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Métodos Otimizados para Investigar a Expressão de Proteínas e Transcritos Desenvolvimentais em Embriões de Camundongo Inteiros

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11 de setembro de 2026

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1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Cellular Imaging Core Facility, Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford

Neste artigo

Resumo

Modelos de camundongos são fundamentais para avançar nosso entendimento do desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos um protocolo para coloração de proteínas e transcritos em embriões de camundongo inteiros e fixados, e como analisar quantitativamente a coloração resultante em três dimensões. Essas técnicas permitem a visualização e análise de tipos celulares e processos de desenvolvimento essenciais.

Resumo

Modelos de camundongos têm sido fundamentais para o avanço do entendimento do desenvolvimento embrionário. Analisar a expressão e a localização de proteínas e transcritos dentro de embriões é essencial para elucidar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento e às doenças. No entanto, as técnicas tradicionais utilizadas para analisar transcritos e proteínas em embriões de camundongo apresentam limitações. A hibridização in situ de RNA permite a coloração em montagem inteira de transcritos, mas não possui capacidade de multiplexação. Por outro lado, o corte em seções de embriões permite a coloração de múltiplos alvos, mas apenas em duas dimensões (2D). Mais recentemente, técnicas como o RNAscope e a coloração por imunofluorescência têm sido aplicadas a embriões em montagem inteira, permitindo a multiplexação de alvos em três dimensões (3D). Esses métodos possibilitam o mapeamento de interações, vias e tipos celulares fundamentais para o desenvolvimento embrionário, sem as limitações das técnicas tradicionais.

Aqui descrevemos métodos otimizados para coloração em montagem inteira de embriões de camundongo fixados no dia embrionário (E) 8,5 e E9,5, utilizando RNAscope ou imunofluorescência. Ambos permitem a detecção multiplexada de até 4 alvos simultaneamente em um único embrião. Também fornecemos um método para combinar a coloração por imunofluorescência com RNAscope no mesmo embrião, a fim de visualizar a interação entre proteínas e transcritos durante o desenvolvimento. Além disso, descrevemos um fluxo de trabalho para imagem confocal e análise tridimensional da expressão dos alvos em todo o embrião e em tipos celulares desenvolvimentais definidos, utilizando o software Zeiss Arivis Pro. Juntos, esses métodos permitem uma análise abrangente de alvos multiplexados de proteínas e transcritos em 3D, fornecendo um sistema poderoso para dissecar interações celulares e moleculares na embriogênese inicial e intermediária.

Introdução

Modelos de camundongos têm sido fundamentais para o avanço da biologia do desenvolvimento, permitindo a compreensão de processos desenvolvimentais relevantes para os humanos in vivo, devido à homologia entre o desenvolvimento de camundongos e humanos e à capacidade de modular a expressão gênica por meio de técnicas-chave como Cre-LoxP ou CRISPR/Cas91,2. Cerca de 90% das regiões genômicas são conservadas entre camundongos e humanos3, e ambos compartilham muitos processos desenvolvimentais. Por exemplo, camundongos e humanos seguem uma cronologia semelhante de embriogênese, incluindo a formação de um zigoto que progride para um blastocisto, seguido por implantação e gastrulação4. Além disso, o desenvolvimento da maioria dos órgãos é semelhante entre camundongos e humanos. Por exemplo, tanto o coração humano quanto o de camundongo seguem uma sequência semelhante de dobramento cardíaco, septação dos átrios e ventrículos, formação das válvulas e formação do trato de saída, resultando em um coração com quatro câmaras5. Assim, os corações em desenvolvimento e completamente formados de camundongos e humanos apresentam significativa semelhança estrutural6,7.

Para investigar os processos que ocorrem no desenvolvimento normal e patológico, foram desenvolvidas múltiplas técnicas, permitindo a visualização espacial de proteínas e transcritos-chave. Tais técnicas incluem coloração por imunofluorescência e hibridização in situ de RNA.

A hibridização in situ de RNA foi descrita pela primeira vez por Gall e Pardue8 e por John, Brinstall e Jones, em 19699, e por Buongiorno-Nardelli e Amaldi10 em 1970. É utilizada para analisar a expressão de transcritos em tecidos8. Resumidamente, sondas contendo uma sequência complementar de RNA ao alvo desejado são selecionadas e marcadas com indicadores para detecção. Tais marcadores incluem rótulos radioativos, biotina ou digoxigenina. Amostras fixadas são permeabilizadas para permitir a penetração da sonda, e então a sonda é hibridizada ao tecido. Os tecidos podem então ser diretamente imageados, se marcados radioativamente, ou os marcadores podem ser visualizados utilizando anticorpos conjugados à fosfatase alcalina ou a um corante fluorescente. A hibridização in situ de RNA apresenta a vantagem de poder corar amostras inteiras para localização tridimensional11. No entanto, geralmente é limitada pela incapacidade de multiplexação para mais de dois alvos, a menos que sejam utilizadas técnicas otimizadas com aplicações muito específicas, ou que se utilize hibridização de DNA, como no caso do M-FISH, que é usado para marcação fluorescente de cromossomos12,13.

A imunofluorescência, inicialmente desenvolvida em 1941 por Coons et al.14,15, é um método de detecção de proteínas-alvo em amostras fixadas ou congeladas. Resumidamente, as amostras são bloqueadas para reduzir a ligação não específica a áreas não alvo do tecido. Em seguida, um anticorpo primário específico para um antígeno-alvo é incubado com as amostras. Os anticorpos primários podem ser diretamente conjugados a um corante ou proteína fluorescente ou podem ser, por sua vez, alvo de um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo, que reconhece a espécie na qual o anticorpo primário foi produzido. A vantagem do uso de anticorpos secundários em vez de anticorpos primários diretamente conjugados é que o sinal é amplificado, resultando em maior sensibilidade. Múltiplos anticorpos primários produzidos em espécies diferentes podem ser utilizados para detecção multiplexada de alvos, empregando anticorpos diretamente conjugados ou anticorpos secundários conjugados a fluoróforos com diferentes espectros de excitação e emissão.

Técnicas tradicionais, como hibridização in situ de RNA e imunofluorescência, são limitadas. Normalmente, a hibridização in situ de RNA permite apenas a detecção de um único alvo em uma amostra, o que restringe extremamente a análise de interações entre diferentes tipos celulares e vias. Além disso, a imunofluorescência é tradicionalmente realizada em cortes de tecido e não em preparações inteiras (whole-mount), limitando a resolução espacial a duas dimensões (2D). Técnicas mais recentes têm se concentrado na detecção multiplexa de alvos em sistemas tridimensionais (3D). A otimização de protocolos de imunofluorescência permitiu o uso dessa técnica em preparações inteiras16. Além disso, foram desenvolvidas técnicas capazes de detectar múltiplos transcritos utilizando sondas marcadas com fluoróforos, de maneira semelhante à imunofluorescência.

O RNAscope foi descrito pela primeira vez em 2012 por Wang et al. Baseia-se na tecnologia de hibridização in situ de RNA17, que permite a identificação espacial de transcritos em amostras fixadas. Resumidamente, amostras fixadas são permeabilizadas, permitindo a infiltração de sondas-alvo que se ligam a sequências complementares dos transcritos. As sondas do RNAscope possuem um "desenho duplo-Z" composto por uma região específica de uma sequência de 18 a 25 pares de bases do RNA-alvo, uma região terminal contendo 14 pares de bases e uma região espaçadora que liga dois "Z probes" entre si. As duas regiões terminais juntas formam uma região de 28 pb à qual se liga um pré-amplificador. Os pares de Z probes ligados são então amplificados por meio da ligação de uma sequência de amplificadores que se ligam aos sítios no pré-amplificador. Os amplificadores podem ser especificamente direcionados utilizando sondas marcadas com marcadores fluorescentes ou peroxidase de rábano (HRP). A ideia do desenho duplo-Z das sondas é impedir a amplificação de sondas não ligadas, reduzindo a amplificação não específica, enquanto o uso de múltiplos amplificadores visa aumentar a sensibilidade. A vantagem do RNAscope em relação à hibridização in situ de RNA é a capacidade de multiplexar a detecção de transcritos em uma única amostra por meio do uso de marcadores fluorescentes distintos para cada alvo. O RNAscope tem sido amplamente utilizado em cortes de amostras fixadas em formalina e emblocadas em parafina, permitindo a detecção espacial de transcritos em 2D18. Estudos mais recentes descreveram a coloração de RNAscope em montagem inteira em embriões de camundongo, permitindo a análise tridimensional de processos de desenvolvimento essenciais19.

Aqui, descrevemos métodos otimizados para coloração de embriões de camundongo fixados em E8,5 e E9,5 em montagem inteira, utilizando tanto hibridização in situ por RNAscope quanto imunofluorescência. Este protocolo descreve um método revisado para combinar imunofluorescência e RNAscope, eficaz para embriões em montagem inteira em E8,5/E9,5, que permite adicionar um canal adicional à coloração por RNAscope em montagem inteira mediante a inclusão de um quarto sonda do RNAscope combinada com o fluoróforo Opal 780, além de detalhar um método amplamente aplicável para análise de embriões corados. Esses métodos podem ser utilizados para avançar ainda mais o conhecimento sobre processos de desenvolvimento essenciais, como migração celular e vias de sinalização, permitindo a visualização multiplexada de até quatro alvos proteicos e transcritos por meio de coloração por imunofluorescência e RNAscope, bem como análise quantitativa tridimensional em embriões de camundongo em montagem inteira em E8,5/E9,5 durante o desenvolvimento.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) do Reino Unido de 1986 e aprovados pelo comitê de bem-estar animal da Universidade de Oxford e pelo Home Office (licença de projeto PP7967396).

1. Dissecção, desidratação e armazenamento de embriões de camundongo E8,5 e E9,5

  1. Eliminar fêmeas prenhes utilizando um método aprovado na gestação E8.5 ou E9.5.
    NOTA: Os camundongos neste estudo foram eliminados por dislocação cervical seguida pela confirmação da morte por exsanguinação. A exsanguinação é realizada fazendo uma incisão nos ventrículos, facilitando o sangramento. Outros métodos, como inalação de CO2, podem ser utilizados, mas não foram testados neste protocolo.
  2. Abra o abdômen primeiro cortando a pele, depois a parede abdominal.
    NOTA: Limpe os camundongos com etanol 70% para reduzir a descamação e contaminação bacteriana. Ao abrir a parede abdominal, é importante puxar a parede para longe do abdômen e, em seguida, fazer uma pequena incisão. Corte a parede abdominal em formato de V, evitando cortar acidentalmente o útero.
  3. Remova o útero cortando o local onde ele se encontra com a vagina. Para ambos os cornos uterinos, corte o útero longe da gordura abdominal, fazendo pequenas excisões até alcançar o ovário.
    NOTA: É útil anotar a posição de cada embrião dentro do útero. Disseque o ovário junto com o útero para ajudar a manter a orientação.
  4. Seccione individualmente um único embrião do corno uterino, dentro do útero circundante, e coloque-o em uma placa contendo solução salina básica de Hanks 1× com 5 mM de EDTA.
  5. Usando pinças finas, remova cuidadosamente o útero do embrião, placenta e decidua materna que as envolve.
  6. Identifique onde a placenta se encontra com a parte da decidua materna que envolve o embrião; deve haver uma ligeira diferença de cor entre essas duas regiões. Separe cuidadosamente o embrião cortando através da decidua materna para desconectar a placenta e revelar o embrião.
  7. Libere suavemente o embrião dentro do seu saco vitelino a partir do tecido remanescente. Usando pinças finas, remova o saco vitelino que envolve o embrião. Remova o âmnio. Conte os somitos para determinar exatamente o estágio embrionário.
    NOTA: O saco vitelino envolve o embrião e é mais espesso e opaco. O âmnio é fino, transparente e adere firmemente ao embrião. É necessário removê-lo cuidadosamente para garantir a penetração de sondas/anticorpos em etapas subsequentes. Em embriões mais velhos, pode-se fazer um pequeno furo na cabeça com pinças finas para evitar o aprisionamento da sonda nos ventrículos cerebrais em desenvolvimento. Neste ponto, é importante remover o máximo possível do saco vitelino. O saco vitelino remanescente apresenta forte fluorescência quando são usados anticorpos secundários anti-murinos.
  8. Opcional: Armazene o saco vitelino para genotipagem lavando-o em 500 µL de PBS ou etanol 70%, conforme o método de genotipagem subsequente, em um tubo Eppendorf de 1,5 mL para remover sangue contaminante. Segure o saco vitelino no PBS usando pinças finas e agite manualmente. Transfira o saco vitelino lavado para um tubo Eppendorf de 1,5 mL limpo ou placa de genotipagem. Armazene por até 4 semanas a -20 °C ou prossiga para a técnica de extração de DNA de preferência.
  9. Usando uma pipeta Pasteur de polietileno de baixa densidade (LDPE) de 2 mL, pipete suavemente o embrião e transfira-o para um tubo Eppendorf redondo de 2 mL contendo 1 mL de paraformaldeído (PFA) a 4%, recém-preparado ou estoque congelado, tomando cuidado para adicionar o mínimo de meio de dissecação ao PFA.
    NOTA: Ao dissecar embriões E9.5, corte a ponta da pipeta Pasteur em ângulo para aumentar o tamanho da abertura. Isso é importante para evitar danos ao embrião durante a pipetagem. O uso de tubos Eppendorf redondos de 2 mL é essencial para evitar que o embrião fique preso no fundo do tubo e permitir recuperação mais fácil. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento do PFA.
    CAUTION: O PFA é tóxico e carcinogênico. Use equipamento de proteção individual (EPI) apropriado e não inale nem ingira. O PFA em pó é perigoso se inalado; portanto, deve ser preparado em capela de exaustão.
  10. Incube o embrião em PFA a 4% por 16–24 h a 4 °C com agitação suave, com os tubos em ângulos retos em relação à direção da agitação.
  11. Desidrate o embrião utilizando lavagens em uma série de metanol. Usando pipetas Pasteur de LDPE e tomando cuidado para não pipetar o embrião, remova o PFA e adicione 1 mL de PBS. Lave por 10 min à temperatura ambiente (TA) com agitação suave, com os tubos a 90° em relação ao plano de agitação. Repita as lavagens com 25%, 50%, 75% e 2× 100% de metanol em PBS.
  12. Substitua a última lavagem com metanol a 100% por 1,5 mL de metanol a 100% fresco e armazene a -20 °C.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas por anos a -20 °C. Tenha cuidado para evitar evaporação.
    CAUTION: O metanol é inflamável e tóxico. Use EPI apropriado e armazene em armário para inflamáveis. Não inale nem ingira.

2. Coloração de embriões em montagem inteira de E8,5 e E9,5 para proteínas utilizando imunofluorescência

NOTA: Todas as etapas de lavagem têm volume de 1 mL e são realizadas em tubos Eppendorf cónicos de 2 mL. Realize as lavagens de 1 mL com movimento suave de balanço, mantendo os tubos a 90° em relação ao plano do balanço. Remova e substitua o líquido utilizando uma pipeta de Pasteur de polietileno linear (LDPE) de 2 mL, tomando cuidado para não aspirar o embrião. Ao utilizar embriões E9.5, corte a extremidade da pipeta de Pasteur para evitar danos ao embrião em caso de aspiração acidental. Dilua o metanol em PBS. Os embriões podem ser corados individualmente ou em um tubo com até 12 embriões agrupados. Para embriões E9.5: até duas condições podem ser coradas em um único tubo. Se utilizar múltiplas condições, corte a cauda de um dos grupos para que possam ser diferenciados durante a obtenção de imagens.

  1. Retire os embriões do armazenamento a -20 °C e deixe-os atingir a temperatura ambiente (TA) de 20–26 °C por 10–20 min. Certifique-se de que os embriões tenham números semelhantes de somitos para garantir a comparação de estágios de desenvolvimento equivalentes.
  2. Branqueie e permeabilize os embriões em uma solução de metanol 100%: dimetilsulfóxido (DMSO): peróxido de hidrogênio a 30% na proporção 4:1:1 por 2 h.
    CAUTELA: O peróxido de hidrogênio é corrosivo e irritante. Pode causar danos graves aos olhos e ser prejudicial se ingerido. Em caso de contato com os olhos, enxágue com água por vários minutos. O peróxido de hidrogênio é um perigo para organismos aquáticos; descarte em instalação aprovada para tratamento de resíduos. Use EPI apropriado, incluindo proteção ocular. Não ingerir.
  3. Pré-aqueça o bloco térmico a 98 °C e prepare o tampão de desmascaramento de citrato diluindo 100 µL do tampão em 10,7 mL de água destilada.
  4. Reidrate as amostras lavando em metanol 70%, seguido por lavagens em metanol 50%, metanol 25% e, finalmente, em PBS, por 10 min cada, à TA com agitação.
  5. Pré-aqueça o tampão de desmascaramento de citrato a 98 °C usando o bloco térmico pré-aquecido por pelo menos 20 minutos. Lave os embriões no tampão de desmascaramento de citrato por 3 × 10 min à TA.
  6. Após as lavagens à TA, adicione o tampão de desmascaramento de citrato pré-aquecido aos embriões e aqueça no bloco térmico a 98 °C por 10 min. Retire do calor e deixe esfriar por pelo menos 40 min.
    NOTA: Não use o tampão de desmascaramento de citrato para recuperação de antígenos em embriões E8,5, pois pode causar dissociação dos embriões. Os embriões podem ficar pegajosos em contato com o tampão de desmascaramento de citrato; mantenha as lavagens sem agitação para evitar danos por aglomeração.
  7. Lave os embriões por 3 × 10 min em PBS + 0,1% Triton-X à TA com agitação. Bloqueie os embriões por 16–24 h em no mínimo 150 µL/tubo de PBS + 0,1% Triton-X + 10% de soro normal de jumento a 4 °C com agitação.
  8. Prepare os anticorpos primários diluindo-os em PBS + 0,1% Triton-X + 10% de soro normal de jumento nas concentrações recomendadas 1 h antes de aplicá-los aos embriões e mantenha a 4 °C.
  9. Remova a solução de bloqueio dos embriões e adicione no mínimo 150 µL/tubo da solução de anticorpo diluído. Incube por 1–3 dias a 4 °C com agitação.
    NOTA: Os anticorpos primários podem ser multiplexados, desde que cada anticorpo tenha sido produzido em espécies diferentes. O uso de anticorpos produzidos em camundongos, seguido por anticorpos secundários anti-rato, pode resultar em marcação não específica intensa. Alternativamente, em alguns casos, anticorpos primários de uma mesma espécie podem ser multiplexados, desde que sejam de isotipos diferentes e combinados com anticorpos secundários específicos para cada isotipo.
  10. Enxágue os embriões em PBS + 0,1% Triton-X e lave-os por 6 × 30 min em PBS + 0,1% Triton-X à TA.
  11. Bloqueie o anticorpo secundário diluindo os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos e DAPI (ou marcador alternativo de núcleos) nas concentrações recomendadas em 0,1% Triton-X + 10% de soro normal de jumento, 1 h antes de aplicá-los aos embriões a 4 °C no escuro.
  12. Remova a solução de lavagem e adicione a solução de anticorpo secundário diluído aos embriões. Incube por 16–24 h a 4 °C com agitação, no escuro.
    NOTA: Recomendamos o uso de anticorpos secundários conjugados com fluoróforos na forma de fragmentos F(ab) em vez de anticorpos inteiros. Os fragmentos F(ab) são menores, proporcionando melhor penetração nos tecidos, e a ausência da região Fc ajuda a reduzir o fundo não específico.
  13. Enxágue os embriões em PBS + 0,1% Triton-X e, em seguida, lave-os por 6 × 30 min em PBS + 0,1% Triton-X à TA com agitação, no escuro. Armazene por até 4 semanas em PBS + 0,1% Triton-X a 4 °C no escuro.

3. Coloração de embriões em montagem inteira de E8,5 e E9,5 para transcritos usando RNAscope

OBSERVAÇÃO: Todas as etapas de lavagem têm volume de 1 mL e são realizadas em tubo Eppendorf de 2 mL. Realize as etapas de lavagem de 1 mL com agitação suave, mantendo os tubos em ângulo de 90° em relação ao plano de movimento. Remova e substitua o líquido utilizando uma pipeta Pasteur de polietileno de baixa densidade (LDPE) de 2 mL, tomando cuidado para não aspirar o embrião. Ao utilizar embriões E9.5, corte a ponta da pipeta Pasteur para evitar danos ao embrião em caso de aspiração acidental. O metanol deve ser diluído com PBS. Ligue o forno de hibridização antes de iniciar, ajustando-o para 40 °C e colocando um tecido úmido no fundo. Os embriões podem ser corados individualmente ou em um tubo com até 12 embriões agrupados. Para embriões E9.5: até 2 condições podem ser coradas em um único tubo. Se forem utilizadas múltiplas condições, corte a cauda de um dos grupos para que possam ser diferenciados durante a obtenção de imagens.

  1. Prepare a bancada, as pipetas e os suportes limpando-os com etanol a 70%, seguido por uma solução de descontaminação de RNase.
  2. Reidrate os embriões por meio de uma série gradativa de metanol diluído em PBS: 75%, 50%, 25%, PBS e PBS + 0,1% Tween 20, durante 5 minutos por etapa, com agitação suave.
  3. Permeabilize os embriões incubando em ~75 µL (3 gotas) de protease III por 20 min a temperatura ambiente com agitação vertical.
    OBSERVAÇÃO: O tempo de permeabilização pode ser otimizado de acordo com o estágio embrionário/tamanho. 20 minutos funcionam bem para embriões E8,5/E9,5, mas incubações mais longas podem ser necessárias para visualizar estruturas mais profundas em embriões E9,5. Etapas de permeabilização excessivamente longas podem levar à dissociação do embrião.
  4. Lavar os embriões em PBS + 0,01% Tween 20 durante 3 × 5 min.
  5. Prepare as sondas RNAscope colocando aproximadamente 150 µL (~6 gotas) por tubo de sondas C1 em um tubo Eppendorf. Dilua quaisquer sondas C2–C4 na sonda C1 numa concentração de 1:50 e incube em posição vertical em forno de hibridização a 40 °C por 10 min antes de colocar sobre os embriões.
    OBSERVAÇÃO: Para cada conjunto de sondas RNAscope em um experimento, 'C' indica a designação do canal. É necessária uma sonda C1, pois todas as outras sondas são diluídas na sonda C1. Certifique-se de que apenas uma sonda de cada designação de canal seja utilizada em cada mistura. As misturas de sondas podem ser reutilizadas pelo menos uma vez× se armazenado a 4 °C por até 6 semanas.
  6. Remova a última lavagem e adicione 150 µL da mistura de sonda para cada tubo de embriões. Incubar em forno de hibridização na posição vertical durante 16–24 h a 40 °C.
  7. Remova a mistura de sonda e lave em 0,2× Tampão Salino-Citrato de Sódio (SSC) + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min à temperatura ambiente.
  8. Fixe os embriões em PFA 4% em temperatura ambiente com agitação suave, com os tubos em 90° ao plano de oscilação.
  9. Lavar em 0,2× Tampão SSC + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min à temperatura ambiente.
  10. Incubar amostras em aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo do reagente Amp1 por 30 min a 40 °C em uma estufa de hibridização, mantendo os tubos na posição vertical.
  11. Lavar em 0,2× Tampão SSC + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min a RT.
  12. Incubar amostras em aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo do reagente Amp2 por 30 min a 40 °C em uma estufa de hibridização, mantendo os tubos na posição vertical.
  13. Lavar em 0,2× Tampão SSC + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min a TA.
  14. Incubar as amostras em aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo do reagente Amp3 por 15 min a 40 °C em um forno de hibridização, mantendo os tubos na posição vertical.
  15. Lavar em 0,2× tampão SSC + 0,1% de Tween 20 por 3 × 8 min a TA.
  16. Incubar em 150 µL (6 gotas) HRP-C1 por 15 min a 40 °C na posição vertical em uma estufa de hibridização. Lave em 0,2× Tampão SSC + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min a RT.
  17. Incubar as amostras com um fluoróforo diluído em tampão TSA por 30 min a 40 °C em uma estufa de hibridização, mantendo os tubos na posição vertical.
    OBSERVAÇÃO: Os fluoróforos RNAscope podem ser usados com diferentes sondas. O TSA-vivid 570 é o mais brilhante, seguido pelo TSA-vivid 650 e depois pelo TSA-vivid 520. Selecione os fluoróforos com base na abundância esperada da sonda.
  18. Lavar com 0,2× Tampão SSC + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min a temperatura ambiente.
  19. No escuro, incube as amostras em aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo do reagente bloqueador de HRP por 15 min a 40 °C em um forno de hibridização, mantendo os tubos na posição vertical.
  20. Lavar em 0,2× Tampão SSC + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min a RT.
    OBSERVAÇÃO: O protocolo pode ser interrompido neste ponto por 16–24 h, mantendo os embriões na última lavagem à temperatura ambiente.
  21. Repita as etapas 3.16–3,20 para cada uma das sondas C2–C4, se utilizadas, substituindo HRP-C1 por HRP-C2/C3/C4 conforme necessário. Utilize um fluoróforo diferente para cada sonda separada.
    OBSERVAÇÃO: Se forem utilizadas sondas C4, é necessário o kit auxiliar RNAscope 4-plex e o fluoróforo Opal 780. O Opal 780 deve ser usado somente quando for necessária a multiplexação de quatro sondas e deve ser o último fluoróforo empregado, pois é sensível à degradação. Ao selecionar fluoróforos, é importante considerar as capacidades da plataforma de microscopia que será utilizada. Verifique sempre se o sistema de imagem dispõe de comprimentos de onda de excitação, filtros de emissão e sensibilidade do detector apropriados para todas as sondas utilizadas. Ao realizar a coloração com Opal 780, substitua as etapas 3.17–3.19 pelas seguintes:
    1. Incubar amostras em 150 µL/tube TSA-DIG (diluído 1:100 em tampão TSA) por 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
    2. Lavar com 0,2× Tampão SSC + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min a RT.
    3. No escuro, incubar as amostras em aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo do reagente bloqueador de HRP durante 15 min a 40° em uma estufa de hibridização, mantendo os tubos em posição vertical.
    4. Lavar com 0,2× Tampão SSC + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min a TA.
    5. Incubar amostras em 150 µL/tube de Opal Polaris 780 diluído em Diluente/Bloqueador de Anticorpo durante 45 min a 40 °C em um forno de hibridização, mantendo os tubos na posição vertical
  22. No escuro, incubar as amostras em aproximadamente 150 µL de DAPI diluído em tampão 0,2 x SSC + 0,1% Tween 20 (concentração de trabalho 1µg/mL) durante 16–24 h a 4 °C com agitação suave, mantendo os tubos na posição vertical
  23. Lavar com 0,2× tampão SSC + 0,1% Tween 20 por 3 × 8 min a RT. Armazene as amostras a curto prazo em PBS a 4 °C.

4. Coloração combinada de RNAscope e imunofluorescência em embriões inteiros de E8,5

  1. Siga os passos 3.1–3.21 do protocolo RNAscope.
    NOTA: A redução do tempo do passo de permeabilização do RNAscope pode ajudar a melhorar o desempenho do anticorpo na imunofluorescência.
  2. Lave as amostras por 16–24 h em 1 mL de tampão 0.2× SSC + 0.1% Tween 20 à temperatura ambiente com agitação.
  3. Siga os passos 2.7–2.12 do protocolo de imunofluorescência.

5. Preparação de embriões em montagem inteira para imagem usando microscopia confocal de varredura pontual ou disco giratório

  1. Após a coloração, utilizando uma pipeta Pasteur de PEAD, pipete suavemente o embrião e transfira-o para um lâmina de imagem com poços múltiplos ou para uma lâmina com cavidade, tomando cuidado para garantir que o embrião não seque. Se necessário, oriente o embrião conforme desejado, tomando cuidado para não danificar a amostra.
    NOTA: lâminas com cavidade são úteis para garantir a orientação dos embriões, mas podem causar compressão do embrião e danos teciduais. As lâminas de imagem com múltiplos poços são mais suaves com os embriões, mas podem resultar em variação na orientação da imagem e podem introduzir artefatos nas bordas dos poços.
  2. Opcional – Clareamento tecidual: clareie os tecidos removendo suavemente a última lavagem do embrião e adicionando até 200 µL de solução CUBIC-R dentro do recipiente de imagem à temperatura ambiente (RT). Mantenha o embrião em uma incubação única com CUBIC-R por um mínimo de 40 min antes da imagem. Amostras clareadas devem ser analisadas na mesma solução de CUBIC-R utilizada para a incubação.
    ATENÇÃO: CUBIC-R é tóxico quando inalado e pode causar irritação nos olhos e na pele. Evite a inalação e utilize EPI apropriado ao manipular.
    NOTA: Os embriões tornam-se completamente transparentes logo após a exposição ao CUBIC-R. Adicione CUBIC-R diretamente ao recipiente de imagem somente após a orientação, tomando cuidado para não perder o embrião. Uma reversão parcial do clareamento ocorre se o CUBIC-R for removido do embrião e substituído por PBS.
  3. Se não for realizado o clareamento tecidual, complete os poços com PBS para garantir que os embriões não fiquem excessivamente secos. Se estiver usando uma lâmina com cavidade, cubra a lâmina com uma lamínula #1.5. Coloque uma tampa na lâmina de imagem com múltiplas câmaras.
    NOTA: Os embriões podem ser analisados com uma ampla gama de microscópios de luz. Devido à espessura da amostra, é fundamental escolher um microscópio capaz de realizar imagens em profundidade apropriada. Escolha uma objetiva adequada para a estrutura desejada. Uma objetiva de 10x com baixa abertura numérica fornece uma boa visão geral da coloração do embrião inteiro, mas uma objetiva com maior aumento e maior abertura numérica pode ser necessária para resolver estruturas menores ou mais profundas com alta resolução. Os embriões às vezes podem se mover no recipiente de imagem, introduzindo erros; portanto, é importante reduzir o tempo de imagem sempre que possível.

6. Analisando núcleos para contagens e intensidade de sinal

OBSERVAÇÃO: Este protocolo abrange a análise de núcleos usando o Zeiss Arivis Pro; análises semelhantes podem ser possíveis usando programas alternativos de análise de imagens. Ele funciona melhor com amostras nucleares, por exemplo, transcritos ou proteínas nucleares. Ao analisar proteínas não nucleares, pode ser útil usar um corante para visualizar a estrutura celular, por exemplo, CellMask, que cora as membranas celulares, e examinar a expressão de marcadores em toda a célula.

  1. Converter arquivos de imagem para o formato SIS utilizando o conversor Zeiss Arivis SIS. Abra o conversor e selecione 'Adicionar arquivos', depois 'Procurar pasta'. Selecione a pasta de imagens de origem. Selecione a conversão 1 para 1. Escolha o diretório de saída e selecione 'iniciar conversão'.
  2. Importe arquivos SIS para o Zeiss Arivis Pro selecionando 'arquivo', depois 'abrir' e, em seguida, selecione o arquivo SIS desejado.
  3. Prepare os dados para análise em pipeline rotacionando as imagens. Para isso, selecione 'Dados' e depois 'Galeria de transformações'. Selecione a função 'rotação' e rotacione o embrião para que a região de interesse possa ser alinhada em uma caixa retangular rígida.
  4. Selecione 'Dados', depois 'Galeria de transformações' e escolha a opção 'Recortar'. Arraste as bordas para recortar a região de interesse e selecione 'OK'.
    OBSERVAÇÃO: Para a região da cabeça em embriões de E8.5, recorte a região da cabeça, cortando a imagem no entalhe próximo à vesícula ótica. Para a região do coração em embriões de E8.5, recorte da região abaixo do entalhe próximo à vesícula ótica até a extremidade inferior do tubo cardíaco. Ao recortar imagens rotacionadas, elimine as regiões pretas criadas como artefato da rotação.
  5. Inicie um novo pipeline selecionando 'Análise' e depois 'Painel de Análise'. Selecione 'novo pipeline'.
  6. ROI de entrada: Defina o ROI como 'conjunto de imagens atual', os canais como 'todos os canais' e a escala como '100%'. Certifique-se de selecionar 'incluir Z'.
    OBSERVAÇÃO: As imagens podem ser reduzidas (por exemplo, para 50%) se forem muito grandes ou se o processamento for muito lento; isso reduzirá a resolução das imagens.
  7. Encontrar núcleos (marcador #1) usando a ferramenta de detecção de blobs: Selecionar 'Adicionar Operação', depois localizar 'Detecção de blobs'. No canal, selecionar o canal contendo o marcador de núcleos. Definir o diâmetro para 6 µm e otimize o limiar de probabilidade com base na intensidade da coloração. Os núcleos no plano devem ser detectados com separação apropriada entre eles. Ajuste a sensibilidade de divisão. 55% é um valor razoável para a maioria das amostras. Defina a 'Normalização' para o primeiro ponto temporal. Defina o nome de saída, por exemplo, Detector de manchas (núcleos). Os objetos detectados podem ser visualizados selecionando o ícone de 'olho' na barra superior da operação.
  8. Encontre a expressão do marcador #2 utilizando a ferramenta de detecção de blobs: Selecione 'Adicionar operação', depois localize 'Detecção de blobs'. No canal, selecione o canal contendo o marcador de núcleos. Defina o diâmetro para 6 µm e otimize o limite de probabilidade com base na intensidade da coloração. Os 'aglomerados' positivos para o marcador #2 no plano devem ser detectados com separação apropriada. Ajuste a sensibilidade de divisão. 55% é um valor razoável para a maioria das amostras. Defina a 'Normalização' para o primeiro ponto temporal. Defina o nome de saída, por exemplo, Detector de aglomerados (canal 2). Os objetos detectados podem ser visualizados selecionando o ícone de 'olho' na barra superior da operação.
  9. Encontre a expressão do marcador #3 utilizando a ferramenta blob finder: Selecione 'Adicionar operação', depois localize 'Blob finder'. No canal, selecione o canal contendo o marcador de núcleos. Defina o diâmetro para 6 µm e otimize o limite de probabilidade com base na intensidade da coloração. 'Aglomerados' positivos para o marcador #3 no plano devem ser detectados com separação apropriada. Ajuste a sensibilidade de divisão. 55% é um valor razoável para a maioria das amostras. Defina 'Normalização' para µ first ponto temporal. Defina o nome de saída, por exemplo, Blob finder (canal 3). Os objetos detectados podem ser visualizados selecionando o ícone de 'olho' na barra superior da operação.
  10. Opcional: filtro de volume – Se houver muitos detritos na imagem, pode-se utilizar um filtro de volume para remover artefatos. Selecione 'Adicionar Operação', depois localize 'Filtro por Característica de Objeto'. Defina a entrada como Blob finder (núcleos) (ou outro nome de conjunto do passo 6.7). Defina 'é do tipo' como 'qualquer'. No menu suspenso, selecione Volume (volume) e defina o valor para > 6 µm3. Selecione 'Adicionar filtro'. No menu suspenso, selecione Volume (volume) e defina o valor para <3000 µm3Nomeie a saída, por exemplo, 'núcleos'. Execute o pipeline até este ponto selecionando o botão de três linhas no módulo e clicando em 'executar pipeline até aqui'.
    OBSERVAÇÃO: Filtros de volume também podem ser utilizados para os outros canais, se necessário. Otimize os valores maiores que e menores que para garantir que todos os objetos positivos sejam selecionados, mas excluindo detritos.
  11. Para identificar núcleos positivos para outro marcador, utilize a ferramenta de interseção. Selecione 'Adicionar operação' e localize a ferramenta 'compartimentos'. Na primeira caixa de seleção suspensa, adicione a saída de núcleos (por exemplo, localizador de aglomerados (núcleos) ou 'núcleos' filtrados por volume) e certifique-se de que o botão à esquerda da caixa esteja selecionado. Na caixa suspensa interna, selecione o canal desejado (por exemplo, localizador de aglomerados (canal 2)). Nomeie a saída, por exemplo, 'núcleos com canal 2'. Repita o procedimento para todos os marcadores desejados.
  12. Para encontrar núcleos positivos para 2 ou mais marcadores adicionais, selecione 'Adicionar operação' e localize a ferramenta 'Filtro de característica de objeto'. Defina a entrada para o marcador de núcleos (por exemplo, 'núcleos', tipo=qualquer) e adicione filtros do passo anterior após 'Tem etiqueta', por exemplo, 'Núcleos com canal 2' e 'Núcleos com canal 3'. Nomeie a saída, por exemplo, 'Núcleos com canal 2 e canal 3'. Execute o pipeline até este ponto.
  13. Crie características personalizadas para contar núcleos selecionando o ícone da tabela de dados na barra superior, escolhendo "criar" e depois "contagem de objetos". Dê um rótulo apropriado à característica (por exemplo, contagem de núcleos) e selecione na menu de etiquetas a saída desejada para quantificar (por exemplo, núcleos). Repita este passo para cada grupo a ser quantificado.
  14. Crie grupos de objetos selecionando 'Adicionar operação' e depois 'Criar grupos de objetos'. Selecione cada um dos grupos a serem utilizados nas análises nas entradas. Rotule as saídas como 'Criar grupos de objetos'. Execute o pipeline até este ponto.
  15. Exporte as contagens resumidas selecionando 'Adicionar operação' e depois 'Exportar características dos objetos'. Nas entradas, selecione 'criar grupos de objetos'. Selecione um diretório para salvar os dados. O modo é 'tabela única'. Clique em características e selecione as características personalizadas criadas na etapa 6.13.
  16. Exportar detalhes dos núcleos selecionando 'Adicionar operação' e depois 'Exportar características de objetos'. Nas entradas, selecione a detecção de núcleos criada na etapa 6.7 (ou 6.10, se estiver usando um filtro de volume). Selecione um diretório para salvar os dados. O modo é 'tabela única'. Clique em características e selecione 'intensidades' para cada canal (#1, #2, #3, etc.) e outras características desejadas para exportar, por exemplo, volume (volume).
  17. Armazene objetos selecionando os objetos necessários para visualização/análise na caixa de armazenamento de objetos.
  18. Salve o pipeline revertendo todas as etapas, selecionando as 3 linhas no canto superior direito e clicando em 'Exportar'. Selecione uma 'pasta' na qual salvar o 'pipeline' e salve.
  19. Para executar um pipeline em lote, recarregue o Arivis. Na barra superior, selecione ‘Análise’ e depois ‘Análise em lote’. Na janela, selecione o pipeline salvo na etapa 6.18. Em ‘arquivos’, selecione os arquivos para análise e clique em ‘Ok’. Após o carregamento, quaisquer visualizações indesejadas podem ser excluídas. Selecione ‘Ok’. Na tela seguinte, selecione o diretório para salvar os dados. Clique em ‘Executar’. Os dados serão automaticamente salvos na pasta de saída selecionada.

Uma visão geral do fluxo de trabalho é mostrada na Figura 1.

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Figura 1: Protocolo de coloração por imunofluorescência e RNAscope. Esquema representando as principais etapas da coleta de embriões, imunofluorescência, RNAscope, imunofluorescência combinada com RNAscope, obtenção de imagens da amostra e análise. As caixas coloridas correspondem a diferentes estágios do protocolo. Criado no BioRender. Sparrow, D. (2026) https://BioRender.com/q6rmax8 Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados

Embriões E8.5 foram corados por imunofluorescência seguindo este protocolo para analisar o número de células da crista neural em migração que estavam na fase G2/M do ciclo celular. As amostras foram coradas com anticorpos direcionados contra PHH3 para visualizar a fase G2/M do ciclo celular e SOX10 para visualizar as células da crista neural em migração. Os embriões foram ainda corados com anticorpos secundários apropriados. Os núcleos foram corados com DAPI. As amostras foram visualizadas utilizando o microscópio confocal de disco giratório Olympus SpinSR com objetiva de 10x (NA = 0,4). As imagens foram adquiridas utilizando uma câmera Hamamatsu Orca Fusion BT e um disco giratório com pinhole de 50 µm. As imagens foram capturadas utilizando a função de mosaico e costura como pilhas Z, com espaçamento Z de 1,99 µm. A delaminação das células da crista neural e a subsequente migração por transição epitélio-mesênquima (EMT) requerem que as células da crista neural pré-migratórias estejam na fase S ou G2/M do ciclo celular20. Aqui, somos capazes de visualizar células na fase G2/M do ciclo celular, indicadas pela marcação de PHH3 (verde), dentro da população de células da crista neural em migração, indicadas por SOX10 (magenta) (Figura 2A). O número de células da crista neural em migração na fase G2/M em embriões controle e expostos ao tratamento pode ser quantificado para determinar se o nosso tratamento afeta o número de células da crista neural migratórias na fase G2/M, e, portanto, se o tratamento pode também perturbar a delaminação da crista neural por EMT. Alguns embriões tinham um saco vitelino residual aderido após a dissecação (Figura 2A’, ponta de seta vermelha). O saco vitelino residual é sensível à marcação por anticorpos secundários anti-rato, comuns nesta amostra, já que o anticorpo anti-PHH3 foi produzido em camundongo. Assim, todo o saco vitelino fluoresce intensamente com o fluoróforo conjugado ao anticorpo anti-rato. Neste exemplo extremo, a marcação inespecífica poderia afetar a quantificação de PHH3 e, portanto, esta amostra deve ser excluída da análise. Além disso, o uso de anticorpos anti-rato deixa uma "trilha" inespecífica adjacente ao tubo cardíaco em embriões E8.5 (Figura 2A’, ponta de seta vermelha). Esta região deve ser considerada ao quantificar o sinal de um anticorpo primário produzido em camundongo.

Embriões E9,5 foram corados por imunofluorescência usando este protocolo para examinar a estrutura dos vasos sanguíneos e a distribuição das células progenitoras cardíacas. As amostras foram coradas com anticorpos direcionados contra ISLET1 (ISL1) para visualizar o segundo campo cardíaco, SOX10 para visualizar as células da crista neural migratórias, ENDOMUCIN (EMCN) para visualizar as células endoteliais venosas e capilares, além de anticorpos secundários apropriados. Os núcleos foram corados com DAPI. Utilizou-se clareamento de tecidos para obter uma melhor profundidade de imagem. As amostras foram analisadas em um microscópio confocal de disco giratório Olympus SpinSR com objetiva de 10x (NA = 0,4). Em E9,5, observamos a migração das células da crista neural cardíaca, que formam parte do arco aórtico (SOX10, amarelo), e das células progenitoras do segundo campo cardíaco (ISL1, verde), que formam partes das aurículas, do trato de saída e do ventrículo esquerdo21 (Figura 2B). A interrupção das células progenitoras cardíacas é um fator chave no desenvolvimento de doenças cardíacas congênitas22,23. Usando este método, é possível visualizar o padrão e o número de células progenitoras cardíacas. A próxima etapa seria comparar o padrão de distribuição das células progenitoras cardíacas entre grupos controle e tratados para determinar se nossa intervenção perturba a migração ou leva à perda de tipos celulares essenciais.

Para determinar a relação entre a fase das células da crista neural e a sinalização Wnt, embriões de E8,5 foram corados por meio do RNAscope utilizando este protocolo para examinar células da crista neural em diferentes estágios de migração e diferenciação, bem como um marcador de sinalização Wnt. Foram utilizadas sondas que indicam a borda da placa neural, de onde emergem as células da crista neural (Msx1), células da crista neural migratórias (Sox10) e diferenciação das células da crista neural (Dlx2), as quais foram comparadas a uma sonda que indica sinalização Wnt (Sp5). Os fluoróforos TSA-vivid 520, 570 e 650 e Opal 780 foram utilizados para visualizar as sondas. As amostras foram analisadas em um microscópio Evident FV4000 com objetiva de 10x (NA=0,4), diafragma de 144 µm e tamanho de pixel de 621 nm. As imagens foram capturadas utilizando a função de mosaico e costura como pilhas Z, com espaçamento Z de 4,32 µm. A borda da placa neural (Msx1, verde) e as células da crista neural migratórias (Sox10, magenta) ocupam regiões distintas na cabeça, com alguma sobreposição quando as células começam a migrar do tubo neural (Figura 3A). Algumas regiões das células da crista neural em migração apresentam co-localização com Dlx2 (ciano), sugerindo que algumas células estão progredindo rumo à diferenciação craniofacial (Figura 3A). A sinalização Wnt (Sp5, amarelo) ocupa regiões da borda da placa neural, o que é relevante, pois a modulação da sinalização Wnt é necessária para a delaminação e diferenciação das células da crista neural24,25, mas também uma região distinta adjacente às células da crista neural migratórias (Figura 3A).

A coloração adicional teve como objetivo analisar a relação entre a migração das células da crista neural e a sinalização Wnt no estádio E9.5, por meio da marcação de indicadores do estado da crista neural e da sinalização Wnt. Foram utilizadas sondas que indicam a borda da placa neural (Msx1) e as células da crista neural migratórias (Sox10), as quais foram comparadas a uma sonda que indica a sinalização Wnt (Sp5). Fluoróforos TSA-vivid 520, 570 e 650 foram empregados para visualizar as sondas. As amostras foram imagiadas utilizando um microscópio de disco giratório Olympus SpinSR com objetiva de 10x (NA = 0,4). Aqui podemos observar a borda da placa neural (Msx1, verde), distinta das células da crista neural migratórias (Sox10, magenta) (Figura 3B). A sinalização Wnt (Sp5, amarelo) é fortemente visível na região dorsal do embrião, onde as células da crista neural do tronco estão se desanexando, bem como em regiões específicas da cabeça, ao redor do 1o e 2o arcos branquiais, abaixo do trato de saída e dentro da vesícula otica (Figura 3B). A comparação do padrão espacial das células da crista neural e da sinalização Wnt entre os grupos controle e tratamento por meio deste método permitiria determinar se nossa intervenção perturba a delaminação e migração das células da crista neural, e se alguma perturbação está relacionada a alterações na sinalização Wnt.

Para determinar o estado do ciclo celular de células na borda da placa neural, utilizamos este protocolo para combinar coloração por imunofluorescência e RNAscope. Utilizou-se uma sonda de RNAscope indicativa da borda da placa neural (Msx1). As amostras foram coradas com anticorpos direcionados à PHH3 e à PCNA para visualizar as fases G2/M e S do ciclo celular, respectivamente. Os embriões foram ainda corados com anticorpos secundários apropriados. Os núcleos foram corados com DAPI. As amostras foram analisadas utilizando um microscópio de disco giratório Olympus SpinSR com objetiva de 10x (NA = 0,4) (Figura 4A,B), ou um microscópio confocal Evident FV4000 com objetiva de 10x (NA = 0,4), pinhole de 127 µm e tamanho de pixel de 311 nm (Figura 4B’). Aqui podemos observar células tanto em G2/M (PHH3, amarelo) quanto em fase S (PCNA, magenta) sobrepostas à borda da placa neural (Figura 4A). Utilizando este método, podemos quantificar a proporção de células dentro da borda da placa neural em cada estágio do ciclo celular e determinar se essas proporções são alteradas pelos nossos grupos de tratamento. Destaca-se neste embrião a presença de orifícios resultantes de danos causados pela dissecação devido à manipulação excessiva do embrião com pinças finas. Isso ressalta a necessidade de cuidado durante a dissecação para evitar danos, especialmente no E8,5, quando os embriões são particularmente frágeis.

A combinação de RNAscope e imunofluorescência pode resultar em coloração mais fraca da sonda RNAscope em comparação com a realização do RNAscope isoladamente. Quando combinada com um anticorpo primário que apresenta fluorescência muito intensa e com um fluoróforo próximo (por exemplo, Fluoresceína e Cy3), isso pode causar vazamento de sinal do canal mais brilhante para o canal mais fraco (Figura 4B). A forma de evitar isso é utilizar uma concentração mais diluída do anticorpo muito brilhante, selecionar fluoróforos com maior distinção espectral ou alterar os parâmetros de aquisição nas amostras. Microscópios de disco giratório são muito rápidos na aquisição de imagens de embriões, mas como utilizam filtros de emissão com janelas de emissão fixas, não é possível ajustar dinamicamente as janelas de detecção para corresponder a fluoróforos específicos. Usando um microscópio de varredura pontual, por exemplo, o Evident FV4000, a janela de detecção pode ser reduzida pelo operador com precisão de nanômetros, permitindo assim reduzir o vazamento de sinal quando fluoróforos com leve sobreposição nos espectros de emissão são utilizados (Figura 4B’).

Para determinar as proporções de células em diferentes estágios do ciclo celular em embriões E8.5, utilizamos este protocolo para analisar a proporção de núcleos e a intensidade do sinal nas fases S e G2/M do ciclo celular. As amostras foram coradas com anticorpos direcionados à PHH3 e à PCNA para visualizar as fases G2/M e S do ciclo celular, respectivamente. Os embriões foram ainda corados com anticorpos secundários apropriados. Os núcleos foram corados com DAPI. As amostras foram imagiadas utilizando o microscópio de disco giratório Olympus SpinSR com objetiva de 10x (NA = 0,4). O software Zeiss Arivis Pro foi utilizado para identificar todos os núcleos, os núcleos positivos para PHH3, os núcleos positivos para PCNA e os núcleos duplo-positivos (Figura 5A). Utilizando este método, fomos capazes de comparar as proporções de células nas fases G2/M (PHH3+) e S (PCNA+) do ciclo celular (Figura 5B), bem como a intensidade da coloração de PHH3 ou PCNA em cada núcleo individual (Figura 5C). Observamos que havia uma proporção ligeiramente maior de núcleos PCNA+ na região cardíaca em comparação com a cabeça e o embrião inteiro (Figura 5B). Além disso, a cabeça apresentou uma proporção maior de núcleos PHH3+ e duplo-corados em comparação com o coração e o embrião completo (Figura 5B). Não houve diferenças evidentes na intensidade da coloração de PHH3 ou PCNA entre as regiões (Figura 5C). Esses dados foram obtidos de um único embrião representativo (n = 1) e são apresentados para demonstrar o fluxo de trabalho da análise; nenhuma análise estatística inferencial foi realizada. Em conjunto, este método permite-nos determinar os padrões de propagação do ciclo celular em um estágio de desenvolvimento crucial para a formação cardíaca e craniofacial. Este método permitirá-nos determinar se o nosso tratamento afeta a propagação do ciclo celular em diferentes regiões do embrião.

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Figura 2: Coloração por imunofluorescência de proteínas em embriões E8,5 e E9,5. (A, A’) Embriões de camundongo E8,5 foram corados por imunofluorescência para PHH3, a fim de visualizar células na fase G2/M do ciclo celular, SOX10 para visualizar células da crista neural migratórias e DAPI para visualizar núcleos. N = 11 embriões de 1 experimento. (B) Embriões E9,5 foram corados para ISL1, a fim de visualizar precursores do segundo campo cardíaco, SOX10 para visualizar células da crista neural migratórias, EMCN para visualizar vasos sanguíneos capilares e venosos, e DAPI (para visualizar núcleos). Cabeças de seta vermelhas indicam coloração inespecífica do saco vitelino e coloração inespecífica dentro do embrião proveniente de anticorpos secundários anti-rato (n = 15 embriões de 1 experimento). Barra de escala = 200 µm. DAPI: 4′,6-diamidino-2-fenilindol; PHH3: Fosfohistona H3; EMCN: Endomucina. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Coloração de transcritos em embriões E8,5 e E9,5 por meio do RNAscope. (A) Embriões E8,5 foram corados pelo RNAscope com sondas direcionadas a Msx1 para visualizar a borda da placa neural, Sox10 para visualizar a crista neural em migração, Dlx2 para visualizar a crista neural em diferenciação e Sp5 para sinalização Wnt. n = 13 embriões de 1 experimento. (B) Embriões E9,5 foram corados pelo RNAscope com sondas direcionadas a Msx1 para visualizar a borda da placa neural, Sox10 para visualizar a crista neural em migração e Sp5 para visualizar a sinalização Wnt. n = 4 embriões de 1 experimento. Barra de escala = 200 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Coloração combinada de imunofluorescência e RNAscope em embriões E8.5. (A, B, B’) Embriões E8.5 foram corados por RNAscope com sondas direcionadas ao Msx1 para visualizar a borda da placa neural e por imunofluorescência com anticorpos anti-PCNA para visualizar células na fase S e anti-PHH3 para visualizar células nas fases G2/M do ciclo celular. As setas laranjas indicam coloração específica de Msx1, as setas vermelhas indicam fluorescência de sobreposição, (B), ou coloração específica de PHH3 sem sobreposição no canal de Msx1 (B'). N = 2 embriões de 1 experimento. Barra de escala = 200 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Análise da fase do ciclo celular em embriões E8,5 utilizando o Arivis Pro. (A) Embriões de camundongo E8,5 foram corados por imunofluorescência para PCNA, a fim de visualizar células na fase S do ciclo celular (verde), PHH3 para visualizar células na fase G2/M do ciclo celular (magenta) e DAPI para visualizar núcleos (azul). Os objetos tridimensionais detectados (esferas multicoloridas) foram sobrepostos e visualizados utilizando o visualizador 4D do Zeiss Arivis Pro. (B) O gráfico demonstra a proporção de núcleos PCNA+, PHH3+ e duplo-positivos no corpo inteiro, cabeça e coração de um único embrião. (C) O gráfico demonstra a intensidade média da marcação de PCNA e PHH3 por núcleo no corpo inteiro, cabeça e coração de um único embrião. Círculos representam a média; barras de erro representam o desvio padrão de todos os núcleos dentro de uma única amostra. Os gráficos foram elaborados utilizando o GraphPad Prism. Barra de escala = 200 µm. A análise quantitativa foi realizada em n = 1 embrião. Nenhuma estatística inferencial foi realizada. As barras de erro indicam o desvio padrão entre núcleos individuais. 3D: Tridimensional; DAPI: 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, descrevemos um método otimizado para analisar espacialmente a expressão gênica e proteica em embriões inteiros de E8.5 e E9.5. Esses métodos apresentam melhor resolução espacial e capacidade de multiplexação em comparação com os métodos tradicionais de hibridização in situ de RNA e imunofluorescência de cortes. Este protocolo baseia-se em protocolos recentes existentes para examinar vias de desenvolvimento em embriões de camundongo. Um protocolo recente utilizou RNAscope e coloração por imunofluorescência para analisar a sinalização Wnt em embriões, mas utilizou cortes em vez de embriões inteiros26. Outro estudo recente realizou coloração por RNAscope e imunofluorescência em embriões inteiros de camundongo de E8.5–E10.527, mas os autores não combinaram as duas técnicas de coloração, nem realizaram coloração com um quarto canal de RNAscope utilizando sondas C4 e fluoróforos Opal 780. A combinação de imunofluorescência e RNAscope já foi descrita anteriormente em embriões inteiros de E3.5, onde o RNAscope é realizado após a conclusão do protocolo de imunofluorescência28. Embora não tenhamos testado exatamente esse protocolo em embriões mais desenvolvidos, obtivemos coloração com anticorpos insatisfatória ao realizar o RNAscope entre as incubações com anticorpos primário e secundário do nosso protocolo de imunofluorescência em embriões de E8.5. Isso provavelmente ocorre porque é necessário realizar uma incubação com protease ao aplicar o RNAscope em embriões maiores, o que não foi necessário no estudo que utilizou embriões de E3.5 de camundongo. A incubação com protease pode afetar a integridade dos anticorpos ligados, tornando improvável que a troca da ordem entre RNAscope e imunofluorescência funcione neste sistema. Um outro estudo recente em miócitos combinou os dois protocolos realizando o RNAscope antes da coloração por imunofluorescência29. De forma semelhante a este protocolo, aquele estudo realizou o RNAscope antes da imunofluorescência; no entanto, o método não foi validado em embriões inteiros de camundongo, nem foi realizado um RNAscope com canal adicional por meio da coloração com sondas C4 e fluoróforo Opal 780.

A capacidade de corar embriões em montagem inteira usando multiplexação tem aplicações abrangentes na biologia do desenvolvimento, permitindo mapear transcritos e proteínas-chave, bem como rotular tipos celulares progenitores ou vias de sinalização do desenvolvimento em embriões em diferentes estágios. Temos sido capazes de utilizar essas técnicas para mapear a distribuição de células progenitoras cardíacas (Figura 2B), células da crista neural em diferentes estágios de migração e diferenciação (Figura 3), sinalização Wnt (Figura 3) e estágio do ciclo celular (Figura 2, Figura 4, Figura 5). Ao modificar as sondas e os anticorpos utilizados, é possível empregar essas técnicas para examinar quaisquer tipos celulares ou moléculas sinalizadoras de interesse, desde que estejam presentes nos embriões nesse estágio. Embora neste protocolo tenhamos focado nos estágios E8,5 e E9,5, é possível que embriões mais jovens ou mais velhos também possam ser corados mediante modificações na permeabilização tecidual, nos tempos de incubação e na clareza do tecido.

No entanto, essa capacidade aprimorada de multiplexar a expressão de proteínas e transcritos em embriões inteiros tem gerado novos desafios. Em primeiro lugar, realizar análises em amostras inteiras é demorado em comparação com a imunofluorescência e o RNAscope em cortes histológicos, que normalmente podem ser realizados em 1–2 dias, em vez de vários dias. Além disso, o uso de amostras inteiras exige uma consideração cuidadosa dos parâmetros de microscopia para garantir profundidade e resolução adequadas da amostra. É necessário um microscópio capaz de imagens através de até 700 µm tecido espesso, e a clareza do tecido precisa ser utilizada em embriões maiores, caso contrário estruturas profundas na amostra podem ser perdidas. Além disso, devido à espessura das amostras, a obtenção de imagens com um microscópio de campo amplo resultaria em grande quantidade de luz proveniente de fora do plano focal sendo captada; recomenda-se o uso de um microscópio confocal devido à sua capacidade de remover sinais oriundos de fora do plano focal, permitindo assim a obtenção de imagens ao longo da amostra enquanto exclui quaisquer sinais fora do plano. Adicionalmente, um microscópio confocal de disco giratório frequentemente permite tempos mais rápidos de aquisição de imagens, mas com prejuízo no controle fino da detecção de fluorescência em comparação com um microscópio confocal de varredura pontual. O tamanho dos embriões também pode ser desafiador, já que muitos microscópios não possuem um campo de visão amplo o suficiente para imagens do embrião sem a necessidade de escaneamento em mosaico. Isso pode levar à presença de artefatos de emenda na imagem (por exemplo, Figura 2B). A multiplexação de amostras também pode levar a vazamento de sinal entre canais (por exemplo, Figura 4B), o que pode ser mitigado pela seleção de um microscópio confocal de varredura pontual em que as janelas de detecção podem ser estreitadas, especialmente quando os fluoróforos apresentam pequenas sobreposições nos espectros de emissão. O uso do fluoróforo Opal 780 é útil para multiplexar ainda mais alvos em uma única amostra; é necessário um microscópio com capacidade de imagem no infravermelho próximo para detectar esse sistema. Essa capacidade não está disponível na maioria dos microscópios ópticos.

O acondicionamento das amostras para a aquisição de imagens também exige uma consideração cuidadosa. Ao permitir que as amostras flutuem livremente, como ao realizar imagens em uma lâmina com câmara de múltiplos poços, as amostras nem sempre ficam exatamente no mesmo ângulo para a aquisição. Isso pode levar a diferenças na intensidade da coloração, dependendo de quais partes do embrião estão mais próximas da câmera/detector, e pode causar dificuldades ao realizar análises de intensidade posteriores. Um problema adicional ao usar lâminas com câmara de múltiplos poços é que a borda do poço pode estar dentro do campo de imagem, o que pode gerar artefatos na imagem. Fixar o embrião, como em uma lâmina de cavidade, pode ajudar a manter a orientação, mas pode facilitar o dano e/ou a compressão do embrião, tornando a análise de volume de estruturas desafiadora.

Várias considerações precisam ser feitas ao seguir este protocolo. Para imunofluorescência, é necessário ter cuidado durante a recuperação de antígenos para não dissociar o embrião, especialmente ao analisar embriões mais jovens. Para evitar isso, pode ser possível utilizar outros métodos de recuperação de antígenos, como o uso de um tampão alternativo, como Tris/EDTA, ou um método de recuperação proteolítica. Embriões menores ou maiores podem se beneficiar da otimização dos tempos de incubação com os anticorpos. É necessário um cuidado especial na escolha dos anticorpos primários, já que diversos anticorpos são produzidos em camundongos, mas o uso de anticorpos anti-rato pode ligar-se ao saco vitelino residual e fluorescer intensamente. Isso pode ser observado com anticorpos secundários anti-rato conjugados ao AlexaFluor 488 (Figura 2) e ao AlexaFluor 647 (Figura 4). Outros fluoróforos não foram testados em nosso laboratório, mas podem apresentar intensidades de fluorescência diferentes, exigindo mais otimização. Esse efeito não é observado nos canais onde foram utilizados anticorpos anti-coelho (Figura 2, Figura 4, Figura 5) ou anti-rato (Figura 2B); portanto, recomenda-se, sempre que possível, o uso de anticorpos primários produzidos em outras espécies.

Para a técnica RNAscope, é extremamente importante otimizar os passos de incubação com protease, pois tempo insuficiente pode resultar em penetração inadequada das sondas, enquanto tempo excessivo pode levar à completa dissociação da amostra. Ao otimizar os tempos de incubação com protease, recomendamos modificar a duração em um único minuto por vez. É considerada uma boa prática também utilizar controles apropriados para determinar se uma sonda ou anticorpo funcionou. Um controle negativo seria um embrião de estágio equivalente corado simultaneamente sem sonda/sem anticorpo primário, ou o uso de um controle de isotipo IgG ou uma sonda de controle negativo para imunofluorescência ou RNAscope, respectivamente, a fim de confirmar que a coloração observada é real. Controles positivos, compostos por um tecido de tamanho equivalente conhecido por expressar o gene ou transcrição de interesse, também podem ser úteis para determinar se a coloração foi bem-sucedida.

No geral, este protocolo é um método robusto e otimizado para visualizar a expressão de proteínas e transcritos em embriões de camundongo inteiros aos estágios E8,5 e E9,5, com grande potencial para investigar mecanismos celulares e moleculares no desenvolvimento embrionário normal e em doenças.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesse financeiro.

Agradecimentos

Os autores agradecem à equipe da infraestrutura de imagem celular, Centro de Genética Humana, Universidade de Oxford, pelo apoio técnico com a microscopia e a análise de imagens incluídas neste manuscrito. Os autores agradecem ao pessoal dos Serviços Biomédicos, Universidade de Oxford, pelo suporte na manutenção dos animais e acasalamentos programados para gerar embriões.

O financiamento para esta pesquisa foi fornecido pela British Heart Foundation Senior Fellowship FS/SBSRF/22/31022 (DBS), Additional Ventures Single Ventricle Fund (DBS), o John Fell Fund, University of Oxford 0016065 (VSR) e o Medical Sciences Internal Fund, University of Oxford 0016707 (VSR).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Plasticware/glassware
Pipetas Pasteur de 3 ml em polietileno de baixa densidade (LDPE), graduadasWheaton711116
Tubos Eppendorf Safe-lock, microtubo de 1,5 mlEppendorf0030 120.086
Ibidi µ-slide com 18 poços Ibidi81817lamínula de vidro #1.5H, não tratada
Lâminas de microscopia Menzel X1000, 22x50 mm, #1.5 (0,16-0,19 mm)Thermo Scientific17284904
Lâminas de microscopia com cavidadesMarienfeld Superior1320000
Microtubo Safe seal de 2 mlSarstedt72.695.500tubo de 2 ml tipo 'Eppendorf', fundo redondo
Soluções/tampões
Tampão diluidor/bloqueador 1xAkoya BiosciencesARD1001EA
Solução descontaminante Ambion™ RnaseZap™Ambion9780.9782
Tampão desmascarante à base de citratoVector labs H-3300Rotulado como solução desmascarante de antígeno,
à base de ácido cítrico
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)Merck (Sigma-Aldrich)D8418
Solução salina balanceada de Hank 10xMerck (Sigma-Aldrich)H4641
Solução de peróxido de hidrogênioMerck (Sigma-Aldrich)H100930% (p/p) em H2O
MetanolMerck (Sigma-Aldrich)32213-2.5L-M
Soro normal de jumento AbcamAb7475Concentração estoque de 100%,
concentração final de 10%
Pó de paraformaldeído (PFA)Merck (Sigma-Aldrich)158127-500gDiluir para 4% em água. Preparar na capela. Agitar em bloco aquecido e adicionar uma pequena quantidade de NaOH para facilitar a dissolução. pH 7,2-7,6
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Merck (Sigma-Aldrich)P44171 comprimido por 200 ml de água destilada
Kit auxiliar RNAscope 4-Plex para Kit de Reagentes Fluorescentes Multiplex v2ACD (Bio-Techne)323120Contém HRP-C4 e bloqueador de HRP
Kit de Detecção Fluorescente Multiplex RNAscope™ v2 ACD (Bio-Techne)323110Contém Protease Plus, Protease III,
Protease IV, peróxido de hidrogênio, tampão TSA,
Amp1/2/3, Hrp-C1/2/3, bloqueador de HRP e DAPI
Solução tampão Salina-Citrato de Sódio (SSC) 20XFisher BioreagentsBP-1325-1Diluir para 0,2x em água destilada
Reagente de clareamento de tecidos Cubic-R+(M) [para animais]Tokyo Chemical IndustryT3741
Triton™ X 100Merck (Sigma-Aldrich)X100
Tween® 20Merck (Sigma-Aldrich)P7949
EDTA Ultrapuro™ 0,5 M, pH 8Invitrogen15575020
Anticorpos primários
Anticorpo contra endomucina (V.7C7) Santa CruzSC-65495Usar diluição 1:50. 
Anticorpo contra Islet 1 e Islet 2Developmental Studies Hybridioma Bank34.4DS-5Diluir em 50% de glicerol. Usar diluição 1:50.
Anticorpo monoclonal murino contra PCNA (PC10)Cell Signaling Technology2586SUsar diluição 1:500
Anticorpo monoclonal murino contra P-histona H3 (Ser10) (6G3)Cell Signaling Technology9706SUsar diluição 1:500
Anticorpo monoclonal coelho contra P-histona H3 (Ser10) (D7N8E) XP®Cell Signaling Technology53348SUsar diluição 1:500
Anticorpo monoclonal coelho Sox10 (E6B6I) XP® Cell Signaling Technology69661SUsar diluição 1:500
Anticorpos secundários/contracolorações nucleares
AlexaFluor® 488 conjugado com Affinipure® Donkey anti-IgG de camundongo (H+L)Jackson Immunoresearch715-545-151Usar diluição 1:500
AlexaFluor® 647 conjugado com Affinipure®  Donkey anti-IgG de rato (H+L)Jackson Immunoresearch712-605-153Usar diluição 1:500
AlexaFluor® 647 conjugado com fragmento F(ab')2 Affinipure® Donkey anti-IgG de camundongo (H+L)Jackson Immunoresearch715-606-150Usar diluição 1:500
Cy™3 Affinipure® Donkey anti-IgG de coelho (H+L)Jackson Immunoresearch711-165-152Usar diluição 1:500
DAPIMerck (Sigma-Aldrich)D9542Usado a 1 µg/ml
Probes do RNAscope
Probe RNAscope® - Mm Sp5-C4ACD (Bio-Techne)405681-C4probe C4
Probe RNAscope® - Mm-Dlx2-C3ACD (Bio-Techne)555951-C3probe C3
Probe RNAscope® - Mm-Msx1ACD (Bio-Techne)421841probe C1
Probe RNAscope® - Mm-Sox10-C2ACD (Bio-Techne)435931-C2probe C2
Fluoróforos do RNAscope
Opal 780 Reagent PackAkoya BiosciencesFP1501001KT Contém reagente Opal 780, Opal TSA-DIG,
DMSO
Fluoróforo TSA-vivid™ 520ACD (Bio-Techne)323271agora ClariTSA™ fluoróforo 520
Fluoróforo TSA-vivid™ 570ACD (Bio-Techne)323272agora ClariTSA™ fluoróforo 570
Fluoróforo TSA-vivid™ 650ACD (Bio-Techne)323273agora ClariTSA™ fluoróforo 650
Equipamentos/software
Microscópio de varredura a laser Fluoview FV4000 Evidentfv4000Lasers de excitação: 405/488/561/640/730 nm.
Comprimentos de onda detectados (Fig. 3): 430-470, 500-540, 570-620,
650-710, 750-850 nm. Comprimentos de onda detectados (Fig. 4): 430-470,
500-531, 570-620 nm.
Graphpad Prism 10Graphpadv10.6.1
Bloco de aquecimentoGrantQBT1
Estufa de hibridização HybrigeneTechne (Bibby Scientific)FHB4DD
Sistema de microscopia de super-resolução Ixplore IX83 SpinSROlympusixplore-ix83-spinsrLasers de excitação: 405/488/561/640 nm.
Filtros de emissão: 447/60, 525/50, 617/73, 685/40. 
Zeiss Arivis Pro Carl Zeiss Microscopy GmbHv. 4.5 (anteriormente Arivis Vision 4D)
Conversor Zeiss Arivis SISCarl Zeiss Microscopy GmbHv. 4.3.0

Referências

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