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Artigo de método

Avaliação Guiada por Rede do $\beta$-sitosterol em Modelos de Células Mesangiais Inflamatórias e Profibróticas Relevantes para Glomerulonefrite Crônica

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DOI:

10.3791/73000

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28 de agosto de 2026

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1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo integra farmacologia de rede, acoplamento molecular validado e experimentos in vitro para avaliar as relações candidatas entre compostos e alvos entre os constituintes do Cordyceps sinensis e processos relacionados à glomerulonefrite crônica. O β-sitosterol foi selecionado para validação em nível de composto e demonstrou atenuar a ativação inflamatória e profibrótica em modelos de células mesangiais.

Resumo

A nefrite glomerular crônica (NGC) caracteriza-se por lesão inflamatória persistente e remodelação fibrótica progressiva, porém as relações entre compostos e alvos subjacentes às intervenções baseadas em produtos naturais ainda não são completamente definidas. Este estudo integrou farmacologia de redes, acoplamento molecular validado e experimentos in vitro para avaliar os constituintes candidatos de Cordyceps sinensis (C. sinensis) em processos patológicos relacionados à NGC. Os constituintes candidatos de C. sinensis foram selecionados, e os alvos associados aos compostos provenientes da plataforma de análise e banco de dados de farmacologia sistêmica da medicina tradicional chinesa foram cruzados com genes associados à NGC. Análises de enriquecimento funcional e de interação proteína-proteína foram utilizadas para priorizar processos biológicos e alvos centrais. PTGS2 foi identificado como um alvo central com sobreposição significativa. O acoplamento molecular foi realizado utilizando uma estrutura da COX-2 ligada à celecoxibe. O reacoplamento do ligante celecoxibe co-cristalizado reproduziu a conformação cristalográfica com um RMSD de 0,876 Å, validando o protocolo de acoplamento. O β-sitosterol e o acetato de linoleila mostraram compatibilidade prevista com a região de acoplamento da COX-2, com afinidades de ligação de −7,2 e −7,5 kcal/mol, respectivamente. O β-sitosterol foi selecionado para validação em nível de composto em células mesangiais glomerulares de rato HBZY-1. Nas concentrações de 0,5 a 10 µM, o β-sitosterol não reduziu significativamente a viabilidade celular. Em células estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS), o β-sitosterol reduziu a expressão de Tnf, Il6 e Ptgs2, diminuiu a produção de prostaglandina E2 (PGE2) e reduziu a abundância da proteína ciclo-oxigenase-2 (COX-2). Em células tratadas com fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1), o β-sitosterol reduziu a expressão de Col1a1 e Acta2 e diminuiu a abundância da proteína alfa-actina de músculo liso (α-SMA). Esses achados fornecem evidências geradoras de hipóteses de que o β-sitosterol modula a ativação inflamatória e pró-fibrótica em modelos de células mesangiais, mas não comprovam inibição direta da atividade enzimática da COX-2 nem eficácia terapêutica na NGC.

Introdução

A glomerulonefrite crônica (CGN) compreende um grupo heterogêneo de distúrbios glomerulares que podem evoluir para doença renal crônica e doença renal em estágio terminal1. Caracteriza-se por lesão glomerular persistente, ativação inflamatória e remodelamento fibrótico progressivo2,3. Embora corticosteroides e agentes imunossupressores sejam utilizados em pacientes selecionados, o controle da doença a longo prazo permanece difícil em muitos casos, e os efeitos adversos relacionados ao tratamento são comuns1,4,5. A progressão da CGN envolve processos patológicos interativos, incluindo ativação imunológica, disfunção endotelial, estresse oxidativo e acúmulo de matriz extracelular3,6,7. Portanto, identificar nós moleculares que conectem respostas inflamatórias e pró-fibróticas pode ajudar a gerar hipóteses testáveis para estratégias de intervenção relevantes à doença.

Cordyceps sinensis (C. sinensis) tem sido utilizada em contextos clínicos e experimentais relacionados aos rins e demonstrou exercer efeitos anti-inflamatórios, antiapoptóticos e citoprotetores em diversos modelos de doenças8,9,10. No entanto, a base molecular pela qual seus constituintes candidatos podem interagir com alvos relevantes para a glomerulonefrite permanece insuficientemente definida11. Dada a natureza multicomponente do C. sinensis e a heterogeneidade mecanicista da NCG, a farmacologia de rede fornece uma estrutura útil para priorizar relações candidatas entre compostos, alvos e vias12,13.

Neste estudo, foram integrados triagem de compostos, recuperação de alvos, análise de interseção entre genes e doenças, enriquecimento funcional, análise de rede de interação proteína-proteína, acoplamento molecular e validação in vitro para explorar possíveis relações moleculares entre os constituintes candidatos de C. sinensis e os processos patológicos relacionados à CGN. A prostaglandina-endoperoxido sintase 2 (PTGS2) foi priorizada como um alvo central na rede composto-doença e avaliada por acoplamento molecular utilizando uma estrutura da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) ligada à celecoxiba, com validação por redocking. Com base nos resultados da rede, na análise de acoplamento e em evidências prévias de atividade anti-inflamatória e anti-fibroticativa, o β-sitosterol foi selecionado como um composto candidato representativo para validação posterior14,15,16. Células mesangiais estimuladas por lipopolissacarídeo (LPS) foram utilizadas para avaliar a ativação inflamatória e a resposta associada à COX-2/prostaglandina E2 (PGE2), enquanto um modelo induzido por fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1) foi incluído para avaliar a expressão de marcadores pró-fibroticos.

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Protocolo

As análises de farmacologia de rede e bioinformática basearam-se em bancos de dados publicamente disponíveis e não envolveram participantes humanos ou animais. Os experimentos in vitro foram realizados utilizando uma linhagem celular estabelecida e não exigiram aprovação ética conforme as exigências institucionais.

Triagem de constituintes candidatos e recuperação de alvos

Os constituintes candidatos e seus respectivos alvos foram recuperados do Banco de Dados e Plataforma de Análise de Farmacologia de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP) utilizando o termo de busca “dongchongxiacao” em 13 de julho de 2025. Foram mantidos os compostos com biodisponibilidade oral prevista de pelo menos 30% e semelhança a fármacos de pelo menos 0,18. Sete constituintes candidatos atenderam a ambos os critérios de triagem. O peso molecular, biodisponibilidade oral, semelhança a fármacos e outros descritores farmacocinéticos disponíveis foram registrados do TCMSP para comparação descritiva.

As informações sobre compostos-alvo associadas aos constituintes mantidos foram baixadas diretamente do TCMSP. Entradas duplicadas de alvos foram removidas manualmente durante a construção do conjunto não redundante de alvos, enquanto as relações originais entre compostos e alvos foram mantidas para a construção subsequente da rede. Como o TCMSP forneceu os nomes dos alvos em sua forma completa, e não em símbolos gênicos padronizados, cada alvo foi pesquisado na base de dados UniProt (acessada em 14 de julho de 2025). A entrada correspondente humana foi selecionada e o nome do alvo foi convertido para seu símbolo gênico oficial. O conjunto padronizado de dados de compostos e alvos foi utilizado para a interseção entre alvos de doenças e análise da rede de compostos-alvos.

Coleta de genes associados à glomerulonefrite e interseção de alvos

Os genes associados à doença foram recuperados do GeneCards, DisGeNET, PharmGKB e do Banco de Dados de Alvos Terapêuticos utilizando o termo de busca “glomerulonefrite” em 14 de julho de 2025. Para o GeneCards, foram mantidas as entradas com pontuações de relevância superiores à pontuação mediana de 10. As entradas elegíveis dos outros bancos de dados foram incluídas de acordo com suas anotações curadas de doença-alvo. Os nomes dos genes foram padronizados para os símbolos oficiais dos genes humanos, e as entradas duplicadas foram removidas. Esse procedimento resultou em 1.134 genes únicos associados à glomerulonefrite. Como a busca utilizou o termo mais amplo “glomerulonefrite”, considerou-se que o conjunto de dados resultante é relevante para os processos moleculares associados à glomerulonefrite crônica, e não específico a um único subtipo histopatológico.

Os alvos associados aos compostos derivados do TCMSP foram cruzados com o conjunto de genes associados à doença usando R. Vinte e três alvos sobrepostos foram identificados. Diagramas de Venn foram gerados utilizando o pacote venn do R, e a rede de alvos sobrepostos aos compostos foi construída e visualizada usando o Cytoscape. As relações entre os constituintes candidatos e os alvos sobrepostos são resumidas na Tabela 1.

Análises de enriquecimento funcional e interações proteína-proteína

Análises de enriquecimento da Gene Ontology (GO) e do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foram realizadas em R utilizando os pacotes clusterProfiler e org.Hs.eg.db. Os termos da Gene Ontology foram analisados nas categorias processo biológico, componente celular e função molecular. Os valores de P foram ajustados para testes múltiplos utilizando o método de Benjamini-Hochberg, e termos ou vias com valores de P ajustados abaixo de 0,05 foram mantidos. Os termos e vias enriquecidos foram exibidos utilizando gráficos de barras e gráficos de pontos gerados independentemente.

Os 23 alvos sobrepostos foram submetidos ao STRING, com Homo sapiens selecionado como o organismo e pontuação mínima de interação superior a 0,4. A rede de interação proteína-proteína resultante foi importada para o Cytoscape. A topologia da rede foi avaliada utilizando o CytoNCA com base no grau, centralidade de intermediação, centralidade de proximidade, centralidade do vetor próprio, conectividade média local e centralidade da rede. Os alvos centrais foram definidos como nós nos quais os valores de grau, centralidade de intermediação, centralidade de proximidade, centralidade do vetor próprio, conectividade média local e centralidade da rede eram todos superiores aos valores medianos correspondentes da rede. Essa análise priorizou nove alvos centrais para interpretação subsequente.

Validação de docking e redocking moleculares

O encaixe molecular foi realizado utilizando a estrutura da ciclo-oxigenase-2 ligada ao celecoxibe, com ID PDB 3LN1. A cadeia A e seu grupo heme associado foram mantidas como receptor, enquanto as moléculas de água cristalográficas e o ligante de celecoxibe co-cristalizado foram removidos durante a preparação do receptor. A conformação nativa do celecoxibe foi extraída separadamente da cadeia A para validação por redocking. Átomos de hidrogênio polares e cargas de Gasteiger foram adicionados usando o AutoDockTools, e o receptor foi salvo no formato PDBQT. O ID PDB 3LN1 corresponde a uma estrutura de 2,40 Å da COX-2 murina ligada ao celecoxibe. As estruturas do β-sitosterol e do acetato de linoleila foram obtidas do PubChem e preparadas usando o Open Babel. Átomos de hidrogênio e cargas parciais de Gasteiger foram adicionados, ligações rotatórias foram definidas, e cada ligante foi convertido para o formato PDBQT. Celecoxibe, β-sitosterol e acetato de linoleila foram submetidos ao encaixe molecular usando o AutoDock Vina com os mesmos parâmetros do receptor e da busca.

A caixa de encaixe foi centralizada na região nativa de ligação da celecoxiba usando as seguintes coordenadas: center_x = 30,9886 center_y = -22,2836 center_z = -16,5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. O valor de exaustividade foi definido como 16, o número de modos de saída como 10 e a faixa de energia como 3 kcal/mol. A conformação com a maior classificação, com base na menor energia de ligação prevista, foi mantida para visualização. Para validação do protocolo, a celecoxiba nativa foi reencaixada nas mesmas condições, e o desvio quadrático médio dos átomos pesados entre as conformações cristalográfica e reencaixada foi calculado usando o PyMOL. Um desvio quadrático médio inferior a 2 Å foi considerado uma reprodução aceitável da conformação de referência. Os resíduos localizados a menos de 4 Å de cada ligante encaixado foram identificados no PyMOL. Os escores de encaixe e as conformações foram interpretados como estimativas de compatibilidade estrutural e não como evidência direta de ligação ao alvo ou inibição enzimática.

Cultura celular e preparação do composto

Células mesangiais glomerulares de rato HBZY-1 foram cultivadas em meio Eagle modificado de Dulbecco com alta concentração de glicose, suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina, a 37 °C em condições úmidas com 5% de CO₂. Células entre as passagens 2–7 foram utilizadas em todos os experimentos, e o status livre de micoplasma foi verificado antes do uso. β-Sitosterol e celecoxib foram utilizados como compostos quimicamente definidos. O β-sitosterol foi dissolvido em etanol absoluto para gerar uma solução estoque de 10 mM (aproximadamente 4,15 mg/mL). Quando necessário, realizou-se breve sonicação e aquecimento a 50–60 °C para obter uma solução visualmente clara. A celecoxib foi dissolvida em dimetilsulfóxido para preparar uma solução estoque de 10 mM (aproximadamente 3,81 mg/mL). As soluções estoque foram aliquotadas e armazenadas a −20 °C. Antes do tratamento, os estoques foram diluídos diretamente no meio de cultura pré-aquecido e misturados imediatamente.

As concentrações de veículo foram igualadas dentro de cada experimento. No ensaio de viabilidade celular, a concentração final de etanol foi ajustada para 0,2% v/v em todos os grupos, pois a maior concentração de β-sitosterol testada foi de 20 µM. No experimento inflamatório induzido por LPS, as concentrações finais de etanol e dimetil sulfóxido foram ajustadas para 0,1% e 0,01% v/v, respectivamente, em todos os grupos. No experimento profibrótico induzido por TGF-β1, a concentração final de etanol foi ajustada para 0,1% v/v em todos os grupos. Volumes equivalentes dos veículos correspondentes foram adicionados aos grupos Controle, LPS e TGF-β1.

Ensaio de viabilidade celular

As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 × 103 células por poço em 100 µL de meio completo e mantidas em incubação por 24 h para aderência. Para avaliar a faixa de concentração de β-sitosterol, as células foram incubadas com 0,5, 1, 5, 10 ou 20 µM de β-sitosterol por 24 h. Para o ensaio de viabilidade celular relacionado à LPS, as células foram pré-tratadas com β-sitosterol nas concentrações de 1, 5 ou 10 µM por 2 h, seguido de exposição a 1 µg/mL de lipopolissacarídeo por mais 24 h.

Os grupos de tratamento foram Controle, β-sitosterol a 0,5 µM, β-sitosterol a 1 µM, β-sitosterol a 5 µM, β-sitosterol a 10 µM, β-sitosterol a 20 µM, LPS, LPS mais β-sitosterol a 1 µM, LPS mais β-sitosterol a 5 µM e LPS mais β-sitosterol a 10 µM. O reagente do Kit de Contagem de Células-8 foi adicionado na quantidade de 10 µL por poço e as placas foram incubadas por 2 h. A absorbância foi então registrada em 450 nm. A viabilidade celular foi determinada após a subtração do branco sem células e expressa em relação ao grupo Controle. Cada condição incluiu seis poços técnicos em cada um dos seis experimentos biológicos independentes. Os valores dos poços técnicos de cada experimento foram médios para gerar um valor por replicata biológica para análise estatística.

Ativação inflamatória induzida por LPS

Para experimentos de ativação inflamatória, as células HBZY-1 foram semeadas em placas de 6 poços com uma densidade de 2 × 105 células por poço e tratadas após atingirem cerca de 70%–80% de confluência. As células foram mantidas em meio suplementado com 1% de soro bovino fetal durante 12 h antes do tratamento. β-Sitosterol ou celecoxib foram administrados 2 h antes da estimulação com LPS. Posteriormente, as células foram expostas a 1 µg/mL de LPS por 24 h.

Os grupos experimentais foram Controle, β-sitosterol a 10 µM, LPS, LPS mais β-sitosterol a 1 µM, LPS mais β-sitosterol a 5 µM, LPS mais β-sitosterol a 10 µM, e LPS mais celecoxibe a 1 µM. O celecoxibe foi incluído como controle positivo funcional para inibição da produção de prostaglandinas dependente de COX-2. Ao final do tratamento, os sobrenadantes de cultura foram coletados para a medição de PGE2. As células foram coletadas separadamente para análise de PCR quantitativa em tempo real de Tnf, Il6 e Ptgs2 e para análise de western blot de COX-2.

Ativação profibrótica induzida por TGF-β1

Um modelo independente induzido por TGF-β1 foi utilizado para avaliar a ativação profibrótica. As células HBZY-1 foram semeadas em placas de 6 poços numa densidade de 2 × 105 células por poço e mantidas em meio suplementado com 1% de soro bovino fetal durante 12 h antes do tratamento. As células foram pré-tratadas com β-sitosterol durante 2 h, seguidas de estimulação com TGF-β1 recombinante 10 ng/mL durante 48 h.

Os grupos de tratamento incluíram Controle, β-sitosterol (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-sitosterol (5 µM) e TGF-β1 + β-sitosterol (10 µM). Ao final do período de tratamento, as células foram coletadas para análise quantitativa por PCR em tempo real de Col1a1 e Acta2 e para análise por western blot de actina alfa-lisa muscular (α-SMA).

PCR quantitativa em tempo real

O RNA total foi isolado de células tratadas utilizando um reagente de extração de RNA baseado em fenol-guanidínio, conforme o protocolo do fabricante. A concentração e a pureza do RNA foram determinadas utilizando um espectrofotômetro. Apenas amostras com uma razão A260/A280 entre 1,8 e 2,0 foram utilizadas para a transcrição reversa. Para cada amostra, 1 µg de RNA total foi transcrito reversamente em DNA complementar em um volume final de reação de 20 µL. O DNA complementar resultante foi diluído cinco vezes com água livre de nucleases antes da PCR quantitativa. A PCR quantitativa foi realizada em um volume total de 20 µL contendo 10 µL de mix mestre 2× SYBR Green, 0,4 µL de cada iniciador (sentido e antissentido) a 10 µM, 2 µL de DNA complementar diluído e 7,2 µL de água livre de nucleases. As condições de amplificação consistiram em uma etapa inicial de desnaturação a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 5 s e anelamento-extensão a 60 °C por 30 s. Uma análise de curva de dissociação foi subsequentemente realizada de 65 °C a 95 °C para verificar a especificidade da amplificação.

Os genes medidos foram Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 e Gapdh. O gene Gapdh foi utilizado como gene de referência interno. A expressão gênica relativa foi determinada pelo método 2−ΔΔCt, utilizando o grupo Controle como calibrador. As sequências dos primers estão fornecidas na Tabela Suplementar 1. Cada amostra foi analisada em triplicata técnica, e seis experimentos biológicos independentes foram realizados. Os valores obtidos das réplicas técnicas foram médias antes da análise estatística.

Medição de PGE2 por ensaio imunoenzimático (ELISA)

Os sobrenadantes de cultura foram coletados após 24 h de estimulação com LPS e centrifugados a 1.000 ×g durante 10 min a 4 °C para remover debris celular. As concentrações de PGE2 foram determinadas utilizando um kit comercialmente disponível de ensaio imunoenzimático segundo as instruções do fabricante.

Os padrões e amostras foram carregados na placa do ensaio em duplicata. Após a conclusão das etapas de ligação do anticorpo e desenvolvimento da cor, a absorbância foi registrada a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. As concentrações de PGE2 foram determinadas a partir de uma curva padrão logística de quatro parâmetros e expressas em pg/mL. Os sobrenadantes de seis experimentos celulares independentes foram analisados. As medidas em duplicata de cada amostra biológica foram médias antes da análise estatística.

Western blotting

As células tratadas foram lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação suplementado com uma mistura de inibidores de protease. Os lisados foram incubados em gelo durante 30 min e centrifugados a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C. As concentrações de proteína nos sobrenadantes foram determinadas utilizando um ensaio de proteína com ácido bicinconínico. Quantidades iguais de proteína (30 µg por poço) foram misturadas com tampão de carga e desnaturadas a 95 °C por 5 min. As proteínas dos experimentos com LPS foram separadas em géis de poliacrilamida a 10% com dodecilsulfato de sódio, enquanto aquelas dos experimentos com TGF-β1 foram separadas em géis a 12%. As proteínas separadas foram posteriormente transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno.

As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween 20 por 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) e GAPDH (1:5000). A COX-2 foi analisada em amostras do experimento com LPS, enquanto o α-SMA foi analisado em amostras do experimento com TGF-β1. Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados à peroxidase do rábano (1:5000) por 1 h à temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas utilizando um substrato de quimioluminescência aprimorado e capturadas com um sistema de imagem de quimioluminescência. Os tempos de exposição foram de aproximadamente 10 s para COX-2, 10 s para α-SMA e 2 s para GAPDH.

As intensidades das bandas foram quantificadas utilizando o ImageJ. Os sinais de COX-2 e α-SMA foram normalizados em relação ao sinal correspondente de GAPDH. O Western blotting foi realizado utilizando amostras proteicas obtidas de seis experimentos independentes de cultivo celular e tratamento.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Seis experimentos independentes de cultura celular e tratamento foram realizados para cada análise quantitativa, sendo cada experimento independente considerado uma replicata biológica. As medidas das réplicas técnicas obtidas do mesmo experimento biológico foram médias antes da análise estatística e não foram consideradas observações independentes.

Para o ensaio de viabilidade celular, cada experimento biológico incluiu seis poços técnicos por condição. As reações de PCR quantitativo foram realizadas em triplicata técnica para cada amostra biológica, e as medições de PGE2 foram realizadas em duplicata. A quantificação por Western blot foi baseada em seis amostras de proteína preparadas independentemente. Assim, cada barra quantitativa contém seis valores individuais de réplicas biológicas.

As diferenças entre múltiplos grupos foram analisadas utilizando análise de variância unidirecional seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Um valor P bilateral < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Os valores individuais de réplicas biológicas foram apresentados juntamente com a média e o desvio padrão.

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Resultados

Triagem de Constituintes Candidatos, Recuperação de Alvos e Interseção de Alvos

O fluxo de trabalho para identificação de alvos sobrepostos candidatos entre compostos e doenças é resumido na Figura 1A. Sete compostos candidatos de C. sinensis atenderam aos critérios predefinidos de triagem de OB ≥30% e DL ≥0,18, incluindo ácido araquidônico, acetato de linoleila, β-sitosterol, peroxiergosterol, cerevisterol, palmitato de colesterol e CLR ...

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Discussão

Este estudo integrou farmacologia de rede, encaixe molecular validado por ligantes de referência e experimentos em nível de compostos para examinar uma hipótese associada ao PTGS2 derivada de constituintes candidatos de C. sinensis. Sete constituintes atenderam aos critérios pré-definidos de triagem do TCMSP, e 23 alvos apresentaram sobreposição com o conjunto de genes associados à glomerulonefrite. A análise de interação proteica priorizou nove alvos centrais, dentre os quais o PTGS2 foi selec...

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Divulgações

Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes. Ferramentas baseadas em inteligência artificial (ChatGPT, OpenAI) foram utilizadas para auxiliar na edição da linguagem e no design preliminar das figuras esquemáticas. A inteligência artificial generativa foi usada para auxiliar na preparação de rascunhos gráficos preliminares das Figuras 1A e 7, que posteriormente foram revisados e modificados pelos autores para garantir a consistência com os métodos e resultados relatados. Todas as saídas assistidas por IA foram criticamente avaliadas e aprovadas pelos autores. Os autores verificaram o conteúdo final das figuras e assumiram total responsabilidade pela integridade e precisão do manuscrito.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Especialidade Característica de Nefropatia pela Medicina Integrada Chinesa Tradicional e Ocidental (ZYTSZK2-3) e pelo Estudo sobre Estratégia de Intervenção da MTC na Doença Renal Crônica sob a Perspectiva do Manejo de Doenças Crônicas (202240169).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Etanol absolutoSigma-Aldrich/MerckE7023Etanol grau biologia molecular não desnaturado, 200 provas; solvente para estoque de β-sitosterol.
AutoDock VinaScripps ResearchVersão 1.1.2Simulação de encaixe molecular
Cabinet de biossegurançaThermo Fisher ScientificSérie 1300 A2Operações estéreis de cultura celular
CelecoxibMedChemExpressHY-14398Inibidor seletivo da COX-2 utilizado como controle positivo; estoque de 10 mM em DMSO. 
Kit de contagem celular-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04Ensaio colorimétrico WST-8 para viabilidade celular; absorbância medida a 450 nm.
Sistema de imagem de quimioluminescênciaBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPAquisição de imagem de Western blot
Pacote R clusterProfilerBioconductorVersão 4.10.0Análise de enriquecimento GO e KEGG
Incubadora de cultura celular com CO2Thermo Fisher ScientificForma Série II 3111Incubação de cultura celular a 37 °C e 5% CO2
Anticorpo monoclonal de coelho contra COX-2 (D5H5)Cell Signaling Technology12282Validado para Western blot de COX-2 humano, de camundongo e de rato; utilizado na diluição 1:1.000.
Plugin CytoNCALoja de Aplicativos CytoscapeVersão 2.1.6Análise topológica de alvos centrais
Software CytoscapeConsortium CytoscapeVersão 3.8.0Visualização e análise de redes
Dissulfóxido de dimetilaSigma-Aldrich/MerckD2650Reagente BioReagent filtrado esterilmente, ≥99,7%; solvente para estoque de celecoxib.
Banco de dados DisGeNETGrupo de Informática Biomédica IntegrativaNão aplicávelRecuperação de genes associados à glomerulonefrite
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTMeio basal para cultura celular HBZY-1
Substrato de quimioluminescência aprimoradoBeyotime BiotechnologyP0018SVisualização de bandas em Western blot
Soro bovino fetalGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141CSuplemento sérico para cultura celular
Anticorpo monoclonal de coelho contra GAPDH (D16H11)Cell Signaling Technology5174Controle de carga em Western blot; reativo com GAPDH humano, de camundongo e de rato; utilizado na diluição 1:5.000 após otimização interna.
Banco de dados GeneCardsInstituto Weizmann de CiênciaNARecuperação de genes associados à glomerulonefrite
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersão 9.0.0.121Análise estatística de dados experimentais in vitro
IgG de cabra anti-coelho conjugado com HRPProteintech GroupSA00001-2Anticorpo secundário para anticorpos primários de coelho
Software ImageJInstitutos Nacionais de SaúdeVersão 1.54Análise densitométrica de Western blot
Microscópio invertido de contraste de faseOlympusCKX53Observação da morfologia celular
Pacote R org.Hs.eg.dbBioconductorVersão 3.18.0Anotação gênica humana para análise de enriquecimento
Solução de penicilina-estreptomicinaGibco/Thermo Fisher Scientific15140122Suplemento antibiótico para cultura celular
Kit de ensaio para parâmetros de PGE2R&D Systems, uma marca Bio-TechneKGE004BELISA competitivo multiespécies para sobrenadantes de cultura celular; faixa do ensaio 39–2.500 pg/mL; detecção colorimétrica a 450 nm.
Banco de dados PharmGKBPharmacogenomics KnowledgebaseNARecuperação de alvos relacionados à doença
Banco de dados PubChemCentro Nacional de Informação BiotecnológicaNARecuperação de estruturas de ligantes
Membrana de PVDFMillipore/MerckIPVH00010Membrana de transferência proteica para Western blotting
Sistema gráfico molecular PyMOLSchrödinger, LLCVersão 2.6.2Visualização de poses de encaixe
Software RR Foundation for Statistical ComputingVersão 4.3.2Análise de interseção de alvos e enriquecimento
Linhagem celular de mesângio glomerular de rato (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117Modelo in vitro para validação de células mesangiais
Banco de Dados de Proteínas RCSBResearch Collaboratory for Structural BioinformaticsID PDB: 3LN1Recuperação da estrutura cristalina de PTGS2/COX2
Proteína recombinante humana TGF-β1PeproTech, uma marca Thermo Fisher Scientific100-21-10UGTGF-β1 recombinante humano derivado de HEK293; estímulo profibrótico a 10 ng/mL. 
Sistema de eletroforese SDS-PAGEBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraSeparacão proteica por SDS-PAGE
Banco de dados STRINGELIXIR/Consortium STRINGVersão 12.0Construção de rede de interação proteína-proteína
Banco de dados TCMSPTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatabaseNATriagem de compostos candidatos de Cordyceps sinensis
Banco de dados de alvos terapêuticosInnovative Drug Research and Bioinformatics GroupNARecuperação de alvos terapêuticos
Anticorpo primário contra α-SMAProteintech Group14395-1-APDetecção da expressão proteica de α-SMA
β-Sitosterol (pureza >98%)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5; composto definido utilizado para tratamento celular; estoque de 10 mM em etanol absoluto. 

Referências

  1. Kidney Disease: Improving Global Outcomes Glomerular Diseases Work G. KDIGO 2021 Clinical Practice Guideline for the Management of Glomerular Diseases. Kidney Int. 2021;100(4S):S1–S276.
  2. Roccatello D. et al. From inflammation to renal fibrosis: A one-way road in autoimmunity? Autoimmun Rev. 2024;23(4):103466.
  3. Reiss AB. et al. Fibrosis in Chronic Kidney Disease: Pathophysiology and Therapeutic Targets. J Clin Med. 2024;13(7).
  4. Kant S, Kronbichler A, Geetha D. Principles of Immunosuppression in the Management of Kidney Disease: Core Curriculum 2022. Am J Kidney Dis. 2022;80(3):393–405.
  5. El Karoui K, Fervenza FC, De Vriese AS. Treatment of IgA Nephropathy: A Rapidly Evolving Field. J Am Soc Nephrol. 2024;35(1):103–16.
  6. Stenvinkel P. et al. Chronic Inflammation in Chronic Kidney Disease Progression: Role of Nrf2. Kidney Int Rep. 2021;6(7):1775–87.
  7. Tanaka S, Portilla D, Okusa MD. Role of perivascular cells in kidney homeostasis, inflammation, repair and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2023;19(11):721–32.
  8. Liu W. et al. Mechanism of Cordyceps sinensis and its Extracts in the Treatment of Diabetic Kidney Disease: A Review. Front Pharmacol. 2022;13:881835.
  9. Yan G. et al. The effects of Ophiocordyceps sinensis combined with ACEI/ARB on diabetic kidney disease: A systematic review and meta-analysis. Phytomedicine. 2023;108:154531.
  10. Li S, Pang W, Wang Y, Zhang Y. Cordyceps sinensis extract protects against acute kidney injury by inhibiting perforin expression in NK cells via the STING/IRF3 pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(7):5887–904.
  11. Zhang Y, Li K, Zhang C, Liao H, Li R. Research Progress of Cordyceps sinensis and Its Fermented Mycelium Products on Ameliorating Renal Fibrosis by Reducing Epithelial-to-Mesenchymal Transition. J Inflamm Res. 2023;16:2817–30.
  12. Zhao L. et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  13. Ru J. et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 2014;6:13.
  14. Bi Y. et al. beta-Sitosterol Suppresses LPS-Induced Cytokine Production in Human Umbilical Vein Endothelial Cells via MAPKs and NF-kappaB Signaling Pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2023;2023:9241090.
  15. Sun Y, Gao L, Hou W, Wu J. beta-Sitosterol Alleviates Inflammatory Response via Inhibiting the Activation of ERK/p38 and NF-kappaB Pathways in LPS-Exposed BV2 Cells. Biomed Res Int. 2020;2020:7532306.
  16. Park YJ. et al. Effects of beta-Sitosterol from Corn Silk on TGF-beta1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Lung Alveolar Epithelial Cells. J Agric Food Chem. 2019;67(35):9789–95.
  17. Li DD. et al. RTEC-intrinsic IL-17-driven inflammatory circuit amplifies antibody-induced glomerulonephritis and is constrained by Regnase-1. JCI Insight. 2021;6(13).
  18. Martin-Carro B. et al. Role of Klotho and AGE/RAGE-Wnt/beta-Catenin Signalling Pathway on the Development of Cardiac and Renal Fibrosis in Diabetes. Int J Mol Sci. 2023;24(6).
  19. Naas S, Schiffer M, Schodel J. Hypoxia and renal fibrosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2023;325(4):C999–C1016.
  20. Harris RC, Breyer MD. Physiological regulation of cyclooxygenase-2 in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(1):F1–11.
  21. Calder PC. Eicosanoids. Essays Biochem. 2020;64(3):423–41.
  22. Waldner C, Heise G, Schror K, Heering P. COX-2 inhibition and prostaglandin receptors in experimental nephritis. Eur J Clin Invest. 2003;33(11):969–75.
  23. Pan Y. et al. Myeloid cyclooxygenase-2/prostaglandin E2/E-type prostanoid receptor 4 promotes transcription factor MafB-dependent inflammatory resolution in acute kidney injury. Kidney Int. 2022;101(1):79–91.
  24. Volzke A, Koch A, Meyer Zu Heringdorf D, Huwiler A, Pfeilschifter J. Sphingosine 1-phosphate (S1P) induces COX-2 expression and PGE2 formation via S1P receptor 2 in renal mesangial cells. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(1):11–21.
  25. Sawano H. et al. 15-Deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 inhibits IL-1beta-induced cyclooxygenase-2 expression in mesangial cells. Kidney Int. 2002;61(6):1957–67.
  26. Guo B. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligands inhibit TGF-beta 1-induced fibronectin expression in glomerular mesangial cells. Diabetes. 2004;53(1):200–8.
  27. Zou R. et al. PPARgamma agonists inhibit TGF-beta-PKA signaling in glomerulosclerosis. Acta Pharmacol Sin. 2010;31(1):43–50.
  28. Wei J. et al. PP2 Ameliorates Renal Fibrosis by Regulating the NF-kappaB/COX-2 and PPARgamma/UCP2 Pathway in Diabetic Mice. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:7394344.
  29. Yang C, Chen EA, Zhang Y. Protein-Ligand Docking in the Machine-Learning Era. Molecules. 2022;27(14).
  30. Quiroga R, Villarreal MA. Developing Generalizable Scoring Functions for Molecular Docking: Challenges and Perspectives. Curr Med Chem. 2025;32(28):5960–72.
  31. Li J. et al. TGF-beta/Smad signaling in chronic kidney disease: Exploring post-translational regulatory perspectives (Review). Mol Med Rep. 2024;30(2).

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