Apresentamos um protocolo para utilizar uma plataforma microfluídica no modelamento de interações tumor-imunes em um ambiente tridimensional (3D). Nossos resultados revelaram que as células Natural Killer (NK) mantiveram sua atividade antitumoral sob compressão mecânica.
Artigo de método
Uma Plataforma Microfluídica para Estudar os Papéis da Compressão Mecânica nas Interações entre Células Tumorais e Imunes em uma Matriz Extracelular 3D
Neste artigo
Resumo
Resumo
As forças mecânicas influenciam significativamente a capacidade das células imunes de matar células tumorais no contexto da imunoterapia baseada em células. Para eliminar células tumorais, as células imunes precisam exercer forças sobre a célula-alvo e formar uma sinapse imune, por meio da qual moléculas citotóxicas — incluindo a granzima B — são entregues. Apesar de sua importância, ainda se compreende pouco sobre como os estímulos mecânicos podem ser aproveitados para potencializar a eliminação mediada pelo sistema imune. Essa lacuna de conhecimento é parcialmente decorrente da falta de ferramentas capazes de fornecer estresse mecânico bem controlado aos cultivos celulares em um ambiente fisiologicamente realista. Aqui, descrevemos um dispositivo microfluídico de compressão que pode aplicar compressão estática ou dinâmica a esferoides tumorais embutidos em matriz extracelular (ECM), permitindo ao mesmo tempo a imagem em tempo real das interações tumor-imunes por meio de microscopia óptica.
A plataforma microfluídica é composta por 12 compartimentos (6 de controle e 6 funcionais). Cada compartimento contém uma câmara celular posicionada diretamente sob a unidade de controle de pressão. Esferoides incorporados na MEC são colocados dentro da câmara celular. Utilizando esta plataforma, investigamos a eficiência de morte mediada por células Natural Killer (NK) contra esferoides tumorais de mama (MCF-7) sob compressão mecânica definida. Os resultados mostraram que as células NK permaneceram os principais responsáveis pela morte dos esferoides tumorais, independentemente da compressão mecânica em colágeno a 1,5 mg/mL. Portanto, sugere-se que as células NK podem manter sua atividade antitumoral sob estresse compressivo. Esses achados demonstram a utilidade dessa plataforma para investigar o papel das forças mecânicas nas interações tumor-imunes. Estudos em andamento estão identificando os mecanismos moleculares que permitem às células imunes se adaptar ao estresse compressivo. Os conhecimentos obtidos a partir desses estudos podem revelar uma via terapêutica promissora.
Introdução
A imunoterapia contra o câncer baseada em células é uma abordagem terapêutica que utiliza células imunes para direcionar células cancerosas1. Essa estratégia demonstrou sucesso notável no tratamento de cânceres sanguíneos2,3,4. No entanto, o nível de sucesso observado nos cânceres sanguíneos ainda não foi totalmente traduzido para o tratamento de tumores sólidos5,6,7. Uma das principais razões para essa limitação é o microambiente tumoral imunossupressor (TME) específico dos tumores sólidos.
O ME é caracterizado por sinais mecânicos distintos que podem regular o comportamento celular. A eliminação eficaz de células tumorais por células imunes exige que elas exerçam forças sobre as células-alvo e estabeleçam uma sinapse imune através da qual moléculas citotóxicas são entregues8. Portanto, compreender como as forças mecânicas influenciam a função das células imunes pode revelar novas estratégias terapêuticas para melhorar a eficácia das imunoterapias baseadas em células contra tumores sólidos.
Uma característica mecânica definidora do microambiente tumoral (TME) sólido é a tensão compressiva que o microambiente tumoral impõe ao tumor em crescimento9,10. Até o momento, a maioria dos estudos sobre compressão tem se concentrado nos efeitos sobre o comportamento das células tumorais10,11. Apenas recentemente a atenção passou a se voltar para a compreensão de como a compressão influencia as células imunes dentro do TME12. Como resultado, os mecanismos pelos quais a tensão compressiva afeta a migração das células Natural Killer (NK), a formação da sinapse imune e a atividade citotóxica permanecem pouco compreendidos e insuficientemente quantificados. Essa lacuna representa uma limitação crítica em nosso entendimento sobre como os sinais mecânicos dentro do TME podem ser aproveitados para melhorar o direcionamento imune de tumores sólidos.
Uma grande barreira para abordar essa questão é a falta de plataformas experimentais capazes de aplicar compressão controlada e quantificável em microambientes tridimensionais fisiologicamente relevantes, ao mesmo tempo em que permitem a imagem em tempo real das interações entre tumor e sistema imunológico. As primeiras abordagens experimentais para estudar o estresse compressivo envolviam a incorporação de esferoides em géis de agarose13. Embora este método tenha capturado efetivamente o confinamento físico, ele eliminou as interações nativas entre matriz extracelular (ECM) e células. Dolega et al. aplicaram pressão osmótica para induzir estresse compressivo; no entanto, os esferoides foram mantidos em suspensão no meio de cultura e, portanto, permaneceram desprovidos de interações com a ECM9. Pandey et al. utilizaram um inserto tipo transwell e pesos para comprimir esferoides incorporados em colágeno, o que preservou as interações entre ECM e células, mas limitou a imagem de alta resolução necessária para quantificar a motilidade das células imunes e sua atividade citotóxica14. Em conjunto, essas limitações destacam a necessidade de plataformas experimentais que permitam a imagem em tempo real das respostas morfológicas das células à compressão dentro do microambiente tumoral (TME).
Aqui, apresentamos um protocolo para um dispositivo microfluídico de compressão15 que permite a aplicação controlada de tensão compressiva, mantendo interações fisiologicamente relevantes entre a matriz extracelular e as células, além de possibilitar a imagem de células vivas com alta resolução das dinâmicas imune-tumorais. O protocolo consiste na preparação dos componentes do dispositivo (Seção 1), montagem do dispositivo (Seção 2) e na aquisição de imagens das interações tumor-imunes (Seção 3). Demonstramos o fluxo de trabalho utilizando um ensaio de citotoxicidade por células NK contra esferoides tumorais marcados com proteína verde fluorescente (GFP). Além dessa aplicação, a plataforma pode ser facilmente adaptada para investigar os efeitos de forças mecânicas sobre uma ampla variedade de tipos celulares e interações celulares em microambientes tridimensionais.
Protocolo
1. Preparação dos componentes do dispositivo
- Ativação da superfície da câmara de carregamento da amostra
- Coloque uma máscara sobre a câmara de carregamento da amostra (Camada 1, C1) de modo que apenas os poços fiquem expostos.
- Exponha a camada 1 mascarada ao plasma de oxigênio por 15 s usando a configuração de alta potência (45 W).
- Coloque a Camada 1 em uma placa de Petri e, em seguida, prossiga com os seguintes passos em uma cabine de segurança biológica.
- Trate cada poço com 10 µL de PEI (polietilenimina) a 1% por 10 min.
- Remova o PEI das cavidades por aspiração a vácuo a partir dos quatro cantos de cada cavidade para evitar arranhar a superfície de vidro.
- Lave as cavidades com 10 µL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), em seguida remova a solução por aspiração a vácuo pela lateral.
- Trate os poços com 10 µL de glutaraldeído 0,1% por 30 min, depois remova o glutaraldeído por aspiração a vácuo a partir dos cantos.
- Lave as cavidades com PBS três vezes, removendo o lavado dos cantos após cada lavagem.
- Envolva a placa de Petri contendo a Camada 1 com papel alumínio e deixe-a no gabinete de segurança biológica durante a noite.
- Esterilização da estrutura metálica
- Submergir o disco de 38 mm × Estrutura metálica de 88 mm e os doze parafusos cabeça redonda M2.5 em etanol 70% durante a noite.
- Priming da unidade de controle de pressão
- Expor a unidade de controle de pressão ao plasma de oxigênio por 30 s utilizando a configuração de alta potência (45 W).
- Mergulhe a unidade de controle de pressão, com as características voltadas para baixo, em água desionizada (DI) durante a noite para preencher os canais e as câmaras da unidade de controle de pressão.
- No dia seguinte, remova a unidade de controle de pressão da água deionizada na qual estava submersa.
- Preencha um reservatório microfluídico com 50 mL de água desionizada.
OBSERVAÇÃO: O reservatório microfluídico consiste em um tubo cônico de 50 mL equipado com uma tampa personalizada contendo duas conexões para tubos: uma linha de tubo pneumático e uma linha de tubo para entrega de fluido. - Conecte uma seringa cheia de ar à linha de tubo pneumático.
- Pressione lentamente o êmbolo da seringa para pressurizar o reservatório e forçar a água desionizada a passar pela tubulação de entrega de fluido até que a tubulação esteja completamente cheia e a água comece a gotejar pela extremidade do tubo.
- Conecte o tubo de entrega de fluido pré-cheio e escorrendo ao manifold de policarbonato e, em seguida, à entrada de 1,5 mm localizada na parte traseira da unidade de controle de pressão.
- Deixe a unidade de controle de pressão e o conjunto do coletor secarem ao ar por 2 h. Após secagem completa, a unidade de controle de pressão e o conjunto do coletor estão prontos para o próximo passo.
2. Montagem do dispositivo
- Preparação do colágeno com células incorporadas
- Remova e seque o quadro metálico e os parafusos do etanol a 70%.
- No gabinete de segurança biológica, coloque três microtubos de 600 µL sobre gelo. Rotule os tubos da seguinte forma: "N" (neutralização), "sp" (esferoides de MCF-7) e "sp+NK" (esferoides de MCF-7 com células NK).
- Prepare a mistura de neutralização adicionando 10× o volume necessário de Meio 199 (M199) e hidróxido de sódio (NaOH) ao tubo "N".
- Transfira o volume apropriado da mistura M199:NaOH para os tubos "sp" e "sp+NK" para obter uma concentração final de 1×.
- Recupere os esferoides tumorais e centrifugue a 141 × g por 3 min para permitir que os esferoides sedimentem no fundo do tubo.
NOTA: Esferoides tumorais com aproximadamente 200 µm de diâmetro foram gerados utilizando uma plataforma de micropoços de agarose descrita previamente16. Resumidamente, 3 × 106 células MCF-7 foram semeadas em uma matriz de micropoços de agarose de 36 × 36, composta por poços de 200 µm de diâmetro e 200 µm de profundidade, e então cultivadas por 7 dias para produzir os esferoides tumorais utilizados nos experimentos. - Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os esferoides em 200 µL de meio completo 50:50 MCF-7/NK (Tabela 1 e Tabela 2).
- Recolha as células NK em um tubo cônico de 50 mL, centrifugue a 141 × g por 4 min e conte as células.
NOTA: A viabilidade das células NK deve ser >85% no dia do experimento. - Ressuspenda o pellet resultante em 200 µL de meio completo para células NK.
- Adicione o volume apropriado da solução estoque de colágeno a cada tubo microcentrífugo.
- Adicione o volume apropriado da suspensão celular a cada tubo para obter um volume final de 200 µL contendo colágeno a 1,5 mg/mL.
NOTA: A suspensão "sp" contém apenas esferoides tumorais, enquanto a suspensão "sp+NK" contém esferoides tumorais e 1,5 × 106 células NK. - Misture suavemente por pipetagem para garantir uma distribuição homogênea de células e colágeno, minimizando a formação de bolhas.
- Montagem do dispositivo e carregamento celular
- Coloque a Camada 1 dentro do quadro metálico seco.
- Carregue 9 µL da mistura de colágeno em cada poço.
- Alinhe a unidade de controle de pressão e o conjunto do manifold com as câmaras celulares na Camada 1 utilizando um microscópio.
- Insira os parafusos secos através do manifold e no quadro metálico, fixando a unidade de controle de pressão e a Camada 1 entre o manifold e o quadro metálico.
- Coloque o dispositivo montado em um incubador a 37 °C e 5% CO₂ por 45 min para permitir a polimerização do colágeno.
- Adicione meio completo de cultura celular 50:50 MCF-7/NK através dos quatro portos de meio.
3. Imagem das interações tumor-imunes
- Coloque o dispositivo montado dentro do incubador de estágio acoplado a um microscópio invertido de epifluorescência para a aquisição de imagens de células vivas.
NOTA: O incubador de estágio manteve uma temperatura de 37 °C e uma umidade de aproximadamente 50% durante todo o período de aquisição de imagens. - Coloque uma caixa de proteção secundária sobre o dispositivo montado para manter o ambiente interno a 37 °C, umidade de 100% e 5% de CO₂ ao longo do período de aquisição de imagens.
- Conecte o dispositivo ao controlador de pressão utilizando o tubo pneumático.
- Adquira imagens de campo claro e GFP dos esferoides tumorais antes de aplicar compressão, a fim de permitir a avaliação da deformação dos esferoides após a compressão.
- Aplique uma pressão constante de 120 mbar durante todo o período de aquisição de imagens.
NOTA: O software do controlador de pressão permite ao usuário definir o perfil e a magnitude da pressão aplicada durante o experimento. A Figura Suplementar 1 contém um esquema do sistema de controle de pressão. - Inicie a aquisição de imagens em lapso de tempo adquirindo imagens de campo claro e GFP a cada 10 minutos durante 18 h.
NOTA: As imagens foram adquiridas no plano Z central de cada esferoide tumoral utilizando uma objetiva de 20× em um microscópio invertido de epifluorescência. As imagens de campo claro e de fluorescência GFP foram capturadas com tempos de exposição de 200,1 ms e 298,9 ms, respectivamente.
Resultados
Para os experimentos a seguir, um dispositivo microfluídico de compressão15 foi utilizado para modelar interações tumor-imunes dentro de um microambiente tridimensional fisiologicamente relevante e, ao mesmo tempo, pode aplicar compressões estáticas e dinâmicas a esferoides tumorais (Figura 1). Os componentes do dispositivo (Figura 1A1) e sua ordem de montagem (Figura 1A2) são mostrados na Figura 1A. O quadro metálico serve como base do dispositivo, com a camada da câmara celular (L1) posicionada dentro do quadro. A unidade de controle de pressão, composta por L2 e L3 ligados por plasma, é colocada acima de L1, seguida pelo coletor (Figura 1A2). Juntos, L1 e a unidade de controle de pressão formam o dispositivo microfluídico funcional e são montados entre o quadro metálico e o coletor com parafusos. O coletor contém portas de entrada para tubos fluídicos que fornecem pressão ao dispositivo, bem como reservatórios de meio que facilitam experimentos de imagem celular viva de longo prazo.
Figura 1: Dispositivo microfluídico de compressão para estudos de interações entre células imunes e esferoides tumorais sob compressão mecânica. (A1) Fotografia dos componentes necessários para a montagem do dispositivo, mostrados da esquerda para a direita: manifold, unidade de controle de pressão (L2 + L3), camada da câmara de células (L1) e estrutura metálica. (A2) Esquema tridimensional dos componentes do dispositivo, mostrados de cima para baixo: manifold, unidade de controle de pressão (L2 + L3), camada da câmara de células (L1) e estrutura metálica. As camadas de PDMS L2 e L3 são ligadas por plasma para formar a unidade de controle de pressão, que é posicionada acima da câmara de células. O manifold e a estrutura metálica fixam o dispositivo montado. (B1) Esquema em corte transversal de uma unidade de compressão antes e após a compressão. Esferoides tumorais embutidos em matriz extracelular (ECM) e células NK são colocados na câmara de células. A distância inicial entre a parte inferior de L1 e a parte inferior de L2 antes da compressão é denotada como h. Ao aplicar pressão à unidade de controle de pressão, L2 se desloca para baixo, fazendo com que o pistão de PDMS comprima o esferoide tumoral. O deslocamento descendente de L2 após a compressão é denotado como Δh. (B2) Imagens sobrepostas de campo claro e GFP de um esferoide tumoral MCF-7 com células NK antes (esquerda) e após (direita) a compressão. As células MCF-7 são marcadas com GFP, enquanto as células NK não são marcadas. Células NK representativas são circundadas em azul, enquanto contornos amarelos marcam as periferias dos esferoides tumorais. Barra de escala = 50 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Uma vez montado, o dispositivo microfluídico de compressão pode ser usado para comprimir esferoides tumorais conforme ilustrado na Figura 1B. Neste caso, os esferoides tumorais embutidos em colágeno com células NK são introduzidos na câmara celular (L1). Ao aplicar pressão na câmara de pressão (L3), a camada de membrana deformável (L2) se desvia para baixo, fazendo com que o pistão de polidimetilsiloxano (PDMS) transmita forças compressivas ao esferoide. A câmara de pressão é controlada por uma fonte de pressão externa. Mais detalhes sobre o projeto, fabricação e caracterização do dispositivo microfluídico de compressão foram previamente publicados em outro estudo15.
Define-se a distância entre a parte inferior da câmara da célula (L1) e a parte inferior da membrana deformável (L2) como h (Figura 1B1, painel esquerdo). Antes da compressão, essa distância é de 200 µm. Ao aplicar pressão fluida à unidade de controle de pressão, a membrana deformável desvia-se para baixo, reduzindo a distância h em Δh (Δh; Figura 1B1, painel direito) e, assim, comprimindo o esferoide tumoral embutido em colágeno. Neste sistema, a deformação compressiva é definida como Δh/h, onde h é a distância inicial entre L1 e L2 antes da compressão, e Δh é o deslocamento descendente de L2 após a compressão. O deslocamento da membrana foi previamente calibrado mediante a visualização de microesferas fluorescentes aderidas à parte inferior de L2. Uma descrição detalhada do procedimento de calibração e dos cálculos de deformação compressiva pode ser encontrada em um estudo anterior17. Um exemplo de curva de calibração pode ser visto na Figura Suplementar 2.
Figura 1B2 mostra imagens representativas sobrepostas de campo claro e GFP de um esferoide de MCF-7 com células NK incorporadas em colágeno a 1,5 mg/mL antes (painel esquerdo) e após compressão (painel direito). Os limites do esferoide tumoral foram destacados em amarelo. Após a compressão, o esferoide exibiu um aumento na área projetada, indicando deformação em resposta à aplicação bem-sucedida de carga mecânica. Para todos os experimentos apresentados neste manuscrito, utilizamos uma deformação por compressão de Δh/h = 50%. Observamos que o diâmetro do esferoide varia de 140 µm a 200 µm. Isso significa que a deformação por compressão real no esferoide é ligeiramente menor que 50%. Vídeo Suplementar 1 e Vídeo Suplementar 2 mostram z-stacks representativos no plano X-Y adquiridos no canal de fluorescência GFP de um esferoide de MCF-7 incorporado em colágeno a 1,5 mg/mL antes e após a aplicação da deformação compressiva de 50%, respectivamente.
O dispositivo microfluídico de compressão foi utilizado para investigar os efeitos das células NK, da compressão e da combinação desses fatores sobre a morte de esferoides tumorais (Figura 2). Isso é possível graças ao design do dispositivo, que contém 12 poços de cultura. Desses poços, seis podem ser submetidos à compressão, enquanto os seis restantes servem como controles sem compressão. Essa configuração permite quatro condições experimentais (Figura 2A): esferoides isolados sem compressão (sp), esferoides com células NK mas sem compressão (+NK), esferoides submetidos à compressão (+comp) e esferoides expostos tanto à compressão quanto às células NK (+comp+NK).
Figura 2: A compressão mecânica modula a eliminação de esferoides tumorais mediada por células NK. (A) Imagens de fluorescência com lapso de tempo de esferoides MCF-7 incorporados em colágeno a 1,5 mg/mL sob quatro condições: controle apenas com esferoide (sp), esferoides com células NK (+NK), esferoides com compressão (+comp) e esferoides com compressão e células NK (+comp+NK). A fluorescência GFP marca células tumorais MCF-7 viáveis. O contorno amarelo indica a região de interesse (ROI), definida usando a imagem de 18 h e aplicada a todos os pontos temporais para quantificação da fluorescência. A intensidade total da fluorescência GFP dentro da ROI foi medida e utilizada para análises posteriores. Barra de escala = 50 µm. (B) Intensidade total da fluorescência GFP de um único esferoide ao longo do tempo sob quatro condições. Cada linha colorida representa a intensidade total de fluorescência de um único esferoide, normalizada em relação à sua intensidade inicial em t = 0. A linha preta é o ajuste polinomial de segunda ordem dos dados de intensidade de fluorescência agrupados a partir de 7 esferoides cultivados na condição controle e foi utilizada como referência para o cálculo da perda de células tumorais em (C). (C) A perda normalizada de GFP para as condições +comp, +NK e +comp+NK foi calculada subtraindo a intensidade de GFP em t = 18 h de cada esferoide da linha de referência do esferoide isolado (sp). Assim, cada ponto de dado representa a perda normalizada de GFP de um único esferoide. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Os efeitos das células NK, da compressão e de sua combinação sobre esferoides tumorais podem ser visualizados nas imagens representativas de esferoides MCF-7 em colágeno a 1,5 mg/mL (Figura 2A). Como as células MCF-7 utilizadas para gerar os esferoides tumorais foram marcadas com GFP, a viabilidade tumoral pôde ser monitorada por meio de alterações na fluorescência de GFP. Imagens de GFP e de campo claro foram adquiridas a cada 10 min durante 18 h usando um microscópio invertido de epifluorescência. Notavelmente, os esferoides submetidos à compressão exibiram uma área projetada maior do que os esferoides não comprimidos, confirmando a transmissão bem-sucedida da carga mecânica da membrana deformável para o esferoide tumoral. Com o tempo, observou-se uma perda progressiva da fluorescência de GFP nas condições +NK e +comp+NK (Figura 2A), indicando a morte celular tumoral mediada por células NK.
Utilizamos a perda da fluorescência GFP como medida de morte celular tumoral. As células MCF-7 marcadas com GFP utilizadas neste estudo foram geradas por meio de transdução lentiviral. Resumidamente, um vetor lentiviral foi usado para introduzir um cassete de expressão da proteína verde fluorescente melhorada (eGFP) sob controle do promotor do fator de alongamento-1α (EF1α), juntamente com um gene de resistência à puromicina sob controle do promotor do vírus da sarcoma de Rous (RSV). Após a infecção, os cassetes de expressão lentivirais foram integrados ao DNA genômico das células MCF-7, resultando em expressão estável de GFP. A seleção com puromicina foi posteriormente utilizada para eliminar células não transduzidas. A marcação com GFP das células MCF-7 permitiu quantificar a viabilidade das células tumorais monitorando as alterações na intensidade da fluorescência GFP ao longo do tempo (Figura 2B). Uma forte correlação entre a perda da fluorescência GFP e marcadores estabelecidos de morte celular, incluindo o marcador vivo/morto iodeto de propídio (PI) e o marcador apoptótico anexina-V, já foi demonstrada anteriormente18, validando a perda da fluorescência GFP como uma medida indireta de morte celular tumoral.
Para quantificar os efeitos das quatro condições experimentais na viabilidade tumoral, a intensidade total da fluorescência GFP de cada esferoide tumoral foi medida em todos os pontos temporais, subtraída do fundo e normalizada em relação ao seu valor inicial (Figura 2B). A fluorescência total do esferoide foi calculada dentro de uma região de interesse (ROI) previamente definida. Esta ROI foi obtida delineando manualmente o contorno do esferoide tumoral na imagem de 18 h (contorno amarelo no painel de 18 h, Fig. 2A) utilizando um script personalizado em MATLAB. A intensidade total de fluorescência dentro dessa ROI foi então calculada para cada ponto temporal e corrigida pela subtração da fluorescência de fundo média medida a partir de uma ROI separada selecionada em outra região da imagem. Os valores de fluorescência corrigidos para o fundo foram posteriormente normalizados em relação à intensidade inicial de fluorescência do esferoide.
Cada curva colorida representa a intensidade normalizada de GFP de um esferoide individual sob uma condição experimental específica em Figura 2B. A curva é obtida utilizando um ajuste polinomial de segunda ordem aos dados experimentais. As curvas roxas representam esferoides submetidos apenas à compressão (+comp, Figura 2B), as curvas vermelhas representam esferoides com células NK (+NK, Figura 2B), e as curvas azuis representam esferoides expostos tanto à compressão quanto às células NK (+comp+NK, Figura 2B). Em contraste, a curva preta é o ajuste polinomial de segunda ordem aos dados de sete esferoides cultivados na condição somente com esferoide, servindo como controle (sp, Figura 2B). Em Figura 2B, apenas os dados ajustados pelo polinômio, e não os pontos de dados experimentais, são apresentados para maior clareza. Notavelmente, a intensidade de fluorescência de GFP nas condições somente com esferoide (sp) e esferoide + compressão (+comp) exibiu uma tendência geral ascendente ao longo do tempo (Figura 2B), consistente com o crescimento contínuo do tumor ou manutenção da viabilidade. Em contraste, as condições +NK e +comp+NK demonstraram uma diminuição progressiva na intensidade de fluorescência de GFP (Figura 2B), indicando morte celular tumoral.
A perda cumulativa de células tumorais foi quantificada subtraindo a intensidade ajustada da fluorescência GFP normalizada de cada esferoide sob uma condição específica (+comp, +NK ou +comp+NK) da condição controle em 18 h (Figura 2C). Como resultado, cada ponto de dado representa a perda normalizada de GFP de um esferoide individual em relação ao controle somente com esferoides (Figura 2C). Assim, a condição +comp reflete a perda de GFP resultante apenas da compressão (roxo, Figura 2C), a condição +NK reflete a perda de GFP resultante apenas das células NK (vermelho, Figura 2C), e a condição +comp+NK reflete a perda de GFP resultante dos efeitos combinados de compressão e células NK (azul, Figura 2C). A condição +comp apresentou o menor grau de perda de GFP (Figura 2C), sugerindo que a compressão isoladamente teve um efeito mínimo sobre a viabilidade do esferoide. Em contraste, tanto a condição +NK quanto a +comp+NK mostraram perda significativamente maior de GFP do que a condição +comp (Figura 2C), indicando que as células NK são os principais responsáveis pela morte celular tumoral. Embora a condição +comp+NK tenha apresentado uma perda média de GFP maior do que a condição +NK, essa diferença não atingiu significância estatística (Figura 2C). Esses resultados sugerem que a compressão não prejudica a eliminação de células tumorais mediada por células NK. Em conjunto, esses achados demonstram que o dispositivo microfluídico de compressão pode ser utilizado com sucesso para quantificar os efeitos independentes e combinados da compressão e das células NK sobre a viabilidade de esferoides tumorais em um ambiente tridimensional fisiologicamente relevante.
Em contraste, resultados subótimos podem surgir quando (1) os esferoides estão localizados fora do limite do pistão, (2) os esferoides estão posicionados muito próximos ao limite do pistão e (3) múltiplos esferoides estão localizados a uma distância inferior ao diâmetro de um esferoide um do outro (Figura 3). Nesses casos, os campos correspondentes devem ser excluídos da análise.
Figura 3: Exemplo representativo de uma sequência de imagens de esferoides excluídos da análise. Imagens de campo claro (BF), fluorescência GFP e imagens sobrepostas de esferoides MCF-7 com células NK em colágeno a 1,5 mg/mL antes (coluna esquerda) e após compressão (duas colunas da direita) são apresentadas. As imagens pré-compressão foram adquiridas 20 minutos antes da aplicação da pressão e 10 minutos antes do início da aquisição com lapso de tempo. As imagens foram subsequentemente coletadas a cada 10 minutos durante 18 h, sendo 0 h correspondente à primeira imagem adquirida imediatamente após a compressão e 18 h representando o fim do experimento. A seta azul indica a borda do pistão de PDMS (L2). Este campo de imagem foi excluído da análise porque dois esferoides estavam presentes dentro da região de compressão e localizados muito próximos ao limite do pistão. Como resultado, a deformação do esferoide e a intensidade da fluorescência GFP não puderam ser quantificadas de forma confiável durante a compressão. Barra de escala = 50 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
(1) Esferoides localizados fora dos limites do pistão não sofrem compressão, pois a pressão é aplicada apenas dentro da região do pistão. Esses esferoides devem, portanto, ser excluídos tanto das condições comprimidas quanto das condições controle. (2) Esferoides posicionados sobre ou próximos ao limite do pistão (Figura 3, esferoide superior) devem ser excluídos, já que o esferoide está submetido a uma carga mecânica não uniforme. (3) Esferoides localizados a uma distância inferior ao diâmetro de um esferoide de esferoides vizinhos devem ser excluídos (Figura 3). A proximidade entre esferoides complica a quantificação da intensidade da fluorescência GFP, pois a região de interesse (ROI) é definida usando o ponto final do tempo. Com o tempo, os contornos dos esferoides podem tornar-se indistintos, dificultando a delimitação de uma ROI que englobe com precisão apenas um único esferoide. Esses problemas podem ser minimizados garantindo que os esferoides sejam centralizados dentro da região de compressão durante o carregamento do dispositivo. Uma atenção cuidadosa à distribuição, posicionamento dos esferoides e configuração do dispositivo é essencial para obter compressão uniforme e gerar resultados experimentais confiáveis e reprodutíveis.
| Componentes | Concentração |
| Meio α-MEM | |
| Soro bovino fetal (FBS) | 10% |
| Penicilina/estreptomicina | 1% |
Tabela 1: Meio completo para MCF-7.
| Componentes | Concentração |
| Meio α-MEM | |
| Mio-inositol | 0,2 mM |
| 2-mercaptoetanol | 0,1 mM |
| Soro bovino fetal (FBS) | 12,50% |
| Ácido fólico | 0,02 mM |
| Soro de cavalo (HS) | 12,50% |
| Penicilina/estreptomicina | 1% |
Tabela 2: Meio completo para NK.
Figura Suplementar 1: Esquema do sistema de controle de pressão. Um compressor de ar fornece ar comprimido (até 20 psi) ao controlador de pressão. O controlador regula a pressão de ar fornecida ao reservatório de pressão com base em configurações definidas pelo usuário. O controlador possui pressão máxima de operação de 200 mbar, estabilidade de pressão de 0,005% da escala total (FS), resolução de pressão de 0,003% FS e tempo de resposta de 9 ms, permitindo controle de pressão preciso e reprodutível. O controlador é conectado a um computador por meio de uma interface serial universal (USB), permitindo que o usuário programe a magnitude e o perfil da pressão aplicada usando o software fornecido. O software suporta múltiplas formas de onda de compressão, incluindo compressão constante, senoidal, triangular e periódica. Neste esquema, a pressão é ajustada em 120 mbar, e o ar comprimido nessa pressão é fornecido ao reservatório pressurizado por meio do tubo pneumático. O reservatório pressurizado contém 50 mL de água desionizada (DI) e tem a função de converter a pressão pneumática em pressão fluidica. Uma vez pressurizado, o reservatório impulsiona o fluido por meio de tubos de entrega até a unidade de controle de pressão do dispositivo microfluídico de compressão (veja Figura 1 para detalhes do dispositivo), onde a pressão fluidica é utilizada para aplicar compressão ao esferoide tumoral. Observe que a pressão do fluido é utilizada para evitar bolhas de ar no dispositivo de PDMS. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 2: Curva de calibração para o dispositivo microfluídico de compressão mostrando a relação entre o deslocamento do pistão (, µm) e a pressão aplicada à câmara de controle de pressão (KPa). As medições experimentais são representadas por pontos, enquanto a linha contínua corresponde à simulação COMSOL. As barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM) a partir de oito medições experimentais independentes, mas são pequenas demais para serem visíveis. Esta figura é reproduzida de Suh et al.15 com permissão da Royal Society of Chemistry. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar 1: Empilhamento Z em X-Y de um esferoide MCF-7 marcado com GFP antes da compressão. O esferoide foi incorporado em colágeno a 1,5 mg/mL dentro do dispositivo microfluídico de compressão e imageado utilizando o canal de fluorescência GFP com um passo Z de 1 µm. Em seguida, o ImageJ foi utilizado para realçar o contraste. Barra de escala = 50 µm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar 2: Uma deformação compressiva de 50% (Δh/h = 50%) foi então aplicada ao esferoide de MCF-7 marcado com GFP embutido em colágeno a 1,5 mg/mL. Após a compressão, foi adquirida uma pilha Z em X–Y no canal de fluorescência GFP usando um tamanho de passo de 1 µm e processada no ImageJ para realçar o contraste. Barra de escala = 50 µm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Este método descreve o uso de um dispositivo microfluídico de compressão para investigar os efeitos do estresse compressivo sobre as interações tumor-imunes. Esse sistema é capaz de aplicar compressão mecânica controlada a esferoides tumorais embutidos em uma matriz tridimensional de colágeno. O substrato de vidro que forma a base da câmara celular (L1) permite a aquisição de imagens de células vivas com alta resolução, tornando a plataforma adequada para estudos que visam quantificar a motilidade, infiltração e atividade citotóxica de células imunes. Importante ressaltar que o sistema preserva as interações célula-célula e célula-matriz, ao mesmo tempo que permite controle preciso do ambiente mecânico. Em contraste, muitas abordagens experimentais existentes para o estudo do estresse compressivo exigem um compromisso entre interações celulares mediadas pela MEC9,13 e o imageamento de alta resolução14.
No presente estudo, células NK e esferoides tumorais de mama MCF-7 foram utilizadas como um sistema modelo. No entanto, o dispositivo microfluídico de compressão não se limita a esses tipos celulares. Até o momento, a plataforma foi aplicada com sucesso a diversos modelos de células mamárias, incluindo esferoides tumorais de mama MDA-MB-231 e esferoides mamários MCF-10A15,17. A plataforma pode ser facilmente adaptada para investigar interações tumor-imunes em uma variedade de outros modelos tumorais, incluindo esferoides tumorais cerebrais e pulmonares. Da mesma forma, a plataforma é compatível com uma ampla gama de populações de células imunes além das células NK, permitindo investigações sobre diversas interações tumor-imunes sob compressão mecânica. Além disso, o dispositivo não se restringe a estudos baseados em esferoides e pode ser adaptado para experimentos com células isoladas. Em conjunto, essas características tornam a plataforma uma ferramenta versátil para examinar como forças mecânicas regulam o comportamento celular em uma ampla gama de contextos biológicos e de doenças.
Outra vantagem deste sistema é o controle preciso sobre a magnitude e o padrão de compressão aplicados às amostras. No presente estudo, uma deformação compressiva estática de 50% foi aplicada durante toda a duração do experimento. No entanto, o nível de deformação pode ser facilmente modificado conforme o objetivo experimental. Além disso, pode-se aplicar compressão dinâmica com diferentes formas de onda, incluindo ondas quadradas e senoidais, aos esferoides utilizando o sistema externo de controle de pressão. A compressão em onda quadrada envolve intervalos alternados de compressão e liberação17, enquanto a compressão senoidal envolve aumentos e diminuições graduais da compressão ao longo do tempo15. Essas capacidades, quando combinadas com imagem quantitativa e modelagem preditiva, podem ser utilizadas para estudar a influência da compressão dinâmica na eficiência de eliminação imune.
Observamos que este dispositivo de compressão foi originalmente desenvolvido para caracterizar as propriedades mecânicas de tumores17. Ao incorporar um sensor de força in situ e uma camada de gel de poliacrilamida (PAA) sob o esferoide tumoral, as propriedades mecânicas do esferoide, como rigidez e viscoelasticidade, podem ser caracterizadas quantitativamente15,17. Essa modificação amplia a utilidade da plataforma além da modelagem de estresse compressivo, incluindo a medição direta do comportamento mecânico do tumor.
No geral, o dispositivo microfluídico de compressão possui uma ampla gama de aplicações, desde a medição das propriedades mecânicas de esferoides até a investigação de interações tumor-imunes em um ambiente com modulação mecânica. No entanto, existem várias etapas críticas necessárias para o funcionamento bem-sucedido do dispositivo. Os esferoides tumorais devem ser posicionados próximo ao centro de cada poço para garantir uma compressão uniforme. A unidade de controle de pressão deve ser corretamente alinhada com a camada da câmara celular (L1) para assegurar a transmissão precisa da pressão. Bolhas de ar podem ser introduzidas quando a unidade de controle de pressão é colocada sobre a L1, o que pode afetar negativamente a qualidade da imagem e os resultados experimentais. Para prevenir esse problema, deve-se ter cuidado para evitar a introdução de bolhas durante o carregamento da mistura de colágeno, e 8 µL da mistura de colágeno devem ser adicionados a cada poço, preenchendo ligeiramente em excesso a câmara antes da colocação da unidade de controle de pressão. Isso ajuda a garantir o contato completo entre as camadas e reduz a probabilidade de aprisionamento de ar.
Em conclusão, este dispositivo permite a modelagem controlada de estresse compressivo dentro de uma matriz tridimensional de colágeno fisiologicamente relevante, que suporta interações entre tumor e sistema imunológico. Esta plataforma fornece uma ferramenta para investigar como forças mecânicas estáticas e dinâmicas regulam a eliminação mediada pelo sistema imunológico e o comportamento tumoral no microambiente tumoral. Atualmente, estamos identificando o mecanismo molecular que subjaz à modulação mecânica da eliminação imunológica de células tumorais. Esses estudos podem levar à descoberta de novos alvos terapêuticos potenciais para fármacos.
Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho é financiado por uma bolsa do National Cancer Institute (Grant R01CA221346), pela Lance R. Collins Fellowship do College of Engineering da Cornell University concedida a FM e pelo Cornell Provost’s Fund for Research Resilience concedido a FM. Este trabalho foi realizado em parte na Cornell NanoScale Facility, membro da National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), que é apoiada pela National Science Foundation (Grant NNCI-2025233).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 N NaOH | Sigma-Aldrich | 79724 | 7 µL |
| Meio M199 10× | Sigma-Aldrich | M0650 | 200 µL |
| 2-mercaptoetanol | ThermoFisher | 313500100 | |
| Compressor de ar | Elveflow | Jun-Air Model 3 Compressor | |
| Estágio microscópico automático X-Y | Applied Scientific Instrumentation | MS-2000 | |
| Câmera CCD | Hamamtsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Soro bovino fetal (FBS) | GeminiBio | S11150 | |
| Tubo de entrega de fluido | Eleveflow | PTFE tubing spare roll | Diâmetro externo de 1/16 in |
| Fonte de luz de fluorescência | Excelitas Technologies | X-Cite series 120 PC unit | |
| Ácido fólico | Sigma | F7876 | |
| Glutaraldeído | EM Sciences | 16019 | 0,10% |
| Limpeza de plasma Harrick | Harrick Plasma | PDC-001-HP | Configuração de alta potência (45 W) |
| Soro de cavalo (HS) | ThermoFisher | 16050-122 | |
| Microscópio invertido com epifluorescência | Olympus | IX81 | Lente objetiva de 20x (NA = 0,25), operado com o software Olympus CellSens |
| Máscara | Artus | 10 Sheet Aluminum Shim Stock | Espessura de 0,0125" (0,75 mm) |
| Linhagem celular estável MCF-7/GFP (Puromicina) | GenTarget Inc | SC050-G | |
| Quadro metálico | Custom made | Custom made | |
| Reservatório microfluídico | Eleveflow | 50 mL microfluidic reservoir | |
| Microscópio | Olympus | CKX41 | Lente objetiva de 4x (NA = 0,1) |
| Mio-inositol | Sigma | I7508 | |
| NK-92 MI | ATCC | CRL-2407 | |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | ThermoFisher | 10010072 | |
| Tubo pneumático | Eleveflow | PUR polyether clear pipe input | Diâmetro externo de 4" mm |
| Polietilenimina (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | 1% |
| Controlador de pressão | Elveflow | OB1 NK4 | Operado com o software Elveflow Smart Interface |
| Colágeno tipo I de cauda de rato | Corning | 354249 | 31,3 µL de colágeno estoque a 9,6 mg/mL |
| Parafusos | Phillips | M2,5 Pan-head | 12 parafusos |
| Incubadora de estágio | Precision Plastic | Custom made | |
| Seringa | Becton Dickinson | 303134 | Emparelhada com um conector luer macho com trava integral para barbela de 3/32" OD da Eleveflow |
| Meio α-MEM | ThermoFisher | 12561056 |
Referências
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Reimpressões e permissões
