Uma Plataforma Microfluídica para Estudar os Papéis da Compressão Mecânica nas Interações entre Células Tumorais e Imunes em uma Matriz Extracelular 3D

Resumo

Apresentamos um protocolo para utilizar uma plataforma microfluídica no modelamento de interações tumor-imunes em um ambiente tridimensional (3D). Nossos resultados revelaram que as células Natural Killer (NK) mantiveram sua atividade antitumoral sob compressão mecânica.

Resumo

As forças mecânicas influenciam significativamente a capacidade das células imunes de matar células tumorais no contexto da imunoterapia baseada em células. Para eliminar células tumorais, as células imunes precisam exercer forças sobre a célula-alvo e formar uma sinapse imune, por meio da qual moléculas citotóxicas — incluindo a granzima B — são entregues. Apesar de sua importância, ainda se compreende pouco sobre como os estímulos mecânicos podem ser aproveitados para potencializar a eliminação mediada pelo sistema imune. Essa lacuna de conhecimento é parcialmente decorrente da falta de ferramentas capazes de fornecer estresse mecânico bem controlado aos cultivos celulares em um ambiente fisiologicamente realista. Aqui, descrevemos um dispositivo microfluídico de compressão que pode aplicar compressão estática ou dinâmica a esferoides tumorais embutidos em matriz extracelular (ECM), permitindo ao mesmo tempo a imagem em tempo real das interações tumor-imunes por meio de microscopia óptica.

A plataforma microfluídica é composta por 12 compartimentos (6 de controle e 6 funcionais). Cada compartimento contém uma câmara celular posicionada diretamente sob a unidade de controle de pressão. Esferoides incorporados na MEC são colocados dentro da câmara celular. Utilizando esta plataforma, investigamos a eficiência de morte mediada por células Natural Killer (NK) contra esferoides tumorais de mama (MCF-7) sob compressão mecânica definida. Os resultados mostraram que as células NK permaneceram os principais responsáveis pela morte dos esferoides tumorais, independentemente da compressão mecânica em colágeno a 1,5 mg/mL. Portanto, sugere-se que as células NK podem manter sua atividade antitumoral sob estresse compressivo. Esses achados demonstram a utilidade dessa plataforma para investigar o papel das forças mecânicas nas interações tumor-imunes. Estudos em andamento estão identificando os mecanismos moleculares que permitem às células imunes se adaptar ao estresse compressivo. Os conhecimentos obtidos a partir desses estudos podem revelar uma via terapêutica promissora.

Introdução

A imunoterapia contra o câncer baseada em células é uma abordagem terapêutica que utiliza células imunes para direcionar células cancerosas¹. Essa estratégia demonstrou sucesso notável no tratamento de cânceres sanguíneos^2,3,4. No entanto, o nível de sucesso observado nos cânceres sanguíneos ainda não foi totalmente traduzido para o tratamento de tumores sólidos^5,6,7. Uma das principais razões para essa limitação é o microambiente tumoral imunossupressor (TME) específico dos tumores sólidos.

O ME é caracterizado por sinais mecânicos distintos que podem regular o comportamento celular. A eliminação eficaz de células tumorais por células imunes exige que elas exerçam forças sobre as células-alvo e estabeleçam uma sinapse imune através da qual moléculas citotóxicas são entregues⁸. Portanto, compreender como as forças mecânicas influenciam a função das células imunes pode revelar novas estratégias terapêuticas para melhorar a eficácia das imunoterapias baseadas em células contra tumores sólidos.

Uma característica mecânica definidora do microambiente tumoral (TME) sólido é a tensão compressiva que o microambiente tumoral impõe ao tumor em crescimento^9,10. Até o momento, a maioria dos estudos sobre compressão tem se concentrado nos efeitos sobre o comportamento das células tumorais^10,11. Apenas recentemente a atenção passou a se voltar para a compreensão de como a compressão influencia as células imunes dentro do TME¹². Como resultado, os mecanismos pelos quais a tensão compressiva afeta a migração das células Natural Killer (NK), a formação da sinapse imune e a atividade citotóxica permanecem pouco compreendidos e insuficientemente quantificados. Essa lacuna representa uma limitação crítica em nosso entendimento sobre como os sinais mecânicos dentro do TME podem ser aproveitados para melhorar o direcionamento imune de tumores sólidos.

Uma grande barreira para abordar essa questão é a falta de plataformas experimentais capazes de aplicar compressão controlada e quantificável em microambientes tridimensionais fisiologicamente relevantes, ao mesmo tempo em que permitem a imagem em tempo real das interações entre tumor e sistema imunológico. As primeiras abordagens experimentais para estudar o estresse compressivo envolviam a incorporação de esferoides em géis de agarose¹³. Embora este método tenha capturado efetivamente o confinamento físico, ele eliminou as interações nativas entre matriz extracelular (ECM) e células. Dolega et al. aplicaram pressão osmótica para induzir estresse compressivo; no entanto, os esferoides foram mantidos em suspensão no meio de cultura e, portanto, permaneceram desprovidos de interações com a ECM⁹. Pandey et al. utilizaram um inserto tipo transwell e pesos para comprimir esferoides incorporados em colágeno, o que preservou as interações entre ECM e células, mas limitou a imagem de alta resolução necessária para quantificar a motilidade das células imunes e sua atividade citotóxica¹⁴. Em conjunto, essas limitações destacam a necessidade de plataformas experimentais que permitam a imagem em tempo real das respostas morfológicas das células à compressão dentro do microambiente tumoral (TME).

Aqui, apresentamos um protocolo para um dispositivo microfluídico de compressão¹⁵ que permite a aplicação controlada de tensão compressiva, mantendo interações fisiologicamente relevantes entre a matriz extracelular e as células, além de possibilitar a imagem de células vivas com alta resolução das dinâmicas imune-tumorais. O protocolo consiste na preparação dos componentes do dispositivo (Seção 1), montagem do dispositivo (Seção 2) e na aquisição de imagens das interações tumor-imunes (Seção 3). Demonstramos o fluxo de trabalho utilizando um ensaio de citotoxicidade por células NK contra esferoides tumorais marcados com proteína verde fluorescente (GFP). Além dessa aplicação, a plataforma pode ser facilmente adaptada para investigar os efeitos de forças mecânicas sobre uma ampla variedade de tipos celulares e interações celulares em microambientes tridimensionais.

Protocolo

1. Preparação dos componentes do dispositivo

1. Ativação da superfície da câmara de carregamento da amostra
   1. Coloque uma máscara sobre a câmara de carregamento da amostra (Camada 1, C1) de modo que apenas os poços fiquem expostos.
   2. Exponha a camada 1 mascarada ao plasma de oxigênio por 15 s usando a configuração de alta potência (45 W).
   3. Coloque a Camada 1 em uma placa de Petri e, em seguida, prossiga com os seguintes passos em uma cabine de segurança biológica.
   4. Trate cada poço com 10 µL de PEI (polietilenimina) a 1% por 10 min.
   5. Remova o PEI das cavidades por aspiração a vácuo a partir dos quatro cantos de cada cavidade para evitar arranhar a superfície de vidro.
   6. Lave as cavidades com 10 µL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), em seguida remova a solução por aspiração a vácuo pela lateral.
   7. Trate os poços com 10 µL de glutaraldeído 0,1% por 30 min, depois remova o glutaraldeído por aspiração a vácuo a partir dos cantos.
   8. Lave as cavidades com PBS três vezes, removendo o lavado dos cantos após cada lavagem.
   9. Envolva a placa de Petri contendo a Camada 1 com papel alumínio e deixe-a no gabinete de segurança biológica durante a noite.
2. Esterilização da estrutura metálica
   1. Submergir o disco de 38 mm × Estrutura metálica de 88 mm e os doze parafusos cabeça redonda M2.5 em etanol 70% durante a noite.
3. Priming da unidade de controle de pressão
   1. Expor a unidade de controle de pressão ao plasma de oxigênio por 30 s utilizando a configuração de alta potência (45 W).
   2. Mergulhe a unidade de controle de pressão, com as características voltadas para baixo, em água desionizada (DI) durante a noite para preencher os canais e as câmaras da unidade de controle de pressão.
   3. No dia seguinte, remova a unidade de controle de pressão da água deionizada na qual estava submersa.
   4. Preencha um reservatório microfluídico com 50 mL de água desionizada.
      OBSERVAÇÃO: O reservatório microfluídico consiste em um tubo cônico de 50 mL equipado com uma tampa personalizada contendo duas conexões para tubos: uma linha de tubo pneumático e uma linha de tubo para entrega de fluido.
   5. Conecte uma seringa cheia de ar à linha de tubo pneumático.
   6. Pressione lentamente o êmbolo da seringa para pressurizar o reservatório e forçar a água desionizada a passar pela tubulação de entrega de fluido até que a tubulação esteja completamente cheia e a água comece a gotejar pela extremidade do tubo.
   7. Conecte o tubo de entrega de fluido pré-cheio e escorrendo ao manifold de policarbonato e, em seguida, à entrada de 1,5 mm localizada na parte traseira da unidade de controle de pressão.
   8. Deixe a unidade de controle de pressão e o conjunto do coletor secarem ao ar por 2 h. Após secagem completa, a unidade de controle de pressão e o conjunto do coletor estão prontos para o próximo passo.

2. Montagem do dispositivo

1. Preparação do colágeno com células incorporadas
   1. Remova e seque o quadro metálico e os parafusos do etanol a 70%.
   2. No gabinete de segurança biológica, coloque três microtubos de 600 µL sobre gelo. Rotule os tubos da seguinte forma: "N" (neutralização), "sp" (esferoides de MCF-7) e "sp+NK" (esferoides de MCF-7 com células NK).
   3. Prepare a mistura de neutralização adicionando 10× o volume necessário de Meio 199 (M199) e hidróxido de sódio (NaOH) ao tubo "N".
   4. Transfira o volume apropriado da mistura M199:NaOH para os tubos "sp" e "sp+NK" para obter uma concentração final de 1×.
   5. Recupere os esferoides tumorais e centrifugue a 141 × g por 3 min para permitir que os esferoides sedimentem no fundo do tubo.
      NOTA: Esferoides tumorais com aproximadamente 200 µm de diâmetro foram gerados utilizando uma plataforma de micropoços de agarose descrita previamente¹⁶. Resumidamente, 3 × 10⁶ células MCF-7 foram semeadas em uma matriz de micropoços de agarose de 36 × 36, composta por poços de 200 µm de diâmetro e 200 µm de profundidade, e então cultivadas por 7 dias para produzir os esferoides tumorais utilizados nos experimentos.
   6. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os esferoides em 200 µL de meio completo 50:50 MCF-7/NK (Tabela 1 e Tabela 2).
   7. Recolha as células NK em um tubo cônico de 50 mL, centrifugue a 141 × g por 4 min e conte as células.
      NOTA: A viabilidade das células NK deve ser >85% no dia do experimento.
   8. Ressuspenda o pellet resultante em 200 µL de meio completo para células NK.
   9. Adicione o volume apropriado da solução estoque de colágeno a cada tubo microcentrífugo.
   10. Adicione o volume apropriado da suspensão celular a cada tubo para obter um volume final de 200 µL contendo colágeno a 1,5 mg/mL.
       NOTA: A suspensão "sp" contém apenas esferoides tumorais, enquanto a suspensão "sp+NK" contém esferoides tumorais e 1,5 × 10⁶ células NK.
   11. Misture suavemente por pipetagem para garantir uma distribuição homogênea de células e colágeno, minimizando a formação de bolhas.
2. Montagem do dispositivo e carregamento celular
   1. Coloque a Camada 1 dentro do quadro metálico seco.
   2. Carregue 9 µL da mistura de colágeno em cada poço.
   3. Alinhe a unidade de controle de pressão e o conjunto do manifold com as câmaras celulares na Camada 1 utilizando um microscópio.
   4. Insira os parafusos secos através do manifold e no quadro metálico, fixando a unidade de controle de pressão e a Camada 1 entre o manifold e o quadro metálico.
   5. Coloque o dispositivo montado em um incubador a 37 °C e 5% CO₂ por 45 min para permitir a polimerização do colágeno.
   6. Adicione meio completo de cultura celular 50:50 MCF-7/NK através dos quatro portos de meio.

3. Imagem das interações tumor-imunes

1. Coloque o dispositivo montado dentro do incubador de estágio acoplado a um microscópio invertido de epifluorescência para a aquisição de imagens de células vivas.
   NOTA: O incubador de estágio manteve uma temperatura de 37 °C e uma umidade de aproximadamente 50% durante todo o período de aquisição de imagens.
2. Coloque uma caixa de proteção secundária sobre o dispositivo montado para manter o ambiente interno a 37 °C, umidade de 100% e 5% de CO₂ ao longo do período de aquisição de imagens.
3. Conecte o dispositivo ao controlador de pressão utilizando o tubo pneumático.
4. Adquira imagens de campo claro e GFP dos esferoides tumorais antes de aplicar compressão, a fim de permitir a avaliação da deformação dos esferoides após a compressão.
5. Aplique uma pressão constante de 120 mbar durante todo o período de aquisição de imagens.
   NOTA: O software do controlador de pressão permite ao usuário definir o perfil e a magnitude da pressão aplicada durante o experimento. A Figura Suplementar 1 contém um esquema do sistema de controle de pressão.
6. Inicie a aquisição de imagens em lapso de tempo adquirindo imagens de campo claro e GFP a cada 10 minutos durante 18 h.
   NOTA: As imagens foram adquiridas no plano Z central de cada esferoide tumoral utilizando uma objetiva de 20× em um microscópio invertido de epifluorescência. As imagens de campo claro e de fluorescência GFP foram capturadas com tempos de exposição de 200,1 ms e 298,9 ms, respectivamente.

Resultados

Para os experimentos a seguir, um dispositivo microfluídico de compressão¹⁵ foi utilizado para modelar interações tumor-imunes dentro de um microambiente tridimensional fisiologicamente relevante e, ao mesmo tempo, pode aplicar compressões estáticas e dinâmicas a esferoides tumorais (Figura 1). Os componentes do dispositivo (Figura 1A1) e sua ordem de montagem (Figura 1A2) sã...

Discussão

Este método descreve o uso de um dispositivo microfluídico de compressão para investigar os efeitos do estresse compressivo sobre as interações tumor-imunes. Esse sistema é capaz de aplicar compressão mecânica controlada a esferoides tumorais embutidos em uma matriz tridimensional de colágeno. O substrato de vidro que forma a base da câmara celular (L1) permite a aquisição de imagens de células vivas com alta resolução, tornando a plataforma adequada para estudos que visam quantificar a motilidade, infiltração e atividad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 N NaOH	Sigma-Aldrich	79724	7 µL
Meio M199 10×	Sigma-Aldrich	M0650	200 µL
2-mercaptoetanol	ThermoFisher	313500100
Compressor de ar	Elveflow	Jun-Air Model 3 Compressor
Estágio microscópico automático X-Y	Applied Scientific Instrumentation	MS-2000
Câmera CCD	Hamamtsu Photonics	ORCA-R2
Soro bovino fetal (FBS)	GeminiBio	S11150
Tubo de entrega de fluido	Eleveflow	PTFE tubing spare roll	Diâmetro externo de 1/16 in
Fonte de luz de fluorescência	Excelitas Technologies	X-Cite series 120 PC unit
Ácido fólico	Sigma	F7876
Glutaraldeído	EM Sciences	16019	0,10%
Limpeza de plasma Harrick	Harrick Plasma	PDC-001-HP	Configuração de alta potência (45 W)
Soro de cavalo (HS)	ThermoFisher	16050-122
Microscópio invertido com epifluorescência	Olympus	IX81	Lente objetiva de 20x (NA = 0,25), operado com o software Olympus CellSens
Máscara	Artus	10 Sheet Aluminum Shim Stock	Espessura de 0,0125" (0,75 mm)
Linhagem celular estável MCF-7/GFP (Puromicina)	GenTarget Inc	SC050-G
Quadro metálico	Custom made	Custom made
Reservatório microfluídico	Eleveflow	50 mL microfluidic reservoir
Microscópio	Olympus	CKX41	Lente objetiva de 4x              (NA = 0,1)
Mio-inositol	Sigma	I7508
NK-92 MI	ATCC	CRL-2407
Penicilina/estreptomicina	Gibco	15140122
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	ThermoFisher	10010072
Tubo pneumático	Eleveflow	PUR polyether clear pipe input	Diâmetro externo de 4" mm
Polietilenimina (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	1%
Controlador de pressão	Elveflow	OB1 NK4	Operado com o software Elveflow Smart Interface
Colágeno tipo I de cauda de rato	Corning	354249	31,3 µL de colágeno estoque a 9,6 mg/mL
Parafusos	Phillips	M2,5 Pan-head	12 parafusos
Incubadora de estágio	Precision Plastic	Custom made
Seringa	Becton Dickinson	303134	Emparelhada com um conector luer macho com trava integral para barbela de 3/32" OD da Eleveflow
Meio α-MEM	ThermoFisher	12561056