Silenciamento do LINC00707 Alivia a Inflamação e o Estresse Oxidativo em Micróglias BV2 Estimuladas por LPS via o eixo miR-145-5p/TRAF6 na lesão medular

Resumo

A expressão do LINC00707 no plasma está elevada na lesão medular e promove inflamação e estresse oxidativo mediados por micróglias por meio do eixo de sinalização miR-145-5p/TRAF6. O silenciamento do LINC00707 atenua essas respostas patológicas, destacando seu potencial como alvo terapêutico.

Resumo

A lesão medular (SCI) causa incapacidade permanente, reduz profundamente o bem-estar e impõe um ônus socioeconômico substancial. Este estudo investigou o papel do LINC00707 na SCI por meio da regulação do eixo de sinalização miR-145-5p/TRAF6. Amostras de plasma de 30 indivíduos saudáveis e 75 pacientes com SCI foram analisadas quanto à expressão de LINC00707, miR-145-5p e TRAF6 utilizando RT-qPCR. As associações entre os níveis plasmáticos de LINC00707 e fatores pró-inflamatórios foram avaliadas em pacientes com SCI. Células microgliais BV2 foram expostas a 100 ng/mL de LPS, e fatores relacionados à inflamação e ao estresse oxidativo foram medidos. As interações moleculares foram avaliadas utilizando um ensaio de repórter de dupla luciferase. A análise de regressão logística foi utilizada para identificar fatores associados à expressão de LINC00707. Os níveis plasmáticos de LINC00707 e TRAF6 estavam aumentados em pacientes com SCI, enquanto os níveis de miR-145-5p estavam reduzidos. Os níveis plasmáticos de LINC00707 correlacionaram-se positivamente com os níveis plasmáticos de fatores inflamatórios. O LINC00707 atuou como uma esponja molecular para o miR-145-5p, e o TRAF6 foi um gene alvo do miR-145-5p. A inibição do LINC00707 diminuiu os fatores inflamatórios, substâncias pró-estresse oxidativo e os níveis de mRNA do TRAF6 em células BV2. A inibição do miR-145-5p produziu efeitos opostos. Esses achados sugerem que a expressão elevada de LINC00707 está associada à gravidade da SCI e que a supressão do LINC00707 pode atenuar a inflamação e o estresse oxidativo mediados por micróglias por meio da regulação do eixo de sinalização miR-145-5p/TRAF6.

Introdução

A lesão medular (SCI) é uma condição traumática que danifica a medula espinhal, um componente crítico do sistema nervoso central. A SCI interrompe diretamente as vias de condução neural entre a medula espinhal e o cérebro, causando graves comprometimentos nas funções motora, sensorial e autonômica^1,2. Estudos epidemiológicos relataram uma incidência anual de aproximadamente 5 casos por 100.000 indivíduos, com mortalidade relacionada à doença chegando a 16,7%^3,4. Uma pesquisa canadense estimou o custo vitalício de reabilitação para cada paciente com SCI em até US$ 336.000⁵. A alta incidência, mortalidade e os custos substanciais associados ao diagnóstico, tratamento e reabilitação tornam a lesão medular um grande desafio clínico que exige estratégias terapêuticas aprimoradas.

A progressão patológica da LME consiste em duas fases: lesão primária e lesão secundária. A lesão primária resulta da compressão mecânica traumática ou da ruptura do tecido da medula espinhal, enquanto a lesão secundária é mediada por processos patológicos, incluindo inflamação e estresse oxidativo^6,7. Em condições fisiológicas, a neuroinflamação mediada por micróglias contribui para a homeostase do sistema nervoso central^8,9,10. Após a LME, no entanto, as micróglias tornam-se excessivamente ativadas e liberam grandes quantidades de mediadores pró-inflamatórios^11,12. Esses mediadores induzem a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ERO), causando dano e morte neuronais e agravando a lesão medular secundária^13,14. Portanto, suprimir a ativação excessiva das micróglias e interromper a cascata inflamatória representam estratégias terapêuticas promissoras para promover a recuperação neurológica e melhorar os resultados após a LME.

Os RNAs não codificantes longos (lncRNAs) são uma classe de RNAs não codificantes com mais de 200 nucleotídeos que não possuem potencial de codificação proteica¹⁵. Inicialmente considerados como "ruído" transcricional, os lncRNAs são agora reconhecidos como importantes reguladores de diversos processos fisiológicos e patológicos¹⁶. Estudos recentes demonstraram que os lncRNAs desempenham papéis cruciais na lesão neural. O RNA não codificante longo intergênico 707 (LINC00707) surgiu como um regulador importante de distúrbios do sistema nervoso. Estudos anteriores relataram que o LINC00707 agrava a lesão cerebral traumática ao potencializar a inflamação mediada por micróglias¹⁷. Além disso, Zhu et al. demonstraram que o silenciamento do LINC00707 atenuou significativamente a inflamação e a apoptose induzidas por lipopolissacarídeo (LPS) em células PC12¹⁸. Esses achados fornecem uma base teórica preliminar para explorar o envolvimento do LINC00707 na lesão medular (SCI). No entanto, ainda permanece a ser elucidado se o LINC00707 regula a inflamação mediada por micróglias durante a lesão medular.

Os lncRNAs atuam como esponjas moleculares por meio do mecanismo de RNA endógeno competitivo (ceRNA), sequestrando microRNAs (miRNAs) e regulando a expressão de genes alvo downstream¹⁹. Esse padrão regulatório está amplamente envolvido na patogênese de diversas doenças. Notavelmente, o miR-145-5p está significativamente subregulado nos tecidos de lesão medular (SCI)²⁰ e durante lesões induzidas por LPS²¹, e sua superexpressão atenua efetivamente as respostas inflamatórias e de estresse oxidativo nas micróglias²². O fator associado ao receptor de fator de necrose tumoral 6 (TRAF6) também desempenha um papel fundamental na patologia da SCI^23,24,25. No entanto, ainda não está esclarecido se LINC00707, miR-145-5p e TRAF6 exercem funções regulatórias coordenadas na SCI.

No presente estudo, a expressão de LINC00707 foi significativamente aumentada em células microgliais estimuladas com LPS. Portanto, formulamos a hipótese de que LINC00707 possa atuar como um regulador pró-inflamatório na microglia e que seu silenciamento possa atenuar a resposta neuroinflamatória, melhorando assim a progressão patológica da lesão medular (SCI). Este estudo investigou se LINC00707 regula as respostas inflamatórias da microglia e contribui para a patogênese da lesão medular.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Zhangjiakou First (número de aprovação 2024-KY-18). Todos os participantes foram informados sobre os objetivos do estudo e os riscos potenciais e forneceram consentimento informado por escrito antes da inscrição. Amostras de sangue venoso foram coletadas de controles saudáveis durante exames físicos de rotina e de pacientes com LES imediatamente após a admissão hospitalar. As medições laboratoriais foram realizadas pelo laboratório clínico do hospital. As ferramentas de pesquisa utilizadas neste protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Sujeitos
Um total de 75 pacientes com LME foram recrutados no Hospital Zhangjiakou Primeiro entre janeiro de 2023 e janeiro de 2025. Os critérios de inclusão foram LME confirmada por tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (RM) e um intervalo de tempo entre a lesão e a admissão hospitalar de ≤ 12 h. Os critérios de exclusão foram histórico de trauma ou cirurgia na medula espinhal ou cérebro nos últimos 6 meses; doença cardiovascular grave, incluindo infarto do miocárdio ou arritmia; gravidez ou lactação; e tumores malignos, disfunção hepática ou renal, doença cerebrovascular grave ou doenças infecciosas.

De acordo com os padrões de classificação neurológica da American Spinal Injury Association (ASIA)²⁶, 75 pacientes com lesão medular foram classificados em grupos de função neurológica normal (n = 21), lesão medular incompleta (n = 36) e lesão medular completa (n = 18). A distribuição dos locais da lesão foi a seguinte: cervical, 36,0%; torácica, 30,7%; e lombar, 33,3%. Trinta indivíduos saudáveis, pareados com a população do estudo, foram recrutados aleatoriamente para servir como grupo controle. As informações clínicas basais foram coletadas para todos os participantes. Os critérios de inclusão para indivíduos saudáveis foram ausência de histórico de trauma medular ou cerebral, cirurgia ou distúrbios neurológicos; ausência de histórico de doenças inflamatórias crônicas, distúrbios autoimunes ou neoplasias; ausência de doenças cardiovasculares, hepáticas ou renais graves; ausência de infecção aguda ou crônica nas últimas 4 semanas; ausência de gravidez ou lactação; e pareamento por idade e sexo com o grupo de lesão medular.

A Medida de Independência Funcional (FIM) foi utilizada para avaliar a independência funcional nas atividades diárias. A pontuação máxima na FIM é 126. As pontuações de sensação tátil, acmestesia e motora foram utilizadas para avaliar as funções sensorial e motora. As pontuações máximas de sensação tátil e acmestesia eram 112, e a pontuação motora máxima era 100. Pontuações mais baixas indicam comprometimento neurológico mais grave.

2. Cultura celular, construção do modelo e transfeção
Células microgliais imortalizadas de camundongo BV2 foram obtidas a partir do Centro de Recursos Celulares do Instituto de Biotecnologia de Xangai. As células foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) com alta concentração de glicose, suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL). As células foram mantidas a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.

Para a construção do modelo, as células BV2 foram estimuladas com 0, 10, 20, 50, 100, 150 ou 200 ng/mL de lipopolissacarídeo (LPS) durante 24 h. A concentração ideal de LPS foi selecionada com base nos resultados experimentais.

Para a transfeção, as células BV2 foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas assim que atingiram a confluência apropriada. Um reagente de transfeção foi utilizado na concentração de 1,5 µL/poço, conforme as instruções do fabricante. Após 6 h, o meio de cultura foi substituído por meio fresco, e as células foram cultivadas por mais 24 h. O construto de silenciamento de LINC00707, o controle negativo correspondente, o oligonucleotídeo de miR-145-5p e o oligonucleotídeo controle correspondente foram utilizados cada um na concentração de 50 nM por poço. Todos os experimentos de transfeção foram repetidos independentemente pelo menos 5 vezes, com 3 réplicas paralelas por experimento independente. Os dados foram analisados estatisticamente utilizando os resultados de pelo menos 5 experimentos independentes.

3. ELISA
Os sobrenadantes culturais de células BV2 transfectadas e estimuladas com LPS foram coletados por centrifugação a 12.000 × g durante 10 min, e os níveis de interleucina-1β (IL-1β), IL-6 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) foram medidos utilizando os kits de ELISA correspondentes. Resumidamente, o ensaio foi realizado por incubação sequencial com um anticorpo biotinilado, um conjugado de estreptavidina-HRP e um substrato TMB, de acordo com as instruções do fabricante. A absorbância foi registrada a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. Os níveis de citocinas foram determinados a partir de curvas-padrão. Cada amostra foi medida em triplicata, e foram realizados 6 experimentos independentes.

4. Medição de ESP
Os níveis intracelulares de ESP em células BV2 estimuladas com LPS foram medidos utilizando um kit de ensaio de espécies reativas de oxigênio. Resumidamente, as células foram incubadas com 10 µmol/L de DCFH-DA a 37 °C por 20 min. Após a incubação, o sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o excesso de sonda extracelular. A intensidade da fluorescência foi medida utilizando um leitor de microplacas com comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 nm e 525 nm, respectivamente. Os níveis relativos de ESP foram calculados com base na intensidade da fluorescência. Todas as amostras foram analisadas em triplicata, e todo o experimento foi repetido independentemente pelo menos 5 vezes.

5. Detecção de malondialdeído, superóxido dismutase e glutationa
As células BV2 tratadas foram coletadas e os homogeneizados celulares foram preparados. As amostras foram centrifugadas a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C para obtenção do sobrenadante. Kits comerciais de detecção para malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD) e glutationa (GSH) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante para determinar seus níveis nos sobrenadantes celulares. Todas as amostras foram analisadas em triplicata e todo o experimento foi repetido independentemente pelo menos 5 vezes.

6. Ensaio de repórter dual-luciferase
Fragmentos da região não traduzida 3' (3' UTR) de LINC00707 e TRAF6 contendo os sítios de ligação previstos para miR-145-5p, juntamente com as sequências mutantes correspondentes, foram clonados no vetor repórter de luciferase pmirGLO para gerar construtos repórter do tipo selvagem (WT-LINC00707 e WT-TRAF6) e mutantes (MUT-LINC00707 e MUT-TRAF6). Células BV2 foram co-transfectadas com os construtos repórter e oligonucleotídeos de miR-145-5p e cultivadas por 24 h. Em seguida, as células foram coletadas e as atividades de luciferase de firefly e Renilla foram medidas utilizando um leitor de microplacas.

7. RT-qPCR
O RNA total foi extraído utilizando um reagente de extração de RNA. A qualidade do RNA foi avaliada pelo índice OD₂₆₀/OD₂₈₀, considerando-se aceitáveis valores entre 1,8 e 2,0. Aproximadamente 1 µg de RNA total foi transcrito reversamente em cDNA utilizando um kit de transcrição reversa. A expressão gênica foi quantificada por RT-qPCR utilizando uma mistura mestra de PCR com SYBR Green. A transcrição reversa foi realizada a 42 °C por 15 min, seguida pela inativação da transcriptase reversa a 95 °C por 3 min. O cDNA sintetizado foi armazenado a −20 °C até a análise. A PCR em tempo real quantitativa foi realizada com uma etapa de pré-desnaturação a 95 °C por 1 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 5 s e hibridização e extensão a 60 °C por 15 s. Os sinais de fluorescência foram coletados ao final de cada etapa de hibridização e extensão. A análise da curva de dissociação foi realizada a 95 °C por 15 s, seguida por 60 °C por 1 min. Os níveis relativos de expressão foram calculados utilizando o método 2⁻^ΔΔCt. GAPDH ou 5S foi utilizado como referência interna para normalização da expressão gênica. As sequências dos iniciadores foram as seguintes: LINC00707, sentido 5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3' e antissentido 5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'; miR-145-5p, sentido 5'-GCCGAGGTCCAGTTTTCCCA-3' e antissentido 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'; TRAF6, sentido 5'-ATTACAACTGAGGTGCTTCT-3' e antissentido 5'-GCATCTGGTTCTGTTATAGGA-3'; GAPDH, sentido 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3' e antissentido 5'-CGCCCCACTTGATTTTGG-3'; e 5S, sentido 5'-TCGTCTGATCTCGGAAGCTAA-3' e antissentido 5'-AAGCCTACAGCACCCGGTAT-3'.

8. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando software estatístico. A normalidade da distribuição dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk, com P > 0,05 indicando distribuição normal. Os dados com distribuição normal foram apresentados como média ± DP, enquanto os dados com distribuição não normal foram apresentados como mediana (P25, P75). Para variáveis contínuas com distribuição normal, comparações entre dois grupos foram realizadas utilizando o teste t de Student, e comparações entre múltiplos grupos foram realizadas utilizando ANOVA a um critério seguida pelo teste post hoc de Tukey. Para dados com distribuição não normal, o teste de Mann-Whitney U foi utilizado para comparações entre dois grupos, e o teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparações entre múltiplos grupos. O teste qui-quadrado foi utilizado para analisar variáveis categóricas entre grupos. Análises de regressão logística univariada e multivariada foram utilizadas para avaliar fatores clínicos associados à expressão de LINC00707. As variáveis contínuas foram dicotomizadas na mediana da coorte (grupo de valor alto = 1; grupo de valor baixo = 0). As variáveis com P < 0,05 na análise de regressão logística univariada foram incluídas na análise de regressão logística multivariada. Os resultados foram apresentados como razões de chances (ORs) com intervalos de confiança de 95% (ICs), em que OR > 1 indicava uma associação positiva e OR < 1 indicava uma associação negativa. Todos os experimentos de fenótipo celular incluíram pelo menos 4 réplicas biológicas independentes, com 3 réplicas técnicas por réplica biológica. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Os níveis plasmáticos de LINC00707 estavam elevados em pacientes com LME
As características clínicas basais de 30 indivíduos saudáveis e 75 pacientes com LME foram analisadas. Em comparação com indivíduos saudáveis, os pacientes com LME apresentaram pontuações significativamente mais baixas de sensação tátil, acmestesia, motricidade e Medida de Independência Funcional (MIF), indicando comprometimento das funções sensorial e motora. Além disso, os níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias foram si...

Discussão

A lesão medular (SCI) é uma desordem traumática grave do sistema nervoso central que resulta em condução neural prejudicada ou perda completa da condução através da medula espinhal, levando a disfunções motoras, sensoriais e autonômicas ao longo da vida, além de consequências fisiológicas e psicológicas profundas²⁹˒³⁰. A gravidade desses prejuízos geralmente aumenta com a extensão da lesão medular. No presente estudo, a expressão plasmática de LINC00707 estava elevada em pa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
tubo microcentrífugo de 1,5 mL	KIRGEN	KG2211	Tubo de polipropileno com tampa de encaixe, livre de DNase/RNase, não pirogênico, força centrífuga máxima de 20.000 × g, para armazenamento e centrifugação de amostras de RNA/proteína.
Placa de Cultura Celular de 6 Poços	Corning	3516	Placa de poliestireno tratada para cultivo celular, com fundo plano, estéril e individualmente embalada; volume do poço é de 16,8 mL com área de crescimento de 9,5 cm²
Agulha para Coleta de Sangue	Becton, Dickinson and Company	367283	Agulha descartável para coleta de sangue BD Vacutainer. Projeto de agulha de dupla ponta, com uma extremidade para punção venosa e a outra conectando-se ao suporte e ao tubo a vácuo para coleta em múltiplos tubos. Revestida com silicone para minimizar o desconforto do paciente durante a inserção.
Tubos para Coleta de Sangue	Becton, Dickinson and Company	367605	Tubos de coleta de sangue a vácuo BD Vacutainer. Tampas codificadas por cores diferentes indicam vários aditivos, correspondentes a testes laboratoriais específicos.
Linha celular imortalizada de micróglia de camundongo BV2	Centro de Recursos Celulares do Instituto de Biotecnologia de Xangai	RRID: CVCL_0182	Linhagem celular imortalizada de micróglias murinas que expressa de forma estável marcadores específicos de micróglias (Iba1, CD11b, F4/80). Após estimulação com LPS, as células BV2 secretam citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α) e acumulam ROS intracelular, MDA para simular a ativação inflamatória de micróglias in vivo após lesão medular. As células são cultivadas em DMEM com alta concentração de glicose suplementado com 10% de FBS e 1× penicilina-estreptomicina, mantido a 37 °C com 5% CO2 incubadora umidificada; repassadas ao atingir 70% de confluência–80% de confluência para evitar superativação.
Kit de Ensaio de Malondialdeído (MDA) Celular	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A003-4-2	Kit colorimétrico baseado em microplacas para detecção quantitativa de malondialdeído celular, um marcador de peroxidação lipídica. O MDA reage com ácido tiobarbitúrico (TBA) sob aquecimento, formando adutos vermelhos; a absorbância é detectada a 532 nm em espectrofotômetro de microplacas. Otimizado para amostras de lisados celulares, operação em alto rendimento em placas de 96 poços, faixa linear de quantificação abrange níveis baixos a moderados de oxidação lipídica em micróglia.
CO2 incubadora	Thermo Scientific	3111	CO₂ com jaqueta de água umidificada2 incubadora com volume interno de 184 L, CO₂ por IR2 sensor, sistema de filtração de ar HEPA para minimizar a contaminação microbiana. Mantém um ambiente de cultura estável em 37 °C, 5% CO₂2 e umidade saturada para cultivo de células aderentes de longo prazo.
Kit de Ensaio de Gene Repórter de Luciferase Dupla	Beyotime Biotechnology	RG028	Este kit de dupla luciferase permite a detecção quantitativa sequencial da luciferase de vaga-lume e da luciferase de Renilla em lisados celulares. Primeiro, o sinal da luciferase de vaga-lume é medido utilizando o substrato luciferina; o reagente subsequente de detecção de Renilla contém um potente quenching que elimina >99,9% de luminiscência residual de luciferase de vaga-lume, garantindo leitura pura do sinal de Renilla com o substrato coelenterazina. O kit inclui tampão de lise celular dedicado para lise de células aderentes, compatível com luminômetro de microplaca de 96 poços. O reagente de luciferase de vaga-lume é um líquido pré-misturado para uso direto; os valores de luminiscência de vaga-lume e Renilla são registrados sequencialmente para calcular a atividade relativa normalizada da luciferase (razão vaga-lume/Renilla) na validação de alvos de ceRNA.
Meio Essencial Modificado de Dulbecco	Gibco	11995065	O DMEM é um meio basal amplamente utilizado para sustentar o crescimento de diversos tipos de células de mamíferos. Esta formulação contém glicose alta, L-glutamina, vermelho de fenol e piruvato de sódio. Requer suplementação, comumente com 10% de Soro Bovino Fetal (FBS), e 5–10% CO2 ambiente para manter o pH fisiológico.
Soro bovino fetal	TODOS OS VERDES	13011-8611	SFB de grau premium, baixo teor de endotoxinas, ausência de micoplasma & bacteriófago negativo, suplementado ao DMEM em 10% v/v para suportar o crescimento celular.
GraphPad Prism Versão 9	GraphPad Software, San Diego, CA, EUA	NA	Software especializado em análise estatística e criação de gráficos científicos para dados experimentais de células in vitro. Todos os valores brutos de qPCR, ELISA, estresse oxidativo e absorbância de luminiscência dual-luciferase foram importados para o Prism 9 para realização da verificação de normalidade, comparações paramétricas/não paramétricas entre grupos, geração de todas as figuras quantitativas, cálculo da média ± DP, valores exatos de P e IC de 95%, e exportar figuras de alta resolução (300 dpi) que atendam aos padrões de publicação em periódicos. Os arquivos-fonte originais do projeto .prism de todos os gráficos são depositados no repositório público de dados, conforme exigido.
IBM SPSS Statistics Versão 26.0	IBM Corporation, Armonk, NY, EUA	NA	Pacote abrangente de software estatístico utilizado para classificação de dados basais de amostras clínicas, teste de normalidade (teste de Shapiro-Wilk), teste t independente/não pareado, ANOVA unifatorial com Tukey’correção para múltiplas comparações, teste não paramétrico Mann-Whitney U e cálculo de valores exatos de P e intervalos de confiança de 95% para todos os conjuntos de dados quantitativos humanos e celulares. Todos os dados clínicos, demográficos e laboratoriais dos pacientes foram processados e analisados nesta plataforma.
IL-1β Kit SimpleStep ELISA	Abcam	ab255730	Este kit ELISA colorimétrico sandwich com uma única etapa de lavagem utiliza a tecnologia proprietária SimpleStep, concluindo todo o procedimento de detecção em 90 minutos. Ele quantifica interleucina-1 de rato de forma quantitativaβ em sobrenadantes de cultivo celular, soro e amostras de plasma com EDTA/citrato/heparina. A sensibilidade de detecção atinge 26,58 pg/mL, com faixa de quantificação linear de 54,69–3500 pg/mL. Inclui-se uma microplaca de tiras removíveis pré-revestida com 8 poços. Os sinais de absorbância são detectados a 450 nm por meio de leitor de microplacas para calcular a IL-1β concentração
Kit ELISA SimpleStep para IL-6	Abcam	ab234570	Um kit colorimétrico ELISA SimpleStep em sanduíche otimizado para a detecção quantitativa da interleucina-6 (IL-6) de rato em sobrenadantes de cultivo celular, soro e amostras de plasma com citrato/EDTA/heparina. Adota um protocolo de incubação em um único passo e uma única lavagem, reduzindo o tempo total do ensaio para 90 minutos, com sensibilidade de detecção de 43 pg/mL e faixa linear de quantificação de 125 pg/mL a 8000 pg/mL. Inclui uma microplaca pré-revestida com tiras quebráveis de 8 poços; os valores de absorbância são lidos a 450 nm utilizando um espectrofotômetro de microplacas para o cálculo final da concentração de IL-6.
Placa Multipoços LightCycler 96, branca	Roche LifeScience, Suíça	4729692001	Placas de reação brancas de polipropileno com meia saia, de 96 poços, especialmente otimizadas para o instrumento de PCR em tempo real LightCycler 96. As paredes brancas dos poços reduzem a interferência da fluorescência de fundo e aumentam a reflexão do sinal, melhorando a sensibilidade de detecção para transcritos de baixa abundância. O design uniforme de paredes finas garante condutividade térmica consistente em todos os poços, compatível com volumes de reação variando de 10 a 50 μL. Livre de DNase/RNase e pirogênio para ensaios de amplificação de cDNA derivado de RNA.
Reagente de Transfecção LipofectamineTM 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015	Reagente de transfeção com nanopartículas lipídicas associado ao potencializador P3000 permite transfeção de siRNA/plasmídeo em microglia BV2 com alta eficiência e baixa citotoxicidade.
Kit lnRcute para Síntese de cDNA de Primeiro Fio de lncRNA	TIANGEN	KR202-02	Este kit é especialmente otimizado para a transcrição reversa de RNAs não codificantes longos (lncRNAs) com baixa abundância, conteúdo variável de GC e estruturas secundárias complexas. Contém um tampão independente para remoção de DNA genômico (gDNA), eliminando a contaminação por DNA genômico antes da transcrição reversa, e uma mistura especializada de iniciadores lnR-RT para enriquecer modelos de lncRNA de comprimento completo. A transcriptase reversa modificada permite a síntese eficiente de cDNA de fita longa a partir de RNA total com entrada variando de 10 ng a 2 ng.
Kit de Detecção de lncRNA por qPCR lnRcute (SYBR Green)	TIANGEN	FP402	Um premix quantitativo dedicado baseado em SYBR Green para a quantificação de lncRNA. A polimerase de DNA com início mediado por anticorpo garante alta especificidade de amplificação; os componentes H-competitor reduzem a interferência da estrutura secundária em moldes de lncRNA com alto teor de GC. Compatível com cDNA gerado a partir do kit de transcrição reversa lnRcute para lncRNA, e adequado para a quantificação da expressão relativa de lncRNA de baixa abundância.
oligonucleotídeos de miR-145-5p	Generalbiol (Wuhan, China)	NA	Mimético sintético de miR-145-5p, inibidor e oligonucleotídeos correspondentes de controle negativo utilizados para modular a atividade do miR-145-5p em células BV2. Utilizados em ensaios de expressão, inflamação, estresse oxidativo e repórter de dupla luciferase.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	TIANGEN	KR211-02	Adota uma reação combinada de caudalização com poli(A) e transcrição reversa em um único tubo para simplificar o fluxo de trabalho experimental. A mistura enzimática contém poli(A) polimerase de E. coli, transcriptase reversa deficiente em RNase H e inibidor de RNase, que direciona especificamente o miRNA maduro de fita simples e evita interferência na amplificação por pré-miRNA com estruturas em alfinete de cabelo. Indicado para miRNA extraído de lisado celular, plasma e amostras de tecido.
Kit de Detecção miRcute Plus miRNA qPCR (SYBR Green)	TIANGEN	FP411	Pré-mistura SYBR Green otimizada para a quantificação de miRNAs maduros, compatível perfeitamente com os produtos de transcrição reversa miRcute. O sistema de tampão melhora a eficiência de hibridização dos iniciadores para amplicons curtos de miRNA, proporcionando sinais de fluorescência estáveis e alta sensibilidade na detecção de miRNAs fracamente expressos. O snRNA U6 é comumente utilizado como referência interna para normalização.
Solução de Penicilina-Estreptomicina (100×)	Beyotime Biotechnology	C0222	Mistura filtrada estéril contendo 10.000 U/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina; diluição de trabalho 1:100 no meio de cultura para prevenir contaminação bacteriana.
Kit de Ensaio para Espécies Reativas de Oxigênio com Diluente	Beyotime Biotechnology	S0034M	Este kit utiliza a sonda fluorescente DCFH-DA para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares. O DCFH-DA atravessa a membrana celular e é hidrolisado pela esterase intracelular em DCFH, o qual é oxidado pelas ROS para gerar DCF fluorescente. Compatível com microplacas de 96 poços e leitor de microplaca por fluorescência para detecção em alto rendimento (Ex = 488 nm, Em = 525 nm). Acompanha diluente específico para a sonda e reagente controle positivo Rosup para estabilizar os sinais de marcação, sendo adequado para a detecção de estresse oxidativo em microglia BV2 aderentes sem lise celular.
Kit de Dosagem de Glutationa Reduzida (GSH)	Instituto de Engenharia Bioquímica de Nanjing	A006-1-2	Kit colorimétrico em microplaca para detecção de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante intracelular. A GSH reage com ácido ditiobis-nitrobenzoico (DTNB) para produzir um produto cromogênico amarelo, cuja absorbância é medida a 405 nm em leitor de microplacas. O kit adapta o protocolo padrão em tubo para detecção em microplaca de 96 poços de alto rendimento, destinado à análise de antioxidantes em lisados celulares.
si-LINC00707	GenePharma (Xangai, China)	NA	RNA interferente pequeno projetado para reduzir a expressão de LINC00707 em células BV2. Utilizado em experimentos de perda de função para avaliar os efeitos do silenciamento de LINC00707 nas respostas inflamatórias, estresse oxidativo, expressão de miR-145-5p e expressão de TRAF6.
si-LINC00707 NC	GenePharma (Xangai, China)	NA	RNA interferente pequeno sem alvo utilizado como controle negativo para a transfeção de si-LINC00707. Utilizado para controlar efeitos inespecíficos do procedimento de transfeção e da exposição ao siRNA.
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	TIANGEN	4992777	Pré-mistura universal SYBR Green para PCR quantitativa de mRNA em quantificação relativa, contendo polimerase Taq hot-start, dNTPs, SYBR Green I e corante referência ROX para normalização de fluorescência. Baixa amplificação não específica, eficiência de amplificação estável, amplamente aplicada na quantificação de genes-alvo de mRNA (TRAF6, GAPDH etc.).
Thermo Scientific™ Sorvall™ ST 8 Centrífuga de Bancada Pequena	Thermo Scientific	75200709	A escolha clássica para laboratórios clínicos, capaz de processar até 24 × Tubos de coleta de sangue de 5/7 mL de uma só vez. A série R é uma versão refrigerada, que pode proteger melhor amostras que requerem centrifugação em baixa temperatura.
Kit TIANScript II de Síntese de cDNA de Primeira Fita	TIANGEN	GKR107-02	Projetado para a transcrição reversa geral de mRNA, gerando cDNA de comprimento longo, até 12 kb. Equipado com primers Oligo (dT) 15 e hexâmeros aleatórios, permitindo estratégias flexíveis de iniciação. A transcriptase reversa M-MLV modificada lê eficientemente estruturas secundárias complexas e ricas em GC no mRNA, com ampla compatibilidade para amplificação posterior de mRNA por qPCR.
TNF-α Kit SimpleStep ELISA	Abcam	ab236712	Um kit ELISA sanduíche SimpleStep com lavagem única rápida, otimizado para detecção quantitativa do fator de necrose tumoral de ratoα (TNF-α) em sobrenadante de cultura celular, soro e diversos espécimes de plasma. A duração total do ensaio é de 90 min, com sensibilidade ultraelevada de 1,04 pg/mL e faixa de detecção linear de 15,63 pg/mL a 1000 pg/mL. Equipado com 8 removível×placa pré-revestida de 12 poços; os valores de DO em 450 nm são registrados para o TNF finalα cálculo quantitativo
Kit de Dosagem de SOD Total (T-SOD)	Instituto de Engenharia Bioquímica de Nanjing	A001-3-2	Kit cromogênico em microplaca WST-1 para detecção da atividade enzimática total de SOD. A SOD elimina os radicais ânion superóxido e inibe a reação de redução do WST-1. A absorbância é registrada a 450 nm por meio de leitor de microplacas para o cálculo da atividade. Indicado para amostras de homogeneizado celular, soro e tecidos, com desenvolvimento de cor estável e alta repetibilidade para avaliação da capacidade antioxidante.
Reagente TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018	Reagente monofásico de fenol-guanidina isotiocianato para o isolamento em um único passo de RNA total de células de micróglia cultivadas; extrai simultaneamente DNA e proteína das mesmas amostras.