Este estudo otimiza o ensaio de amplificação isotérmica mediado por alça (LAMP) utilizando carvão ativado e bentonita para detectar espécies patogênicas de Vibrio em frutos do mar. Este pré-tratamento remove efetivamente inibidores da reação, proporcionando diagnósticos significativamente mais rápidos, sensíveis e econômicos em comparação com métodos convencionais.
Artigo de investigação
Aumento da Sensibilidade da Amplificação em Alça Utilizando Carvão Ativado e Bentonita para a Detecção de Vibrio spp. em Produtos Pesqueiros
Neste artigo
Resumo
Resumo
O Vibrio o gênero possui mais de 100 espécies, das quais 12 são consideradas patogênicas para humanos; as espécies mais frequentemente isoladas em alimentos são V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus. O principal problema na identificação desses microrganismos por métodos microbiológicos convencionais é o alto custo e o diagnóstico demorado. A amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) foi utilizada para a identificação de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus. O carvão ativado com bentonita (CAB) foi utilizado para remover inibidores, melhorando a sensibilidade do teste; foram testados os pH 6, 7 e 9, bem como diferentes tempos de contato entre a amostra e o CAB. O método LAMP teve sua sensibilidade aprimorada quando o carvão ativado e a bentonita foram usados para remover inibidores da reação em amostras de camarão, peixe e ostra. A sensibilidade do LAMP, valor preditivo negativo, valor preditivo positivo e especificidade do LAMP foram iguais ou superiores a 90% para todas as amostras testadas. O método LAMP poderá ser uma alternativa para identificar V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus em produtos pesqueiros devido à aplicação mais rápida, maior sensibilidade e menores custos em comparação com o método padrão.
Introdução
Espécies do gênero Vibrio o gênero amplamente distribuído em ambientes marinhos e pode estar associado a peixes, moluscos ou crustáceos de forma patogênica ou comensal. Relatou-se que 12 espécies podem ser patogênicas para humanos, com Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus revelando uma maior frequência de isolamento em produtos pesqueiros. Nos Estados Unidos, as autoridades de saúde estimam que Vibrio spp. causam mais de 80.000 infecções por ano1,2,3,4,5O isolamento de Vibrio spp. é realizado por meio de métodos convencionais que envolvem pré-enriquecimento, cultivo em meios seletivos e confirmação por testes bioquímicos e sorológicos.6,7. Esses métodos convencionais são limitados pelo tempo prolongado necessário para o isolamento do patógeno (até 5 dias) e pela sua falta de poder de resolução, o que frequentemente impede a diferenciação precisa de espécies estreitamente relacionadas dentro do Vibrio gênero devido a perfis fenotípicos e bioquímicos semelhantes6,7,8.
Alternativamente, a amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) tem sido relatada como uma técnica molecular rápida, precisa e de baixo custo para a identificação de patógenos9,10. Este método é altamente econômico e mais rápido que a PCR convencional, pois não requer equipamentos sofisticados como termocicladores9. O método LAMP permite, em uma única etapa, a detecção do gene alvo pela observação da turbidez no tubo de reação causada pela precipitação do pirofosfato de magnésio, pois este é um produto de reação estável a 65 °C, a temperatura utilizada na técnica LAMP, de modo que o aumento da turbidez correlaciona-se com a quantidade de DNA sintetizado, evitando o uso de géis de agarose e transiluminadores11,12,13,14,15.
A detecção de sensibilidade a esses patógenos pode ser melhorada pela eliminação de inibidores da reação, como proteases, íons de cálcio, glicogênio e lipídios, que podem inibir a polimerase Bst ou ligar-se ao alvo de DNA, impedindo a amplificação13,16,17,18,19,20. Relatou-se que a combinação de carvão ativado com bentonita (ACB) apresenta alta eficiência na eliminação de inibidores de amplificação, aumentando assim a sensibilidade na detecção de Escherichia coli em amostras de ostras e reduzindo custos, pois o ACB é mais barato do que o uso de kits comerciais21.
Neste trabalho, propomos otimizar o método LAMP utilizando carvão ativado e bentonita para aumentar a sensibilidade na identificação de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus diretamente em produtos pesqueiros. Esse método otimizado fornece orientações práticas para o monitoramento rotineiro e controle de qualidade na indústria alimentícia, sendo altamente aplicável para o diagnóstico rápido de patógenos, evitando as etapas demoradas de pré-enriquecimento. Em relação ao desempenho esperado, o método demonstra excelente sensibilidade (superior a 98%) e especificidade (100%) em matrizes como peixe e camarão. No entanto, uma limitação importante a considerar é que, em amostras altamente contaminadas de origem, como ostras, o sistema ACB não consegue eliminar completamente toda a matéria orgânica interferente, o que pode diminuir ligeiramente a sensibilidade do ensaio (94%–98%).
Protocolo
Este estudo não envolveu seres humanos nem animais vertebrados; portanto, não foi necessária aprovação ética institucional. Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cepas bacterianas utilizadas e extração de DNA
As cepas de Vibrio cholerae não O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 e V. alginolyticus ATCC 17749 foram cultivadas em caldo cérebro-corpo (BHI) com 2% de NaCl a 37 °C por 24 h. As cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028 foram cultivadas em caldo BHI sem cloreto de sódio a 37 °C por 24 h para serem utilizadas como controles negativos nos testes. Para a extração de DNA, uma cultura de 18 h foi centrifugada a 16.000 x g durante 6 min a 25 °C em uma centrífuga. O sobrenadante foi cuidadosamente decantado para evitar perturbar o pellet celular, e o pellet foi completamente ressuspenso por pipetagem em 500 μL de solução tampão TAE (Tris-ácido acético-EDTA, pH 8). A suspensão foi fervida por 6 min para lisar as células, seguida imediatamente por resfriamento em gelo por 5 min. Uma centrifugação final foi realizada para obter o pellet de detritos celulares, resultando em um sobrenadante límpido contendo o DNA extraído, que foi posteriormente utilizado como molde para amplificação por LAMP22,23.
2. Procedimento LAMP
Os primers utilizados na LAMP (Tabela 1) foram testados para corroborar a especificidade na identificação de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus. A identificação de cada Vibrio espécies utilizando LAMP foi realizada em tubos de reação preparando um volume final de 25 μL da mistura contendo: 1.6 μM de cada um dos primers, 1,4 mM de uma mistura de dNTP, 6 mM de MgSO₄, 800 mM de betaina, 8 U de Bst DNA polimerase, e 5 μL de DNA molde. A mistura da reação foi cuidadosamente homogeneizada e incubada em banho-maria a 65 °C por 60 min. Após o tempo de incubação, os produtos de amplificação foram separados em um gel de agarose a 1,5%. Os produtos de amplificação foram então corados utilizando 1 μL de um corante fluorescente de DNA diluído 1:100 e revelado utilizando um transiluminador de luz azul. Outra técnica para determinar se o teste foi positivo na identificação do patógeno envolveu a adição de 4 μL de azul de hidroxinaftol (HNB, 125 μM) aos tubos de reação e observando a mudança de cor a olho nu. Um teste positivo foi indicado pela formação de uma cor azul, e um teste negativo por uma cor violeta.24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028 foram utilizados como controles negativos para o método LAMP. As amplificações obtidas no LAMP foram separadas em gel de agarose e observadas utilizando um transiluminador. As imagens resultantes foram adquiridas e digitalizadas utilizando o software MS 1D Analysis.
3. Tratamento de amostras de ostras, camarões e peixes para a eliminação de Vibrio spp. naturalmente presentes nas amostras
Foram adquiridas dez amostras de ostras, dez amostras de camarão e dez amostras de peixe, com peso aproximado de 200 g cada. Para remover células de Vibrio naturalmente presentes, seguiu-se a metodologia previamente publicada21. Cinquenta gramas (50 g) de cada amostra foram pesados e homogeneizados mecanicamente em um misturador com pás a 260 rpm durante 1 minuto, produzindo uma suspensão tecidual uniforme, que foi então armazenada a -70 °C por 72 h. Posteriormente, as amostras foram completamente descongeladas em banho-maria a 40 °C, e lavadas com 300 mL de solução tampão fosfato salino (0,85% NaCl, pH 9). Para garantir que o procedimento anterior havia eliminado com sucesso Vibrio nas amostras, realizou-se a metodologia de pré-enriquecimento indicada no capítulo 9 do Manual Analítico Bacteriológico da Food and Drug Administration7. A solução salina contendo a amostra foi substituída por 450 mL de água peptonada alcalina (APW, pH 9). Em seguida, foram preparadas cuidadosamente diluições seriadas em APW até uma diluição de 10⁻3 e incubadas por 24 h. Finalmente, uma alíquota de cada tubo foi repicada em um meio seletivo de ágar tiossalvato-citrato-bile-sacarose (TCBS) e incubada por 24 h a 37 °C para confirmar visualmente a ausência de colônias características de Vibrio. Todos os testes foram realizados em triplicata.
4. Preparação de carvão ativado com bentonita (ACB) e avaliação da recuperação celular
Para determinar as condições em que o carvão ativado com bentonita (ACB) é mais eficiente na absorção de inibidores presentes em amostras de produtos pesqueiros, mantendo absorção mínima das células-alvo, seguiu-se a metodologia publicada21 para estabelecer o pH e o tempo de contato ótimos entre o ACB e as amostras alimentares. O carvão ativado foi lavado completamente com água destilada e seco a 55 °C. Em seguida, 32,6 g de carvão ativado foram misturados com 3,04 g de bentonita, agitados continuamente a 150 rpm durante 24 h para garantir distribuição uniforme, secos a 55 °C e esterilizados, resultando em um pó fino e homogêneo de ACB. Para avaliar a recuperação celular após a mistura das células de Vibrio com a mistura de carvão ativado e bentonita (ACB), as cepas foram cultivadas separadamente em caldo BHI com 2% de NaCl até atingirem uma densidade celular de 1,5 x 104 UFC/mL. Em seguida, 1 mL de cada cepa de Vibrio foi inoculado separadamente em 100 mL de tampão fosfato (PBS, 0,85% de NaCl, ajustado a pH 4, 6 e 9). A suspensão bacteriana foi então combinada com 4,6 g do ACB previamente preparado e mantida sob agitação a 150 rpm por 15, 30 e 60 min para facilitar o contato. Após cada tempo de contato determinado, uma alíquota de 0,1 mL foi cuidadosamente separada, espalhada em ágar TCBS, e incubada a 37 °C por 24 h antes da contagem de colônias.
5. Avaliação do limite de detecção de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus em amostras de ostras, camarões e peixes tratadas com carbono ativado e bentonita
Cada uma das espécies de Vibrio utilizadas neste estudo foi cultivada em caldo BHI, e suas densidades celulares foram ajustadas com precisão para 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102 e 76 UFC/mL (A600 nm ~0,25), conforme medido com um espectrofotômetro. Posteriormente, 1 mL de cada cultura de Vibrio foi usado para inocular 50 g de cada amostra (ostras, peixes, camarões) previamente tratadas para eliminar qualquer presença de Vibrio. As amostras inoculadas foram homogeneizadas em um misturador com pás a 360 rpm durante 30 s e diluídas com 450 mL de APW (pH 6). A mistura foi então centrifugada a 260 x g durante 5 min a 4 °C para separar os resíduos maiores. O sobrenadante resultante foi decantado em frascos contendo 23 g de ACB, agitado a 150 rpm por 15 min para absorver inibidores e filtrado usando papel filtro, obtendo-se um eluato claro, isento de partículas grandes. Este eluato foi então centrifugado a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C, resultando em um pellet celular visível no fundo do tubo, que foi posteriormente utilizado para extrair o DNA. Cada espécie de Vibrio foi identificada pelo método LAMP. Os controles negativos consistiram em amostras inoculadas com cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028. A mistura da reação foi incubada em banho-maria a 65 °C por 60 min. Após o tempo de incubação, os produtos de amplificação foram separados em um gel de agarose a 1,5% e corados com um corante fluorescente de DNA. Os géis foram visualizados em um transiluminador de luz azul. Finalmente, 4 μL de azul de hidroxinaftol (125 μM) foram adicionados a cada tubo para detecção a olho nu24.
6. Determinação do valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, especificidade e sensibilidade do método LAMP
A sensibilidade, especificidade e valores preditivos do método LAMP foram determinados utilizando 30 amostras (10 de camarão, 10 de ostra e 10 de peixe). Cada amostra foi inoculada com a concentração mínima detectável estabelecida para cada espécie de Vibrio. Para determinar a porcentagem de sensibilidade e especificidade, bem como o valor preditivo negativo (VPN) e o valor preditivo positivo25, foi utilizada uma tabela de contingência para resumir os verdadeiros positivos (VP), verdadeiros negativos (VN), falsos positivos (FP) e falsos negativos (FN) obtidos durante os experimentos. (Tabela 2). A partir desses dados, foram aplicadas as seguintes fórmulas:
Resultados
Estirpes bacterianas utilizadas e a extração de DNA
O DNA foi extraído com sucesso de todas as estirpes patogênicas e de controle negativo para ser usado como modelo nos ensaios LAMP subsequentes.
Procedimento LAMP
Os iniciadores utilizados neste trabalho foram específicos para a amplificação do alvo molecular em cada espécie de Vibrio. Os produtos de amplificação obtidos pela LAMP quando cepas de Vibrio foram utilizadas demonstraram que cada iniciador foi específico na amplificação do gene-alvo de cada espécie de Vibrio (Figura 1).
Tratamento de amostras de ostras, camarões e peixes para a eliminação de Vibrio spp. naturalmente presentes nas amostras
O tratamento para eliminar Vibrio spp. naturalmente presentes nas amostras foi adequado, permitindo a redução de 100% de Vibrio spp. Não houve crescimento de Vibrio spp. quando o método BAM foi seguido7.
Preparação de carvão ativado com bentonita (ACB) e avaliação da recuperação celular
A eliminação dos inibidores da reação utilizando o carvão ativado-bentonita permitiu um aumento na sensibilidade na detecção do patógeno pelo método LAMP. Isso se deve à capacidade do carvão ativado-bentonita de absorver substâncias inibitórias que podem afetar a polimerase durante o procedimento de amplificação, além da retenção limitada das células bacterianas (Figura 2). A porcentagem de recuperação de Vibrio utilizando diferentes valores de pH e tempos de contato mostrou uma maior recuperação celular (93,4% ± 2,9%) quando o pH foi 6 com um tempo de contato de 15 minutos. Quando foi utilizado pH 4, não houve crescimento de nenhum Vibrio, e os valores de pH 7 e 9 foram de 33,4% ± 7,6% e 67,2% ± 5,8%, respectivamente. Este trabalho sugere o uso de pH 6 para melhorar a sensibilidade de detecção do método.
Avaliação do limite de detecção de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus em amostras de ostras, camarões e peixes tratadas com carvão ativado e bentonita
Em amostras de ostras, o limite de detecção para V. cholerae foi de 150 UFC/g, para V. alginolyticus, V. vulnificus e V. parahaemolyticus foi de 3 x 102 UFC/g; em amostras de camarão e peixe, V. cholerae foi detectado em uma concentração mínima de 150 UFC/g, enquanto para V. alginolyticus, V. vulnificus e V. parahaemolyticus foi de 76 UFC/g. Os resultados obtidos pelo método LAMP revelaram que o uso de hidroxinaftol azul em comparação com a sensibilidade do LAMP permitiu a eliminação de inibidores da reação em relação às amostras que não foram tratadas com ACB (Figura 3). Observamos que a sensibilidade do LAMP foi maior quando as amostras foram tratadas com ACB.
Determinação do valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, especificidade e sensibilidade do método LAMP
O desempenho diagnóstico do método otimizado de amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), com e sem pré-tratamento com carvão ativado-bentonita (ACB), foi avaliado sistematicamente em 150 ensaios para verificar sua robustez (Tabela 3). A eliminação de inibidores naturais presentes nos alimentos mediante o sistema ACB melhorou significativamente todos os parâmetros diagnósticos (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN)), atingindo valores iguais ou superiores a 90% em todas as matrizes, em comparação com as amostras não tratadas.
Em amostras de peixe e camarão tratadas com ACB, o ensaio demonstrou desempenho diagnóstico máximo, alcançando sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) de 100% (Figura 4). Por outro lado, em amostras não tratadas de peixe e camarão, a presença de inibidores derivados da matriz comprometeu severamente o ensaio, reduzindo a sensibilidade de detecção para 62,5% e 52,5%, respectivamente. Para a matriz altamente complexa da ostra, o tratamento com ACB mitigou com sucesso as principais interferências, resultando em uma alta sensibilidade geral de 95,0% e um VPN de 71,4% (Figura 5). Em contraste, amostras não tratadas de ostra exibiram uma queda crítica na sensibilidade de detecção para 32,5% e um VPN de 15,6%, devido à presença maciça de compostos orgânicos, como glicogênio e lipídios, que inibem a polimerase.
A especificidade diagnóstica do método LAMP manteve-se em 100% em todos os 150 ensaios, independentemente do tipo de matriz ou pré-tratamento, sem registros de resultados falsos-positivos. Essa especificidade absoluta é atribuída ao design altamente seletivo dos conjuntos de iniciadores que visam genes específicos de espécies (gyrB para V. alginolyticus, ompW para V. cholerae, tlh para V. parahaemolyticus e vvhA para V. vulnificus). Esses resultados estatísticos demonstram que o método ACB-LAMP otimizado é uma ferramenta altamente confiável e robusta para a detecção rápida e livre de cultivo de espécies patogênicas de Vibrio em diversos produtos pesqueiros.
Por fim, consideramos que o uso do método LAMP em combinação com um pré-tratamento para eliminar inibidores da reação pode aumentar a sensibilidade na detecção de patógenos em alimentos utilizando o método LAMP. Portanto, essa técnica aplicada na pesquisa de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, e V. vulnificus deve ser útil no monitoramento para prevenir infecções causadas por esses microrganismos.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Todos os dados brutos que sustentam os achados deste estudo, incluindo as contagens numéricas de colônias recuperadas de bactérias (UFC/g) sob diferentes valores de pH e tempos de contato, bem como os resultados completos do desempenho diagnóstico para os 150 ensaios de validação, estão disponíveis publicamente no repositório Zenodo em https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272. O conjunto de dados associado contém o arquivo completo da planilha (Arquivo Suplementar 1).
Figura 1: Análise da especificidade dos produtos amplificados por LAMP em gel de agarose a 1,5%. Poço M, marcador molecular de 100 pb; Poço 1, controle negativo (Escherichia coli ATCC 25922); Poço 2, controle negativo (Listeria monocytogenes ATCC 49594); Poço 3, V. alginolyticus ATCC 17749; Poço 4, V. cholerae não O1 CECT 557; Poço 5, V. parahaemolyticus ATCC 7802; Poço 6, V. vulnificus ATCC 29037. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Porcentagem de recuperação de cepas de Vibrio utilizando diferentes condições de pH e tempos de contato com a mistura de carvão ativado-bentonita (ACB). A recuperação celular (%) foi determinada após inoculação das cepas de Vibrio em concentração de 1,5 × 104 UFC/mL em PBS ajustado a pH 4,0, 6,0, 7,0 e 9,0, e tratamento com 4,6 g de ACB por 15 min, 30 min e 60 min. O ponto de dados em pH 6,0 e 15 min de contato demonstra a recuperação celular ótima (93,4% ± 2,9%), indicando que um tempo breve de contato é suficiente para recuperar as células-alvo mantendo alta eficiência na remoção de inibidores. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Limite de detecção de produtos amplificados por LAMP em amostras de frutos do mar artificialmente contaminadas. Resultados da amplificação em amostras de (A) ostra, (B) camarão e (C) peixe contaminadas com diluições seriadas de espécies de Vibrio e pré-tratadas com ACB. Tubos: (1) Controle negativo; (2) V. alginolyticus; (3) V. parahaemolyticus; (4) V. vulnificus; (5) V. cholerae não O1; e (6) V. mimicus (utilizado como controle-alvo). Painel superior: Detecção colorimétrica visual utilizando 4 μL de Hidroxinaftol Azul (HNB, 125 μM) à inspeção a olho nu, em que reações positivas aparecem azuis e reações negativas permanecem violeta. Painel inferior: Detecção baseada em fluorescência utilizando corante Midori Green Advanced (MGA), visualizado sob transiluminador de luz azul. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Parâmetros comparativos de desempenho diagnóstico do método LAMP com e sem remoção de inibidores. Comparação da sensibilidade geral, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) em amostras de peixe, camarão e ostra contaminadas nos limites mínimos detectáveis (n = 10 ensaios por combinação espécie/matriz, totalizando 150 ensaios). As barras comparam amostras pré-tratadas com a mistura otimizada de carvão ativado-bentonita (ACB) em relação aos controles não tratados (sem remoção de inibidores). Os níveis de contaminação foram definidos em 150 UFC/g para V. cholerae em todas as matrizes; 300 UFC/g para V. parahaemolyticus, V. alginolyticus e V. vulnificus em ostra; e 76 UFC/g em peixe e camarão. O pré-tratamento com ACB restaurou com sucesso todos os parâmetros diagnósticos para ≥90% em todas as matrizes. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
Figura 5: Sensibilidade e especificidade específicas para o alvo do método ACB-LAMP otimizado em diferentes matrizes de frutos do mar. Desempenho diagnóstico individual de V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus em amostras de peixe, camarão e ostra (n = 10 testes por combinação alvo/alimento) pré-tratadas com ACB. A especificidade atingiu 100% para todos os alvos devido ao desenho de primers específicos para espécies, direcionados aos genes gyrB, ompW, tlh e vvhA. A sensibilidade atingiu 100% nas matrizes de peixe e camarão, com uma ligeira redução para 90% observada nas ostras devido à alta complexidade basal da matriz orgânica, que interfere na reação. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Primers utilizados em ensaios de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP). Descrição dos primers internos direcionais e reversos (FIP, BIP), primers externos (F3, B3) e primers de loop (LF, LB) projetados para alvo específico de espécies de V. alginolyticus (gyrB), V. parahaemolyticus (tlh), V. vulnificus (vvhA) e V. cholerae (ompW). Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Tabela de contingência para avaliação dos parâmetros de desempenho diagnóstico do método LAMP. Configuração matricial padrão 2x2 utilizada para classificar e resumir Verdadeiros Positivos (VP), Verdadeiros Negativos (VN), Falsos Positivos (FP) e Falsos Negativos (FN) para calcular sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) em amostras de frutos do mar com e sem adição de analito. Clique aqui para baixar esta tabela.
Arquivo Suplementar 1: Conjuntos de dados brutos que apoiam os resultados deste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Este estudo estabelece condições otimizadas para aumentar a sensibilidade da amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) na detecção de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus e V. vulnificus em amostras de frutos do mar contaminados. Ao contornar a etapa tradicional de pré-enriquecimento, o tempo diagnóstico é significativamente reduzido, oferecendo uma abordagem altamente eficiente e rápida para identificar diretamente patógenos em produtos pesqueiros.
Uma melhoria metodológica fundamental neste estudo é a otimização da etapa de remoção do inibidor. Metodologias anteriores utilizavam um pH de 4 antes da amplificação21; no entanto, isso resultou na recuperação nula de cepas de Vibrio, principalmente porque Vibrio as espécies são altamente sensíveis a ambientes ácidos26. Para resolver isso, as condições foram sistematicamente modificadas para melhorar simultaneamente a recuperação celular e eliminar inibidores naturais da reação. A suspensão do carvão ativado com bentonita (ACB) em solução tampão com pH 6, seguida de 15 minutos de agitação com a amostra, mostrou-se a condição ideal. Essa modificação maximiza a repulsão eletrostática entre as bactérias e o ACB, aproximando-se do ponto isoelétrico da membrana bacteriana.21,27,28, minimizando assim a perda de células-alvo. Consequentemente, esse aprimoramento metodológico resultou em uma sensibilidade de detecção 2 a 50 vezes maior do que a de amostras processadas sem tratamento com ACB.
Diferentemente desses aprimoramentos metodológicos, a implementação bem-sucedida deste protocolo pode exigir solução explícita de problemas caso ocorram dificuldades comuns. Um problema frequente encontrado durante a implementação é a remoção incompleta da matéria orgânica, o que pode interferir com a polimerase e reduzir a sensibilidade do LAMP, especialmente em matrizes altamente contaminadas. Se a amplificação falhar ou a sensibilidade diminuir, a solução de problemas deve começar verificando o pH da mistura de amostra ACB; desvios do pH 6 podem levar à morte celular (se muito ácido) ou à absorção insuficiente de inibidores. Além disso, se ocorrerem falsos negativos apesar do tratamento adequado com ACB, os pesquisadores devem garantir que o tempo de contato não exceda 15 min, pois a exposição prolongada pode resultar na retenção involuntária de células-alvo pela matriz. Para detecção a olho nu, mudanças de cor ambíguas podem ser solucionadas garantindo a remoção completa dos íons cálcio da matriz, que de outra forma poderiam interferir com a precipitação de pirofosfato de magnésio no ensaio de LAMP.
Este trabalho relata, pela primeira vez, a identificação de Vibrio spp. em amostras de peixe utilizando o método LAMP em combinação com um tratamento prévio com ACB. Esta pesquisa contribui para o avanço científico ao estabelecer um método rápido, confiável e de baixo custo para a identificação de produtos pesqueiros13,19,23,29Embora a PCR convencional represente uma abordagem alternativa para testar essa hipótese, a alta especificidade e os valores preditivos obtidos aqui demonstram que o ensaio ACB-LAMP é uma opção superior. Uma vantagem metodológica fundamental dessa técnica é sua independência em relação a equipamentos sofisticados e caros, como termocicladores, câmaras de eletroforese e transiluminadores.9,30. Além disso, a detecção visual dos resultados via o azul de hidroxinaftol simplifica significativamente a interpretação dos dados.
Apesar da alta sensibilidade e especificidade alcançadas, uma limitação notável do estudo é observada em matrizes com alta contaminação de fundo, como amostras de ostra. Nessas situações, o sistema ACB não consegue eliminar completamente toda a matéria orgânica interferente, o que diminui ligeiramente a sensibilidade do ensaio em comparação com amostras de peixe ou camarão. Por fim, as aplicações potenciais deste método destacam sua utilidade para monitoramento rotineiro e de alto rendimento na indústria alimentícia, a fim de prevenir infecções relacionadas a Vibrio. As pesquisas futuras devem priorizar a automação das etapas de extração de DNA e remoção do inibidor ACB. A automação desses aspectos metodológicos fundamentais representa uma vantagem crucial que reduzirá significativamente o tempo de manipulação, minimizará erros humanos e padronizará variáveis de solução de problemas, facilitando assim a aplicação em larga escala dessa técnica em laboratórios industriais de controle de qualidade.
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Carvão ativado | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonita | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betaina | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transiluminador Bio-Image Systems | Bio-Image Systems | MBE-CP-01 | |
| Polimerase Bst de DNA | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrífuga (modelo J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| Mistura de dNTPs | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Hidroxinaftol azul | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Software de Análise MS 1D | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Espectrofotômetro (modelo 6300) | Jenway | 630531 | |
| Circulador Stomacher (modelo 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae não O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Papel Whatman | Whatman | 1001-055 |
Referências
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