Este estudo otimiza o ensaio de amplificação isotérmica mediado por alça (LAMP) utilizando carvão ativado e bentonita para detectar espécies patogênicas de Vibrio em frutos do mar. Este pré-tratamento remove efetivamente inibidores da reação, proporcionando diagnósticos significativamente mais rápidos, sensíveis e econômicos em comparação com métodos convencionais.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de investigação
Aumento da Sensibilidade da Amplificação em Alça Utilizando Carvão Ativado e Bentonita para a Detecção de Vibrio spp. em Produtos Pesqueiros
Neste artigo
Resumo
Resumo
O Vibrio o gênero possui mais de 100 espécies, das quais 12 são consideradas patogênicas para humanos; as espécies mais frequentemente isoladas em alimentos são V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus. O principal problema na identificação desses microrganismos por métodos microbiológicos convencionais é o alto custo e o diagnóstico demorado. A amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) foi utilizada para a identificação de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus. O carvão ativado com bentonita (CAB) foi utilizado para remover inibidores, melhorando a sensibilidade do teste; foram testados os pH 6, 7 e 9, bem como diferentes tempos de contato entre a amostra e o CAB. O método LAMP teve sua sensibilidade aprimorada quando o carvão ativado e a bentonita foram usados para remover inibidores da reação em amostras de camarão, peixe e ostra. A sensibilidade do LAMP, valor preditivo negativo, valor preditivo positivo e especificidade do LAMP foram iguais ou superiores a 90% para todas as amostras testadas. O método LAMP poderá ser uma alternativa para identificar V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus em produtos pesqueiros devido à aplicação mais rápida, maior sensibilidade e menores custos em comparação com o método padrão.
Introdução
Espécies do gênero Vibrio o gênero amplamente distribuído em ambientes marinhos e pode estar associado a peixes, moluscos ou crustáceos de forma patogênica ou comensal. Relatou-se que 12 espécies podem ser patogênicas para humanos, com Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus revelando uma maior frequência de isolamento em produtos pesqueiros. Nos Estados Unidos, as autoridades de saúde estimam que Vibrio spp. causam mais de 80.000 infecções por ano1,2,3,4,5O isolamento de Vibrio spp. é realizado por meio de métodos convencionais que envolvem pré-enriquecimento, cultivo em meios seletivos e confirmação por testes bioquímicos e sorológicos.6,7. Esses métodos convencionais são limitados pelo tempo prolongado necessário para o isolamento do patógeno (até 5 dias) e pela sua falta de poder de resolução, o que frequentemente impede a diferenciação precisa de espécies estreitamente relacionadas dentro do Vibrio gênero devido a perfis fenotípicos e bioquímicos semelhantes6,7,8.
Alternativamente, a amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) tem sido relatada como uma técnica molecular rápida, precisa e de baixo custo para a identificação de patógenos9,10. Este método é altamente econômico e mais rápido que a PCR convencional, pois não requer equipamentos sofisticados como termocicladores9. O método LAMP permite, em uma única etapa, a detecção do gene alvo pela observação da turbidez no tubo de reação causada pela precipitação do pirofosfato de magnésio, pois este é um produto de reação estável a 65 °C, a temperatura utilizada na técnica LAMP, de modo que o aumento da turbidez correlaciona-se com a quantidade de DNA sintetizado, evitando o uso de géis de agarose e transiluminadores11,12,13,14,15.
A detecção de sensibilidade a esses patógenos pode ser melhorada pela eliminação de inibidores da reação, como proteases, íons de cálcio, glicogênio e lipídios, que podem inibir a polimerase Bst ou ligar-se ao alvo de DNA, impedindo a amplificação13,16,17,18,19,20. Relatou-se que a combinação de carvão ativado com bentonita (ACB) apresenta alta eficiência na eliminação de inibidores de amplificação, aumentando assim a sensibilidade na detecção de Escherichia coli em amostras de ostras e reduzindo custos, pois o ACB é mais barato do que o uso de kits comerciais21.
Neste trabalho, propomos otimizar o método LAMP utilizando carvão ativado e bentonita para aumentar a sensibilidade na identificação de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus diretamente em produtos pesqueiros. Esse método otimizado fornece orientações práticas para o monitoramento rotineiro e controle de qualidade na indústria alimentícia, sendo altamente aplicável para o diagnóstico rápido de patógenos, evitando as etapas demoradas de pré-enriquecimento. Em relação ao desempenho esperado, o método demonstra excelente sensibilidade (superior a 98%) e especificidade (100%) em matrizes como peixe e camarão. No entanto, uma limitação importante a considerar é que, em amostras altamente contaminadas de origem, como ostras, o sistema ACB não consegue eliminar completamente toda a matéria orgânica interferente, o que pode diminuir ligeiramente a sensibilidade do ensaio (94%–98%).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Este estudo não envolveu seres humanos nem animais vertebrados; portanto, não foi necessária aprovação ética institucional. Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cepas bacterianas utilizadas e extração de DNA
As cepas de Vibrio cholerae não O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 e V. alginolyticus ATCC 17749 foram cultivadas em caldo cérebro-corpo (BHI) com 2% de NaCl a 37 °C por 24 h. As cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028 foram cultivadas em caldo BHI sem cloreto de sódio a 37 °C por 24 h para serem utilizadas como controles negativos nos testes. Para a extração de DNA, uma cultura de 18 h foi centrifugada a 16.000 x g durante 6 min a 25 °C em uma centrífuga. O sobrenadante foi cuidadosamente decantado para evitar perturbar o pellet celular, e o pellet foi completamente ressuspenso por pipetagem em 500 μL de solução tampão TAE (Tris-ácido acético-EDTA, pH 8). A suspensão foi fervida por 6 min para lisar as células, seguida imediatamente por resfriamento em gelo por 5 min. Uma centrifugação final foi realizada para obter o pellet de detritos celulares, resultando em um sobrenadante límpido contendo o DNA extraído, que foi posteriormente utilizado como molde para amplificação por LAMP22,23.
2. Procedimento LAMP
Os primers utilizados na LAMP (Tabela 1) foram testados para corroborar a especificidade na identificação de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus. A identificação de cada Vibrio espécies utilizando LAMP foi realizada em tubos de reação preparando um volume final de 25 μL da mistura contendo: 1.6 μM de cada um dos primers, 1,4 mM de uma mistura de dNTP, 6 mM de MgSO₄, 800 mM de betaina, 8 U de Bst DNA polimerase, e 5 μL de DNA molde. A mistura da reação foi cuidadosamente homogeneizada e incubada em banho-maria a 65 °C por 60 min. Após o tempo de incubação, os produtos de amplificação foram separados em um gel de agarose a 1,5%. Os produtos de amplificação foram então corados utilizando 1 μL de um corante fluorescente de DNA diluído 1:100 e revelado utilizando um transiluminador de luz azul. Outra técnica para determinar se o teste foi positivo na identificação do patógeno envolveu a adição de 4 μL de azul de hidroxinaftol (HNB, 125 μM) aos tubos de reação e observando a mudança de cor a olho nu. Um teste positivo foi indicado pela formação de uma cor azul, e um teste negativo por uma cor violeta.24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028 foram utilizados como controles negativos para o método LAMP. As amplificações obtidas no LAMP foram separadas em gel de agarose e observadas utilizando um transiluminador. As imagens resultantes foram adquiridas e digitalizadas utilizando o software MS 1D Analysis.
3. Tratamento de amostras de ostras, camarões e peixes para a eliminação de Vibrio spp. naturalmente presentes nas amostras
Foram adquiridas dez amostras de ostras, dez amostras de camarão e dez amostras de peixe, com peso aproximado de 200 g cada. Para remover células de Vibrio naturalmente presentes, seguiu-se a metodologia previamente publicada21. Cinquenta gramas (50 g) de cada amostra foram pesados e homogeneizados mecanicamente em um misturador com pás a 260 rpm durante 1 minuto, produzindo uma suspensão tecidual uniforme, que foi então armazenada a -70 °C por 72 h. Posteriormente, as amostras foram completamente descongeladas em banho-maria a 40 °C, e lavadas com 300 mL de solução tampão fosfato salino (0,85% NaCl, pH 9). Para garantir que o procedimento anterior havia eliminado com sucesso Vibrio nas amostras, realizou-se a metodologia de pré-enriquecimento indicada no capítulo 9 do Manual Analítico Bacteriológico da Food and Drug Administration7. A solução salina contendo a amostra foi substituída por 450 mL de água peptonada alcalina (APW, pH 9). Em seguida, foram preparadas cuidadosamente diluições seriadas em APW até uma diluição de 10⁻3 e incubadas por 24 h. Finalmente, uma alíquota de cada tubo foi repicada em um meio seletivo de ágar tiossalvato-citrato-bile-sacarose (TCBS) e incubada por 24 h a 37 °C para confirmar visualmente a ausência de colônias características de Vibrio. Todos os testes foram realizados em triplicata.
4. Preparação de carvão ativado com bentonita (ACB) e avaliação da recuperação celular
Para determinar as condições em que o carvão ativado com bentonita (ACB) é mais eficiente na absorção de inibidores presentes em amostras de produtos pesqueiros, mantendo absorção mínima das células-alvo, seguiu-se a metodologia publicada21 para estabelecer o pH e o tempo de contato ótimos entre o ACB e as amostras alimentares. O carvão ativado foi lavado completamente com água destilada e seco a 55 °C. Em seguida, 32,6 g de carvão ativado foram misturados com 3,04 g de bentonita, agitados continuamente a 150 rpm durante 24 h para garantir distribuição uniforme, secos a 55 °C e esterilizados, resultando em um pó fino e homogêneo de ACB. Para avaliar a recuperação celular após a mistura das células de Vibrio com a mistura de carvão ativado e bentonita (ACB), as cepas foram cultivadas separadamente em caldo BHI com 2% de NaCl até atingirem uma densidade celular de 1,5 x 104 UFC/mL. Em seguida, 1 mL de cada cepa de Vibrio foi inoculado separadamente em 100 mL de tampão fosfato (PBS, 0,85% de NaCl, ajustado a pH 4, 6 e 9). A suspensão bacteriana foi então combinada com 4,6 g do ACB previamente preparado e mantida sob agitação a 150 rpm por 15, 30 e 60 min para facilitar o contato. Após cada tempo de contato determinado, uma alíquota de 0,1 mL foi cuidadosamente separada, espalhada em ágar TCBS, e incubada a 37 °C por 24 h antes da contagem de colônias.
5. Avaliação do limite de detecção de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus em amostras de ostras, camarões e peixes tratadas com carbono ativado e bentonita
Cada uma das espécies de Vibrio utilizadas neste estudo foi cultivada em caldo BHI, e suas densidades celulares foram ajustadas com precisão para 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102 e 76 UFC/mL (A600 nm ~0,25), conforme medido com um espectrofotômetro. Posteriormente, 1 mL de cada cultura de Vibrio foi usado para inocular 50 g de cada amostra (ostras, peixes, camarões) previamente tratadas para eliminar qualquer presença de Vibrio. As amostras inoculadas foram homogeneizadas em um misturador com pás a 360 rpm durante 30 s e diluídas com 450 mL de APW (pH 6). A mistura foi então centrifugada a 260 x g durante 5 min a 4 °C para separar os resíduos maiores. O sobrenadante resultante foi decantado em frascos contendo 23 g de ACB, agitado a 150 rpm por 15 min para absorver inibidores e filtrado usando papel filtro, obtendo-se um eluato claro, isento de partículas grandes. Este eluato foi então centrifugado a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C, resultando em um pellet celular visível no fundo do tubo, que foi posteriormente utilizado para extrair o DNA. Cada espécie de Vibrio foi identificada pelo método LAMP. Os controles negativos consistiram em amostras inoculadas com cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028. A mistura da reação foi incubada em banho-maria a 65 °C por 60 min. Após o tempo de incubação, os produtos de amplificação foram separados em um gel de agarose a 1,5% e corados com um corante fluorescente de DNA. Os géis foram visualizados em um transiluminador de luz azul. Finalmente, 4 μL de azul de hidroxinaftol (125 μM) foram adicionados a cada tubo para detecção a olho nu24.
6. Determinação do valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, especificidade e sensibilidade do método LAMP
A sensibilidade, especificidade e valores preditivos do método LAMP foram determinados utilizando 30 amostras (10 de camarão, 10 de ostra e 10 de peixe). Cada amostra foi inoculada com a concentração mínima detectável estabelecida para cada espécie de Vibrio. Para determinar a porcentagem de sensibilidade e especificidade, bem como o valor preditivo negativo (VPN) e o valor preditivo positivo25, foi utilizada uma tabela de contingência para resumir os verdadeiros positivos (VP), verdadeiros negativos (VN), falsos positivos (FP) e falsos negativos (FN) obtidos durante os experimentos. (Tabela 2). A partir desses dados, foram aplicadas as seguintes fórmulas:
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Estirpes bacterianas utilizadas e a extração de DNA
O DNA foi extraído com sucesso de todas as estirpes patogênicas e de controle negativo para ser usado como modelo nos ensaios LAMP subsequentes.
Procedimento LAMP
Os iniciadores utilizados neste trabalho foram específicos para a amplificação do alvo molecular em cada espécie de Vibrio. Os produtos de amplificação obtidos pela LAMP quando cepas de Vibrio foram utilizadas demonstraram ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este estudo estabelece condições otimizadas para aumentar a sensibilidade da amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) na detecção de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus e V. vulnificus em amostras de frutos do mar contaminados. Ao contornar a etapa tradicional de pré-enriquecimento, o tempo diagnóstico é significativamente reduzido, oferecendo uma abordagem altamente eficiente e rápida para identificar diretamente patógenos em produtos pesqueiros.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Carvão ativado | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonita | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betaina | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transiluminador Bio-Image Systems | Bio-Image Systems | MBE-CP-01 | |
| Polimerase Bst de DNA | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrífuga (modelo J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| Mistura de dNTPs | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Hidroxinaftol azul | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Software de Análise MS 1D | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Espectrofotômetro (modelo 6300) | Jenway | 630531 | |
| Circulador Stomacher (modelo 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae não O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Papel Whatman | Whatman | 1001-055 |
Referências
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
- Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
- Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
- Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
- De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
- Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
- Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
- Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
- Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
- Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
- Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
- Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
- Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
- Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
- Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
- Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
- Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
- Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
- Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
- Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
- Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
- Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
- Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
- Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.