Este protocolo apresenta um modelo de ratos para lesão renal aguda induzida por contraste e avalia a administração pós-contraste de N-acetilcisteína e montelucaste, separadamente e em combinação. Os regimes de tratamento foram associados a disfunção renal, estresse oxidativo, inflamação e lesão histopatológica menos graves, embora o tratamento combinado não tenha superado consistentemente a monoterapia.
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Efeitos Nefroprotetores do Tratamento com N-Acetilcisteína e Montelucaste Pós-contraste em um Modelo de Rato de Lesão Renal Aguda Induzida por Contraste
Neste artigo
Resumo
Resumo
A lesão renal aguda induzida por contraste (CI-AKI) é uma complicação importante da exposição a contraste iodado, na qual o estresse oxidativo e os processos inflamatórios contribuem para o dano renal. Este estudo estabeleceu um modelo experimental de CI-AKI em ratos e examinou os efeitos do tratamento iniciado após a administração do contraste com N-acetilcisteína (NAC), montelucaste ou uma combinação de ambos. Ratos Wistar machos adultos foram submetidos à privação hídrica seguida pela administração intravenosa sequencial de Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), indometacina e iohexol. O tratamento foi iniciado 1 h após a conclusão da administração de iohexol, aproximadamente 1,5 h após a administração de L-NAME, e foi mantido uma vez ao dia durante 3 dias consecutivos. Foram avaliados índices de função renal, parâmetros de estresse oxidativo, citocinas inflamatórias, biomarcadores de lesão renal e histopatologia renal. O grupo de CI-AKI sem tratamento exibiu disfunção renal acentuada, perfil desfavorável de estresse oxidativo e inflamação e danos histopatológicos substanciais. Em comparação com o grupo de CI-AKI sem tratamento, os animais que receberam NAC, montelucaste ou o regime combinado geralmente apresentaram achados bioquímicos e histopatológicos melhorados. Os níveis de glutationa (GSH) foram mais altos e as pontuações médias de lesão histopatológica numericamente mais baixas no grupo de combinação; no entanto, o tratamento combinado não superou consistentemente a monoterapia em todos os desfechos avaliados. Este protocolo fornece uma estrutura pré-clínica controlada para avaliar intervenções pós-contraste na CI-AKI, e os achados justificam investigações experimentais adicionais com NAC e montelucaste, sem estabelecer eficácia clínica ou vantagem específica da combinação.
Introdução
A lesão renal aguda (LRA) frequentemente complica o quadro de pacientes hospitalizados e contribui para o aumento da morbidade, mortalidade e uso de recursos em saúde. Como os meios de contraste iodados são rotineiramente utilizados em exames de imagem diagnóstica e procedimentos intervencionais, a deterioração da função renal após exposição ao contraste tornou-se uma preocupação clínica importante. A nomenclatura atual distingue a lesão renal aguda associada ao contraste (LRA-AC), que engloba qualquer episódio de LRA ocorrendo após a administração de contraste, da lesão renal aguda induzida por contraste (LRA-IC), na qual o dano renal é causalmente atribuído ao agente de contraste. Em modelos experimentais controlados, nos quais a exposição ao contraste pode ser diretamente associada à lesão renal, o termo LRA-IC permanece amplamente utilizado1,2.
Pacientes com doença renal crônica, diabetes melito, idade avançada, insuficiência cardíaca ou outras comorbidades cardiovasculares são particularmente suscetíveis à LRA-C. A função renal se recupera em muitos pacientes afetados; no entanto, em casos mais graves, podem ocorrer comprometimento renal persistente, necessidade de terapia de substituição renal e aumento do risco de morte. A LRA-C também está associada a internações hospitalares mais longas e maior uso de recursos de saúde. Essas consequências adversas destacam a necessidade contínua de desenvolver abordagens preventivas e terapêuticas eficazes para lesões renais relacionadas ao contraste1,3,4,5.
O desenvolvimento da LCA-AIQ envolve diversos processos inter-relacionados, incluindo alteração na perfusão renal, desequilíbrio do oxigênio na medula, estresse oxidativo, inflamação e toxicidade tubular direta. A exposição ao contraste desloca o tônus vascular intrarrenal em direção à vasoconstrição, ao mesmo tempo que reduz as respostas vasodilatadoras, diminuindo assim o fluxo sanguíneo renal. A medula externa é particularmente vulnerável, pois a disponibilidade de oxigênio nesta região já é limitada sob condições fisiológicas. Uma diminuição adicional na oferta de oxigênio após a administração do contraste pode, portanto, precipitar lesão tubular hipóxica2,6,7.
A hipóxia renal após exposição ao contraste é acompanhada pelo aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), o que contribui significativamente para a lesão renal. Quando a produção de ROS excede a capacidade antioxidante endógena, pode ocorrer dano oxidativo nos lipídios, proteínas e DNA celulares, enquanto simultaneamente é potencializado o sinalização inflamatória. Em contextos experimentais e clínicos, a administração de contraste tem sido associada ao aumento de parâmetros de estresse oxidativo e à defesa antioxidante prejudicada. As vias moleculares implicadas nesta resposta incluem a formação de radicais dependentes da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase e a ativação do fator nuclear kappa-B (NF-κB)1,6,8,9.
A contribuição da inflamação indica que a CI-AKI não pode ser explicada apenas pelo distúrbio hemodinâmico. Evidências recentes também implicaram a ferroptose, o estresse nitrosativo e as armadilhas extracelulares de neutrófilos na lesão renal após exposição ao contraste. O reconhecimento desses mecanismos adicionais ampliou a gama de alvos moleculares em investigação para a prevenção e tratamento da CI-AKI1.
A creatinina sérica e o débito urinário são comumente utilizados para identificar a LRA-CI, mas ambos podem alterar-se apenas após o dano renal já ter se desenvolvido. Essa limitação tem incentivado a avaliação de indicadores mais precoces, incluindo a molécula-1 de lesão renal (KIM-1), que reflete o dano tubular, e a cistatina C, que está associada a alterações na filtração glomerular. Evidências de estudos experimentais e clínicos indicam que alterações nesses biomarcadores podem tornar-se detectáveis na fase inicial da LRA-CI e, portanto, permitem uma avaliação mais precoce da lesão renal9,10,11.
Os avanços no entendimento da fisiopatologia da CI-AKI incentivaram a avaliação de intervenções farmacológicas direcionadas a vias oxidativas e inflamatórias. A hidratação adequada continua sendo a principal medida preventiva, enquanto os benefícios relatados das abordagens baseadas em medicamentos têm variado entre os estudos. Consequentemente, nenhum tratamento farmacológico demonstrou até agora eficácia suficientemente consistente para ser adotado como uma intervenção clínica padrão para a CI-AKI1,4,12,13.
A N-acetilcisteína (NAC) tem sido amplamente avaliada como uma abordagem farmacológica para limitar a LCA-AKI. Os efeitos renoprotetores propostos estão relacionados à eliminação de espécies reativas e à restauração das reservas de glutationa. O apoio clínico inicial surgiu de um estudo marcante com pacientes com doença renal crônica, no qual a NAC reduziu a incidência de disfunção renal relacionada ao contraste14. No entanto, ensaios clínicos posteriores e sínteses de evidências produziram resultados inconsistentes, com alguns estudos relatando benefícios e outros não demonstrando efeito clínico significativo. A eficácia da NAC para LCA-AKI, portanto, permanece incerta12,15,16,17.
O montelucaste bloqueia seletivamente o receptor de leucotrienos cisteínico-1 e há muito tempo é usado para tratar asma e distúrbios alérgicos. Evidências experimentais também indicam que este agente exerce efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e antiapoptóticos. Em diferentes modelos de lesão renal, a administração de montelucaste tem sido associada à redução da peroxidação lipídica, ao fortalecimento das defesas antioxidantes endógenas, a danos histopatológicos menos graves e à atenuação da lesão renal18,19,20,21,22.
As evidências que examinam especificamente o montelucaste na nefropatia induzida por contraste (CI-AKI) ainda são limitadas. Os achados experimentais disponíveis sugerem que seus efeitos renais podem envolver a modulação da sinalização oxidativa e inflamatória. A redução da expressão da NADPH oxidase 4 (NOX4), p22phox e NF-κB tem sido proposta como um dos mecanismos pelos quais o montelucaste pode atenuar a lesão renal relacionada ao contraste9.
A NAC e o montelukast influenciam parcialmente vias distintas, mas sobrepostas, envolvidas na lesão renal. A NAC atua principalmente no suporte à defesa antioxidante, enquanto o montelukast possui ações tanto anti-inflamatórias quanto antioxidantes. A administração concomitante desses agentes pode, portanto, afetar múltiplos componentes da fisiopatologia da CI-AKI; no entanto, ainda não foi estabelecido em modelos experimentais se sua interação produz um benefício aditivo ou sinérgico18,19,20,21,22.
Investigações anteriores avaliaram predominantemente intervenções administradas antes da exposição ao contraste, enquanto as evidências sobre tratamentos iniciados após a exposição permanecem escassas. Em particular, a administração pós-contraste de montelucaste juntamente com NAC foi pouco investigada em modelos experimentais de LRA-IC. O presente estudo, portanto, avaliou o montelucaste e a NAC, administrados após a exposição ao contraste, separadamente ou em combinação, em relação à função renal, parâmetros de estresse oxidativo e defesas antioxidantes, lesão renal e biomarcadores inflamatórios, bem como alterações histopatológicas em um modelo de rato de LRA-IC.
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes internacionalmente aceitas para o cuidado e uso de animais de laboratório e cumpriram as diretrizes Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE). O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética Local em Experimentação Animal da Universidade Ahi Evran, Kırşehir, Turquia (Número da Decisão: 2, Número da Reunião: 12, Data: 12 de junho de 2025). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais utilizados ao longo do estudo. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
Preparação dos produtos químicos
Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), indometacina, iohexol, montelucaste sódico e NAC foram utilizados neste estudo. Uma solução de L-NAME a 10 mg/mL foi preparada em solução salina normal estéril a 0,9%, utilizando 1 g de L-NAME por 100 mL. A solução foi preparada no dia da administração e utilizada sem armazenamento além desse dia. Para indução do modelo experimental de LRA-AKI induzida por contraste, o L-NAME foi administrado por via intravenosa (IV) na dose de 10 mg/kg. Em um rato com peso aproximado de 220 g, a quantidade calculada foi de aproximadamente 2,2 mg, correspondendo a um volume de administração de aproximadamente 0,22 mL. A indometacina foi preparada em solução a 5% de bicarbonato de sódio, numa concentração de 10 mg/mL, dissolvendo-se 100 mg em um volume final de 10 mL. O preparo foi agitado em vórtex até ficar visualmente homogêneo. O pH final da solução de indometacina preparada não foi medido durante o experimento e, portanto, não pôde ser determinado retrospectivamente. Não foi documentado nos registros experimentais um procedimento específico de esterilidade ou filtração para a solução de indometacina preparada e, por isso, não pôde ser informado retrospectivamente. Nenhum intervalo formal de estabilidade foi estabelecido ou avaliado; a solução foi preparada no dia e utilizada no mesmo dia. Para induzir o modelo experimental de LRA-AKI induzida por contraste, a indometacina foi administrada por via intravenosa na dose de 10 mg/kg. Para um rato com peso aproximado de 220 g, a quantidade calculada foi de aproximadamente 2,2 mg, correspondendo a um volume de administração de aproximadamente 0,22 mL.
A formulação comercial de iohexol, contendo 647 mg de iohexol/mL e uma concentração equivalente de iodo de 300 mg/mL, foi administrada sem diluição adicional. A temperatura exata do iohexol no momento da injeção não foi registrada. Um valor específico de osmolalidade da formulação não pôde ser verificado com confiança a partir dos registros experimentais disponíveis e, portanto, não é informado. Para a indução do modelo experimental de LCA-AQI induzida por contraste, o iohexol foi administrado por via intravenosa na dose de 3 g de iodo/kg. Em uma rata com peso aproximado de 220 g, essa dose forneceu cerca de 0,66 g de iodo e correspondeu a um volume de injeção de aproximadamente 2,2 mL.
Uma suspensão de montelukast sódico foi preparada em carboximetilcelulose (CMC) a 0,5%. Foi preparada recentemente em cada dia de administração e vortexada imediatamente antes da dose para obter uma distribuição uniforme das partículas em suspensão. A dose de montelukast necessária para cada animal foi calculada separadamente com base no peso corporal registrado no início do estudo, utilizando a seguinte fórmula: dose necessária (mg) = peso corporal (kg) × 10 mg/kg. Para um animal com peso aproximado de 220 g, a dose calculada foi de aproximadamente 2,2 mg, administrada por gavagem oral. A suspensão foi inspecionada visualmente antes de cada administração, e qualquer preparação que apresentasse sedimentação foi novamente vortexada antes do uso.
O NAC foi administrado aos grupos tratados a partir de sua formulação comercial, sem diluição adicional, na dose intraperitoneal de 100 mg/kg. Para cada animal, a dose necessária foi calculada individualmente com base no peso corporal registrado no início do estudo. Em um animal com peso aproximado de 220 g, isso correspondeu a aproximadamente 22 mg de NAC e um volume de administração de aproximadamente 0,15 mL. Antes da administração, a solução foi examinada visualmente, e somente preparações límpidas e livres de partículas visíveis foram utilizadas.
Cada preparação foi submetida à inspeção visual antes da administração. As soluções de L-NAME, indometacina, iohexol e NAC foram verificadas quanto a descoloração e partículas visíveis. Imediatamente antes da administração, a suspensão de montelukast foi vortexada e examinada visualmente para confirmar a uniformidade. Qualquer preparação que não atendesse a esses critérios de aceitação não foi utilizada. Jalecos laboratoriais, luvas de proteção e proteção ocular foram usados durante o preparo e a administração de todos os produtos químicos. Todos os procedimentos cumpriram os requisitos institucionais de segurança laboratorial e biossegurança.
Seleção animal, acomodação, grupos experimentais e randomização
Trinta ratos machos adultos da linhagem Wistar albino (8–12 semanas de idade; peso corporal, 200–220 g) foram obtidos do Laboratório de Pesquisa com Animais Experimentais da Universidade Ahi Evran, em Kırşehir, Türkiye. Os ratos machos foram selecionados para manter a consistência metodológica com modelos experimentais prévios de LIA-AQC publicados anteriormente e para evitar a introdução da fase do ciclo estral como uma variável biológica adicional. O sexo não foi avaliado como variável experimental no presente estudo. A instalação animal possuía uma licença de criação/produção nº 184, e os ratos foram criados e mantidos nesse local sob condições laboratoriais padrão. No momento da inclusão, os animais não tinham status documentado de livres de patógenos específicos (SPF) nem outra classificação formal de saúde microbiológica. Cada rato foi alojado individualmente em gaiolas de policarbonato medindo 40 cm × 25 cm × 20 cm, com aparas de pinho picadas grosseiramente usadas como cama. As condições ambientais foram mantidas em 24 °C ± 2 °C e umidade relativa de 35% ± 10% por meio de um sistema automatizado de controle ambiental e ventilação. Um ciclo de 12 h de luz/12 h de escuro foi aplicado, com iluminação das 07:00 às 19:00. Nenhum enriquecimento ambiental específico foi fornecido durante a fase de aclimatação de 7 dias nem durante o período experimental subsequente. Ração peletizada padrão para roedores e água da torneira foram oferecidas ad libitum, exceto durante o período definido de privação de água de 16 h anterior à indução do LIA-AQC. A composição da ração foi de 24% de proteína bruta, 3,94% de celulose bruta, 5,08% de gordura bruta, 8,8% de cinzas brutas, 1,44% de lisina, 0,61% de metionina, 1,14% de cálcio, 0,89% de fósforo e 0,28% de sódio. Todos os animais foram aclimatados por 7 dias antes do início dos procedimentos experimentais. Observações diárias foram realizadas tanto durante o período de aclimatação quanto no período experimental para avaliar o estado geral, consumo de alimento e água, mobilidade, postura, aparência da pelagem e quaisquer sinais de sofrimento. Para minimizar o viés de seleção, os animais foram alocados nos cinco grupos experimentais utilizando uma sequência aleatória gerada por computador, com seis animais designados para cada grupo. O tamanho da amostra foi determinado por meio de uma análise de poder a priori utilizando o software G*Power versão 3.1.9.6.
O tamanho da amostra foi determinado por uma análise de poder a priori para uma análise de variância unidirecional de efeitos fixos envolvendo cinco grupos experimentais. Assumindo um tamanho do efeito (f) de 0,65, uma taxa de erro tipo I (α) de 0,05 e um poder estatístico de 80%, o tamanho total da amostra necessário foi calculado como 30 animais, correspondendo a seis animais por grupo. O tamanho do efeito (f = 0,65) foi assumido a priori como representando um efeito global grande entre grupos na comparação de cinco grupos. O cálculo teve como objetivo determinar o tamanho da amostra necessário para detectar tal efeito global e não foi especificamente projetado para detectar diferenças pareadas menores entre os grupos de tratamento ativo. O animal individual foi considerado a unidade experimental para todas as análises.
Exceto pelo manejo rotineiro, monitoramento diário de saúde e procedimentos terminais, os animais do grupo Controle não foram submetidos a manipulações ou contenções relacionadas ao protocolo, privação de água, injeções intravenosas ou intraperitoneais, gavagem oral ou administração de veículo. O grupo CI-AKI compreendia animais nos quais o modelo de CI-AKI foi estabelecido no dia 8 e que não receberam tratamento. O grupo CI-AKI + Montelukast compreendia animais nos quais o modelo de CI-AKI foi estabelecido e que posteriormente receberam tratamento com montelukast. O grupo CI-AKI + NAC compreendia animais nos quais o modelo de CI-AKI foi estabelecido e que posteriormente receberam tratamento com NAC. O grupo CI-AKI + Montelukast + NAC compreendia animais nos quais o modelo de CI-AKI foi estabelecido e que posteriormente receberam uma combinação de montelukast e NAC. Nem o grupo Controle nem o grupo CI-AKI sem tratamento passaram por procedimentos simulados correspondentes aos tratamentos. Especificamente, não foram realizadas contenções simuladas, gavagem oral simulada, injeções simuladas de tratamento ou administrações simuladas de veículo nestes grupos. Os veículos utilizados para a preparação de L-NAME, indometacina e montelukast foram solução salina normal a 0,9%, solução de bicarbonato de sódio a 5% e CMC a 0,5%, respectivamente, conforme descrito na preparação dos produtos químicos. O NAC foi administrado a partir de sua formulação comercial sem diluição adicional, e nenhum veículo separado foi preparado para o NAC. No dia 8, todos os animais, exceto os do grupo Controle, foram submetidos a 16 h de privação de água, seguidas pela administração sequencial intravenosa de L-NAME (10 mg/kg), indometacina (10 mg/kg) e iohexol (3 g de iodo/kg) para induzir lesão renal aguda induzida por contraste. Nos grupos de tratamento designados, montelukast (10 mg/kg, gavagem oral) e/ou NAC (100 mg/kg, injeção intraperitoneal) foram administrados primeiramente 1 h após a conclusão da administração de iohexol no dia 8, correspondendo a aproximadamente 1,5 h após a administração de L-NAME, e subsequentemente administrados uma vez ao dia, no mesmo horário, nos dias 9 e 10.
Protocolo de administração de fármacos
A IAR-CI foi estabelecida de acordo com um protocolo experimental publicado, consistindo em 16 h de privação de água seguidas pela administração intravenosa sequencial de L-NAME, indometacina e iohexol23,24,25. O L-NAME e a indometacina foram administrados em doses de 10 mg/kg cada, enquanto o iohexol foi administrado na dose de 3 g de iodo/kg. As doses de tratamento foram de 10 mg/kg para o montelukast sódico e 100 mg/kg para a NAC. A seleção das doses para indução do modelo e para o tratamento foi baseada em estudos experimentais previamente publicados22,26,27. Nenhum estudo preliminar de determinação ou otimização de dose foi realizado. As doses da NAC e do montelukast foram selecionadas independentemente, com base em estudos experimentais publicados anteriormente sobre os agentes individuais, e não foram derivadas de um estudo de determinação de dose específico para a combinação. As doses selecionadas não tinham a intenção de representar exposições farmacologicamente equipotentes, e nenhuma análise de resposta à dose ou interação medicamentosa formal foi realizada. Nenhum limiar numérico ou laboratorial pré-definido foi utilizado para definir a indução bem-sucedida do modelo ao nível individual dos animais. No ponto final do estudo, o estabelecimento bem-sucedido da lesão renal foi apoiado pelas alterações histopatológicas características observadas no grupo de IAR-CI não tratado em comparação com o grupo Controle. No dia 8, todos os animais, exceto os do grupo Controle, passaram por um único período de 16 h de privação de água imediatamente antes da indução da lesão renal aguda induzida por contraste. A privação de água não foi repetida durante o restante do período experimental. A ração padrão em pellets permaneceu disponível ad libitum durante todo o período de privação de água. Após a conclusão do único período de 16 h de privação de água, o acesso à água da torneira foi restabelecido simultânea e ad libitum em todos os grupos experimentais privados de água, antes da administração do primeiro agente indutor do modelo, o L-NAME, e foi mantido pelo restante do período experimental. O momento e as condições do restabelecimento da água foram idênticos em todos os grupos privados de água. A ingestão de água após o restabelecimento não foi limitada a um volume pré-definido e não foi medida quantitativamente. Os pesos corporais pareados imediatamente antes e após o período de 16 h de privação de água não foram medidos; portanto, a perda percentual de peso corporal associada à desidratação não pôde ser calculada. A diurese não foi monitorada quantitativamente. Após o restabelecimento do acesso à água, a indução da IAR-CI foi iniciada. Todas as administrações intravenosas sequenciais de L-NAME, indometacina e iohexol foram realizadas por meio de uma veia lateral da cauda, utilizando uma agulha 26 G acoplada a uma seringa estéril de 5 mL. Antes da administração intravenosa, a cauda foi aquecida em água por vários minutos para facilitar a visualização e a dilatação das veias laterais da cauda. Após cada administração intravenosa, a veia foi lavada com 0,5 mL de solução salina normal estéril a 0,9%, além do volume de administração calculado do respectivo agente indutor do modelo. O local da injeção foi monitorado visualmente durante a administração e a lavagem quanto a inchaço, vazamento ou sinais de extravasamento. O L-NAME (10 mg/kg) foi administrado primeiro. Quinze minutos após a administração do L-NAME, a indometacina (10 mg/kg) foi administrada intravenosamente pela mesma veia lateral da cauda. Quinze minutos após a administração da indometacina, o iohexol foi administrado intravenosamente pela mesma veia lateral da cauda na dose de 3 g de iodo/kg. Para cada animal, a dose de iohexol e o volume de injeção correspondente foram calculados individualmente com base no peso corporal registrado no início do estudo e na concentração comercial de iodo de 300 mg de iodo/mL. Isso correspondeu a um volume de administração de 10 mL/kg e, portanto, aproximadamente 2,0–2,2 mL para ratos com peso entre 200–220 g. Nenhum volume máximo permitido por via intravenosa definido por protocolo foi pré-especificado; a maior administração única por via intravenosa utilizada neste estudo foi o iohexol em 10 mL/kg. O iohexol foi administrado lentamente durante aproximadamente 1–2 min. A administração intravenosa bem-sucedida foi verificada pela ausência de inchaço visível, vazamento ou extravasamento no local da injeção. Nenhum extravasamento parcial foi observado, e nenhuma injeção precisou ser repetida ou redosada devido a suspeita de extravasamento. Uma hora após a conclusão da administração do iohexol, os tratamentos designados foram administrados pela primeira vez aos grupos de tratamento. Como a administração do iohexol foi iniciada 30 min após a administração do L-NAME e concluída em aproximadamente 1–2 min, o início do tratamento ocorreu aproximadamente 91–92 min (cerca de 1,5 h) após a administração do L-NAME. O montelukast sódico (10 mg/kg) foi administrado por gavagem oral, enquanto a NAC (100 mg/kg) foi administrada por via intraperitoneal.
A gavagem oral foi realizada utilizando uma cânula de alimentação de aço inoxidável 22 G. Cada animal foi mantido em posição ereta, e a cânula de alimentação foi suavemente avançada através do esôfago até o estômago. Caso fosse encontrada resistência excessiva, a cânula era retirada e reposicionada antes da administração. O animal foi observado quanto à regurgitação durante e imediatamente após a gavagem. Nenhuma regurgitação ou outro sinal de dose oral incompleta foi observado durante ou imediatamente após a gavagem em qualquer animal, e nenhum animal foi excluído com base em suspeita de administração oral mal sucedida. As injeções intraperitoneais foram administradas no quadrante inferior direito do abdômen. A agulha foi inserida em um ângulo de aproximadamente 30°–45°, e foi realizada aspiração antes da administração para verificar entrada vascular acidental. O local da injeção foi monitorado visualmente durante e imediatamente após a administração, em busca de vazamento, sangramento ou outras complicações visíveis. Os tratamentos designados foram administrados uma vez ao dia, no mesmo horário, nos dias 8, 9 e 10. Assim, os animais no grupo CI-AKI + Montelukast receberam montelukast uma vez ao dia durante três dias consecutivos, os animais no grupo CI-AKI + NAC receberam NAC uma vez ao dia durante três dias consecutivos, e os animais no grupo CI-AKI + Montelukast + NAC receberam ambos montelukast e NAC uma vez ao dia, de acordo com o mesmo esquema de tratamento de três dias. Todas as administrações para indução do modelo e tratamentos foram realizadas pelo mesmo pesquisador. O peso corporal foi medido uma única vez para cada animal no início do estudo e não foi reavaliado durante o período experimental. Para cada animal, a dose e o volume correspondente de todos os agentes indutores do modelo e tratamentos do estudo foram calculados individualmente, utilizando o peso corporal registrado no início do estudo. Todos os procedimentos intravenosos, intraperitoneais e de gavagem oral foram realizados utilizando a mesma técnica padronizada para minimizar a variabilidade relacionada à administração.
Procedimento de eutanásia, pontos finais humanos e coleta de amostras
Os animais foram observados uma vez ao dia durante todo o experimento quanto a alterações no estado geral, consumo de ração e água, mobilidade, postura, aparência da pelagem e sinais de sofrimento. Os critérios humanitários definidos prospectivamente incluíam letargia acentuada, incapacidade de acessar ou consumir ração ou água disponíveis, postura anormal, mobilidade reduzida, piloereção persistente e qualquer outra manifestação evidente de sofrimento. Os animais que atendessem a qualquer um desses critérios deveriam ser submetidos imediatamente à eutanásia; no entanto, nenhum animal cumpriu os critérios de ponto final humanitário durante o estudo. No dia 11, 24 h após o tratamento final, a anestesia profunda foi induzida pela administração intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) juntamente com xilazina (10 mg/kg). A ausência da resposta de retirada plantar foi utilizada para verificar um plano anestésico adequado. Após a confirmação de profundidade anestésica suficiente, aproximadamente 3–5 mL de sangue foram coletados de cada animal por punção intracardíaca. A eutanásia foi então concluída por exsanguinação enquanto o animal permanecia sob anestesia profunda. A ausência de atividade cardíaca e de respiração espontânea foi utilizada para confirmar a morte.
O sangue coletado para medições bioquímicas séricas foi colocado em tubos sem anticoagulante e mantido até que a coagulação estivesse completa. Os tubos foram então centrifugados a 3.000 × g durante 10–15 min a 4 °C, após o que a fração sérica foi separada e armazenada a −80 °C até a análise. As amostras destinadas à medição de glutationa foram coletadas separadamente em tubos contendo ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). Como essas amostras foram anticoaguladas, foram processadas sem etapa de coagulação, conforme o procedimento correspondente do ensaio de glutationa. A separação sérica foi considerada aceitável quando o soro recuperado estava límpido e não apresentava evidência visível de hemólise.
Após a confirmação da morte, foi realizada uma laparotomia mediana e ambos os rins foram cuidadosamente removidos de cada animal. Os tecidos adiposos e conjuntivos ao redor foram removidos das amostras. O rim direito foi reservado exclusivamente para exame histopatológico, enquanto o rim esquerdo foi destinado à análise bioquímica. O tecido misto do rim esquerdo foi analisado sem dissecção separada da córtex e medula renais. Os dois rins foram manipulados de forma independente, e as amostras de diferentes animais permaneceram separadas durante todo o processamento, sem agrupamento. Todo o rim direito foi colocado em formaldeído neutro tamponado a 10% e processado para avaliação histopatológica. Seções que incluíam a córtex renal e a medula externa foram preparadas e examinadas conforme os procedimentos descritos no processamento e escore histopatológico. Cada rim esquerdo foi rotulado individualmente e mantido a -80 °C até a homogeneização e testes bioquímicos. Após a excisão, a integridade macroscópica do tecido foi verificada, e uma quantidade adequada de tecido foi conservada para as avaliações histopatológicas e bioquímicas previstas.
O pesquisador responsável pela indução do modelo e administração do tratamento não pôde ser cegado, pois os grupos experimentais passaram por procedimentos diferentes. No entanto, as identidades dos grupos foram ocultadas dos pesquisadores que realizaram as análises bioquímicas e estatísticas e do patologista que realizou as avaliações histopatológicas. Todos os animais incluídos foram mantidos no estudo e incluídos nas análises subsequentes. As amostras biológicas, tecidos animais, fixadores à base de formaldeído e outros materiais químicos residuais foram manipulados com equipamentos de proteção individual apropriados. A eliminação de todos os resíduos biológicos e químicos foi realizada em conformidade com os requisitos institucionais de biossegurança e gerenciamento de resíduos perigosos.
Análises bioquímicas
As medições bioquímicas foram realizadas utilizando soro, sangue anticoagulado com EDTA e homogeneados de tecido renal esquerdo coletados de cada animal. Os procedimentos são apresentados a seguir de acordo com a matriz biológica utilizada para cada parâmetro. O soro foi analisado quanto à ureia, nitrogênio ureico no sangue (BUN), creatinina, superóxido dismutase (SOD) e malondialdeído (MDA). A ureia, o BUN e a creatinina foram utilizados como índices de função renal, enquanto a atividade da SOD e a concentração de MDA foram avaliadas como parâmetros de estresse oxidativo. Os valores séricos de ureia e BUN foram obtidos utilizando o mesmo ensaio enzimático urease–glutamato desidrogenase. Neste método, a ureia foi hidrolisada pela urease para produzir amônia, que subsequentemente reagiu com 2-oxoglutarato e nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (NADH) na presença de glutamato desidrogenase. O método analítico utilizado foi um ensaio cinético enzimático urease–glutamato desidrogenase. A diminuição da absorbância resultante do consumo de NADH foi medida cineticamente utilizando um espectrofotômetro. A concentração sérica de creatinina foi medida colorimetricamente utilizando um analisador bioquímico automatizado. A atividade sérica de SOD foi medida colorimetricamente utilizando um kit de ensaio comercial disponível no mercado, no mesmo analisador bioquímico automatizado. O ensaio de SOD baseou-se na geração de radicais superóxido pelo sistema xantina–xantina oxidase e sua reação com cloreto de 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazólio para formar um produto de formazano colorido. A absorbância final foi medida a 505 nm, e a atividade de SOD foi expressa em U/mL. A concentração sérica de MDA foi determinada colorimetricamente utilizando a reação com ácido tiobarbitúrico. As amostras séricas foram misturadas com ácido tricloroacético frio para precipitar as proteínas, e o precipitado resultante foi separado por centrifugação. Esta etapa de centrifugação foi realizada a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C. O sobrenadante foi reagido com ácido tiobarbitúrico a 90 °C por 60 min, resfriado e medido a 532 nm. As concentrações de MDA foram calculadas a partir da curva de calibração correspondente e expressas em nmol/mL. A análise de glutationa (GSH) foi realizada utilizando sangue anticoagulado com EDTA. As proteínas foram precipitadas com ácido tricloroacético, e as amostras desproteinizadas resultantes foram analisadas colorimetricamente por um método de Ellman modificado. As amostras foram combinadas com 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) em tampão Tris 500 mM com pH 8,2. A reação dos grupos tiol do GSH com o DTNB gerou um produto colorido, e a absorbância foi registrada a 412 nm. A atividade da catalase (CAT) foi determinada utilizando um procedimento colorimétrico de dois passos. Inicialmente, as amostras foram incubadas com uma quantidade conhecida de peróxido de hidrogênio, que a catalase converteu em água e oxigênio molecular. Após a terminação da reação enzimática, o peróxido de hidrogênio residual foi medido utilizando um reagente cromogênico. A absorbância foi registrada a 405 nm, e a atividade da CAT foi expressa em U/mL. Para as medições no tecido renal, o rim esquerdo de cada animal foi utilizado como tecido misto, sem separar a córtex da medula. Conforme indicado no procedimento, o rim direito foi mantido exclusivamente para avaliação histopatológica. As amostras pertencentes a animais individuais foram processadas independentemente e não foram agrupadas em nenhuma etapa. Cada espécime de rim esquerdo foi homogeneizado em gelo em tampão fosfato 50 mM com pH 7,4, utilizando uma proporção tecido:tampão de 1:10 (p/v). Um homogeneado de tecido renal específico para cada animal foi gerado para cada rato. Aliquotas separadas deste homogeneado foram utilizadas para as diferentes medições no tecido renal, garantindo que todos os parâmetros fossem derivados do mesmo animal individual. Os homogeneados de tecido renal resultantes foram centrifugados a 14.000 × g durante 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, o sobrenadante obtido de cada animal foi coletado separadamente e dividido em aliquotas para as análises planejadas no tecido renal. As concentrações de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), cistatina C e KIM-1 nos sobrenadantes do tecido renal foram medidas utilizando kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) específicos para ratos. Os ensaios foram realizados de acordo com os protocolos do fabricante. As condições de incubação foram idênticas para os ELISAs de TNF-α, IL-1β, IL-6, cistatina C e KIM-1. Para cada ensaio, as amostras e os reagentes do ELISA foram incubados por 1 h a 37 °C; após cinco ciclos de lavagem, as soluções de substrato A e B foram adicionadas e incubadas por 10 min a 37 °C. Resumidamente, os padrões e os sobrenadantes do tecido renal foram adicionados às placas pré-revestidas com anticorpo, seguidos pelo anticorpo de detecção biotinilado correspondente e pelo conjugado estreptavidina–peroxidase de rábbito. Após as etapas de incubação especificadas, os componentes não ligados foram removidos utilizando um lavador automatizado de microplacas. A solução de substrato foi subsequentemente adicionada, e a reação de cor foi interrompida utilizando a solução ácida de parada. A absorbância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas, e as concentrações dos analitos foram calculadas a partir das curvas-padrão correspondentes. As medições de ELISA no tecido renal foram realizadas em duplicata. Para cada analito, a média das duas placas com réplicas técnicas foi calculada para obter um único valor por animal. As placas com réplicas técnicas e as aliquotas separadas obtidas do mesmo homogeneado específico para cada animal não foram consideradas observações independentes. Todas as medições bioquímicas foram realizadas sob condições padronizadas específicas para cada ensaio. As amostras de soro, sangue anticoagulado com EDTA e tecido renal foram processadas separadamente de acordo com os requisitos dos métodos analíticos correspondentes. Os pesquisadores que realizaram as análises bioquímicas estavam cegos quanto à alocação dos grupos. O animal individual, e não cada amostra de soro, amostra de sangue, espécime de rim, alíquota de homogeneado ou poço com réplica técnica, foi considerado a unidade experimental. Assim, seis observações independentes por animal foram incluídas na análise estatística para cada grupo experimental.
Processamento e pontuação histopatológicos
Espécimes do rim direito foram preparados para avaliação microscópica mediante processamento histológico de rotina. O rim direito inteiro de cada animal foi imerso em formaldeído neutro tamponado a 10% durante 72 h à temperatura ambiente. Após a fixação, a desidratação do tecido foi realizada sequencialmente em etanol a 50%, 70%, 80%, 96% e 100%, com cada concentração aplicada por 1 h. Os espécimes foram então submetidos a dois banhos de xilol, com 30 min por banho, antes da inclusão em parafina. Utilizando um micrótomo rotativo, seções de 5 µm que incluíam tanto o córtex renal quanto a medula externa foram obtidas dos blocos de parafina.
Para a coloração com hematoxilina e eosina (HE), as seções foram desparafinizadas e reidratadas, expostas à hematoxilina por 5 min e lavadas sob água corrente por mais 5 min. O álcool ácido foi utilizado para diferenciação, após a qual as seções foram realçadas em água amoniacal por 1 min e contracoloradas com eosina por 2 min. As seções coradas foram subsequentemente desidratadas em concentrações crescentes de álcool, clareadas com xilol e montadas permanentemente sob lamínulas.
As seções destinadas à coloração com tricrômio de Masson foram igualmente desparafinizadas e rehidratadas. O tratamento com mordente foi realizado por 60 min a 56 °C, seguido por enxágue em água corrente por 10 min. As seções foram então tratadas sequencialmente com hematoxilina férrica de Weigert por 10 min, solução de vermelho de Biebrich–fucsina ácida por 15 min, solução de ácido fosfotungstico por 10 min e solução de azul de anilina por 10 min. Após imersão em ácido acético a 1% por 5 min, as seções foram desidratadas, clarificadas em xilol e montadas com lamínulas.
Antes da avaliação microscópica, a adequação da coloração foi verificada separadamente para cada método. Considerou-se adequada a coloração com HE quando os detalhes nucleares e o contraste citoplasmático eram claramente discerníveis, enquanto as seções coradas com tricrômio de Masson foram aceitas quando as estruturas do tecido conjuntivo puderam ser visualizadas de forma distinta. Para cada animal, foram examinadas três seções coradas com HE e três seções coradas com tricrômio de Masson. Em cada seção, foram avaliados cinco campos microscópicos selecionados aleatoriamente, utilizando objetiva de 40×. Assim, foram examinados 15 campos microscópicos por método de coloração para cada animal. Todos os exames microscópicos foram realizados com a mesma objetiva e condições padronizadas de avaliação em todos os animais e grupos experimentais. As seções coradas com tricrômio de Masson foram avaliadas qualitativamente quanto à distribuição e deposição de colágeno intersticial, acúmulo da matriz extracelular e arquitetura tubulointersticial. Essas seções não foram utilizadas para gerar os escores semi-quantitativos de lesão histopatológica de 0 a 3. Fotomicrografias representativas coradas com HE e com tricrômio de Masson foram obtidas com objetiva de 40×, e uma barra de escala de 100 µm foi incluída em cada imagem representativa. Essas fotomicrografias foram obtidas com fins ilustrativos e não foram tratadas como observações independentes na pontuação histopatológica ou nas análises estatísticas. Todas as avaliações histopatológicas foram realizadas por um único patologista experiente, que permaneceu cegado quanto às identidades dos grupos experimentais. O uso de um único examinador cegado teve como objetivo limitar o viés de avaliação e a variação atribuível às diferenças entre observadores. A necrose tubular, dilatação tubular, degeneração celular e congestão vascular foram pontuadas semi-quantitativamente em seções renais coradas com HE, segundo um sistema adaptado de modelos de lesão renal previamente publicados28,29. Para cada parâmetro, os escores variaram de 0 a 3, correspondendo a ausência, leve, moderada e grave lesão histopatológica, respectivamente. Para cada animal, os achados dos cinco campos microscópicos examinados em cada uma das três seções coradas com HE, totalizando 15 campos, foram considerados em conjunto para atribuir um único escore de 0 a 3 para cada parâmetro histopatológico. Assim, cada animal contribuiu com um escore para necrose tubular, dilatação tubular, degeneração celular e congestão vascular. As seções histológicas e os campos microscópicos foram tratados como subamostras intra-animais e não foram considerados observações independentes. Em cada seção, os campos microscópicos foram selecionados aleatoriamente em regiões renais corticais e medulares externas comparáveis, a fim de padronizar a amostragem anatômica entre os animais e grupos experimentais. O animal individual, e não cada rim, seção histológica ou campo microscópico, foi considerado a unidade experimental. Assim, seis observações independentes ao nível animal foram incluídas na análise estatística para cada grupo experimental. Os valores apresentados na Tabela 3 representam as médias dos grupos calculadas a partir dos escores individuais ao nível animal dos seis animais em cada grupo experimental.
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando software de análise estatística. O animal individual foi considerado a unidade experimental para todas as análises estatísticas. Cada grupo experimental era composto por seis animais independentes (n = 6 por grupo). Replicatas técnicas, poços de ensaio, seções de tecido e campos microscópicos não foram tratados como observações independentes e não foram utilizados para aumentar o tamanho amostral estatístico. As variáveis contínuas são apresentadas como média ± desvio padrão (DP). A normalidade foi avaliada separadamente dentro de cada grupo experimental utilizando o teste de Shapiro–Wilk, e a homogeneidade das variâncias foi verificada utilizando o teste de Levene. Dado o delineamento experimental completamente balanceado, com tamanhos amostrais iguais entre os grupos, uma análise de variância unifatorial (ANOVA) foi utilizada para comparar os grupos. Comparações par a par foram realizadas utilizando o teste de comparação múltipla post hoc de Duncan. Possíveis valores atípicos foram avaliados mediante exame gráfico de diagramas de caixa (boxplots) e inspeção das observações individuais. Nenhuma observação foi considerada representar um erro de medição ou um resultado experimental inválido, e nenhum ponto de dado foi excluído por critérios estatísticos. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Resultados
Marcadores séricos de função renal (ureia, nitrogênio ureico no sangue e creatinina)
O delineamento experimental, o agrupamento dos animais, o cronograma de tratamento e a linha do tempo da coleta de amostras do presente estudo são resumidos na Figura 1. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas entre os grupos quanto aos níveis séricos de ureia, BUN e creatinina (p = 0.003, p = 0.003 e
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Discussão
Este estudo experimental de LRA-CI avaliou o tratamento pós-contraste com montelucaste, NAC ou sua combinação em relação à função renal, parâmetros de estresse oxidativo, respostas inflamatórias, biomarcadores de lesão renal e resultados histopatológicos. A exposição ao contraste provocou aumentos substanciais na ureia sérica, BUN e creatinina e foi acompanhada por alterações adversas nos parâmetros de estresse oxidativo e biomarcadores inflamatórios. Níveis elevados de KIM-1 e cistatina C forneceram evidências adicionai...
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Divulgações
Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes. Durante a elaboração deste manuscrito, ferramentas assistidas por IA foram utilizadas exclusivamente para edição linguística e correção gramatical. Nenhuma ferramenta de inteligência artificial foi usada para a geração, análise ou interpretação de dados, nem para a criação de quaisquer figuras, tabelas ou elementos gráficos. Os autores assumem total responsabilidade pelo conteúdo do manuscrito.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES:
YS, CS e OK contribuíram para a concepção e o delineamento do estudo. YS realizou os procedimentos experimentais e a coleta de dados. OK conduziu os exames histopatológicos. YS e CS realizaram as análises estatísticas e interpretaram os dados. YS redigiu o manuscrito. Todos os autores revisaram criticamente o manuscrito e aprovaram a versão final.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pela Unidade de Coordenação de Projetos de Pesquisa Científica da Universidade Kırşehir Ahi Evran (Projeto nº: TIP.A3.26.006).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Auto Strip Washer | Bio-Tek Instruments, USA | ELx50 | Limpeza automatizada de placas para ELISA. |
| Microplate Reader | Bio-Tek Instruments, USA | ELx800 | Medições de absorbância em ELISA. RRID:SCR_028651 |
| Formol tamponado neutro a 10% | Merck | Não registrado | Fixação de tecidos para histopatologia. |
| Centrífuga de bancada | Nüve | NF048 | Preparação de amostras e centrifugação. |
| Carboximetilcelulose (CMC) | Sigma-Aldrich, USA | C5678 | Veículo utilizado para suspensão de montelucaste. |
| Kit CAT Universal | Otto Scientific | Otto3051 | Medição colorimétrica da atividade de CAT no soro utilizando um analisador químico Mindray BS-400. |
| Homogeneizador digital | Daihan Scientific | HG-15D | Homogeneização de tecidos. |
| Eosina Y (amarelada) | Merck | 1.15935.0025 | Coloração HE. |
| Solução de Hematoxilina de Harris | BSLAB | BS-002 | Coloração HE. |
| Indometacina | Sigma-Aldrich, USA | I7378 | Utilizada para indução de CI-AKI. |
| Iohexol (Omnipaque 300) | GE HealthCare | Não registrado | Agente de contraste utilizado para induzir CI-AKI. |
| Cloretato de cetamina (Ketalar) | Pfizer, USA | Não registrado | Anestesia geral antes da coleta de amostras. |
| Microscópio óptico (Nikon Eclipse) | Nikon | Ni-U | Exame e imagem histopatológicos. RRID:SCR_024835 |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginina metil éster) | Sigma-Aldrich, USA | N5751 | Utilizado para indução de CI-AKI. |
| Kit de Coloração Tricrômio de Masson | MOSLAB, Türquia | BKMTO001 | Coloração tricrômio de Masson. |
| Analisador Químico Mindray | Mindray | BS-400 | Análises bioquímicas. |
| Montelucaste sódico | Sigma-Aldrich, USA | SML0101 | Administrado por gavagem oral como tratamento. |
| N-acetilcisteína (ASIST 300 mg/2 mL) | MAC  laç, Türquia | Não registrado | Administrado por via intraperitoneal como tratamento. |
| Kit ELISA de Cistatina C de Rato | BT Lab, China | E0145Ra | Medição por ELISA da cistatina C em sobrenadantes de tecido renal. |
| Kit ELISA de IL-1β de Rato | BT Lab, China | E0119Ra | Medição por ELISA da IL-1β em sobrenadantes de tecido renal. |
| Kit ELISA de IL-6 de Rato | BT Lab, China | E0135Ra | Medição por ELISA da IL-6 em sobrenadantes de tecido renal. |
| Kit ELISA de KIM-1 de Rato | BT Lab, China | E0549Ra | Medição por ELISA do KIM-1 em sobrenadantes de tecido renal. |
| Kit ELISA de TNF-α de Rato | BT Lab, China | E0764Ra | Medição por ELISA do TNF-α em sobrenadantes de tecido renal. |
| Agulha de alimentação em aço inoxidável (cânula de gavagem oral 22 G) | Instech Laboratories, USA | Não registrado | Administração por gavagem oral. |
| Ração peletizada padrão para roedores (Optima) | Optima, Türquia | Não registrado | Lote no. 58931. Composição nutricional: 24% proteína bruta, 3,94% celulose bruta, 5,08% gordura bruta, 8,8% cinza bruta, 1,44% lisina, 0,61% metionina, 1,14% cálcio, 0,89% fósforo e 0,28% sódio. |
| Kit Universal de Creatinina | Otto Scientific | OttoBC139 | Medição colorimétrica de creatinina no soro. |
| Kit Universal de GSH | Otto Scientific | Otto3053 | Medição colorimétrica de GSH em sangue anticoagulado com EDTA utilizando um método de Ellman modificado. |
| Kit Universal de MDA | Otto Scientific | Otto1001 | Medição colorimétrica de MDA no soro utilizando um leitor de microplacas ELx800. |
| Kit Universal de SOD | Otto Scientific | Otto3047 | Medição colorimétrica da atividade de SOD no soro utilizando um analisador químico Mindray BS-400. |
| Kit Universal de Uréia | Otto Scientific | OttoBC157 | Medição colorimétrica de uréia e BUN no soro. |
| Cloretato de xilazina (Rompun) | Bayer, Alemanha | Não registrado | Anestesia geral antes da coleta de amostras. |
Referências
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