clínicos. Este estudo teve como objetivo caracterizar os desfechos clínicos e os perfis da microbiota intestinal após a TFM na DP e fornecer evidências preliminares para futuros estudos prospectivos controlados.
Protocolo
O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque, e o protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing (número de aprovação: 2021-KY-100-01). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.
Este estudo observacional retrospectivo de centro único foi conduzido no Departamento de Neurologia, Hospital Afiliado à Segunda Universidade Médica de Nanjing. De janeiro de 2022 a dezembro de 2023, foram incluídos um total de 32 pacientes com DP primária que atenderam aos Critérios Diagnósticos para a Doença de Parkinson (edição de 2020). No final, seis pacientes que atenderam a critérios rigorosos de seleção e completaram todos os procedimentos do estudo foram incluídos na análise subsequente. Os detalhes do processo de triagem, exclusão e acompanhamento são apresentados na Figura Suplementar 1.
Coleta de amostras fecais e análise da comunidade microbiana
O microbiota fecal foi obtido de voluntários saudáveis. O processo de triagem dos doadores foi rigorosamente conduzido de acordo com o Consenso Chinês de Especialistas sobre a Aplicação Clínica do Transplante de Microbiota Fecal. Critérios de inclusão dos doadores: Idade entre 18 e 40 anos, sem histórico de doenças crônicas; ausência de histórico de doenças gastrointestinais, distúrbios metabólicos, doenças autoimunes ou transtornos psiquiátricos; ausência de uso de antibióticos, probióticos, imunossupressores ou inibidores da bomba de prótons nos últimos 3 meses; ausência de viagens a áreas epidêmicas, transfusões sanguíneas ou histórico cirúrgico nos últimos 6 meses. A triagem sanguínea e fecal para exclusão de doenças infecciosas e patógenos inclui: vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), Treponema pallidum, Clostridium difficile, Salmonella, Shigella, Campylobacter, patogénico Escherichia coli, vírus entéricos e parasitas. O volume de uma única amostra de fezes válida deve ser de pelo menos 50 g. Utilizando um sistema automatizado de purificação de microbiota fecal (consulte Tabela de Materiais), foram adicionados 500 mL de soro fisiológico estéril a cada 100 g de fezes frescas, seguidos por três ciclos de centrifugação e lavagem padronizados (700 × g, 3 min), e imediatamente inoculados após o preparo de uma suspensão com solução salina estéril em uma proporção volumétrica de 1:2. Os indivíduos receberam uma única injeção de 150 mL da suspensão contendo aproximadamente 5 × 10^13 bactérias viáveis13.
Todos os receptores receberam TFM por colonoscopia, com o instrumento avançado até o ceco e o cólon ascendente; a suspensão foi infundida lentamente e de forma uniforme através do canal de biópsia para promover a colonização preferencial do cólon direito. Após a infusão, os pacientes permaneceram na posição decúbito lateral direito por pelo menos 2 h. Antes do procedimento, foi seguida uma dieta de baixo resíduo durante 3 dias, seguida por uma dieta líquida completa nas 24 h anteriores ao procedimento, com jejum de sólidos por 6 h e de líquidos por 2 h antes da infusão. Na noite anterior ao transplante, foi realizada uma limpeza completa do intestino com solução eletrolítica de polietilenoglicol até obtenção de efluente claro e livre de fezes. As restrições medicamentosas incluíram a suspensão de antibióticos sistêmicos por pelo menos 72 h antes da TFM e a sua evitação durante 1 semana após o procedimento. Inibidores da bomba de prótons (IBPs) são descontinuados entre 24 e 48 h antes do procedimento, e laxantes e probióticos são suspensos no dia do transplante.
Durante o procedimento, a frequência cardíaca, a pressão arterial e a saturação de oxigênio foram monitoradas continuamente, e quaisquer sintomas, como distensão abdominal, dor ou náusea, foram observados; a infusão foi interrompida imediatamente caso ocorresse dor abdominal grave ou hipotensão. Durante os primeiros 7 dias após o transplante, foi realizado acompanhamento diário para registrar a frequência das evacuações intestinais, a consistência das fezes e todos os eventos adversos, incluindo dor abdominal, diarreia, febre e hematocázia. O acompanhamento de longo prazo estendeu-se até 5 meses, com coleta programada de amostras fecais para análise da microbiota intestinal e avaliações clínicas utilizando a Escala Unificada de Avaliação da Doença de Parkinson (UPDRS) e o Índice de Constipação de Wexner, juntamente com o registro de alterações nos sintomas e do uso de medicações concomitantes, a fim de avaliar de forma abrangente tanto a eficácia quanto a segurança.
As amostras fecais foram coletadas em seis momentos: antes do TFM e aos 1, 2, 3, 4 e 5 meses após o TFM. Todos os participantes receberam instruções padronizadas para a coleta das amostras de fezes. Aproximadamente 10–20 g da porção mediana das fezes foram coletados utilizando pinças estéreis e colocados em recipientes estéreis para coleta. As amostras foram transportadas para o laboratório em até 2–3 h após a coleta e fracionadas em tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mL (ver Tabela de Materiais) por pesquisadores treinados em condições assépticas. Todas as alíquotas foram imediatamente armazenadas a −80 °C até a análise posterior.
Após a coleta das amostras fecais, todos os espécimes foram transportados em gelo seco para um fornecedor comercial de sequenciamento (consulte a Tabela de Materiais) para o sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S. A preparação das bibliotecas, o sequenciamento e o controle inicial de qualidade foram realizados de acordo com o protocolo padrão do fornecedor. O DNA genômico foi extraído de cada amostra fecal, e as regiões hipervariáveis V3–V4 do gene bacteriano do RNA ribossômico 16S foram amplificadas por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os iniciadores 341F e 805R. O sequenciamento foi realizado em uma plataforma de sequenciamento de leitura curta de bancada (consulte a Tabela de Materiais) utilizando química de leitura pareada 2 × 300 pb para caracterizar os perfis microbianos intestinais dos pacientes antes do TFM e em diferentes pontos temporais de acompanhamento pós-TFM. Após o sequenciamento, as leituras brutas foram processadas para obter sequências de alta qualidade para análises microbianas posteriores. A classificação taxonômica foi realizada utilizando um pacote comercial de atribuição taxonômica 16S e sua base de dados associada de identificação microbiana (consulte a Tabela de Materiais). Os perfis taxonômicos resultantes foram utilizados para análises subsequentes de diversidade microbiana, composição comunitária, abundância diferencial e função microbiana predita.
Avaliações clínicas e rótulos analíticos
Os pacientes com DP foram estratificados em dois grupos de gravidade de acordo com a duração da doença: um grupo de alta gravidade (>6 anos, designado como “_H”) e um grupo de baixa gravidade (≤6 anos, designado como “_L”). As amostras fecais coletadas antes do TFM foram definidas como amostras basais e rotuladas como FB_H ou FB_L de acordo com o grupo de gravidade correspondente. As amostras coletadas aos 1, 2, 3, 4 e 5 meses após o TFM foram rotuladas como FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H para o grupo de alta gravidade, e como FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L e FP5M_L para o grupo de baixa gravidade. Os parâmetros clínicos avaliados incluíram o escore de constipação de Wexner, Escala de Sintomas Não Motores (NMSS), Questionário de Sintomas Não Motores (NMSQ), Inventário Neuropsiquiátrico (NPI), estágio de Hoehn–Yahr, Escala de Atividades de Vida Diária (ADL), Índice de Qualidade do Sono de Pittsburgh (PSQI), a escala original (UPDRS I–VI) e o escore total da UPDRS. Uma combinação de métodos estatísticos descritivos e inferenciais foi utilizada para analisar as alterações nos indicadores clínicos dos pacientes com DP no grupo de alta gravidade (grupo _H) e no grupo de baixa gravidade (grupo _L) em seis pontos temporais. Para explorar preliminarmente as diferenças entre os grupos em todos os pontos temporais, as distribuições dos indicadores entre os grupos _H e _L foram comparadas em cada ponto temporal utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon, e aplicou-se um modelo linear misto (LMM) mais rigoroso com interceptos aleatórios específicos por paciente. Devido ao tamanho limitado da amostra, os resultados do modelo de efeitos mistos são fornecidos apenas como referências exploratórias. O desfecho primário deste estudo exploratório foi a alteração na diversidade e composição microbiana intestinal do ponto basal até os pontos temporais pós-transplante de microbiota fecal, sendo as alterações clínicas avaliadas como desfechos secundários.
Agrupamento de OTUs, análise de diversidade e abundância taxonômica
Unidades taxonômicas operacionais (OTUs) foram utilizadas para resumir a composição da comunidade microbiana, e sequências com ≥97% de similaridade foram agrupadas na mesma OTU. A profundidade de sequenciamento foi avaliada por meio de curvas de rarefação baseadas no índice de Shannon, cujos platôs indicam, em geral, cobertura suficiente para análises de diversidade subsequentes.
A diversidade alfa foi avaliada utilizando os índices Chao1 e estimador de cobertura baseado na abundância (ACE) para riqueza microbiana, e os índices de Shannon e Simpson para diversidade geral e equitatividade. A diversidade beta foi avaliada utilizando distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas, seguidas por análise de coordenadas principais (PCoA) para visualizar as diferenças na composição da comunidade microbiana entre grupos. As diferenças entre grupos na diversidade alfa e beta foram avaliadas usando testes não paramétricos e Análise de Variância Multivariada Permutacional (PERMANOVA), respectivamente, conforme descrito na seção de análise estatística.
A composição taxonômica foi resumida nos níveis de filo, classe, ordem, família e gênero com base em dados de sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S. Utilizando um pacote de análise de ecologia comunitária para R (veja Tabela de Materiais), identifique e visualize os 10 táxons mais abundantes em cada nível taxonômico. Os perfis taxonômicos foram exibidos usando gráficos de barras, e táxons selecionados foram comparados entre grupos utilizando gráficos de caixa.
Análise da abundância diferencial de táxons microbianos
Os táxons diferencialmente abundantes entre grupos pré-definidos foram identificados utilizando a análise linear do tamanho do efeito (LEfSe). O LEfSe integra o teste de Kruskal–Wallis, o teste de Wilcoxon e a análise discriminante linear (LDA) para identificar táxons com significância estatística e valor discriminatório. Considerou-se haver diferença na abundância para táxons com P < 0,05 e escore LDA (log10) > 3. As abundâncias relativas dos táxons discriminatórios foram visualizadas utilizando gráficos de barras taxonômicos.
Previsão funcional e análise de correlação clínica
Os perfis funcionais previstos da microbiota intestinal foram inferidos a partir de dados de sequenciamento do gene 16S rRNA utilizando o Tax4Fun2 e anotados de acordo com a base de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). As vias previstas diferencialmente enriquecidas foram identificadas usando o LEfSe, com P < 0,05 e um escore LDA (log10) > 3 como limiares. Como esses perfis funcionais foram inferidos em vez de diretamente medidos por abordagens metagenômicas ou metabolômicas, foram interpretados como diferenças funcionais previstas. Foi realizada análise de correlação de postos de Spearman para explorar associações entre características microbianas e indicadores clínicos.
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software R (consulte a Tabela de Materiais). As variáveis clínicas foram resumidas como medianas e intervalos (mínimo–máximo). Os índices de diversidade alfa foram comparados entre grupos utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon, enquanto a diversidade beta foi avaliada por meio de PERMANOVA com 999 permutações. Os táxons e vias funcionais preditos com abundância diferencial foram identificados utilizando o LEfSe, com P < 0,05 e escore LDA (log10) > 3 como limiares de significância. Para a análise longitudinal de abundância diferencial, foi aplicado um modelo de efeitos mistos com interceptos aleatórios específicos por paciente, seguido de comparações pareadas pós-hoc com correção da taxa de falsa descoberta de Benjamini-Hochberg. A análise de correlação de postos de Spearman foi utilizada para avaliar as associações entre características microbianas intestinais e indicadores clínicos, com aplicação da correção da taxa de falsa descoberta de Benjamini–Hochberg aos valores de P de correlação. Um valor de P bicaudal < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A correção para múltiplas comparações foi aplicada às análises de correlação e de abundância taxonômica. Dado o tamanho reduzido da amostra e o delineamento com amostragem longitudinal repetida, as análises estatísticas foram consideradas exploratórias, e os resultados foram interpretados com cautela.
Resultados
Seleção dos pacientes e características basais
Seis pacientes com DP foram incluídos na análise final, incluindo três homens e três mulheres. A idade mediana foi de 69,0 anos (intervalo, 61–75), e o índice de massa corporal mediano foi de 22,6 kg/m2. A coorte incluiu dois fenótipos clínicos predominantemente rígidos, dois predominantemente tremorosos e dois mistos. As características clínicas basais estão apresentadas na Tabela 1.
As características clínicas diferiram entre os subgrupos de DP de alta e baixa gravidade (Tabela 1). Nesta coorte exploratória, o escore total da UPDRS foi maior no grupo FB_H do que no grupo FB_L, o que está de acordo com a classificação de gravidade predefinida, indicando um comprometimento motor mais grave. Também foram observadas diferenças em diversos parâmetros clínicos motores e não motores, incluindo subescalas da UPDRS, PSQI, escore de constipação Wexner, escala de ADL e NMSS. Esses achados sugerem que os subgrupos de gravidade predefinidos diferiram não apenas no estágio motor da doença, mas também em diversas características não motoras e funcionais.
As trajetórias individuais dos pacientes foram visualizadas usando gráficos de linhas para indicadores clínicos principais (Figura 1). Como ilustrado, uma tendência descendente consistente nas pontuações do NMSQ, NMSS, NPI, PSQI, UPDRS Total e Wexner foi observada nos seis pacientes após o TFM, independentemente da gravidade inicial da doença. Notavelmente, os pacientes no grupo _H apresentaram uma melhora clínica mais acentuada do que aqueles no grupo _L, apesar de pontuações basais mais altas. As comparações clínicas mostraram diferenças consistentes entre os grupos de alta e baixa gravidade. A maioria das comparações específicas por ponto temporal foi significativa, todos os indicadores clínicos agrupados diferiram entre os grupos e modelos de efeitos mistos confirmaram menor carga de sintomas e melhor função diária no grupo de baixa gravidade.
Eventos adversos em pacientes com DP após TFM
Os eventos adversos registrados após o TFM foram resumidos na Tabela 2. Os eventos mais frequentemente relatados foram flatulência, diarreia, constipação agravada e náusea/vômito, cada um ocorrendo em dois pacientes. Dor abdominal foi relatada em um paciente. Nenhuma febre foi registrada, e nenhum paciente interrompeu o TFM devido a eventos adversos. Esses achados sugerem que os sintomas gastrointestinais foram os eventos adversos mais comumente documentados nesta pequena coorte; no entanto, os resultados de segurança devem ser interpretados com cautela devido ao tamanho limitado da amostra.
Cobertura de diversidade suficiente e identificação de OTUs específicos do grupo
A análise da curva de rarefação mostrou que o índice de Shannon gradualmente se aproximou de uma platô conforme a profundidade de sequenciamento aumentou, sugerindo que a profundidade de sequenciamento foi geralmente suficiente para avaliar a diversidade microbiana entre as amostras (Figura 2A). Um total de 80 OTUs foi identificado em todas as amostras. Esse número relativamente baixo de OTUs é consistente com a profundidade de sequenciamento e o tamanho limitado da amostra neste estudo exploratório. A análise do diagrama de Venn identificou OTUs compartilhados e exclusivos entre os 12 grupos (Figura 2B). Um total de 80 OTUs foi detectado, incluindo 53 OTUs compartilhados por todos os grupos. O número de OTUs exclusivos em cada grupo foi o seguinte: 2 em FB_H, 12 em FB_L, 4 em FP1M_H, 0 em FP1M_L, 1 em FP2M_H, 0 em FP2M_L, 4 em FP3M_H, 0 em FP3M_L, 0 em FP4M_H, 1 em FP4M_L, 1 em FP5M_H e 2 em FP5M_L. Entre esses grupos, FB_L apresentou o maior número de OTUs exclusivos, enquanto FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L e FP4M_H não apresentaram OTUs exclusivos nesta análise. Esses achados sugerem que os subgrupos de DP compartilharam um conjunto básico de OTUs, enquanto alguns grupos exibiram padrões limitados de OTUs específicos de grupo.
A diversidade microbiana e os perfis funcionais previstos diferem entre subgrupos de gravidade da DP
A diversidade alfa foi maior no grupo FB_L do que no grupo FB_H, conforme refletido pelos índices aumentados de Chao1, ACE, Shannon e Simpson (Figura 3A). A PCoA baseada em UniFrac mostrou separação aparente entre os dois subgrupos de gravidade, sugerindo diferenças na estrutura da comunidade microbiana intestinal (Figura 3B). No nível de filo, FB_L apresentou abundâncias relativamente maiores de Firmicutes e Actinobacteria, enquanto FB_H foi caracterizado por abundâncias maiores de Bacteroidetes e Proteobacteria (Figura 3C). No nível de gênero, Bacteroides, Megasphaera e Escherichia foram mais abundantes em FB_H, enquanto Bifidobacterium e Lactobacillus foram mais abundantes em FB_L (Figura 3D).
A análise LEfSe identificou táxons associados à gravidade que apresentavam abundância diferencial. Táxons relacionados a Bacteroidetes/Bacteroides e táxons relacionados a Proteobacteria estavam enriquecidos em FB_H, enquanto táxons relacionados a Bifidobacterium, Actinobacteria, Firmicutes, Clostridia e Parabacteroides estavam enriquecidos em FB_L (Figura 3E). A análise predita de vias KEGG também mostrou perfis funcionais distintos entre os grupos. FB_H foi principalmente enriquecido em vias preditas relacionadas ao metabolismo global, metabolismo de carboidratos e energia, transdução de sinal, sistemas de duas componentes e biossíntese de lipopolissacarídeo. Em contraste, FB_L foi enriquecido em vias preditas relacionadas à biossíntese de metabólitos secundários, metabolismo de aminoácidos, metabolismo de nucleotídeos, replicação e reparo, percepção de quórum, transporte de membrana e transportadores ABC (Figura 3F). Esses achados indicam que os subgrupos de gravidade da DP diferiam na diversidade microbiana, composição taxonômica e potencial funcional predito.
Um mês após a TFM, o subgrupo FP1M_H apresentou maior diversidade microbiana e perfis funcionais preditos distintos
Em comparação com FB_H, FP1M_H apresentou maior diversidade alfa, indicada pelos índices aumentados de Chao1, ACE, Shannon e Simpson (Figura 4A). A PCoA baseada em UniFrac mostrou separação aparente entre FB_H e FP1M_H, sugerindo uma alteração na estrutura da comunidade microbiana intestinal um mês após o TFM (Figura 4B). No nível de filo, FP1M_H apresentou abundâncias relativamente maiores de Firmicutes, Actinobacteria e Verrucomicrobia, enquanto FB_H mostrou abundâncias maiores de Bacteroidetes e Proteobacteria (Figura 4C). No nível de gênero, Bifidobacterium, Akkermansia, Enterococcus e Lactobacillus foram mais abundantes em FP1M_H, enquanto Bacteroides, Megasphaera e Escherichia foram mais abundantes em FB_H (Figura 4D).
A análise LEfSe identificou táxons diferencialmente abundantes associados aos grupos. Táxons relacionados a Bacteroidetes/Bacteroides estavam enriquecidos em FB_H, enquanto táxons relacionados a Firmicutes, Actinobacteria, Clostridia, Bifidobacterium e Acidaminococcus estavam enriquecidos em FP1M_H (Figura 4E). A análise predita de vias KEGG mostrou que FB_H apresentava enriquecimento em vias relacionadas à transdução de sinal, sistemas de duas componentes, metabolismo de carboidratos, metabolismo de lipídios, metabolismo energético e metabolismo de cofatores/vitaminas. Em contraste, FP1M_H apresentava enriquecimento nas vias preditas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos, metabolismo de nucleotídeos, metabolismo de amido e sacarose, replicação e reparo, tradução, biossíntese de metabólitos secundários, sensibilidade ao quórum, transportadores ABC e transporte de membrana (Figura 4F). Esses achados sugerem que, no subgrupo de alta gravidade, o TFM foi associado ao aumento da diversidade microbiana e a alterações na composição taxonômica e no potencial funcional predito.
A riqueza microbiana, a composição taxonômica e os perfis funcionais preditos diferiram entre os grupos FB_L e FP1M_L
Em comparação com FB_L, FP1M_L apresentou maior riqueza microbiana, indicada pelos índices Chao1 e ACE aumentados, enquanto os índices de Shannon e Simpson não diferiram significativamente entre os grupos (Figura 5A). A PCoA baseada em UniFrac mostrou separação aparente entre FB_L e FP1M_L, sugerindo diferenças na composição da comunidade microbiana após o TFM (Figura 5B). No nível de filo, FP1M_L apresentou abundâncias relativamente maiores de Actinobacteria, Verrucomicrobia, Synergistetes e Euryarchaeota, enquanto Firmicutes e Bacteroidetes foram mais abundantes em FB_L (Figura 5C). No nível de gênero, Bifidobacterium, Akkermansia e Parabacteroides foram mais abundantes em FP1M_L, enquanto Bacteroides e Lactobacillus foram mais abundantes em FB_L (Figura 5D).
A análise LEfSe mostrou enriquecimento de táxons relacionados a Firmicutes, Clostridia e Ruminococcaceae em FB_L, enquanto táxons relacionados a Bacteroidetes, Bacteroidales, Parabacteroides, Porphyromonadaceae, Synergistetes, Alistipes e Rikenellaceae foram enriquecidos em FP1M_L (Figura 5E). A análise predita de vias KEGG indicou que FB_L apresentava enriquecimento em vias relacionadas à transdução de sinal, sistemas de duas componentes, metabolismo de carboidratos, metabolismo de lipídeos, metabolismo de amino-açúcares e nucleotídeo-açúcares, metabolismo de amido e sacarose e sistema fosfotransferase. FP1M_L apresentava enriquecimento nas vias preditas relacionadas a vias metabólicas globais, metabolismo de aminoácidos, tradução, biossíntese de aminoácidos, biossíntese de metabólitos secundários e processamento da informação genética (Figura 5F). Esses resultados indicam que, no subgrupo de baixa gravidade, o TFM esteve associado principalmente ao aumento da riqueza microbiana e a alterações na composição taxonômica e no potencial funcional predito.
A diversidade microbiana intestinal, a composição taxonômica e os perfis funcionais preditos variaram entre subgrupos de DP de alta gravidade em diferentes pontos temporais pós-TFM
A análise de alfa diversidade entre os cinco subgrupos de DP de alta gravidade (FP1M_H a FP5M_H) mostrou variação na riqueza microbiana e diversidade ao longo dos pontos temporais (Figura 6A). Dentre esses subgrupos, FP2M_H apresentou os menores índices de Chao1, ACE, Shannon e Simpson, enquanto FP1M_H, FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H apresentaram valores relativamente mais altos. A análise de beta diversidade utilizando distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas revelou separação entre os cinco subgrupos nos gráficos de PCoA, indicando diferenças na composição da comunidade microbiana intestinal ao longo dos pontos temporais pós-TFM (Figura 6B). No nível de filo, os 10 táxons mais abundantes estão mostrados na Figura 6C. Bacteroidetes apareceu mais abundante em FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H, enquanto Firmicutes e Actinobacteria foram mais abundantes em FP1M_H. Verrucomicrobia apareceu relativamente enriquecido em FP2M_H. No nível de gênero, Bacteroides foi relativamente mais abundante em FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H, enquanto Akkermansia e Escherichia foram mais abundantes em FP2M_H. Bifidobacterium foi relativamente enriquecido em FP1M_H (Figura 6D). A análise LEfSe identificou táxons distintos com abundância diferencial entre vários subgrupos de alta gravidade (Figura 6E), incluindo táxons relacionados a Firmicutes, Actinobacteria, Bifidobacterium e Clostridia em FP1M_H; táxons relacionados a Proteobacteria e Enterobacteriaceae em FP2M_H; táxons relacionados a Bacteroidetes e Bacteroides em FP3M_H; e táxons relacionados a Synergistetes em FP4M_H. O perfil funcional predito com base na anotação de vias KEGG mostrou padrões de enriquecimento específicos por subgrupo (Figura 6F). FP1M_H mostrou enriquecimento predito em metabolismo de amido e sacarose e biossíntese de outros metabólitos secundários, FP2M_H mostrou enriquecimento predito em metabolismo de cofatores e vitaminas e metabolismo energético, e FP5M_H mostrou enriquecimento predito em transdução de sinal e sistemas de duas componentes. Esses achados sugerem que os subgrupos de DP de alta gravidade apresentaram variação temporal na diversidade microbiana, composição taxonômica e perfis funcionais preditos após TFM.
A diversidade microbiana intestinal, a composição taxonômica e os perfis funcionais preditos variaram entre subgrupos de DP de baixa gravidade em diferentes momentos após o TFM
A análise de alfa diversidade entre os cinco subgrupos de DP de baixa gravidade (FP1M_L a FP5M_L) mostrou variação na riqueza e diversidade microbiana ao longo dos pontos temporais (Figura 7A). O FP2M_L apresentou índices Chao1 e ACE relativamente mais baixos, enquanto FP4M_L e FP5M_L apresentaram índices Shannon e Simpson relativamente mais altos, indicando variação na riqueza e uniformidade entre os subgrupos de baixa gravidade. A análise de beta diversidade utilizando distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas revelou separação entre os cinco subgrupos nos gráficos de PCoA, indicando diferenças na composição da comunidade microbiana intestinal ao longo dos pontos temporais pós-TFM (Figura 7B). No nível de filo, os 10 táxons mais abundantes estão mostrados na Figura 7C. Bacteroidetes e Firmicutes foram os filos dominantes em todos os grupos, enquanto Actinobacteria e Verrucomicrobia apareceram relativamente enriquecidos em FP1M_L, e Firmicutes apareceu relativamente mais abundante em FP3M_L. No nível de gênero, Bifidobacterium e Akkermansia foram relativamente mais abundantes em FP1M_L, enquanto Bacteroides foi relativamente mais abundante em FP2M_L (Figura 7D). A análise LEfSe identificou táxons diferencialmente abundantes associados a subgrupos em diversos subgrupos de baixa gravidade (Figura 7E), incluindo táxons relacionados a Ruminococcaceae em FP1M_L, táxons relacionados a Firmicutes e Clostridiales em FP2M_L, táxons relacionados a Synergistetes em FP3M_L, e táxons relacionados a Bacteroidetes, Parabacteroides, Actinobacteria e Bifidobacterium em FP4M_L. O perfil funcional predito com base na anotação de vias KEGG mostrou padrões de enriquecimento específicos a subgrupos (Figura 7F). FP1M_L mostrou enriquecimento predito na biossíntese de metabólitos secundários, FP2M_L mostrou enriquecimento predito em vias relacionadas à transdução de sinal, sistemas de duas componentes, processamento de informações ambientais, comunidade celular-procariotos e metabolismo de carboidratos, FP3M_L mostrou enriquecimento predito em transporte de membrana, quorum sensing, replicação e reparo, e sistema fosfotransferase, FP4M_L mostrou enriquecimento predito em processamento de informação genética, e FP5M_L mostrou enriquecimento predito em metabolismo e vias metabólicas. Esses achados sugerem que os subgrupos de DP de baixa gravidade apresentaram variação temporal na diversidade microbiana, composição taxonômica e perfis funcionais preditos após TFM.
Associações entre OTUs específicas e indicadores clínicos na DP
Para explorar as associações entre alterações microbianas intestinais e características clínicas na DP, as 50 principais correlações entre OTUs e parâmetros clínicos foram visualizadas após a correção para comparações múltiplas, correspondendo a 23 OTUs únicos (Figura 8). Vários OTUs exibiram padrões de correlação semelhantes em múltiplos indicadores clínicos. Por exemplo, OTU165, OTU67, OTU230, OTU154, OTU72 e diversos outros OTUs apresentaram correlações positivas com o escore de Wexner, estágio de Hoehn–Yahr, PSQI e múltiplas medidas relacionadas à UPDRS, enquanto mostraram correlações negativas com a escala de ADL e NPI. Em contraste, OTU10 (Parabacteroides) e OTU45 (Fusobacterium) exibiram um padrão de correlação oposto para diversas variáveis clínicas. OTU165, que foi anotado ao nível do filo como Firmicutes, mostrou correlações positivas com a gravidade da constipação, estágio da doença, distúrbios do sono e diversos componentes da UPDRS, enquanto apresentou correlações negativas com a escala de ADL e NPI. De forma semelhante, OTU67 (Porphyromonadaceae) também se correlacionou com diversos indicadores clínicos motores e não motores. De modo geral, esses achados sugerem que OTUs específicos estiveram associados a múltiplas medidas clínicas na DP, embora essas correlações devam ser interpretadas com cautela e consideradas como geradoras de hipóteses, e não como evidência de causalidade.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Materiais suplementares para este estudo estão disponíveis em DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.21620775.
Figura 1: Alterações longitudinais nas pontuações clínicas após o transplante de microbiota fecal em pacientes com DP. Os gráficos de linhas mostram as alterações nas pontuações NMSQ, NMSS, NPI, PSQI, UPDRS total e Wexner para constipação desde a linha de base antes do TFM (AB) até 1, 2, 3, 4 e 5 meses após o TFM (AP1M–AP5M) no grupo de alta gravidade (A) e no grupo de baixa gravidade (B). Os pontos de dados representam valores-resumo em nível de grupo e as barras de erro indicam a variabilidade ou faixa correspondente. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curvas de rarefação e comparação de OTUs entre grupos. (A) Curvas de rarefação de Shannon mostrando a relação entre profundidade de sequenciamento e diversidade microbiana. O eixo x representa a profundidade de sequenciamento, e o eixo y representa o índice de diversidade de Shannon. O platô gradual das curvas sugere que a profundidade de sequenciamento foi geralmente suficiente para a avaliação da diversidade. (B) Diagrama de Venn mostrando OTUs compartilhados e exclusivos entre os 12 grupos. O número no centro representa OTUs compartilhados por todos os grupos, enquanto os números nas regiões externas representam OTUs exclusivos de cada grupo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diversidade microbiana, composição taxonômica e diferenças funcionais previstas entre os grupos FB_H e FB_L. (A) Análise da diversidade alfa com base nos índices Chao1, ACE, Shannon e Simpson. (B) Análise de coordenadas principais (PCoA) com base nas distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas. (C,D) Abundância relativa dos 10 principais táxons microbianos intestinais nos níveis de filo (C) e gênero (D), apresentada por meio de gráficos de barras empilhadas e gráficos de caixa. (E) Análise LEfSe mostrando táxons diferencialmente abundantes entre os grupos FB_H e FB_L. (F) Análise LEfSe de vias funcionais previstas no KEGG. Pontuações LDA positivas e negativas indicam vias enriquecidas em diferentes grupos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diversidade microbiana, composição taxonômica e diferenças funcionais preditas entre os grupos FP1M_H e FB_H. (A) Análise da diversidade alfa com base nos índices Chao1, ACE, Shannon e Simpson. (B) Análise de coordenadas principais (PCoA) com base nas distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas. (C,D) Abundância relativa dos 10 principais táxons microbianos intestinais nos níveis de filo (C) e gênero (D), mostrada por meio de gráficos de barras empilhadas e gráficos de caixa. (E) Análise LEfSe mostrando táxons diferencialmente abundantes entre os grupos FP1M_H e FB_H. (F) Análise LEfSe de vias funcionais preditas no KEGG. Escores LDA positivos e negativos indicam vias enriquecidas em diferentes grupos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: Diferenças microbianas e funcionais entre os grupos FB_L e FP1M_L. (A) Análise da diversidade alfa dos grupos FB_L e FP1M_L. (B) Análise da diversidade beta dos grupos FB_L e FP1M_L. (C,D) Abundância relativa de táxons microbianos intestinais nos grupos FB_L e FP1M_L nos níveis de filo (C) e gênero (D). (E) Análise comparativa das diferenças entre espécies dos grupos FB_L e FP1M_L. (F) Funções microbianas preditas nos grupos FB_L e FP1M_L. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 6: Diversidade microbiana, composição taxonômica e diferenças funcionais previstas entre os grupos FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H. (AAnálise da diversidade alfa com base nos índices de Chao1, ACE, Shannon e Simpson.BAnálise de coordenadas principais (PCoA) baseada em distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas.C,D) Abundância relativa dos 10 principais táxons microbianos intestinais ao nível de filo (C) e níveis de gênero (D), mostrados por meio de gráficos de barras empilhadas e gráficos de caixa. (EAnálise LEfSe mostrando táxons diferencialmente abundantes entre os cinco subgrupos de alta gravidade após FMT.FAnálise LEfSe de vias funcionais do KEGG preditas. Pontuações LDA positivas indicam vias enriquecidas nos grupos correspondentes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 7: Diversidade microbiana, composição taxonômica e diferenças funcionais preditas entre os grupos FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L e FP5M_L. (A) Análise de diversidade alfa com base nos índices Chao1, ACE, Shannon e Simpson. (B) Análise de coordenadas principais (PCoA) com base nas distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas. (C,D) Abundância relativa dos 10 principais táxons microbianos intestinais nos níveis de filo (C) e gênero (D), apresentada por meio de gráficos de barras empilhadas e boxplots. (E) Análise LEfSe mostrando táxons diferencialmente abundantes entre os cinco subgrupos pós-TFM de baixa gravidade. (F) Análise LEfSe de vias funcionais preditas no KEGG. Escores LDA positivos indicam vias enriquecidas nos grupos correspondentes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise de correlação de Spearman entre OTUs e indicadores clínicos. As linhas representam OTUs e as colunas representam características clínicas. Cada célula mostra o coeficiente de correlação de Spearman entre uma OTU específica e um indicador clínico. A cor vermelha indica correlação positiva e a cor azul indica correlação negativa, sendo a intensidade da cor proporcional à força da associação. Os valores numéricos nas células representam os coeficientes de correlação. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; ns, não significativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Paciente | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Gênero (F/M) | M | F | M | F | M | F |
| Idade (anos) | 65 | 72 | 68 | 75 | 61 | 70 |
| IMC | 23,5 | 21,8 | 24,2 | 20,5 | 22,1 | 23 |
| Subtipo de DP | Rigidez | Tremor | Híbrido | Rigidez | Tremor | Híbrido |
| Duração da doença | 5 | 8 | 6 | 10 | 3 | 7 |
| Pontuação de Wexner | 12 | 15 | 10 | 18 | 8 | 13 |
| UPDRS total | 45 | 61 | 49 | 72 | 36 | 55 |
| NMSS total | 45 | 62 | 50 | 70 | 38 | 55 |
| NMSQ | 10 | 14 | 11 | 16 | 8 | 12 |
| PSQI | 8 | 11 | 9 | 13 | 6 | 10 |
| ADL | 90 | 75 | 85 | 70 | 95 | 65 |
| NPI | 5 | 9 | 6 | 12 | 3 | 7 |
| Duração da constipação | 4 | 7 | 5 | 9 | 2 | 6 |
| LEDD (mg/d) | 600 | 800 | 700 | 900 | 400 | 750 |
| Uso de laxantes | Não | Uso intermitente | Não | Uso prolongado | Não | Uso intermitente |
| Uso de probióticos | Não | Sim | Não | Sim | Não | Não |
| Uso de antibióticos | Não | Não | Sim | Não | Não | Não |
| Estágio de Hoehn–Yahr | 2 | 3 | 2,5 | 3,5 | 1,5 | 3 |
| Grupo de gravidade | baixo | alto | baixo | alto | baixo | alto |
Tabela 1: Características demográficas e clínicas basais dos pacientes com doença de Parkinson, estratificadas por duração da doença. Os pacientes foram classificados no grupo de alta duração (>6 anos; FB_H) ou no grupo de baixa duração (≤6 anos; FB_L). Os dados devem ser apresentados como mediana (intervalo) para variáveis contínuas e número (%) para variáveis categóricas, quando aplicável. Abreviações: ADL, Atividades de Vida Diária; BMI, índice de massa corporal; NMSS, Escala de Sintomas Não Motores; NMSQ, Questionário de Sintomas Não Motores; NPI, Inventário Neuropsiquiátrico; PD, doença de Parkinson; PSQI, Índice de Qualidade do Sono de Pittsburgh; UPDRS, Escala Unificada de Avaliação da Doença de Parkinson.
| Eventos adversos | Pacientes (n, %) |
| Flatulência | 2 (33,3%) |
| Dor abdominal | 1 (16,7%) |
| Diarréia | 2 (33,3%) |
| Constipação agravada | 2 (33,3%) |
| Febre | 0 |
| Náusea/vômito | 2 (33,3%) |
| Interrupção da TFM devido a eventos adversos | 0 |
Tabela 2: Eventos adversos após transplante de microbiota fecal em pacientes com doença de Parkinson. A tabela apresenta o número e a porcentagem de pacientes que apresentaram cada evento adverso durante o acompanhamento após o transplante de microbiota fecal. Não foram relatados casos de febre nem interrupção do tratamento devido a eventos adversos. Abreviações: FMT, transplante de microbiota fecal; PD, doença de Parkinson.
Figura Suplementar 1: Seleção dos participantes e fluxo dos pacientes. Fluxograma do processo de triagem da amostra para pacientes com doença de Parkinson submetidos à TFM e participantes do sequenciamento de rRNA 16S. n representa o número de participantes.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
A TFM é uma intervenção baseada na microbiota que transfere a microbiota fecal de um doador saudável para o intestino do receptor, a fim de restaurar o equilíbrio microbiano intestinal14. Evidências crescentes sugerem que a microbiota intestinal desempenha um papel importante na manutenção da homeostase do sistema nervoso15. Evidências provenientes do eixo bidirecional intestino-cérebro indicam que a microbiota intestinal pode influenciar a inflamação do sistema nervoso central, o metabolismo de neurotransmissores e as respostas comportamentais na DP16,17. Assim, o transplante de microbiota tem atraído atenção como uma possível intervenção, embora sua aplicação clínica em doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas permaneça exploratória18. Este estudo observacional retrospectivo de centro único avaliou os desfechos clínicos, a segurança e perfis exploratórios da microbiota intestinal em pacientes com DP que realizaram transplante de microbiota fecal (TFM) na prática clínica habitual. Observamos diferenças na riqueza microbiana intestinal, diversidade, estrutura comunitária e perfis funcionais preditos entre subgrupos de gravidade da DP e pontos temporais após o TFM. Esses achados sugerem que os perfis microbianos intestinais podem variar conforme a gravidade da doença e podem mudar dinamicamente após a intervenção com TFM. Portanto, esses resultados devem ser considerados exclusivamente como geradores de hipóteses e requerem validação em estudos maiores e adequadamente dimensionados.
A constipação é um dos sintomas não motores mais comuns e onerosos na DP19. A constipação pode reduzir a qualidade de vida, aumentar a necessidade de laxantes e interferir na absorção de medicamentos dopaminérgicos. Na presente coorte, os escores de constipação de Wexner diminuíram após o TFM em ambos os subgrupos analíticos, embora a magnitude e a persistência da melhora tenham diferido entre os pontos de acompanhamento. Esse padrão sugere uma associação temporal entre o TFM e a melhora dos sintomas intestinais.
Também observamos alterações em diversas medidas clínicas motoras e não motoras, incluindo os escores do NMSS, PSQI, UPDRS III e UPDRS total. Esses achados são notáveis porque a DP é uma desordem multissistêmica na qual disfunção gastrointestinal, distúrbios do sono, sintomas autonômicos, sintomas neuropsiquiátricos e comprometimento motor frequentemente coexistem. Uma explicação possível é que a modulação da microbiota intestinal possa influenciar a motilidade gastrointestinal, a inflamação sistêmica, a integridade da barreira intestinal, os metabólitos microbianos e a sinalização ao longo do eixo microbiota-intestino-cérebro. Contudo, os escores motores e não motores na DP são afetados por múltiplos fatores, incluindo estágio da doença, terapia dopaminérgica, qualidade do sono, humor, disfunção autonômica, estado de reabilitação e atividade diária. Portanto, as alterações nos escores do UPDRS, NMSS, PSQI e medidas relacionadas às AIVD devem ser interpretadas como observações clínicas exploratórias.
Nossos achados são amplamente consistentes com estudos anteriores que associam a microbiota intestinal à heterogeneidade clínica relacionada à DP. Um estudo recente relatou que o transplante de microbiota fecal de doadores saudáveis pode melhorar os sintomas motores e não motores em pacientes com doença de Parkinson, acompanhado de alterações na composição da microbiota intestinal e nas vias funcionais13,20. Embora distúrbios do controle impulsivo não tenham afetado significativamente as diversidades α e β em pacientes com DP em um estudo anterior, certos táxons microbianos estavam enriquecidos em pacientes com distúrbios do controle impulsivo e mostraram possíveis diferenças funcionais em vias como degradação de xenobióticos e metabolismo da niacina21. Outro estudo relatou que pacientes com DP e ansiedade exibiam alterações na composição da microbiota intestinal e na β-diversidade, reforçando ainda mais a possível associação entre a flora intestinal e os sintomas não motores relacionados à DP22. Neste estudo, a diversidade e a composição microbianas diferiram entre os subgrupos de alta e baixa gravidade, e vários subgrupos pós-TMF apresentaram padrões microbianos distintos. Esses resultados sustentam a possibilidade de que a microbiota intestinal possa estar envolvida nas manifestações clínicas multidimensionais da DP, embora as relações causais permaneçam por ser confirmadas.
Vários táxons identificados neste estudo podem ser biologicamente relevantes para alterações relacionadas à DP no microbioma intestinal. Determinadas bactérias podem influenciar a fisiopatologia da DP por meio de vias imunológicas e metabólicas23. Firmicutes é um dos principais filos bacterianos Gram-positivos no intestino humano e inclui membros envolvidos na produção de ácidos graxos de cadeia curta e na manutenção da barreira intestinal24. Neste estudo, OTU165, anotado ao nível do filo como Firmicutes, foi um dos OTUs mais frequentemente associados a variáveis clínicas. No entanto, grupos taxonômicos amplos como Firmicutes contêm membros funcionalmente diversos, e sua interpretação biológica deve ser feita com cautela. A análise metagenômica fecal mostrou que Lactobacillus e seus epítopos microbianos associados ao filo Firmicutes estão enriquecidos em pacientes com DP e estão associados a marcadores inflamatórios e vias metabólicas como a fermentação de propionato25. Bifidobacterium é um gênero bacteriano com propriedades potencialmente anti-inflamatórias e pode contribuir para a regulação do microbioma intestinal, enquanto Bacteroides é um gênero comensal importante cuja disbiose tem sido associada à disfunção da barreira intestinal e a respostas inflamatórias aumentadas26,27. No presente estudo, Bacteroides foi relativamente mais abundante em FP2M_L, enquanto Bifidobacterium foi relativamente mais abundante em FP1M_L. Em um modelo de ratos de DP, a suplementação com Bifidobacterium breve Bif11 melhorou os déficits motores e cognitivos, reduziu fatores inflamatórios e estresse oxidativo no mesencéfalo e restaurou o teor de ácidos graxos de cadeia curta e a função da barreira intestinal28. Estudos anteriores também relataram alterações na abundância de Bacteroides em pacientes com DP, acompanhadas por mudanças no metabolismo de precursores de ácidos graxos de cadeia curta e associações com a gravidade da doença29. Esses achados indicam que os táxons observados neste estudo podem ter significado biológico potencial, mas são necessárias análises taxonômicas de maior resolução e validação funcional.
A análise de predição funcional sugeriu que diferentes subgrupos de DP apresentaram padrões distintos de enriquecimento predito em vias KEGG. O grupo FB_H apresentou enriquecimento predito em vias como metabolismo de carboidratos, fosforilação oxidativa, metabolismo microbiano em diversos ambientes e processos relacionados a lipopolissacarídeos, o que pode refletir uma potencial alteração no metabolismo microbiano no grupo de alta gravidade. A fosforilação oxidativa é um processo principal pelo qual as mitocôndrias geram energia e mantêm a função neuronal normal30. A perturbação da fosforilação oxidativa pode levar à deficiência energética, estresse oxidativo e neuroinflamação, fatores implicados na depressão e no DP31. Estudos sugerem que o microbioma intestinal pode influenciar a disfunção mitocondrial regulando a síntese de neurotransmissores, a mitofagia e a homeostase do estresse oxidativo32. Genes associados ao DP também podem prejudicar a função do complexo I mitocondrial, reduzir a produção de ATP e agravar a progressão da doença ao interromper a via Akt33. Além disso, o lipopolissacarídeo (LPS), um componente importante de bactérias Gram-negativas, pode desencadear respostas neuroinflamatórias, e estudos em animais demonstraram que a exposição ao LPS pode ativar a microglia, promover a liberação de fatores inflamatórios, danificar estruturas neurais e induzir alterações comportamentais semelhantes às do parkinsonismo34. Neste estudo, alguns subgrupos de baixa gravidade e pós-TFM também apresentaram enriquecimento predito em vias relacionadas ao metabolismo de aminoácidos, biossíntese de metabólitos secundários, transporte de membrana, replicação e reparo, e metabolismo relacionado a ácidos graxos de cadeia curta. No entanto, como esses resultados de vias foram inferidos a partir do sequenciamento de rRNA 16S e não medidos diretamente por abordagens metagenômicas ou metabolômicas, devem ser considerados exploratórios.
Este estudo também avaliou as associações entre características microbianas intestinais e indicadores clínicos que refletem sintomas motores e não motores na DP. O escore de Wexner reflete a função defecatória; o estágio de Hoehn–Yahr e a UPDRS avaliam a gravidade do comprometimento motor; PSQI e ADL medem, respectivamente, a qualidade do sono e a capacidade funcional diária; e a NPI avalia sintomas neuropsiquiátricos, como ansiedade e depressão35,36,37. Várias OTUs estiveram associadas a escalas clínicas relacionadas à constipação, distúrbios do sono, comprometimento motor, estado funcional e sintomas neuropsiquiátricos. Estudos randomizados e controlados anteriores relataram que o TFM pode melhorar a função autonômica e os sintomas gastrointestinais em pacientes com DP e aumentar a complexidade do microbioma intestinal, sugerindo que o TFM pode ser uma intervenção adjuvante viável38. Outro estudo também descobriu que a diversidade microbiana intestinal estava alterada em pacientes com DP, com Firmicutes e Actinobacteria positivamente correlacionados com os escores da UPDRS III, NMSS, Wexner e do Questionário de Doença de Parkinson de 39 itens PDQ-39, enquanto Bacteroidetes mostrou correlações negativas com esses indicadores39. No entanto, as correlações observadas no presente estudo não estabelecem causalidade, e a direcionalidade dessas associações deve ser interpretada com cautela.
A segurança é uma consideração essencial na avaliação da TFM para doenças neurodegenerativas. Nesta coorte, os eventos adversos relatados foram principalmente gastrointestinais, incluindo flatulência, diarreia, constipação agravada, náusea/vômito e dor abdominal. Nenhuma febre foi registrada, e nenhum paciente interrompeu a TFM devido a eventos adversos. Esses achados sugerem que a TFM foi geralmente bem tolerada nesta pequena coorte. No entanto, a avaliação de segurança baseou-se em registros clínicos retrospectivos e em um número limitado de pacientes. Complicações raras, mas clinicamente importantes, incluindo infecção, aspiração, transmissão de patógenos derivados do doador, complicações metabólicas e eventos adversos tardios, não podem ser excluídas. Estudos prospectivos futuros devem incluir definições padronizadas de eventos adversos, vigilância ativa de segurança, documentação do rastreamento de doadores e acompanhamento de longo prazo.
Várias limitações devem ser reconhecidas, incluindo o tamanho reduzido da amostra (n = 6), ausência de um grupo controle, delineamento com medidas repetidas com potencial pseudorreplicação e regressão à média, e documentação incompleta de possíveis fatores de confusão, como dieta, tratamentos para constipação, ajustes medicamentosos e uso de antibióticos ou probióticos, embora os participantes tivessem sido orientados a evitar estes últimos. Contudo, exposições não documentadas não podem ser descartadas e podem ter influenciado a microbiota intestinal. Além disso, a história familiar de doença de Parkinson ou outros distúrbios neurológicos não foi registrada sistematicamente, impedindo a avaliação de contribuições genéticas ou familiares. As previsões funcionais basearam-se em dados de 16S rRNA, e não em medidas diretas de metagenômica ou metabolômica, e diversas OTUs foram anotadas apenas em níveis taxonômicos amplos, limitando a interpretabilidade biológica. Essas limitações exigem uma interpretação cautelosa desses achados.
No entanto, este estudo exploratório sugere que a TFM esteve associada a alterações nos sintomas relacionados à constipação, escores clínicos motores e não motores selecionados, eventos adversos gastrointestinais e perfis exploratórios da microbiota intestinal em pacientes com DP. Os achados fornecem evidências preliminares do mundo real e apoiam investigações adicionais sobre intervenções direcionadas à microbiota em DP com constipação. Contudo, dada a pequena amostra, o delineamento retrospectivo, a estrutura de medidas repetidas e a ausência de um grupo controle, os resultados devem ser interpretados com cautela. Estudos prospectivos controlados, com protocolos padronizados de TFM, desfechos clínicos pré-definidos, monitoramento rigoroso de segurança e análises integradas de múltiplos ômicas, são necessários para esclarecer o valor clínico, a segurança e os mecanismos biológicos da TFM na DP.
Divulgações
Conflitos de Interesse: Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os colegas que auxiliaram e apoiaram esta pesquisa. Sua colaboração e incentivo foram inestimáveis para o nosso trabalho.
Financiamento: Esta pesquisa foi financiada pelo Programa-Chave Provincial de Jiangsu para a Saúde do Idoso (LKZ2022004).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema MiSeq | Illumina, Inc. | SY-410-1003 | Plataforma de sequenciamento de leitura curta em bancada utilizada para o sequenciamento de amplicons V3–V4 do RNA ribossomal 16S com química pareada de 2 × 300 pb. |
| Metagenome@KIN | World Fusion Co., Ltd. | v2.2.1; https://www.w-fusion.com/metagenome | Software comercial utilizado para atribuição taxonômica do RNA ribossomal 16S e análise da comunidade microbiana. |
| Banco de dados de identificação microbiana (bacteriano) | TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd. | DB-BA, banco de dados v10.0; https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/ | Banco de dados de referência de 16S rDNA bacteriano utilizado para identificação microbiana. |
| Primer 341F | BGI Genomics Co., Ltd. | Oligonucleotídeo personalizado; sem número de catálogo | Sequência do primer direto: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′. |
| Primer 805R | BGI Genomics Co., Ltd. | Oligonucleotídeo personalizado; sem número de catálogo | Sequência do primer reverso: 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. |
| Serviço de sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S | BGI Genomics Co., Ltd. (Wuhan, China) | https://www.bgi.com/us/sequencing-services/rna-sequencing-solutions/16s18s-its-sequencing/ | Prestador comercial de sequenciamento; realizou a preparação da biblioteca, o sequenciamento e o controle inicial de qualidade. |
| Tubos microcentrífugos Eppendorf Safe-Lock, Biopur, 1,5 mL | Eppendorf SE | '0030121589 | Tubos estéreis de polipropileno utilizados para aliquotar amostras fecais para armazenamento a −80 °C. |
| LEfSe | Segata Lab/bioBakery | v1.1.2; https://github.com/SegataLab/lefse | Software de tamanho do efeito por análise discriminante linear utilizado para identificar táxons e vias preditas com abundância diferencial. |
| Tax4Fun2 | Equipe de desenvolvimento do Tax4Fun2 | v1.1.5; https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2 | Pacote R utilizado para inferir perfis funcionais do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes a partir de dados de RNA ribossomal 16S. |
| Pacote R microeco | Chi Liu e colaboradores | v1.15.0; https://cran.r-project.org/package=microeco | Pacote para análise e visualização da ecologia comunitária em análises de abundância e diversidade microbianas. |
| Software R | R Foundation for Statistical Computing | Versão não informada; https://www.r-project.org/ | Ambiente de computação estatística utilizado para análises clínicas e do microbioma; a versão exata deve ser confirmada pelos autores. |
| Sistema automatizado de purificação de microbiota fecal GenFMTer | Nanjing FMT Medical Co., Ltd. | Modelo: GenFMTer; https://en.fmtmed.com/ | Sistema automatizado utilizado para centrifugação padronizada, lavagem e preparação da suspensão de microbiota fecal. |
Referências
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