Artigo de investigação

Carreadores Lipídicos Nanoestruturados Carregados com Hidroxiureia para Melhoria da Citotoxicidade In Vitro e da Entrega de Fármacos

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DOI:

10.3791/73012

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22 de setembro de 2026

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1Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Jazan University, 2School of Health Sciences, University of Petroleum and Energy Studies, 3Center for Global Health Research, Saveetha Medical College, and Hospitals, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, Saveetha University

Neste artigo

Resumo

Este estudo desenvolveu transportadores lipídicos nanoestruturados (NLCs) carregados com hidroxiuréia e avaliou suas propriedades e atividade anticâncer in vitro. O NX-ST apresentou alta eficiência de encapsulação, liberação controlada e maior citotoxicidade contra células MCF-7 (IC₅₀ = 225 µg/mL) em comparação com a hidroxiuréia livre (IC₅₀ = 722,57 µg/mL).

Resumo

A hidroxiuréia (HU) é uma droga anticâncer estabelecida usada para tratar a leucemia mieloide crônica, mas sua eficácia terapêutica é limitada pela rápida eliminação, biodisponibilidade variável e toxicidade relacionada à dose. Este estudo teve como objetivo melhorar a entrega da HU por meio do desenvolvimento de transportadores lipídicos nanoestruturados carregados com hidroxiuréia (NLCs) utilizando diferentes combinações de surfactantes. Três formulações, incluindo NX-ST (Tween 80–SDS), NX-CT (Cremophor EL–Tween 80) e NX-CS (Cremophor EL–SDS), foram preparadas e avaliadas quanto ao tamanho das partículas, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta, eficiência de encapsulação (EE) e atividade citotóxica. As formulações exibiram tamanhos de partículas em escala nanométrica (67,377 a 110 nm), PDI aceitável (<0,35), alto potencial zeta (-30,033 a -46,433 mV) e boa eficiência de encapsulação (78,189 a 86,626%), indicando formulações estáveis. O perfil de liberação apresentou um aumento aproximadamente linear no período de 0,5 a 6 h, seguido por uma platô. Estudos de citotoxicidade mostraram atividade anticâncer aumentada em comparação com a HU livre (IC₅₀ = 722,57 µg/mL). A formulação NX-ST demonstrou a maior citotoxicidade (IC₅₀ = 225 ± 21,47 µg/mL), consistente com uma entrega melhorada do fármaco; infere-se a contribuição de uma captação celular aprimorada, embora não tenha sido diretamente medida neste estudo. As formulações de NLCs estudadas, particularmente a NX-ST, aumentaram efetivamente o desempenho terapêutico da HU ao melhorar sua estabilidade, eficiência de entrega e atividade anticâncer.

Introdução

O câncer continua sendo uma das principais causas de morte no mundo, com cerca de 20 milhões de novos casos e 9,7 milhões de mortes relacionadas ao câncer registradas em 2022. Até 2040, espera-se que esses números aumentem significativamente, atingindo 29,9 milhões de novos casos e 15,3 milhões de mortes relacionadas ao câncer anualmente1,2. A maioria dos regimes atuais de medicamentos anticancerígenos depende de compostos altamente tóxicos, mas sua toxicidade sistêmica limita as concentrações terapêuticas que podem efetivamente alcançar os tecidos cancerosos3. Para superar esse desafio, os pesquisadores têm explorado novas abordagens de entrega de medicamentos para aprimorar o direcionamento tumoral e melhorar o índice terapêutico da quimioterapia.

Uma área crucial da pesquisa em oncologia é o desenvolvimento de sistemas avançados de liberação de fármacos para aumentar a eficácia terapêutica enquanto minimiza os efeitos colaterais dos medicamentos anticâncer. A hidroxiuréia (HU), um agente quimioterápico e antineoplásico bem estabelecido, tem sido fundamental no tratamento da anemia falciforme, da leucemia mieloide crônica e de certos tumores sólidos devido à sua capacidade de aumentar a produção de hemoglobina fetal e inibir a síntese de DNA por meio da inibição da ribonucleotídeo redutase4,5. Apesar de sua eficácia clínica, o potencial terapêutico da HU é prejudicado por desafios como eliminação rápida, biodisponibilidade variável e um índice terapêutico estreito, o que frequentemente resulta em farmacocinética variável e toxicidades dependentes da dose, incluindo mielossupressão, distúrbios gastrointestinais e possíveis neoplasias secundárias6,7. Para superar essas limitações, sistemas avançados de liberação de fármacos, incluindo carreadores lipídicos nanoestruturados (NLCs), surgiram como estratégias promissoras para aumentar a estabilidade, solubilidade e liberação controlada da hidroxiuréia, melhorando assim seu perfil de segurança e eficácia8.

As NLCs são um tipo de nanopartícula baseada em lipídios que oferece diversas vantagens em comparação com sistemas tradicionais de liberação de fármacos. Elas consistem em uma matriz lipídica sólida estabilizada por surfactantes e podem encapsular fármacos hidrofílicos e lipofílicos. Essa estrutura única permite maior capacidade de carregamento de fármacos, liberação controlada e estabilidade aprimorada9,10. A preparação das NLCs envolve tipicamente técnicas como homogeneização em alta pressão e ultrassonicação, que facilitam a formação de nanopartículas com distribuição estreita de tamanho e alta eficiência de encapsulação11,12. O encapsulamento do fármaco em NLCs não apenas melhora sua solubilidade e estabilidade, mas também facilita a entrega direcionada às células cancerígenas, reduzindo assim os efeitos fora do alvo. Estudos recentes demonstraram o potencial das NLCs carregadas com fármacos para melhorar o índice terapêutico e os perfis de liberação prolongada do fármaco13,9. Esse mecanismo de liberação controlada é essencial para manter concentrações terapêuticas do fármaco por períodos prolongados, reduzindo, dessa forma, a frequência de administração e melhorando a adesão do paciente14. Estudos demonstraram que NLCs carregadas com fármacos anticancerígenos, como gefitinibe15, capecitabina16 e imatinibe14, aumentam significativamente a eficácia do fármaco ao melhorar a captação celular e o acúmulo nas células cancerígenas. Por exemplo, as NLCs carregadas com gefitinibe mostraram um aumento de 4,5 vezes na citotoxicidade contra células cancerígenas em comparação com o fármaco livre, destacando o potencial das NLCs para aprimorar o índice terapêutico de inibidores da tirosina quinase utilizados no tratamento do câncer de pulmão de células não pequenas e do câncer colorretal. Da mesma forma, as NLCs carregadas com capecitabina melhoram a estabilidade do fármaco e a liberação controlada, o que é crucial para manter concentrações terapêuticas e reduzir a toxicidade sistêmica. As NLCs carregadas com imatinibe também se beneficiam de uma entrega direcionada aprimorada, reduzindo os efeitos fora do alvo e melhorando os resultados dos pacientes no tratamento da leucemia mieloide crônica. Esses atributos tornam as NLCs fortes candidatas a ensaios clínicos e a possíveis aplicações em medicina personalizada, adaptando os tratamentos aos perfis individuais dos pacientes. A avaliação da estabilidade de NLCs carregadas com fármacos é outro aspecto importante que influencia sua aplicabilidade clínica. Os estudos de estabilidade envolvem frequentemente submeter as formulações a diversas condições ambientais para avaliar sua integridade física ao longo do tempo.

Testes de estabilidade acelerada demonstraram que essas NLCs mantêm sua integridade estrutural e conteúdo de fármaco por períodos prolongados, destacando seu potencial para armazenamento e uso a longo prazo4,17.

Apesar dessas vantagens, a seleção de surfactantes influencia significativamente as propriedades físico-químicas e o desempenho dos transportadores lipídicos nanoestruturados (NLCs). Os sistemas lipídio-surfactante desempenham um papel importante na melhoria da estabilidade das nanopartículas, encapsulação do fármaco e biodisponibilidade18,19,20. No entanto, estudos limitados investigaram como diferentes combinações de surfactantes afetam as características físico-químicas e a atividade citotóxica de NLCs carregados com hidroxiuréia. Portanto, este estudo foi realizado para desenvolver NLCs carregados com hidroxiuréia (NANOXURIA) utilizando diferentes sistemas de surfactantes e para avaliar sistematicamente como essas variações influenciam a estabilidade físico-química, o comportamento durante o armazenamento e a atividade anticâncer. Ao estabelecer uma relação clara entre o design da formulação e o desempenho terapêutico, este trabalho tem como objetivo fornecer um sistema disperso baseado em nanocarreadores eficaz (dispersão coloidal) para caracterizar formulações de NLCs carregadas com hidroxiuréia e avaliar sua liberação in vitro do fármaco, citotoxicidade e estabilidade durante armazenamento de curto prazo, gerando dados fundamentais de desempenho físico-químico e in vitro para orientar o desenvolvimento futuro da entrega de HU, sem alterar a própria molécula do fármaco.

Protocolo

Este estudo não envolveu participantes humanos, tecidos de origem humana nem animais vivos. Todas as avaliações biológicas foram realizadas in vitro utilizando a linhagem celular comercialmente disponível de câncer de mama humano MCF-7 obtida da American Type Culture Collection (ATCC). Assim sendo, a aprovação por um conselho de revisão institucional (IRB) ou comitê de ética não era aplicável a este trabalho.

Materiais

Hidroxirreia (HU) (ensaio ≥99%), dodecilsulfato de sódio (SDS) (aniónico, ensaio 90%), Tween-80 (T80) (não iônico, ácido oleico ≥58%), Cremophor EL (não iônico, derivado do óleo de rícino, ensaio ≥98%), ácido esteárico (ensaio 95–106%) e óleo de gergelim foram utilizados conforme recebidos. Todos os demais produtos químicos e reagentes utilizados eram de grau analítico. Os detalhes completos do fornecedor e catálogo para todos os materiais e equipamentos estão fornecidos na Tabela de Materiais.

Preparação de NLCs carregadas com hidroxiuréia (NANOXURIA)

A preparação do NANOXURIA inclui três etapas: preparação da fase lipídica, incorporação do fármaco e preparação da fase aquosa. A fase lipídica foi obtida como uma fusão de uma mistura de ácido esteárico (500 mg) e óleo de gergelim (250 µl). A fusão foi realizada em um béquer sobre uma placa aquecedora. A quantidade exata de HU (150 mg) foi misturada à fase lipídica. A fase aquosa foi preparada pela dissolução de surfactantes (Tabela 1) em água (Millipore) (25 mL). A solução de surfactante foi aquecida até a mesma temperatura da fase lipídica (70°C) para evitar a solidificação prematura. A fase aquosa quente foi adicionada gradualmente à fase lipídica fundida sob agitação em alta velocidade com um homogeneizador. A mistura foi homogeneizada em alta velocidade (6.000 rpm) por 20 minutos para formar uma emulsão quente estável. A emulsão quente foi resfriada até a temperatura ambiente sob agitação contínua. Durante o resfriamento, a fase lipídica se solidifica, formando as NLCs. As NLCs carregadas com HU foram armazenadas para caracterização e aplicação posteriores.

Caracterização e avaliação

Tamanho das partículas, potencial zeta (ZP) e índice de politropicidade (PDI)

A análise do tamanho das partículas e o índice de politropicidade (PDI) do NANOXURIA foram determinados utilizando um Zetasizer Nano ZS90. Este dispositivo opera com base no princípio da dispersão dinâmica da luz (DLS), que mede o movimento browniano das partículas em uma suspensão e o correlaciona ao seu diâmetro hidrodinâmico por meio da equação de Stokes-Einstein. Além do tamanho e do PDI, a carga superficial do NANOXURIA foi avaliada mediante a medição do potencial zeta (ZP) utilizando o mesmo instrumento. O potencial zeta foi determinado por meio da dispersão eletroforética da luz (ELS), na qual a velocidade das partículas em um campo elétrico aplicado é analisada para calcular sua carga superficial. Este parâmetro é crucial para avaliar a estabilidade coloidal do NANOXURIA. As medições foram realizadas em um ambiente controlado, com as amostras diluídas colocadas em cubetas para garantir a compatibilidade com os requisitos ópticos e elétricos do instrumento. Para aumentar a robustez e a reprodutibilidade dos resultados, todas as medições foram realizadas em triplicata.

Morfologia

A morfologia do NANOXURIA foi estudada utilizando um microscópio eletrônico operando em modo de transmissão e em modo de varredura. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi utilizada para observar a estrutura interna e a forma das partículas, enquanto a microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo A microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (MEV-EF) foi empregada para examinar a morfologia da superfície e a distribuição de partículas. As amostras foram adequadamente preparadas e analisadas em tensões de aceleração apropriadas para obter imagens de alta resolução. Para o preparo das amostras, dispersões de NANOXURIA foram diluídas com água purificada; para MET, uma gota da dispersão diluída foi colocada em uma grade de cobre revestida com carbono, o excesso foi removido por absorção e o filme foi secado ao ar à temperatura ambiente antes da obtenção das imagens sob alto vácuo e tensão de aceleração de 60–80 kV. Para MEV-EF, uma gota da dispersão diluída foi depositada sobre um suporte de alumínio, seca ao ar e metalizada com uma camada condutiva fina antes da análise em tensões de 1–3 kV. Micrografias representativas foram obtidas em diferentes aumentos.

Análise da eficiência de aprisionamento para formulações NANOXURIA

A eficiência de aprisionamento (EE) do NANOXURIA foi avaliada utilizando a técnica de ultrafiltração-centrifugação com um filtro centrífugo Amicon Ultra-2 mL (corte molecular de 3 kDa). Esse método separou a HU não aprisionada (aproximadamente 6 mg em 1 mL de NANOXURIA) da fração encapsulada por meio de centrifugação a 4.000 x g durante 20 min a 25 °C, garantindo isolamento eficaz. O filtrado, contendo HU livre, foi diluído com água purificada e analisado em um espectrofotômetro UV-visível a 213 nm para quantificar a droga não aprisionada, utilizando uma curva de calibração baseada na lei de Beer-Lambert. A % EE foi calculada como;

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Estudo de liberação in vitro

O perfil de liberação in vitro de HU a partir do NANOXURIA foi avaliado utilizando a técnica de difusão em bolsa de diálise, um método amplamente adotado para avaliar a liberação controlada de fármacos. As bolsas de diálise (12–14 kDa de limite de exclusão molecular) foram previamente hidratadas em água destilada por 12 h para garantir a hidratação adequada e a remoção de conservantes. Uma das extremidades da bolsa de diálise foi firmemente selada, e 2 mL da formulação NANOXURIA, equivalentes a 12 mg de HU, foram cuidadosamente introduzidos no interior da bolsa. A outra extremidade foi então firmemente amarrada para evitar vazamentos. A bolsa de diálise foi imersa em um béquer contendo água (50 mL) como meio de liberação. O sistema foi mantido a 37 ± 0,5 °C para simular a temperatura corporal e agitado a 50 rpm com um agitador magnético para garantir uma mistura uniforme e minimizar os efeitos da camada limite. Em intervalos de tempo predeterminados (0,5; 1; 2; 4; 6; 12 e 24 h), alíquotas de 2 mL foram retiradas do meio de liberação e imediatamente substituídas por volume igual de água fresca e pré-aquecida para manter as condições de sumidouro. As amostras coletadas foram filtradas por meio de um filtro de seringa de 0,45 µm para remover qualquer material particulado, assegurando a clareza para análise. O filtro de membrana retém os particulados, permitindo a passagem do HU dissolvido. Como o HU é livremente solúvel em água, o fármaco livre permaneceu no filtrado, garantindo que o material retido representasse particulados e não fármaco livre. As amostras filtradas foram então analisadas quanto ao teor de HU utilizando um espectrofotômetro UV-visível no comprimento de onda de 213 nm, correspondente à absorção máxima do HU (λmáx). Uma curva de calibração foi estabelecida para quantificar com precisão as concentrações de HU.

Cultura celular

O estudo foi realizado utilizando a linhagem celular de câncer de mama humano metastático MCF-7, obtida da American Type Culture Collection (ATCC). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) para sustentar o crescimento e a viabilidade celular, e com 1% de solução de penicilina-estreptomicina para prevenir contaminação microbiana durante o cultivo. As células foram então incubadas em condições fisiológicas padrão a 37 °C em um incubador de CO₂ umidificado, com o meio de cultura mantido em pH 7,4. Essas condições foram escolhidas para garantir crescimento celular, proliferação e confiabilidade experimental ideais ao longo dos estudos de citotoxicidade.

Ensaio de viabilidade celular (MTT)

O ensaio MTT foi realizado para avaliar a capacidade de indução de morte celular de diferentes formulações de NANOXURIA16,21. Resumidamente, células MCF-7 foram semeadas em placas de 96 poços com uma densidade de 1 x 104 células/mL e incubadas por 24 h em incubadora de CO₂ para permitir adequada adesão e crescimento celular. Células não tratadas serviram como controle negativo, enquanto poços contendo apenas meio de cultura foram utilizados como controles em branco. Após a incubação, o meio de cultura foi substituído por meio fresco contendo diferentes concentrações das formulações testadas, até 200 µg/mL. As placas tratadas foram incubadas por mais 72 h em condições padrão de cultura. Após o tratamento, 20 µL do reagente MTT (5 mg/mL) foram adicionados a cada poço e incubados por mais 4 h para permitir a formação de cristais de formazano no interior das células metabolicamente ativas. Posteriormente, 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados para dissolver os cristais, resultando em uma solução violeta. A absorbância foi medida a 570 nm utilizando um leitor de microplacas (SpectroStar Nano). A viabilidade celular (%) foi calculada em relação ao grupo controle não tratado, com base nos valores de absorbância obtidos.

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Estudo de estabilidade

A estabilidade do NANOXURIA foi avaliada sistematicamente ao longo de um período de 3 meses sob condições controladas de armazenamento, a fim de verificar sua adequação para uso de longo prazo. Cada formulação do NANOXURIA foi fracionada em recipientes de vidro âmbar herméticos para minimizar a exposição à luz e à umidade. Os recipientes foram armazenados em temperatura ambiente constante de 25 ± 2 °C e em temperatura refrigerada de 4 ± 2 °C. As amostras foram avaliadas periodicamente em intervalos predeterminados (1, 2 e 3 meses) quanto à estabilidade física e físico-química. Uma medição inicial foi realizada imediatamente após o preparo e antes do armazenamento, sendo considerada como 0 mês (inicial). As avaliações físicas incluíram inspeção visual quanto a alterações na aparência, incluindo sinais de aglomeração, sedimentação, separação de fases, alteração de cor (por exemplo, de branco-acinzentado a amarelo), mudanças na consistência (por exemplo, viscosidade ou textura) e odor (por exemplo, ranço devido à oxidação lipídica). Para a estabilidade físico-química, foram medidos parâmetros-chave de caracterização, incluindo tamanho das partículas, índice de politropicidade (PDI) e potencial zeta (ZP).

Análise estatística

Neste estudo, todos os resultados experimentais são expressos como valores médios ± desvio padrão (DP) (n = 3) para refletir a tendência central e a variabilidade dos dados. Análises estatísticas foram realizadas para avaliar a formulação utilizando um teste t pareado e para comparar as diferenças entre formulações utilizando análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism versão 10.

Resultados

Propriedades físico-químicas

As propriedades físico-químicas das formulações NANOXURIA, incluindo tamanho das partículas, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (ZP), morfologia e eficiência de encapsulação (EE), são apresentadas na Tabela 2. A avaliação morfológica por MEV e MET, complementada por gráficos de distribuição do tamanho das partículas e do potencial zeta, é apresentada nas Figuras 1, 2 e 3. Uma comparação do PDI para diferentes combinações de surfactantes é apresentada na Figura 4.

Estudo de liberação

O estudo de liberação in vitro das formulações NANOXURIA foi conduzido para avaliar como as diferenças nas formulações afetam o perfil de liberação do fármaco ao longo de 24 h (Figura 5). NX-CS apresentou a liberação mais rápida, iniciando em 55,90% após 0,5 h e atingindo 104,05% após 24 h (valores >100% podem refletir variabilidade experimental ou liberação completa com leve superestimação). O perfil de liberação mostrou um aumento quase linear entre 0,5 e 6 h, seguido por uma platô. NX-CT exibiu a liberação mais lenta e mais controlada, iniciando em 46,18% após 0,5 h e alcançando 82,99% após 24 h, com um platô entre 2–12 h (54,51% a 59,38%), seguido por um aumento posterior. NX-ST mostrou um perfil de liberação intermediário, iniciando em 54,05% após 0,5 h, atingindo um pico de 90,63% após 12 h e diminuindo ligeiramente para 86,23% após 24 h. No geral, a liberação cumulativa seguiu a ordem: NX-CS > NX-ST > NX-CT. NX-CS e NX-ST apresentaram liberação inicial em surto mais acentuada, enquanto NX-CT mostrou liberação retardada. A cinética de liberação indicou liberação rápida para NX-CS, liberação sustentada para NX-CT e liberação bifásica para NX-ST.

Ensaio de citotoxicidade

O in vitro citotoxicidade de NANOXURIA as formulações foi avaliada contra células de câncer de mama MCF-7 utilizando o ensaio MTT, com Tabela 3 detalhando o IC₅₀ valores. O NX-ST demonstrou a maior citotoxicidade, com uma IC estimada₅₀ de 225 ± 21.47 µg/mL (extrapolado), indicando atividade antineoplásica superior. Em contraste, NX-CS e NX-CT exibiram citotoxicidade menor, com IC₅₀ valores excedendo 300 µg/mL. A hidroxiuréia (HU) livre apresentou a menor citotoxicidade, com uma IC₅₀ de 722.57 µg/mL. Porque o IC₅₀ valores para NX-CS e NX-CT foram relatados apenas como superiores a 300 µg/mL, sua citotoxicidade em relação umas às outras e em relação à HU livre (722.57 µg/mL) não podem ser estabelecidas a partir dos dados atuais; apenas NX-ST pôde ser firmemente classificado como mais citotóxico do que a hidroxiuréia livre. Esses resultados indicam que as formulações de NLC aumentam significativamente a atividade antineoplásica da hidroxiuréia em comparação com a droga livre.

Correlação estatística entre parâmetros físico-químicos e citotoxicidade

Todos os parâmetros estudados são correlacionados e apresentados na Figura 6. As análises estatísticas revelaram diferenças significativas entre as NLCs carregadas com HU (NX-ST, NX-CT, NX-CS) em potencial zeta, eficiência de encapsulação (EE) e citotoxicidade (IC₅₀) [F(2,12) = 6,45, p = 0,014], mas não no tamanho das partículas ou no PDI [F(2,12) = 1,27, p = 0,31]. A formulação NX-ST apresentou citotoxicidade ideal com EE moderada, enquanto NX-CS e NX-CT exibiram EE mais alta, mas citotoxicidade mais fraca. Valores de IC50 acima do limite superior da faixa de concentração testada (>300 µg/mL) foram atribuídos ao valor de 300 µg/mL para a análise exploratória de correlação. A análise exploratória de correlação de Spearman mostrou uma associação positiva entre potencial zeta e IC₅₀ (ρ = 0,866, p = 0,333). Assim, formulações com potencial zeta menos negativo tenderam a apresentar valores mais altos de IC₅₀, enquanto a formulação NX-ST, com carga mais negativa, mostrou maior atividade citotóxica.

Estudo de estabilidade

Estabilidade do tamanho das partículas

A 25 °C, o tamanho das partículas de todas as formulações NANOXURIA aumentou ao longo do período de armazenamento de três meses, mostrando tendências distintas (Figura 7). NX-ST, 110 nm (1 mês), manteve-se relativamente estável durante os dois primeiros meses (106,4 nm), mas aumentou para 150,6 nm no terceiro mês. NX-CT, iniciando em 91,9 nm, apresentou um aumento gradual até 102,2 nm em dois meses, seguido por uma elevação acentuada para 168,3 nm aos três meses. NX-CS exibiu a maior alteração, aumentando de 67,3 nm inicialmente para 171,06 nm no terceiro mês. No geral, todas as formulações apresentaram aumento no tamanho das partículas a 25 °C, com a extensão do aumento seguindo a ordem: NX-CS > NX-CT > NX-ST.

A 4 °C, as formulações NANOXURIA apresentaram estabilidade melhorada em comparação com 25 °C, com aumentos menores no tamanho das partículas ao longo do período de armazenamento de três meses (Figura 7). O NX-ST manteve estabilidade relativa, com tamanhos de partícula de 110 nm após um mês, 102 nm após dois meses e 120,96 nm após três meses. O NX-CT mostrou um aumento gradual no tamanho das partículas, passando de 91,9 nm em um mês para 116,7 nm em dois meses e 128,5 nm em três meses. O NX-CS exibiu a menor variação, aumentando de 67,3 nm inicialmente para 74,75 nm após dois meses e 89,3 nm após três meses. No geral, o crescimento do tamanho das partículas a 4 °C seguiu a tendência: NX-CT > NX-ST > NX-CS, indicando estabilidade melhorada sob condições refrigeradas.

Estabilidade da PDI

A 25 °C, o PDI das formulações NANOXURIA mostrou tendências diferentes ao longo do período de armazenamento de três meses (Figura 8). O NX-ST manteve valores de PDI relativamente estáveis durante todo o estudo, indicando uma distribuição consistente do tamanho das partículas. O NX-CT apresentou um aumento no PDI no segundo mês (0,342), seguido por uma redução para 0,248 no terceiro mês. O NX-CS exibiu um aumento progressivo do PDI ao longo do tempo, indicando uma perda gradual da uniformidade do tamanho das partículas. No geral, o NX-ST demonstrou a distribuição mais estável, o NX-CT mostrou variabilidade transitória e o NX-CS exibiu heterogeneidade crescente.

A 4 °C, o PDI das formulações NANOXURIA apresentou tendências diferentes ao longo do período de armazenamento de três meses (Figura 8). O NX-ST exibiu valores de PDI relativamente estáveis, diminuindo de 0,347 no primeiro mês para 0,269 no segundo mês, seguido por um leve aumento para 0,349 no terceiro mês. O NX-CT mostrou um aumento progressivo do PDI, passando de 0,221 no primeiro mês para 0,331 no terceiro mês, indicando uma perda gradual de uniformidade das partículas. O NX-CS também apresentou uma tendência crescente no PDI ao longo do tempo, indicando redução na homogeneidade. No geral, o NX-ST manteve a distribuição mais estável, enquanto o NX-CT e o NX-CS mostraram heterogeneidade crescente.

Estabilidade do potencial zeta

A 25 °C, o potencial zeta (ZP) das formulações NANOXURIA apresentou tendências distintas ao longo do período de armazenamento de três meses (Figura 9). O NX-ST exibiu um ZP inicial de −46,43 mV após um mês, que diminuiu para −39,37 mV após dois meses e aumentou para −52,33 mV no terceiro mês. O NX-CT mostrou um aumento gradual na negatividade, variando de −30,76 mV após um mês para −35,66 mV após dois meses e −37,13 mV após três meses. O NX-CS demonstrou um aumento na negatividade do ZP, passando de −30,03 mV inicialmente para −39,6 mV após dois meses e −52,47 mV após três meses. No geral, todas as formulações apresentaram valores decrescentes de ZP ao longo do tempo, com o NX-ST e o NX-CS exibindo magnitudes maiores do que o NX-CT.

A 4 °C, o potencial zeta (ZP) das formulações NANOXURIA apresentou tendências distintas ao longo do período de armazenamento de três meses (Figura 9). NX-ST manteve valores de ZP negativos consistentemente altos durante todo o estudo. NX-CT exibiu um aumento gradual na negatividade do ZP, iniciando em −30,76 mV e tornando-se ligeiramente mais negativo no terceiro mês. NX-CS mostrou uma ligeira diminuição na negatividade do ZP, passando de −30,03 mV inicialmente para −28,8 mV em três meses.

Disponibilidade de Dados:

Os dados que apoiam as descobertas deste estudo estão disponíveis no próprio artigo. Os conjuntos de dados brutos gerados e analisados durante o presente estudo estão disponíveis no Arquivo Suplementar

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Figura 1: Caracterização morfológica e físico-química do NX-ST. (A) Imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV). (B) Imagem de microscopia eletrônica de transmissão (MET). (C) Distribuição do tamanho de partículas (108,3 nm; PDI = 0,336) (n = 1). (D) Distribuição do potencial zeta (−48,8 mV) (n = 1). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Caracterização morfológica e físico-química do NX-CT. (A) Imagem de MEV. (B) Imagem de MET. (C) Distribuição de tamanho de partículas (91,87 nm; PDI = 0,235) (n = 1). (D) Distribuição do potencial zeta (−31,3 mV) (n = 1). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Caracterização morfológica e físico-química do NX-CS. (A) Imagem de MEV. (B) Imagem de MET. (C) Distribuição do tamanho de partículas (74,72 nm; PDI = 0,244) (n = 1). (D) Distribuição do potencial zeta (−36,8 mV) (n = 1). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Comparação do PDI entre formulações NANOXURIA com diferentes combinações de surfactantes. Os valores de PDI são apresentados para as formulações NX-ST, NX-CT e NX-CS. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Liberação in vitro de hidroxiuréia a partir das formulações NANOXURIA. A liberação acumulada de hidroxiuréia a partir de NX-CS, NX-CT e NX-ST é mostrada ao longo de 24 h. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Comparação de parâmetros físico-químicos e citotoxicidade entre formulações NANOXURIA. Gráfico de radar comparando tamanho das partículas, PDI, potencial zeta (ZP), eficiência de encapsulação (EE) e IC₅₀ para NX-ST, NX-CS e NX-CT. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Efeito da temperatura e duração do armazenamento no tamanho das partículas de NANOXURIA. (A) Tamanho das partículas durante o armazenamento a 25 °C. (B) Tamanho das partículas durante o armazenamento a 4 °C. (C) Comparação do tamanho das partículas entre 4 °C e 25 °C aos 2 e 3 meses. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Efeito da temperatura e duração do armazenamento no PDI da NANOXURIA. (A) PDI durante o armazenamento a 25 °C. (B) PDI durante o armazenamento a 4 °C. (C) Comparação do PDI entre 4 °C e 25 °C aos 2 e 3 meses. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Efeito da temperatura e duração do armazenamento no potencial zeta do NANOXURIA. (A) Potencial zeta durante o armazenamento a 25 °C. (B) Potencial zeta durante o armazenamento a 4 °C. (C) Comparação do potencial zeta entre 4 °C e 25 °C aos 2 e 3 meses. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

FormulaçõesTween-80 (µL)*Dodecilsulfato de sódio (SDS) (mg)Cremophor EL (µL)#
NX-ST50100-
NX-CT50-100
NX-CS-50100
Densidade (g/ml) = (1,07*, 1,05#)

Tabela 1: Composição de surfactantes das formulações NANOXURIA. Quantidades de Tween-80, dodecilsulfato de sódio (SDS) e Cremophor EL foram utilizadas para preparar as formulações NX-ST, NX-CT e NX-CS.

FormulaçõesTamanho das partículas (d.nm) (n = 3) (± DP)PDI (n = 3) (± DP)PZ (mV) (n = 3) (± DP) EE (%) (n = 3) (± DP)
NX-ST110 ± 1.9970.347 ± 0.011-46.433 ± 8.40478.189 ± 3.49
NX-CT91.947 ± 0.2150.221 ± 0.015-30.767 ± 0.47384.638 ± 5.0
NX-CS67.377 ± 7.1580.302 ± 0.091-30.033 ± 5.86286.626 ± 4.676

Tabela 2: Caracterização físico-química das formulações NANOXURIA. Tamanho das partículas, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (ZP) e eficiência de encapsulação (EE) de NX-ST, NX-CT e NX-CS a 25 °C. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3).

FormulaçõesIC50 (µg/mL)IC50 (µM)
NX-ST225 ± 21,472960
NX-CS>300-
NX-CT>300-
HU722,579500

Tabela 3: Citotoxicidade in vitro das formulações NANOXURIA e da hidroxiureia livre. Valores de CI₅₀ de NX-ST, NX-CS, NX-CT e hidroxiureia livre (HU) contra células MCF-7, expressos em µg/mL e µM.

Arquivo Suplementar 1: Dados brutos e cálculos para a caracterização de nanocarreadores lipídicos nanoestruturados carregados com hidroxiuréia. O arquivo contém os dados experimentais e cálculos subjacentes para as formulações NX-ST, NX-CT e NX-CS, incluindo tamanho das partículas, índice de polidispersão, potencial zeta, eficiência de encapsulação, medidas de liberação do fármaco e análises comparativas das formulações.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Abordagem proposta e descobertas principais

O presente estudo desenvolveu o NANOXURIA utilizando uma abordagem de homogeneização a quente. O ácido esteárico foi usado como lipídio sólido, e a temperatura de preparação foi mantida em aproximadamente 70 °C, próxima ao ponto de fusão do ácido esteárico (~69,3 °C), para garantir a fusão completa do lipídio e uma homogeneização eficiente, ao mesmo tempo que se minimiza a exposição térmica desnecessária da HU e dos surfactantes22. Os sistemas de surfactantes foram selecionados com base em seu valor de equilíbrio hidrófilo-lipófilo (HLB), biocompatibilidade e adequação para a preparação de NLC. Ensaios preliminares de formulação foram utilizados para identificar concentrações de surfactantes que produzem nano-dispersões estáveis com tamanho reduzido de partículas e baixo PDI, evitando ao mesmo tempo concentrações excessivas que poderiam afetar negativamente a estabilidade ou a citocompatibilidade. As formulações foram devidamente diluídas com água de alta pureza antes da análise de tamanho de partícula, a fim de minimizar os efeitos de espalhamento múltiplo que podem interferir na determinação precisa do tamanho e da distribuição das partículas23.

As três formulações, NX-ST, NX-CT e NX-CS, diferiram principalmente na sua composição de surfactantes. A formulação NX-ST continha T80 e SDS, a NX-CT continha Cremophor EL e T80, e a NX-CS continha Cremophor EL e SDS. Essa estratégia de formulação permitiu avaliar os efeitos de surfactantes não iônicos e iônicos, bem como suas concentrações, nas características físico-químicas das NLCs carregadas com HU. Os resultados demonstraram diferenças claras no tamanho das partículas, PDI, ZP, EE, comportamento de liberação do fármaco e citotoxicidade entre as formulações, indicando que a escolha do surfactante é um determinante importante no desempenho das NLCs.

O tamanho das partículas diferiu significativamente entre as formulações (p < 0,05), seguindo a ordem NX-CS < NX-CT < NX-ST. O tamanho das partículas é um determinante importante do desempenho dos nanocarreadores, pois partículas menores podem proporcionar maior área de superfície e influenciar a estabilidade da dispersão, as interações celulares, a biodistribuição e o comportamento de liberação do fármaco24,25. A formulação NX-CS produziu as partículas menores, o que pode estar associado à alta eficiência de emulsificação do Cremophor EL combinado com a concentração moderada de SDS. O Cremophor EL pode facilitar a formação de gotículas menores ao reduzir a tensão interfacial, enquanto o SDS contribui para a estabilização eletrostática. A menor concentração de SDS utilizada em NX-CS em comparação com NX-ST pode ter proporcionado estabilização interfacial suficiente sem provocar os efeitos interfaciais excessivos associados à concentração mais elevada de SDS26,27,28.

O NX-CT produziu um tamanho de partícula intermediário. A combinação de Cremophor EL e T80 fornece dois surfactantes não iônicos com propriedades complementares de estabilização interfacial e estérica. O Cremophor EL contribui com forte emulsificação, enquanto o T80 pode formar uma barreira estérica ao redor das partículas e reduzir a coalescência29,30,31. A ausência de um surfactante iônico também evita interações fortes mediadas por carga durante a formação das partículas. Em contraste, o NX-ST exibiu o maior tamanho de partícula. Embora o SDS seja um surfactante emulsificante potente, sua concentração relativamente alta no NX-ST pode ter alterado o ambiente interfacial e o comportamento de crescimento das partículas. O T80 fornece estabilização estérica, mas o efeito combinado do T80 e da maior concentração de SDS pode ter produzido um equilíbrio menos favorável entre emulsificação e estabilização do que o alcançado no NX-CS.

Os estudos de morfologia apoiaram ainda mais a formação de carreadores lipídicos em nanoescala. A MEV e a MET mostraram partículas predominantemente esféricas a quase esféricas, com a morfologia observada amplamente consistente com os tamanhos de partícula determinados por DLS. Diferenças entre as medições microscópicas e por DLS são esperadas porque a MEV examina partículas secas, enquanto o DLS mede o diâmetro hidrodinâmico das partículas juntamente com suas camadas associadas de hidratação e surfactantes. Assim, os resultados combinados das análises microscópicas e por DLS apoiam a formação bem-sucedida de sistemas de NLC em nanoescala.

O PDI forneceu informações adicionais sobre a uniformidade das populações de partículas. O NX-CT exibiu a distribuição de tamanho de partículas mais estreita, enquanto o NX-ST apresentou o PDI médio mais alto. O NX-CS teve um PDI médio intermediário, mas maior variabilidade entre as medições replicadas. Em particular, os valores replicados para o NX-CS indicam que a formulação exibiu maior variabilidade do que os observados para o NX-ST e o NX-CT. A tendência geral do PDI foi NX-CT < NX-CS < NX-ST, embora a diferença relatada não tenha sido estatisticamente significativa (p > 0,05). O PDI relativamente baixo do NX-CT pode estar relacionado à estabilização estérica combinada fornecida pelo Cremophor EL e pelo T80. Ambos os surfactantes são não iônicos e podem estabilizar a interface das partículas sem introduzir fortes interações eletrostáticas. O Cremophor EL facilita a emulsificação, enquanto o T80 fornece proteção estérica, potencialmente promovendo uma população de partículas mais homogênea32,33. O PDI mais alto do NX-ST pode refletir a influência de sua maior concentração de SDS. O SDS proporciona repulsão eletrostática, mas alterações na concentração do surfactante também podem modificar a micelização e a organização interfacial, potencialmente contribuindo para a heterogeneidade do tamanho das partículas34,35,36. O NX-CS apresentou comportamento intermediário de PDI, consistente com os efeitos combinados do Cremophor EL e de uma concentração mais baixa de SDS37.

As formulações também diferiram quanto à carga superficial. NX-ST exibiu o potencial zeta (ZP) mais negativo, compatível com a presença da maior concentração de SDS, seguido por NX-CT e NX-CS. A carga superficial mais negativa dos sistemas contendo SDS é esperada, pois o SDS é um surfactante aniônico. Os valores de ZP, portanto, indicam que o SDS contribuiu significativamente para a carga superficial das NLCs, enquanto os surfactantes não iônicos contribuíram principalmente para a estabilização estérica. A tendência do ZP foi NX-ST > NX-CT > NX-CS (p < 0,05). No entanto, essas diferenças não devem ser atribuídas exclusivamente à composição dos surfactantes, pois surfactante livre residual, força iônica e alterações na organização lipídio-surfactante também podem influenciar o ZP medido38,39,40.

A eficiência de encapsulação demonstrou ainda a influência da composição na retenção de HU. Todas as formulações exibiram EE relativamente alta (>75%), indicando incorporação bem-sucedida de HU nos sistemas de NLC. NX-CS apresentou a EE mais elevada, seguida por NX-CT e NX-ST, com diferença significativa entre as formulações (p < 0,05). O Cremophor EL pode ter contribuído para uma eficiente estabilização interfacial e retenção do fármaco, enquanto a concentração moderada de SDS em NX-CS pode ter proporcionado estabilização adicional sem os efeitos potencialmente disruptivos associados à concentração mais alta de SDS em NX-ST41,42,43. No entanto, como a HU é hidrofílica, é improvável que ela esteja completamente dissolvida dentro da matriz lipídica. Em vez disso, a HU pode estar presente como um fármaco finamente disperso, associado à interface lipídio-água, ou acomodada dentro da matriz lipídica imperfeita e da região interfacial rica em surfactante.

Os perfis de liberação demonstraram comportamento dependente da formulação, com a liberação acumulada de HU seguindo a ordem NX-CS > NX-ST > NX-CT em 24 h. O NX-CS exibiu liberação relativamente rápida com um pico inicial seguido por uma platô, consistente com cinética semelhante à de primeira ordem, enquanto o NX-CT apresentou a liberação mais lenta e mais controlada, aproximando-se cinética semelhante à de ordem zero; NX-ST exibiu um intermediário perfil de liberação bifásico A liberação provavelmente é regida pela difusão da HU a partir da superfície da partícula e da região interfacial rica em surfactante, seguida pela difusão mais lenta do fármaco aprisionado através da matriz lipídica. A liberação mais rápida a partir do NX-CS pode estar relacionada ao seu menor tamanho de partícula, maior área superficial e aos efeitos combinados do Cremophor EL e do SDS, sendo que o SDS aumenta a hidrofilicidade interfacial e o Cremophor EL facilita a solubilização do fármaco. Em contraste, a combinação de Cremophor EL e T80 em NX-CT pode proporcionar uma barreira interfacial mais estável, limitando a difusão inicial do fármaco e produzindo uma liberação mais sustentada, enquanto NX-ST apresentou um padrão bifásico intermediário atribuível às influências opostas da liberação facilitada por SDS e da estabilização mediada por T80. Essas interpretações são compatíveis com o papel proposto dos surfactantes na modulação das interações entre a matriz lipídica e o meio de liberação41,44,45,46,47,48A água foi utilizada como meio de liberação para estabelecer o comportamento básico de difusão, mas não replica a composição iônica e as condições fisiológicas dos fluidos biológicos. Os eletrólitos presentes em tampões fisiológicos podem alterar a dupla camada elétrica, a organização do surfactante, a agregação de partículas e a permeabilidade da membrana, potencialmente modificando a cinética de liberação.

Os resultados de citotoxicidade demonstraram uma diferença clara entre a HU livre e as formulações de NLC, sendo que a HU livre apresentou o maior valor de IC₅₀ e a NX-ST exibiu a maior atividade citotóxica. Os valores mais baixos de IC₅₀ observados para as formulações de NLC indicam que a incorporação da HU no transportador lipídico alterou sua atividade in vitro contra células MCF-7. A resposta particularmente acentuada da NX-ST pode refletir a contribuição combinada de seu sistema de surfactantes SDS/T80, potencial zeta negativo relativamente alto e perfil de liberação bifásico intermediário, que em conjunto podem influenciar a disponibilidade do fármaco na interface celular e a exposição temporal das células à HU liberada49,50. Curiosamente, o menor tamanho de partícula e a maior EE da NX-CS não se traduziram em maior citotoxicidade, enfatizando que o tamanho de partícula e o aprisionamento do fármaco isoladamente não determinam a atividade biológica; ao contrário, interações celulares, comportamento de liberação do fármaco, efeitos dos surfactantes e disponibilidade do fármaco podem coletivamente influenciar a resposta51,52,53. Assim, a menor citotoxicidade das formulações NX-CT e NX-CS em comparação com a NX-ST não deve ser interpretada simplesmente como desempenho inferior da formulação, especialmente porque a NX-CT demonstrou a liberação mais controlada.

O estudo de armazenamento demonstrou boa estabilidade física, pois nenhuma aglomeração visível, sedimentação, separação de fases, descoloração, alteração na viscosidade ou textura, ou odor anormal/rancifico foi observada em qualquer formulação durante todo o período de armazenamento. No entanto, os dados de estabilidade físico-química forneceram um quadro mais diferenciado. A 25 °C, um aumento no tamanho das partículas e/ou no PDI indicou mudanças progressivas nos sistemas coloidais, com a extensão e significância estatística variando entre as formulações. NX-ST se beneficiou da forte contribuição eletrostática do SDS, enquanto NX-CT, que dependia predominantemente da estabilização estérica do Cremophor EL e do T80, mostrou maior suscetibilidade a alterações nas características das partículas. NX-CS, apesar da combinação de estabilização eletrostática e estérica, também apresentou alterações durante o armazenamento, indicando que a presença de dois mecanismos de estabilização não impede completamente a reestruturação dependente do tempo do sistema NLC. O armazenamento a 4 °C geralmente proporcionou melhor preservação físico-química, consistente com a redução da mobilidade molecular e mudanças estruturais lipídicas mais lentas; NX-CS mostrou estabilidade do tamanho de partícula comparativamente melhorada, enquanto NX-ST manteve características relativamente constantes. Apesar disso, NX-CT continuou a apresentar mudanças progressivas no PDI, indicando que a estabilização estérica isoladamente pode não ser suficiente para armazenamento prolongado. As alterações no ZP durante o armazenamento sugerem ainda uma reorganização dependente do tempo na interface lipídio-tensioativo, potencialmente relacionada à dessorção do tensioativo, recristalização lipídica e mudanças estruturais associadas à HU, que não foram diretamente comprovadas47,48,54. 

Avanço da área

Formulações de NLC de outros agentes anticâncer, incluindo gefitinibe, capecitabina e imatinibe, demonstraram previamente uma entrega melhorada em relação à droga livre14,15,16, mas dados comparativos sobre como diferentes combinações de surfactantes moldam o perfil físico-químico e citotóxico de NLCs carregadas com hidroxiuréia especificamente têm sido limitados43,44,55. Ao comparar sistematicamente três sistemas de surfactantes dentro de uma única plataforma de NLC, este estudo fornece uma comparação direta e internamente controlada, esclarecendo como a natureza iônica e a concentração do surfactante influenciam conjuntamente o tamanho das partículas, a estabilidade coloidal, a retenção do fármaco e a atividade anticâncer in vitro para uma droga pequena e altamente hidrofílica — uma combinação menos representada na literatura de NLC do que cargas lipofílicas51,54,56,57. Esses resultados ampliam relatos anteriores de encapsulação de HU em nanocarreadores à base de lipídios e albumina53,58 ao identificar um par de surfactantes (T80–SDS) associado ao maior aumento da citotoxicidade in vitro.

Limitações do estudo

Este estudo apresenta várias limitações que devem ser consideradas ao interpretar os resultados. Primeiro, a avaliação biológica foi restrita a um único ensaio in vitro de MTT em células de câncer de mama MCF-7; embora a HU seja usada clinicamente na leucemia mieloide crônica e na anemia falciforme, os dados atuais não sustentam conclusões específicas para essas condições, sendo necessário confirmar os achados em um modelo relevante de leucemia (por exemplo, células K562) e in vivo. Segundo, as explicações mecanicistas propostas para as diferenças observadas nas propriedades físico-químicas e citotóxicas (por exemplo, dessorção do surfactante, recristalização dos lipídios, captação celular alterada) não foram demonstradas diretamente e devem ser consideradas hipóteses; técnicas como DSC, XRD e Cryo-TEM23,41, juntamente com estudos de captação celular e de cinética de liberação, seriam necessárias para confirmá-las. Terceiro, a liberação in vitro foi avaliada em água em vez de um tampão fisiológico, o que é considerado um passo essencial para prever o desempenho in vivo59. Quarto, a estabilidade química da HU durante a preparação não foi quantificada diretamente, e não foi realizado um estudo dedicado sobre o vazamento do fármaco para a fase aquosa durante o armazenamento; dada a alta solubilidade aquosa da HU, tal vazamento é possível e deve ser avaliado. Por fim, a formulação destina-se à administração parenteral, e as interpretações mecanicistas aqui apresentadas devem ser vistas como exploratórias até que caracterizações adicionais sejam realizadas, em consonância com a literatura mais ampla sobre NLC, que enfatiza a necessidade de validação físico-química rigorosa32.

Abordagens alternativas

Várias estratégias alternativas de caracterização e validação poderiam fortalecer trabalhos futuros nesta área. Técnicas no estado sólido (por exemplo, DSC, XRD) e criomicroscopia eletrônica (crio-TEM) ajudariam a esclarecer o estado físico da HU dentro da matriz lipídica e testariam diretamente os mecanismos propostos de desorção do surfactante e recristalização dos lipídios, utilizados para explicar as tendências de estabilidade observadas36,60,61. Testes de liberação em tampão fisiológico ou fluidos biológicos simulados, em vez de apenas água, predisseriam melhor o comportamento de liberação in vivo, e a quantificação direta da captação celular (por exemplo, por marcação fluorescente e citometria de fluxo) testaria a explicação baseada na captação para a citotoxicidade aumentada do NX-ST, em vez de inferi-la apenas a partir do potencial zeta62,63,64. Testes confirmatórios em uma segunda linhagem celular clinicamente relevante (por exemplo, K562 para leucemia mieloide crônica) e avaliação sob condições formais de estabilidade acelerada ajudariam ainda mais a traduzir as descobertas in vitro atuais para uma formulação aplicável clinicamente.

Importância e aplicações potenciais

Essas descobertas são relevantes para o esforço mais amplo de melhorar a entrega de hidroxiuréia, cujo uso clínico atualmente é limitado pela eliminação rápida, biodisponibilidade variável e toxicidade relacionada à dose. Ao demonstrar que a composição do surfactante pode ser ajustada para favorecer partículas menores e mais estáveis, com maior eficiência de encapsulação (NX-CS, NX-CT), ou maior potência citotóxica in vitro (NX-ST)41,65, este trabalho fornece uma base prática para selecionar ou otimizar ainda mais a composição de NLC de acordo com o atributo de entrega priorizado para uma determinada aplicação, sem modificar a própria molécula de HU. Plataformas de nanocarreadores ajustáveis desse tipo também podem ser aplicáveis a outras drogas pequenas e hidrofílicas que enfrentam limitações semelhantes de entrega.

Próximas direções

Trabalhos futuros devem priorizar a validação quantitativa dos mecanismos físico-químicos propostos aqui, utilizando técnicas de estado sólido e de imagem; testes de liberação de fármacos sob condições fisiologicamente relevantes; medição direta da captação celular e sua relação com a citotoxicidade; testes em linhagens celulares adicionais e clinicamente relevantes e, eventualmente, em modelos in vivo; estudos formais de estabilidade acelerada e de longo prazo para apoiar a determinação da vida útil; e quantificação da estabilidade química da HU e do vazamento relacionado ao armazenamento. Abordar esses pontos ajudaria a estabelecer se as vantagens físico-químicas identificadas aqui se traduzem em benefício terapêutico significativo.

Conclusões

Este estudo aborda limitações importantes da terapia com HU, incluindo baixa eficiência de entrega devido à rápida eliminação, biodisponibilidade variável e toxicidade relacionada à dose, por meio do desenvolvimento de carreadores lipídicos nanoestruturados (NANOXURIA). Os resultados demonstram que a composição do surfactante e as condições de armazenamento influenciam criticamente a estabilidade físico-química, o desempenho citotóxico e a eficiência geral de entrega. Entre as formulações, a NX-ST apresentou desempenho superior, com atividade citotóxica 3,2 vezes maior que a da HU livre, indicando maior captação celular e entrega do fármaco. Essa eficácia aprimorada é atribuída às suas características equilibradas das partículas, liberação controlada e estabilização eletrostática eficaz.

Em contraste, formulações baseadas principalmente em surfactantes não iônicos apresentaram estabilidade e desempenho comparativamente menores, destacando a importância de mecanismos combinados de estabilização. As condições de armazenamento afetaram significativamente o comportamento da formulação: 25 °C promoveu o crescimento e a heterogeneidade das partículas, enquanto 4 °C preservou melhor a estabilidade, uniformidade e carga superficial.

No geral, este estudo aborda a lacuna de pesquisa identificada demonstrando que sistemas de NLC projetados racionalmente podem aumentar a entrega de HU sem alterar a própria droga. Os resultados enfatizam que combinações ideais de lipídios e surfactantes, bem como condições adequadas de armazenamento, são essenciais para obter sistemas de entrega de fármacos estáveis, eficientes e clinicamente relevantes.

Divulgações

Todos os autores declaram que não possuem conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Diretoria de Estudos de Pós-Graduação e Pesquisa da Universidade de Jazan pelo financiamento deste trabalho de pesquisa por meio do projeto número: JU-RSP2026. Os autores também expressam sua sincera gratidão ao Colegiado de Farmácia da Universidade de Jazan, Jazan, Arábia Saudita, pelo fornecimento dos recursos essenciais que facilitaram a conclusão bem-sucedida deste projeto.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro centrífugo Amicon Ultra-2 mL (3 kDa MWCO)Millipore, IrlandaUFC200324
Grade de cobre revestida com carbono (suporte para amostra de MET)N/A
Cremofor EL (surfactante não iônico, derivado do óleo de rícino, pureza ≥98%)MedChemExpress, NJ, EUAHY-Y1890
Bolsas de diálise (12-14 kDa MWCO)Spectrum Laboratories, CA, EUA08-670-3BB
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)Fisher Chemicals, Reino Unido10162090
Soro bovino fetal (SBF)Gibco, Paisley, Reino Unido10270-106
Microscópio eletrônico de varredura com emissão de campo (MEV-EF), Apreo 2Thermo Fisher-FEI, EUA1229000
Homogeneizador, HG 15DWiseTis, AlemanhaDH.WHG02020
Hidroxiuréia (HU) (pureza ≥99%)Sudair Pharma, Riade, Arábia Saudita21L001
Linhagem celular de câncer de mama humano MCF-7Coleção Americana de Culturas (ATCC), EUAHTB-22
Leitor de microplacas, SpectroStar NanoBMG LABTECH, Ortenberg, Alemanha601-101
Reagente MTT (5 mg/mL)Invitrogen Corporation, San Diego, CA, EUAM6494
Solução de penicilina-estreptomicinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAP4333
Meio RPMI 1640Gibco, Grand Island, NY, EUA11875093
Óleo de gergelimComerciante local, Jazan, Arábia SauditaN/A
Dodecilsulfato de sódio (SDS) (surfactante aniônico, pureza 90%)PanReac AppliChem, Darmstadt, Alemanha28312
Ácido esteárico (pureza 95-106%)Himedia, Mumbai, ÍndiaGRM1425
Filtro de seringa (0,45 µm)Merck, SASLHV033RS
Microscópio eletrônico de transmissão (MET), TalosThermo Fisher, EUAN/A
Tween-80 (T80) (surfactante não iônico, ácido oleico ≥58%)Loba Chemie, Mumbai, ÍndiaArt. No. 06420
Espetrofotômetro UV-visívelShimadzu, Quioto, Japão220-92961-01
Zetasizer Nano ZS90Malvern Panalytical, Malvern, Reino UnidoZEN3690

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