Efeitos Nefroprotetores do Tratamento com N-Acetilcisteína e Montelucaste Pós-contraste em um Modelo de Rato de Lesão Renal Aguda Induzida por Contraste

Resumo

Este protocolo apresenta um modelo de ratos para lesão renal aguda induzida por contraste e avalia a administração pós-contraste de N-acetilcisteína e montelucaste, separadamente e em combinação. Os regimes de tratamento foram associados a disfunção renal, estresse oxidativo, inflamação e lesão histopatológica menos graves, embora o tratamento combinado não tenha superado consistentemente a monoterapia.

Resumo

A lesão renal aguda induzida por contraste (CI-AKI) é uma complicação importante da exposição a contraste iodado, na qual o estresse oxidativo e os processos inflamatórios contribuem para o dano renal. Este estudo estabeleceu um modelo experimental de CI-AKI em ratos e examinou os efeitos do tratamento iniciado após a administração do contraste com N-acetilcisteína (NAC), montelucaste ou uma combinação de ambos. Ratos Wistar machos adultos foram submetidos à privação hídrica seguida pela administração intravenosa sequencial de Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), indometacina e iohexol. O tratamento foi iniciado 1 h após a conclusão da administração de iohexol, aproximadamente 1,5 h após a administração de L-NAME, e foi mantido uma vez ao dia durante 3 dias consecutivos. Foram avaliados índices de função renal, parâmetros de estresse oxidativo, citocinas inflamatórias, biomarcadores de lesão renal e histopatologia renal. O grupo de CI-AKI sem tratamento exibiu disfunção renal acentuada, perfil desfavorável de estresse oxidativo e inflamação e danos histopatológicos substanciais. Em comparação com o grupo de CI-AKI sem tratamento, os animais que receberam NAC, montelucaste ou o regime combinado geralmente apresentaram achados bioquímicos e histopatológicos melhorados. Os níveis de glutationa (GSH) foram mais altos e as pontuações médias de lesão histopatológica numericamente mais baixas no grupo de combinação; no entanto, o tratamento combinado não superou consistentemente a monoterapia em todos os desfechos avaliados. Este protocolo fornece uma estrutura pré-clínica controlada para avaliar intervenções pós-contraste na CI-AKI, e os achados justificam investigações experimentais adicionais com NAC e montelucaste, sem estabelecer eficácia clínica ou vantagem específica da combinação.

Introdução

A lesão renal aguda (LRA) frequentemente complica o quadro de pacientes hospitalizados e contribui para o aumento da morbidade, mortalidade e uso de recursos em saúde. Como os meios de contraste iodados são rotineiramente utilizados em exames de imagem diagnóstica e procedimentos intervencionais, a deterioração da função renal após exposição ao contraste tornou-se uma preocupação clínica importante. A nomenclatura atual distingue a lesão renal aguda associada ao contraste (LRA-AC), que engloba qualquer episódio de LRA ocorrendo após a administração de contraste, da lesão renal aguda induzida por contraste (LRA-IC), na qual o dano renal é causalmente atribuído ao agente de contraste. Em modelos experimentais controlados, nos quais a exposição ao contraste pode ser diretamente associada à lesão renal, o termo LRA-IC permanece amplamente utilizado^1,2.

Pacientes com doença renal crônica, diabetes melito, idade avançada, insuficiência cardíaca ou outras comorbidades cardiovasculares são particularmente suscetíveis à LRA-C. A função renal se recupera em muitos pacientes afetados; no entanto, em casos mais graves, podem ocorrer comprometimento renal persistente, necessidade de terapia de substituição renal e aumento do risco de morte. A LRA-C também está associada a internações hospitalares mais longas e maior uso de recursos de saúde. Essas consequências adversas destacam a necessidade contínua de desenvolver abordagens preventivas e terapêuticas eficazes para lesões renais relacionadas ao contraste^1,3,4,5.

O desenvolvimento da LCA-AIQ envolve diversos processos inter-relacionados, incluindo alteração na perfusão renal, desequilíbrio do oxigênio na medula, estresse oxidativo, inflamação e toxicidade tubular direta. A exposição ao contraste desloca o tônus vascular intrarrenal em direção à vasoconstrição, ao mesmo tempo que reduz as respostas vasodilatadoras, diminuindo assim o fluxo sanguíneo renal. A medula externa é particularmente vulnerável, pois a disponibilidade de oxigênio nesta região já é limitada sob condições fisiológicas. Uma diminuição adicional na oferta de oxigênio após a administração do contraste pode, portanto, precipitar lesão tubular hipóxica^2,6,7.

A hipóxia renal após exposição ao contraste é acompanhada pelo aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), o que contribui significativamente para a lesão renal. Quando a produção de ROS excede a capacidade antioxidante endógena, pode ocorrer dano oxidativo nos lipídios, proteínas e DNA celulares, enquanto simultaneamente é potencializado o sinalização inflamatória. Em contextos experimentais e clínicos, a administração de contraste tem sido associada ao aumento de parâmetros de estresse oxidativo e à defesa antioxidante prejudicada. As vias moleculares implicadas nesta resposta incluem a formação de radicais dependentes da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase e a ativação do fator nuclear kappa-B (NF-κB)^1,6,8,9.

A contribuição da inflamação indica que a CI-AKI não pode ser explicada apenas pelo distúrbio hemodinâmico. Evidências recentes também implicaram a ferroptose, o estresse nitrosativo e as armadilhas extracelulares de neutrófilos na lesão renal após exposição ao contraste. O reconhecimento desses mecanismos adicionais ampliou a gama de alvos moleculares em investigação para a prevenção e tratamento da CI-AKI¹.

A creatinina sérica e o débito urinário são comumente utilizados para identificar a LRA-CI, mas ambos podem alterar-se apenas após o dano renal já ter se desenvolvido. Essa limitação tem incentivado a avaliação de indicadores mais precoces, incluindo a molécula-1 de lesão renal (KIM-1), que reflete o dano tubular, e a cistatina C, que está associada a alterações na filtração glomerular. Evidências de estudos experimentais e clínicos indicam que alterações nesses biomarcadores podem tornar-se detectáveis na fase inicial da LRA-CI e, portanto, permitem uma avaliação mais precoce da lesão renal^9,10,11.

Os avanços no entendimento da fisiopatologia da CI-AKI incentivaram a avaliação de intervenções farmacológicas direcionadas a vias oxidativas e inflamatórias. A hidratação adequada continua sendo a principal medida preventiva, enquanto os benefícios relatados das abordagens baseadas em medicamentos têm variado entre os estudos. Consequentemente, nenhum tratamento farmacológico demonstrou até agora eficácia suficientemente consistente para ser adotado como uma intervenção clínica padrão para a CI-AKI^1,4,12,13.

A N-acetilcisteína (NAC) tem sido amplamente avaliada como uma abordagem farmacológica para limitar a LCA-AKI. Os efeitos renoprotetores propostos estão relacionados à eliminação de espécies reativas e à restauração das reservas de glutationa. O apoio clínico inicial surgiu de um estudo marcante com pacientes com doença renal crônica, no qual a NAC reduziu a incidência de disfunção renal relacionada ao contraste¹⁴. No entanto, ensaios clínicos posteriores e sínteses de evidências produziram resultados inconsistentes, com alguns estudos relatando benefícios e outros não demonstrando efeito clínico significativo. A eficácia da NAC para LCA-AKI, portanto, permanece incerta^12,15,16,17.

O montelucaste bloqueia seletivamente o receptor de leucotrienos cisteínico-1 e há muito tempo é usado para tratar asma e distúrbios alérgicos. Evidências experimentais também indicam que este agente exerce efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e antiapoptóticos. Em diferentes modelos de lesão renal, a administração de montelucaste tem sido associada à redução da peroxidação lipídica, ao fortalecimento das defesas antioxidantes endógenas, a danos histopatológicos menos graves e à atenuação da lesão renal^{18,19,20,21,22}.

As evidências que examinam especificamente o montelucaste na nefropatia induzida por contraste (CI-AKI) ainda são limitadas. Os achados experimentais disponíveis sugerem que seus efeitos renais podem envolver a modulação da sinalização oxidativa e inflamatória. A redução da expressão da NADPH oxidase 4 (NOX4), p22phox e NF-κB tem sido proposta como um dos mecanismos pelos quais o montelucaste pode atenuar a lesão renal relacionada ao contraste⁹.

A NAC e o montelukast influenciam parcialmente vias distintas, mas sobrepostas, envolvidas na lesão renal. A NAC atua principalmente no suporte à defesa antioxidante, enquanto o montelukast possui ações tanto anti-inflamatórias quanto antioxidantes. A administração concomitante desses agentes pode, portanto, afetar múltiplos componentes da fisiopatologia da CI-AKI; no entanto, ainda não foi estabelecido em modelos experimentais se sua interação produz um benefício aditivo ou sinérgico^{18,19,20,21,22}.

Investigações anteriores avaliaram predominantemente intervenções administradas antes da exposição ao contraste, enquanto as evidências sobre tratamentos iniciados após a exposição permanecem escassas. Em particular, a administração pós-contraste de montelucaste juntamente com NAC foi pouco investigada em modelos experimentais de LRA-IC. O presente estudo, portanto, avaliou o montelucaste e a NAC, administrados após a exposição ao contraste, separadamente ou em combinação, em relação à função renal, parâmetros de estresse oxidativo e defesas antioxidantes, lesão renal e biomarcadores inflamatórios, bem como alterações histopatológicas em um modelo de rato de LRA-IC.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes internacionalmente aceitas para o cuidado e uso de animais de laboratório e cumpriram as diretrizes Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE). O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética Local em Experimentação Animal da Universidade Ahi Evran, Kırşehir, Turquia (Número da Decisão: 2, Número da Reunião: 12, Data: 12 de junho de 2025). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais utilizados ao longo do estudo. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

Preparação dos produtos químicos

Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), indometacina, iohexol, montelucaste sódico e NAC foram utilizados neste estudo. Uma solução de L-NAME a 10 mg/mL foi preparada em solução salina normal estéril a 0,9%, utilizando 1 g de L-NAME por 100 mL. A solução foi preparada no dia da administração e utilizada sem armazenamento além desse dia. Para indução do modelo experimental de LRA-AKI induzida por contraste, o L-NAME foi administrado por via intravenosa (IV) na dose de 10 mg/kg. Em um rato com peso aproximado de 220 g, a quantidade calculada foi de aproximadamente 2,2 mg, correspondendo a um volume de administração de aproximadamente 0,22 mL. A indometacina foi preparada em solução a 5% de bicarbonato de sódio, numa concentração de 10 mg/mL, dissolvendo-se 100 mg em um volume final de 10 mL. O preparo foi agitado em vórtex até ficar visualmente homogêneo. O pH final da solução de indometacina preparada não foi medido durante o experimento e, portanto, não pôde ser determinado retrospectivamente. Não foi documentado nos registros experimentais um procedimento específico de esterilidade ou filtração para a solução de indometacina preparada e, por isso, não pôde ser informado retrospectivamente. Nenhum intervalo formal de estabilidade foi estabelecido ou avaliado; a solução foi preparada no dia e utilizada no mesmo dia. Para induzir o modelo experimental de LRA-AKI induzida por contraste, a indometacina foi administrada por via intravenosa na dose de 10 mg/kg. Para um rato com peso aproximado de 220 g, a quantidade calculada foi de aproximadamente 2,2 mg, correspondendo a um volume de administração de aproximadamente 0,22 mL.

A formulação comercial de iohexol, contendo 647 mg de iohexol/mL e uma concentração equivalente de iodo de 300 mg/mL, foi administrada sem diluição adicional. A temperatura exata do iohexol no momento da injeção não foi registrada. Um valor específico de osmolalidade da formulação não pôde ser verificado com confiança a partir dos registros experimentais disponíveis e, portanto, não é informado. Para a indução do modelo experimental de LCA-AQI induzida por contraste, o iohexol foi administrado por via intravenosa na dose de 3 g de iodo/kg. Em uma rata com peso aproximado de 220 g, essa dose forneceu cerca de 0,66 g de iodo e correspondeu a um volume de injeção de aproximadamente 2,2 mL.

Uma suspensão de montelukast sódico foi preparada em carboximetilcelulose (CMC) a 0,5%. Foi preparada recentemente em cada dia de administração e vortexada imediatamente antes da dose para obter uma distribuição uniforme das partículas em suspensão. A dose de montelukast necessária para cada animal foi calculada separadamente com base no peso corporal registrado no início do estudo, utilizando a seguinte fórmula: dose necessária (mg) = peso corporal (kg) × 10 mg/kg. Para um animal com peso aproximado de 220 g, a dose calculada foi de aproximadamente 2,2 mg, administrada por gavagem oral. A suspensão foi inspecionada visualmente antes de cada administração, e qualquer preparação que apresentasse sedimentação foi novamente vortexada antes do uso.

O NAC foi administrado aos grupos tratados a partir de sua formulação comercial, sem diluição adicional, na dose intraperitoneal de 100 mg/kg. Para cada animal, a dose necessária foi calculada individualmente com base no peso corporal registrado no início do estudo. Em um animal com peso aproximado de 220 g, isso correspondeu a aproximadamente 22 mg de NAC e um volume de administração de aproximadamente 0,15 mL. Antes da administração, a solução foi examinada visualmente, e somente preparações límpidas e livres de partículas visíveis foram utilizadas.

Cada preparação foi submetida à inspeção visual antes da administração. As soluções de L-NAME, indometacina, iohexol e NAC foram verificadas quanto a descoloração e partículas visíveis. Imediatamente antes da administração, a suspensão de montelukast foi vortexada e examinada visualmente para confirmar a uniformidade. Qualquer preparação que não atendesse a esses critérios de aceitação não foi utilizada. Jalecos laboratoriais, luvas de proteção e proteção ocular foram usados durante o preparo e a administração de todos os produtos químicos. Todos os procedimentos cumpriram os requisitos institucionais de segurança laboratorial e biossegurança.

Seleção animal, acomodação, grupos experimentais e randomização

Trinta ratos machos adultos da linhagem Wistar albino (8–12 semanas de idade; peso corporal, 200–220 g) foram obtidos do Laboratório de Pesquisa com Animais Experimentais da Universidade Ahi Evran, em Kırşehir, Türkiye. Os ratos machos foram selecionados para manter a consistência metodológica com modelos experimentais prévios de LIA-AQC publicados anteriormente e para evitar a introdução da fase do ciclo estral como uma variável biológica adicional. O sexo não foi avaliado como variável experimental no presente estudo. A instalação animal possuía uma licença de criação/produção nº 184, e os ratos foram criados e mantidos nesse local sob condições laboratoriais padrão. No momento da inclusão, os animais não tinham status documentado de livres de patógenos específicos (SPF) nem outra classificação formal de saúde microbiológica. Cada rato foi alojado individualmente em gaiolas de policarbonato medindo 40 cm × 25 cm × 20 cm, com aparas de pinho picadas grosseiramente usadas como cama. As condições ambientais foram mantidas em 24 °C ± 2 °C e umidade relativa de 35% ± 10% por meio de um sistema automatizado de controle ambiental e ventilação. Um ciclo de 12 h de luz/12 h de escuro foi aplicado, com iluminação das 07:00 às 19:00. Nenhum enriquecimento ambiental específico foi fornecido durante a fase de aclimatação de 7 dias nem durante o período experimental subsequente. Ração peletizada padrão para roedores e água da torneira foram oferecidas ad libitum, exceto durante o período definido de privação de água de 16 h anterior à indução do LIA-AQC. A composição da ração foi de 24% de proteína bruta, 3,94% de celulose bruta, 5,08% de gordura bruta, 8,8% de cinzas brutas, 1,44% de lisina, 0,61% de metionina, 1,14% de cálcio, 0,89% de fósforo e 0,28% de sódio. Todos os animais foram aclimatados por 7 dias antes do início dos procedimentos experimentais. Observações diárias foram realizadas tanto durante o período de aclimatação quanto no período experimental para avaliar o estado geral, consumo de alimento e água, mobilidade, postura, aparência da pelagem e quaisquer sinais de sofrimento. Para minimizar o viés de seleção, os animais foram alocados nos cinco grupos experimentais utilizando uma sequência aleatória gerada por computador, com seis animais designados para cada grupo. O tamanho da amostra foi determinado por meio de uma análise de poder a priori utilizando o software G*Power versão 3.1.9.6.

O tamanho da amostra foi determinado por uma análise de poder a priori para uma análise de variância unidirecional de efeitos fixos envolvendo cinco grupos experimentais. Assumindo um tamanho do efeito (f) de 0,65, uma taxa de erro tipo I (α) de 0,05 e um poder estatístico de 80%, o tamanho total da amostra necessário foi calculado como 30 animais, correspondendo a seis animais por grupo. O tamanho do efeito (f = 0,65) foi assumido a priori como representando um efeito global grande entre grupos na comparação de cinco grupos. O cálculo teve como objetivo determinar o tamanho da amostra necessário para detectar tal efeito global e não foi especificamente projetado para detectar diferenças pareadas menores entre os grupos de tratamento ativo. O animal individual foi considerado a unidade experimental para todas as análises.

Exceto pelo manejo rotineiro, monitoramento diário de saúde e procedimentos terminais, os animais do grupo Controle não foram submetidos a manipulações ou contenções relacionadas ao protocolo, privação de água, injeções intravenosas ou intraperitoneais, gavagem oral ou administração de veículo. O grupo CI-AKI compreendia animais nos quais o modelo de CI-AKI foi estabelecido no dia 8 e que não receberam tratamento. O grupo CI-AKI + Montelukast compreendia animais nos quais o modelo de CI-AKI foi estabelecido e que posteriormente receberam tratamento com montelukast. O grupo CI-AKI + NAC compreendia animais nos quais o modelo de CI-AKI foi estabelecido e que posteriormente receberam tratamento com NAC. O grupo CI-AKI + Montelukast + NAC compreendia animais nos quais o modelo de CI-AKI foi estabelecido e que posteriormente receberam uma combinação de montelukast e NAC. Nem o grupo Controle nem o grupo CI-AKI sem tratamento passaram por procedimentos simulados correspondentes aos tratamentos. Especificamente, não foram realizadas contenções simuladas, gavagem oral simulada, injeções simuladas de tratamento ou administrações simuladas de veículo nestes grupos. Os veículos utilizados para a preparação de L-NAME, indometacina e montelukast foram solução salina normal a 0,9%, solução de bicarbonato de sódio a 5% e CMC a 0,5%, respectivamente, conforme descrito na preparação dos produtos químicos. O NAC foi administrado a partir de sua formulação comercial sem diluição adicional, e nenhum veículo separado foi preparado para o NAC. No dia 8, todos os animais, exceto os do grupo Controle, foram submetidos a 16 h de privação de água, seguidas pela administração sequencial intravenosa de L-NAME (10 mg/kg), indometacina (10 mg/kg) e iohexol (3 g de iodo/kg) para induzir lesão renal aguda induzida por contraste. Nos grupos de tratamento designados, montelukast (10 mg/kg, gavagem oral) e/ou NAC (100 mg/kg, injeção intraperitoneal) foram administrados primeiramente 1 h após a conclusão da administração de iohexol no dia 8, correspondendo a aproximadamente 1,5 h após a administração de L-NAME, e subsequentemente administrados uma vez ao dia, no mesmo horário, nos dias 9 e 10.

Protocolo de administração de fármacos

A IAR-CI foi estabelecida de acordo com um protocolo experimental publicado, consistindo em 16 h de privação de água seguidas pela administração intravenosa sequencial de L-NAME, indometacina e iohexol^23,24,25. O L-NAME e a indometacina foram administrados em doses de 10 mg/kg cada, enquanto o iohexol foi administrado na dose de 3 g de iodo/kg. As doses de tratamento foram de 10 mg/kg para o montelukast sódico e 100 mg/kg para a NAC. A seleção das doses para indução do modelo e para o tratamento foi baseada em estudos experimentais previamente publicados^22,26,27. Nenhum estudo preliminar de determinação ou otimização de dose foi realizado. As doses da NAC e do montelukast foram selecionadas independentemente, com base em estudos experimentais publicados anteriormente sobre os agentes individuais, e não foram derivadas de um estudo de determinação de dose específico para a combinação. As doses selecionadas não tinham a intenção de representar exposições farmacologicamente equipotentes, e nenhuma análise de resposta à dose ou interação medicamentosa formal foi realizada. Nenhum limiar numérico ou laboratorial pré-definido foi utilizado para definir a indução bem-sucedida do modelo ao nível individual dos animais. No ponto final do estudo, o estabelecimento bem-sucedido da lesão renal foi apoiado pelas alterações histopatológicas características observadas no grupo de IAR-CI não tratado em comparação com o grupo Controle. No dia 8, todos os animais, exceto os do grupo Controle, passaram por um único período de 16 h de privação de água imediatamente antes da indução da lesão renal aguda induzida por contraste. A privação de água não foi repetida durante o restante do período experimental. A ração padrão em pellets permaneceu disponível ad libitum durante todo o período de privação de água. Após a conclusão do único período de 16 h de privação de água, o acesso à água da torneira foi restabelecido simultânea e ad libitum em todos os grupos experimentais privados de água, antes da administração do primeiro agente indutor do modelo, o L-NAME, e foi mantido pelo restante do período experimental. O momento e as condições do restabelecimento da água foram idênticos em todos os grupos privados de água. A ingestão de água após o restabelecimento não foi limitada a um volume pré-definido e não foi medida quantitativamente. Os pesos corporais pareados imediatamente antes e após o período de 16 h de privação de água não foram medidos; portanto, a perda percentual de peso corporal associada à desidratação não pôde ser calculada. A diurese não foi monitorada quantitativamente. Após o restabelecimento do acesso à água, a indução da IAR-CI foi iniciada. Todas as administrações intravenosas sequenciais de L-NAME, indometacina e iohexol foram realizadas por meio de uma veia lateral da cauda, utilizando uma agulha 26 G acoplada a uma seringa estéril de 5 mL. Antes da administração intravenosa, a cauda foi aquecida em água por vários minutos para facilitar a visualização e a dilatação das veias laterais da cauda. Após cada administração intravenosa, a veia foi lavada com 0,5 mL de solução salina normal estéril a 0,9%, além do volume de administração calculado do respectivo agente indutor do modelo. O local da injeção foi monitorado visualmente durante a administração e a lavagem quanto a inchaço, vazamento ou sinais de extravasamento. O L-NAME (10 mg/kg) foi administrado primeiro. Quinze minutos após a administração do L-NAME, a indometacina (10 mg/kg) foi administrada intravenosamente pela mesma veia lateral da cauda. Quinze minutos após a administração da indometacina, o iohexol foi administrado intravenosamente pela mesma veia lateral da cauda na dose de 3 g de iodo/kg. Para cada animal, a dose de iohexol e o volume de injeção correspondente foram calculados individualmente com base no peso corporal registrado no início do estudo e na concentração comercial de iodo de 300 mg de iodo/mL. Isso correspondeu a um volume de administração de 10 mL/kg e, portanto, aproximadamente 2,0–2,2 mL para ratos com peso entre 200–220 g. Nenhum volume máximo permitido por via intravenosa definido por protocolo foi pré-especificado; a maior administração única por via intravenosa utilizada neste estudo foi o iohexol em 10 mL/kg. O iohexol foi administrado lentamente durante aproximadamente 1–2 min. A administração intravenosa bem-sucedida foi verificada pela ausência de inchaço visível, vazamento ou extravasamento no local da injeção. Nenhum extravasamento parcial foi observado, e nenhuma injeção precisou ser repetida ou redosada devido a suspeita de extravasamento. Uma hora após a conclusão da administração do iohexol, os tratamentos designados foram administrados pela primeira vez aos grupos de tratamento. Como a administração do iohexol foi iniciada 30 min após a administração do L-NAME e concluída em aproximadamente 1–2 min, o início do tratamento ocorreu aproximadamente 91–92 min (cerca de 1,5 h) após a administração do L-NAME. O montelukast sódico (10 mg/kg) foi administrado por gavagem oral, enquanto a NAC (100 mg/kg) foi administrada por via intraperitoneal.

A gavagem oral foi realizada utilizando uma cânula de alimentação de aço inoxidável 22 G. Cada animal foi mantido em posição ereta, e a cânula de alimentação foi suavemente avançada através do esôfago até o estômago. Caso fosse encontrada resistência excessiva, a cânula era retirada e reposicionada antes da administração. O animal foi observado quanto à regurgitação durante e imediatamente após a gavagem. Nenhuma regurgitação ou outro sinal de dose oral incompleta foi observado durante ou imediatamente após a gavagem em qualquer animal, e nenhum animal foi excluído com base em suspeita de administração oral mal sucedida. As injeções intraperitoneais foram administradas no quadrante inferior direito do abdômen. A agulha foi inserida em um ângulo de aproximadamente 30°–45°, e foi realizada aspiração antes da administração para verificar entrada vascular acidental. O local da injeção foi monitorado visualmente durante e imediatamente após a administração, em busca de vazamento, sangramento ou outras complicações visíveis. Os tratamentos designados foram administrados uma vez ao dia, no mesmo horário, nos dias 8, 9 e 10. Assim, os animais no grupo CI-AKI + Montelukast receberam montelukast uma vez ao dia durante três dias consecutivos, os animais no grupo CI-AKI + NAC receberam NAC uma vez ao dia durante três dias consecutivos, e os animais no grupo CI-AKI + Montelukast + NAC receberam ambos montelukast e NAC uma vez ao dia, de acordo com o mesmo esquema de tratamento de três dias. Todas as administrações para indução do modelo e tratamentos foram realizadas pelo mesmo pesquisador. O peso corporal foi medido uma única vez para cada animal no início do estudo e não foi reavaliado durante o período experimental. Para cada animal, a dose e o volume correspondente de todos os agentes indutores do modelo e tratamentos do estudo foram calculados individualmente, utilizando o peso corporal registrado no início do estudo. Todos os procedimentos intravenosos, intraperitoneais e de gavagem oral foram realizados utilizando a mesma técnica padronizada para minimizar a variabilidade relacionada à administração.

Procedimento de eutanásia, pontos finais humanos e coleta de amostras

Os animais foram observados uma vez ao dia durante todo o experimento quanto a alterações no estado geral, consumo de ração e água, mobilidade, postura, aparência da pelagem e sinais de sofrimento. Os critérios humanitários definidos prospectivamente incluíam letargia acentuada, incapacidade de acessar ou consumir ração ou água disponíveis, postura anormal, mobilidade reduzida, piloereção persistente e qualquer outra manifestação evidente de sofrimento. Os animais que atendessem a qualquer um desses critérios deveriam ser submetidos imediatamente à eutanásia; no entanto, nenhum animal cumpriu os critérios de ponto final humanitário durante o estudo. No dia 11, 24 h após o tratamento final, a anestesia profunda foi induzida pela administração intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) juntamente com xilazina (10 mg/kg). A ausência da resposta de retirada plantar foi utilizada para verificar um plano anestésico adequado. Após a confirmação de profundidade anestésica suficiente, aproximadamente 3–5 mL de sangue foram coletados de cada animal por punção intracardíaca. A eutanásia foi então concluída por exsanguinação enquanto o animal permanecia sob anestesia profunda. A ausência de atividade cardíaca e de respiração espontânea foi utilizada para confirmar a morte.

O sangue coletado para medições bioquímicas séricas foi colocado em tubos sem anticoagulante e mantido até que a coagulação estivesse completa. Os tubos foram então centrifugados a 3.000 × g durante 10–15 min a 4 °C, após o que a fração sérica foi separada e armazenada a −80 °C até a análise. As amostras destinadas à medição de glutationa foram coletadas separadamente em tubos contendo ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). Como essas amostras foram anticoaguladas, foram processadas sem etapa de coagulação, conforme o procedimento correspondente do ensaio de glutationa. A separação sérica foi considerada aceitável quando o soro recuperado estava límpido e não apresentava evidência visível de hemólise.

Após a confirmação da morte, foi realizada uma laparotomia mediana e ambos os rins foram cuidadosamente removidos de cada animal. Os tecidos adiposos e conjuntivos ao redor foram removidos das amostras. O rim direito foi reservado exclusivamente para exame histopatológico, enquanto o rim esquerdo foi destinado à análise bioquímica. O tecido misto do rim esquerdo foi analisado sem dissecção separada da córtex e medula renais. Os dois rins foram manipulados de forma independente, e as amostras de diferentes animais permaneceram separadas durante todo o processamento, sem agrupamento. Todo o rim direito foi colocado em formaldeído neutro tamponado a 10% e processado para avaliação histopatológica. Seções que incluíam a córtex renal e a medula externa foram preparadas e examinadas conforme os procedimentos descritos no processamento e escore histopatológico. Cada rim esquerdo foi rotulado individualmente e mantido a -80 °C até a homogeneização e testes bioquímicos. Após a excisão, a integridade macroscópica do tecido foi verificada, e uma quantidade adequada de tecido foi conservada para as avaliações histopatológicas e bioquímicas previstas.

O pesquisador responsável pela indução do modelo e administração do tratamento não pôde ser cegado, pois os grupos experimentais passaram por procedimentos diferentes. No entanto, as identidades dos grupos foram ocultadas dos pesquisadores que realizaram as análises bioquímicas e estatísticas e do patologista que realizou as avaliações histopatológicas. Todos os animais incluídos foram mantidos no estudo e incluídos nas análises subsequentes. As amostras biológicas, tecidos animais, fixadores à base de formaldeído e outros materiais químicos residuais foram manipulados com equipamentos de proteção individual apropriados. A eliminação de todos os resíduos biológicos e químicos foi realizada em conformidade com os requisitos institucionais de biossegurança e gerenciamento de resíduos perigosos.

Análises bioquímicas

As medições bioquímicas foram realizadas utilizando soro, sangue anticoagulado com EDTA e homogeneados de tecido renal esquerdo coletados de cada animal. Os procedimentos são apresentados a seguir de acordo com a matriz biológica utilizada para cada parâmetro. O soro foi analisado quanto à ureia, nitrogênio ureico no sangue (BUN), creatinina, superóxido dismutase (SOD) e malondialdeído (MDA). A ureia, o BUN e a creatinina foram utilizados como índices de função renal, enquanto a atividade da SOD e a concentração de MDA foram avaliadas como parâmetros de estresse oxidativo. Os valores séricos de ureia e BUN foram obtidos utilizando o mesmo ensaio enzimático urease–glutamato desidrogenase. Neste método, a ureia foi hidrolisada pela urease para produzir amônia, que subsequentemente reagiu com 2-oxoglutarato e nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (NADH) na presença de glutamato desidrogenase. O método analítico utilizado foi um ensaio cinético enzimático urease–glutamato desidrogenase. A diminuição da absorbância resultante do consumo de NADH foi medida cineticamente utilizando um espectrofotômetro. A concentração sérica de creatinina foi medida colorimetricamente utilizando um analisador bioquímico automatizado. A atividade sérica de SOD foi medida colorimetricamente utilizando um kit de ensaio comercial disponível no mercado, no mesmo analisador bioquímico automatizado. O ensaio de SOD baseou-se na geração de radicais superóxido pelo sistema xantina–xantina oxidase e sua reação com cloreto de 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazólio para formar um produto de formazano colorido. A absorbância final foi medida a 505 nm, e a atividade de SOD foi expressa em U/mL. A concentração sérica de MDA foi determinada colorimetricamente utilizando a reação com ácido tiobarbitúrico. As amostras séricas foram misturadas com ácido tricloroacético frio para precipitar as proteínas, e o precipitado resultante foi separado por centrifugação. Esta etapa de centrifugação foi realizada a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C. O sobrenadante foi reagido com ácido tiobarbitúrico a 90 °C por 60 min, resfriado e medido a 532 nm. As concentrações de MDA foram calculadas a partir da curva de calibração correspondente e expressas em nmol/mL. A análise de glutationa (GSH) foi realizada utilizando sangue anticoagulado com EDTA. As proteínas foram precipitadas com ácido tricloroacético, e as amostras desproteinizadas resultantes foram analisadas colorimetricamente por um método de Ellman modificado. As amostras foram combinadas com 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) em tampão Tris 500 mM com pH 8,2. A reação dos grupos tiol do GSH com o DTNB gerou um produto colorido, e a absorbância foi registrada a 412 nm. A atividade da catalase (CAT) foi determinada utilizando um procedimento colorimétrico de dois passos. Inicialmente, as amostras foram incubadas com uma quantidade conhecida de peróxido de hidrogênio, que a catalase converteu em água e oxigênio molecular. Após a terminação da reação enzimática, o peróxido de hidrogênio residual foi medido utilizando um reagente cromogênico. A absorbância foi registrada a 405 nm, e a atividade da CAT foi expressa em U/mL. Para as medições no tecido renal, o rim esquerdo de cada animal foi utilizado como tecido misto, sem separar a córtex da medula. Conforme indicado no procedimento, o rim direito foi mantido exclusivamente para avaliação histopatológica. As amostras pertencentes a animais individuais foram processadas independentemente e não foram agrupadas em nenhuma etapa. Cada espécime de rim esquerdo foi homogeneizado em gelo em tampão fosfato 50 mM com pH 7,4, utilizando uma proporção tecido:tampão de 1:10 (p/v). Um homogeneado de tecido renal específico para cada animal foi gerado para cada rato. Aliquotas separadas deste homogeneado foram utilizadas para as diferentes medições no tecido renal, garantindo que todos os parâmetros fossem derivados do mesmo animal individual. Os homogeneados de tecido renal resultantes foram centrifugados a 14.000 × g durante 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, o sobrenadante obtido de cada animal foi coletado separadamente e dividido em aliquotas para as análises planejadas no tecido renal. As concentrações de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), cistatina C e KIM-1 nos sobrenadantes do tecido renal foram medidas utilizando kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) específicos para ratos. Os ensaios foram realizados de acordo com os protocolos do fabricante. As condições de incubação foram idênticas para os ELISAs de TNF-α, IL-1β, IL-6, cistatina C e KIM-1. Para cada ensaio, as amostras e os reagentes do ELISA foram incubados por 1 h a 37 °C; após cinco ciclos de lavagem, as soluções de substrato A e B foram adicionadas e incubadas por 10 min a 37 °C. Resumidamente, os padrões e os sobrenadantes do tecido renal foram adicionados às placas pré-revestidas com anticorpo, seguidos pelo anticorpo de detecção biotinilado correspondente e pelo conjugado estreptavidina–peroxidase de rábbito. Após as etapas de incubação especificadas, os componentes não ligados foram removidos utilizando um lavador automatizado de microplacas. A solução de substrato foi subsequentemente adicionada, e a reação de cor foi interrompida utilizando a solução ácida de parada. A absorbância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas, e as concentrações dos analitos foram calculadas a partir das curvas-padrão correspondentes. As medições de ELISA no tecido renal foram realizadas em duplicata. Para cada analito, a média das duas placas com réplicas técnicas foi calculada para obter um único valor por animal. As placas com réplicas técnicas e as aliquotas separadas obtidas do mesmo homogeneado específico para cada animal não foram consideradas observações independentes. Todas as medições bioquímicas foram realizadas sob condições padronizadas específicas para cada ensaio. As amostras de soro, sangue anticoagulado com EDTA e tecido renal foram processadas separadamente de acordo com os requisitos dos métodos analíticos correspondentes. Os pesquisadores que realizaram as análises bioquímicas estavam cegos quanto à alocação dos grupos. O animal individual, e não cada amostra de soro, amostra de sangue, espécime de rim, alíquota de homogeneado ou poço com réplica técnica, foi considerado a unidade experimental. Assim, seis observações independentes por animal foram incluídas na análise estatística para cada grupo experimental.

Processamento e pontuação histopatológicos

Espécimes do rim direito foram preparados para avaliação microscópica mediante processamento histológico de rotina. O rim direito inteiro de cada animal foi imerso em formaldeído neutro tamponado a 10% durante 72 h à temperatura ambiente. Após a fixação, a desidratação do tecido foi realizada sequencialmente em etanol a 50%, 70%, 80%, 96% e 100%, com cada concentração aplicada por 1 h. Os espécimes foram então submetidos a dois banhos de xilol, com 30 min por banho, antes da inclusão em parafina. Utilizando um micrótomo rotativo, seções de 5 µm que incluíam tanto o córtex renal quanto a medula externa foram obtidas dos blocos de parafina.

Para a coloração com hematoxilina e eosina (HE), as seções foram desparafinizadas e reidratadas, expostas à hematoxilina por 5 min e lavadas sob água corrente por mais 5 min. O álcool ácido foi utilizado para diferenciação, após a qual as seções foram realçadas em água amoniacal por 1 min e contracoloradas com eosina por 2 min. As seções coradas foram subsequentemente desidratadas em concentrações crescentes de álcool, clareadas com xilol e montadas permanentemente sob lamínulas.

As seções destinadas à coloração com tricrômio de Masson foram igualmente desparafinizadas e rehidratadas. O tratamento com mordente foi realizado por 60 min a 56 °C, seguido por enxágue em água corrente por 10 min. As seções foram então tratadas sequencialmente com hematoxilina férrica de Weigert por 10 min, solução de vermelho de Biebrich–fucsina ácida por 15 min, solução de ácido fosfotungstico por 10 min e solução de azul de anilina por 10 min. Após imersão em ácido acético a 1% por 5 min, as seções foram desidratadas, clarificadas em xilol e montadas com lamínulas.

Antes da avaliação microscópica, a adequação da coloração foi verificada separadamente para cada método. Considerou-se adequada a coloração com HE quando os detalhes nucleares e o contraste citoplasmático eram claramente discerníveis, enquanto as seções coradas com tricrômio de Masson foram aceitas quando as estruturas do tecido conjuntivo puderam ser visualizadas de forma distinta. Para cada animal, foram examinadas três seções coradas com HE e três seções coradas com tricrômio de Masson. Em cada seção, foram avaliados cinco campos microscópicos selecionados aleatoriamente, utilizando objetiva de 40×. Assim, foram examinados 15 campos microscópicos por método de coloração para cada animal. Todos os exames microscópicos foram realizados com a mesma objetiva e condições padronizadas de avaliação em todos os animais e grupos experimentais. As seções coradas com tricrômio de Masson foram avaliadas qualitativamente quanto à distribuição e deposição de colágeno intersticial, acúmulo da matriz extracelular e arquitetura tubulointersticial. Essas seções não foram utilizadas para gerar os escores semi-quantitativos de lesão histopatológica de 0 a 3. Fotomicrografias representativas coradas com HE e com tricrômio de Masson foram obtidas com objetiva de 40×, e uma barra de escala de 100 µm foi incluída em cada imagem representativa. Essas fotomicrografias foram obtidas com fins ilustrativos e não foram tratadas como observações independentes na pontuação histopatológica ou nas análises estatísticas. Todas as avaliações histopatológicas foram realizadas por um único patologista experiente, que permaneceu cegado quanto às identidades dos grupos experimentais. O uso de um único examinador cegado teve como objetivo limitar o viés de avaliação e a variação atribuível às diferenças entre observadores. A necrose tubular, dilatação tubular, degeneração celular e congestão vascular foram pontuadas semi-quantitativamente em seções renais coradas com HE, segundo um sistema adaptado de modelos de lesão renal previamente publicados^28,29. Para cada parâmetro, os escores variaram de 0 a 3, correspondendo a ausência, leve, moderada e grave lesão histopatológica, respectivamente. Para cada animal, os achados dos cinco campos microscópicos examinados em cada uma das três seções coradas com HE, totalizando 15 campos, foram considerados em conjunto para atribuir um único escore de 0 a 3 para cada parâmetro histopatológico. Assim, cada animal contribuiu com um escore para necrose tubular, dilatação tubular, degeneração celular e congestão vascular. As seções histológicas e os campos microscópicos foram tratados como subamostras intra-animais e não foram considerados observações independentes. Em cada seção, os campos microscópicos foram selecionados aleatoriamente em regiões renais corticais e medulares externas comparáveis, a fim de padronizar a amostragem anatômica entre os animais e grupos experimentais. O animal individual, e não cada rim, seção histológica ou campo microscópico, foi considerado a unidade experimental. Assim, seis observações independentes ao nível animal foram incluídas na análise estatística para cada grupo experimental. Os valores apresentados na Tabela 3 representam as médias dos grupos calculadas a partir dos escores individuais ao nível animal dos seis animais em cada grupo experimental.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando software de análise estatística. O animal individual foi considerado a unidade experimental para todas as análises estatísticas. Cada grupo experimental era composto por seis animais independentes (n = 6 por grupo). Replicatas técnicas, poços de ensaio, seções de tecido e campos microscópicos não foram tratados como observações independentes e não foram utilizados para aumentar o tamanho amostral estatístico. As variáveis contínuas são apresentadas como média ± desvio padrão (DP). A normalidade foi avaliada separadamente dentro de cada grupo experimental utilizando o teste de Shapiro–Wilk, e a homogeneidade das variâncias foi verificada utilizando o teste de Levene. Dado o delineamento experimental completamente balanceado, com tamanhos amostrais iguais entre os grupos, uma análise de variância unifatorial (ANOVA) foi utilizada para comparar os grupos. Comparações par a par foram realizadas utilizando o teste de comparação múltipla post hoc de Duncan. Possíveis valores atípicos foram avaliados mediante exame gráfico de diagramas de caixa (boxplots) e inspeção das observações individuais. Nenhuma observação foi considerada representar um erro de medição ou um resultado experimental inválido, e nenhum ponto de dado foi excluído por critérios estatísticos. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Marcadores séricos de função renal (ureia, nitrogênio ureico no sangue e creatinina)

O delineamento experimental, o agrupamento dos animais, o cronograma de tratamento e a linha do tempo da coleta de amostras do presente estudo são resumidos na Figura 1. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas entre os grupos quanto aos níveis séricos de ureia, BUN e creatinina (p = 0.003, p = 0.003 e p = 0.002, respectivamente). O nível médio de ureia sérica foi de 67,43 mg/dL ± 53,11 mg/dL no grupo Controle e aumentou para 606,71 mg/dL ± 429,42 mg/dL no grupo CI-AKI. Da mesma forma, o nível médio de BUN aumentou de 31,51 mg/dL ± 24,82 mg/dL no grupo Controle para 268,63 mg/dL ± 190,84 mg/dL no grupo CI-AKI. Os níveis séricos de creatinina também aumentaram acentuadamente, de 0,60 mg/dL ± 0,05 mg/dL no grupo Controle para 3,27 mg/dL ± 2,14 mg/dL no grupo CI-AKI. As comparações post hoc de Duncan demonstraram que os níveis séricos de ureia, BUN e creatinina foram significativamente menores em cada grupo tratado — CI-AKI + Montelucaste, CI-AKI + NAC e CI-AKI + Montelucaste + NAC — em comparação com o grupo CI-AKI não tratado (todos p < 0,05). Os dados dos marcadores séricos de função renal são apresentados na Tabela 1.

Parâmetros de estresse oxidativo e atividades de enzimas antioxidantes

Diferenças estatisticamente significativas foram observadas entre os grupos em termos dos níveis de SOD, GSH, CAT e MDA (p = 0,044, p = 0,001, p = 0,003 e p = 0,001, respectivamente; Tabela 1). A análise post hoc de Duncan mostrou que os níveis de GSH foram significativamente mais altos nos grupos tratados com montelucaste, NAC e combinação terapêutica do que no grupo de CI-AKI não tratado (todos p < 0,05). O grupo de combinação também apresentou nível de GSH significativamente mais alto do que o grupo Controle (p < 0,05). No entanto, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o grupo de combinação e qualquer um dos grupos com monoterapia, nem entre os dois grupos com monoterapia (todos p > 0,05). O nível mais baixo de SOD foi observado no grupo CI-AKI (92,23 U/mL ± 16,37 U/mL), enquanto o grupo Controle apresentou 147,81 U/mL ± 33,27 U/mL. Os níveis de GSH foram mais baixos no grupo CI-AKI (66,05 mmol/L ± 24,72 mmol/L) e mais altos no grupo CI-AKI + Montelucaste + NAC (172,44 mmol/L ± 60,48 mmol/L). A atividade de CAT foi mais alta no grupo Controle (93,35 U/mL ± 18,75 U/mL) e mais baixa no grupo CI-AKI (33,22 U/mL ± 17,07 U/mL). Em relação aos níveis de MDA, o valor mais alto foi observado no grupo CI-AKI (54,13 nmol/mL ± 19,37 nmol/mL), enquanto o valor mais baixo foi registrado no grupo CI-AKI + NAC (21,53 nmol/mL ± 5,07 nmol/mL). Os dados referentes aos parâmetros de estresse oxidativo e atividades das enzimas antioxidantes estão apresentados na Tabela 1.

Lesão renal e biomarcadores inflamatórios (KIM-1, Cistatina C, TNF-α, IL-1β e IL-6)

Diferenças estatisticamente significativas foram observadas entre os grupos com relação aos níveis renais de cistatina C, IL-6, KIM-1, TNF-α e IL-1β (p < 0,001, p = 0,008, p = 0,027, p = 0,006 e p < 0,001, respectivamente; Tabela 2). As comparações post hoc de Duncan mostraram que os níveis de cistatina C, IL-6, KIM-1, TNF-α e IL-1β foram significativamente menores em cada grupo de tratamento — CI-AKI + Montelukast, CI-AKI + NAC e CI-AKI + Montelukast + NAC — em comparação com o grupo CI-AKI não tratado (todos p < 0,05). Para a IL-1β, uma diferença estatisticamente significativa também foi observada entre os grupos CI-AKI + Montelukast e CI-AKI + NAC (p < 0,05). Os níveis renais de cistatina C foram mais altos no grupo CI-AKI (18,43 ng/mL ± 1,06 ng/mL), enquanto o grupo Controle exibiu um valor de 10,30 ng/mL ± 0,78 ng/mL. De forma semelhante, os níveis de IL-6 foram mais altos no grupo CI-AKI (13,41 ng/L ± 2,14 ng/L) e mais baixos no grupo Controle (9,29 ng/L ± 2,70 ng/L). Os níveis de KIM-1 foram mais altos no grupo CI-AKI (3,07 ng/mL ± 0,36 ng/mL), em comparação com 2,25 ng/mL ± 0,54 ng/mL no grupo Controle. Da mesma forma, os níveis de TNF-α foram mais altos no grupo CI-AKI (161,69 ng/L ± 26,14 ng/L), enquanto os mais baixos foram observados no grupo Controle (95,49 ng/L ± 16,98 ng/L). Os níveis de IL-1β foram mais altos no grupo CI-AKI (9,28 ng/mL ± 0,68 ng/mL), enquanto o valor mais baixo foi observado no grupo CI-AKI + Montelukast (7,34 ng/mL ± 0,57 ng/mL). Os dados referentes aos biomarcadores de lesão renal e inflamação estão apresentados na Tabela 2. Importante ressaltar que, embora alguns valores dos marcadores bioquímicos no grupo CI-AKI + Montelukast + NAC tenham sido numericamente superiores aos do grupo CI-AKI + Montelukast, as comparações post hoc de Duncan não mostraram diferenças estatisticamente significativas entre esses dois grupos de tratamento para nenhuma das variáveis bioquímicas avaliadas, incluindo parâmetros de estresse oxidativo, biomarcadores de lesão renal e biomarcadores inflamatórios (p > 0,05).

Avaliação histopatológica

Achados histopatológicos

Seções renais coradas com HE demonstraram arquitetura renal preservada no grupo Controle, com morfologia glomerular e tubular normal. Em contraste, o grupo CI-AKI não tratado exibiu alterações histopatológicas acentuadas, incluindo lesão do epitélio tubular, degeneração celular generalizada, dilatação tubular, debris celulares nos lúmens tubulares e congestão vascular. Alterações necróticas foram particularmente evidentes nos segmentos tubulares proximais. No grupo CI-AKI + Montelukast, a gravidade da lesão tubular foi reduzida em comparação com o grupo CI-AKI não tratado, embora alterações degenerativas focais permanecessem evidentes. De forma semelhante, o grupo CI-AKI + NAC mostrou melhor preservação da integridade epitelial tubular e menores áreas necróticas. Ao exame histopatológico qualitativo, a arquitetura renal apareceu preservada no grupo CI-AKI + Montelukast + NAC, com estruturas corticais e medulares em grande parte preservadas e necrose tubular, dilatação tubular, degeneração celular e congestão vascular relativamente limitadas. As seções coradas com tricrômio de Masson revelaram distribuição normal de colágeno intersticial no grupo Controle. No grupo CI-AKI não tratado, observou-se aumento do depósito de colágeno intersticial, desorganização arquitetural tubulointersticial e acúmulo de matriz extracelular. Essas alterações pareceram menos acentuadas nos grupos tratados, incluindo o grupo com tratamento combinado, em comparação com o grupo CI-AKI não tratado. Seções representativas de rim coradas com HE e tricrômio de Masson que ilustram esses achados são apresentadas na Figura 2.

Escores histopatológicos semi-quantitativos

A avaliação histopatológica semi-quantitativa demonstrou que os escores de necrose tubular, dilatação tubular, degeneração celular e congestão vascular foram os mais altos no grupo de CI-AKI não tratado. Os escores médios neste grupo foram 2,67, 2,83, 2,67 e 2,50, respectivamente. Os escores médios relativamente altos, próximos ao limite superior da escala de 0–3, foram consistentes com as alterações tubulares e vasculares extensas e graves observadas no exame histopatológico qualitativo no mesmo grupo. Em contraste, todos os parâmetros estavam ausentes no grupo Controle. Escores de lesão mais baixos foram observados em todos os grupos tratados em comparação com o grupo de CI-AKI não tratado. O grupo CI-AKI + Montelucaste apresentou escores médios de 1,33 para necrose tubular, 1,50 para dilatação tubular, 1,17 para degeneração celular e 1,00 para congestão vascular. Os valores correspondentes no grupo CI-AKI + NAC foram 1,17, 1,17, 0,83 e 0,83, respectivamente. Numericamente, os escores médios mais baixos de lesão histopatológica foram observados no grupo CI-AKI + Montelucaste + NAC, com valores médios de 0,50, 0,67, 0,50 e 0,17 para necrose tubular, dilatação tubular, degeneração celular e congestão vascular, respectivamente. Os dados detalhados de pontuação histopatológica são apresentados na Tabela 3.

Os dados brutos subjacentes a todas as análises bioquímicas e histopatológicas, bem como as imagens originais de histologia em HE e tricrômio de Masson sem recorte, são fornecidos como Arquivo Suplementar 1.

Figura 1: Desenho experimental e cronograma do estudo. Representação esquemática do fluxo experimental. Trinta ratos machos adultos da linhagem Wistar foram randomizados em cinco grupos (n = 6 por grupo) após um período de aclimatação de 7 dias. O grupo Controle não passou por privação de água, indução de LCA-AKI ou tratamento. Os demais grupos foram submetidos a um único período de privação hídrica de 16 horas, seguido pela administração intravenosa sequencial de L-NAME (10 mg/kg), indometacina (10 mg/kg) e iohexol (3 g de iodo/kg) para induzir LCA-AKI. Uma hora após a administração de iohexol, os grupos tratados receberam montelucaste (10 mg/kg, por gavagem oral), NAC (100 mg/kg, injeção intraperitoneal) ou ambos, uma vez ao dia nos dias 8 a 10, enquanto o grupo LCA-AKI não tratado não recebeu tratamento terapêutico. Todos os grupos foram submetidos a procedimentos terminais e coleta de amostras no dia 11. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Cortes renais representativos corados com HE e tricrômio de Masson dos grupos experimentais. Cortes renais representativos corados com HE e tricrômio de Masson obtidos dos grupos (A) Controle, (B) CI-AKI, (C) CI-AKI + Montelucasto, (D) CI-AKI + NAC e (E) CI-AKI + Montelucasto + NAC. Os cortes corados com HE (linha superior) demonstram arquitetura renal preservada no grupo Controle, enquanto o grupo CI-AKI exibe necrose tubular acentuada (*), dilatação tubular (+), degeneração celular (×) e congestão vascular (↑). Essas alterações histopatológicas parecem atenuadas nos cortes representativos dos grupos tratados em comparação com os do grupo CI-AKI não tratado. Os cortes corados com tricrômio de Masson (linha inferior) mostram aumento do depósito de colágeno intersticial e desorganização tubulointersticial no grupo CI-AKI, enquanto essas alterações parecem menos acentuadas nos cortes representativos dos grupos tratados. Barra de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Variável	Controle	CI-AKI	CI-AKI+M	CI-AKI+NAC	CI-AKI+NAC+M	p
UREIA (mg/dL)	67,43±53,11a	606,71±429,42b	105,89±28,63a	243,14±135,99a	293,61±212,05a	0,003
BUN (mg/dL)	31,51±24,82a	268,63±190,84b	51,53±14,69a	129,54±73,54a	108,38±87,36a	0,003
Creatinina (mg/dL)	0,60±0,05a	3,27±2,14b	0,61±0,12a	1,53±1,17a	1,28±0,55a	0,002
SOD (U/mL)	147,81±33,27a	92,23±16,37b	130,96±42,19a	137,87±31,95a	141,71±30,27a	0,044
GSH (mmol/L)	124,29±21,24b	66,05±24,72a	133,87±26,95bc	139,31±30,10bc	172,44±60,48c	0,001
CAT (U/mL)	93,35±18,75c	33,22±17,07a	58,67±32,95ab	52,64±19,97ab	75,46±26,85bc	0,003
MDA (nmol/mL)	23,42±13,48a	54,13±19,37b	22,40±14,81a	21,53±5,07a	37,01±9,29a	0,001
Em cada linha, grupos que compartilham ao menos uma letra sobrescrita não diferem significativamente, enquanto grupos sem letra sobrescrita em comum diferem significativamente de acordo com o teste post hoc de Duncan (p < 0,05).

Tabela 1: Parâmetros bioquímicos e de estresse oxidativo nos grupos experimentais. Diferenças significativas aos pares: ureia, BUN, creatinina (CREA), SOD e MDA, CI-AKI versus Controle, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC e CI-AKI+M+NAC; GSH, CI-AKI versus todos os outros grupos e Controle versus CI-AKI+M+NAC; CAT, Controle versus CI-AKI, CI-AKI+M e CI-AKI+NAC, e CI-AKI versus CI-AKI+M+NAC. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 6) e foram analisados por meio de ANOVA a um critério seguida pelo teste post hoc de Duncan. Valores sem letra sobrescrita comum diferem significativamente (p < 0,05).

Variável	Controle	CI-AQI	CI-AQI+M	CI-AQI+NAC	CI-AQI+NAC+M	p
Cistatina C (ng/mL)	10,30±0,78a	18,43±1,06b	10,90±1,13a	11,00±0,59a	11,13±0,84a	<0,001
IL-6 (ng/L)	9,29±2,70a	13,41±2,14b	10,24±0,86a	10,66±0,83a	10,85±1,63a	0,008
KIM-1 (ng/mL)	2,25±0,54a	3,07±0,36b	2,39±0,60a	2,45±0,33a	2,45±0,17a	0,027
TNF-α (ng/L)	95,49±16,98a	161,69±26,14b	110,26±38,12a	119,42±35,35a	127,76±15,13a	0,006
IL-1β (ng/mL)	7,65±0,53ab	9,28±0,68c	7,34±0,57a	8,24±0,73b	8,11±0,72ab	<0,001
Em cada linha, os grupos que compartilham pelo menos uma letra sobrescrita não diferem significativamente, enquanto os grupos sem letra sobrescrita em comum diferem significativamente de acordo com o teste post hoc de Duncan (p < 0,05).

Tabela 2: Níveis de lesão renal e biomarcadores inflamatórios nos grupos experimentais. Diferenças significativas aos pares: cystatina C, IL-6, KIM-1 e TNF-α, CI-AKI versus Controle, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC e CI-AKI+M+NAC; IL-1β, CI-AKI versus todos os outros grupos e CI-AKI+M versus CI-AKI+NAC. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 6) e foram analisados por meio de ANOVA a um critério seguida pelo teste post hoc de Duncan. Valores sem letra sobrescrita em comum diferem significativamente (p < 0,05).

Grupos	Necrose tubular	Dilatação tubular	Degeneração celular	Congestão vascular
Controle	0	0	0	0
CI-AKI	2,67	2,83	2,67	2,5
CI-AKI+M	1,33	1,5	1,17	1
CI-AKI+NAC	1,17	1,17	0,83	0,83
CI-AKI+NAC+M	0,5	0,67	0,5	0,17

Tabela 3: Comparação dos parâmetros de dano histopatológico no tecido renal dos grupos experimentais. Os escores histopatológicos de lesão baseados em HE de forma semi-quantitativa são apresentados como médias dos grupos (n = 6 animais/grupo). Os escores foram classificados como 0 (sem dano), 1 (leve), 2 (moderado) e 3 (dano grave), sendo que escores mais altos indicam maior lesão histopatológica.

Arquivo Suplementar 1: Dados que apoiam os resultados deste estudo.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este estudo experimental de LRA-CI avaliou o tratamento pós-contraste com montelucaste, NAC ou sua combinação em relação à função renal, parâmetros de estresse oxidativo, respostas inflamatórias, biomarcadores de lesão renal e resultados histopatológicos. A exposição ao contraste provocou aumentos substanciais na ureia sérica, BUN e creatinina e foi acompanhada por alterações adversas nos parâmetros de estresse oxidativo e biomarcadores inflamatórios. Níveis elevados de KIM-1 e cistatina C forneceram evidências adicionais de lesão renal.

O tratamento pós-contraste com montelucaste, NAC ou sua combinação foi associado a alterações favoráveis em diversos parâmetros avaliados. No entanto, a combinação não superou consistentemente a monoterapia com montelucaste nos desfechos bioquímicos. Em conjunto, essas observações são compatíveis com a participação do estresse oxidativo e da inflamação na LCA-AIQ e sugerem que intervenções que atuem sobre esses processos podem atenuar a lesão renal, embora as vias de sinalização subjacentes não tenham sido diretamente examinadas no presente estudo^1,30.

Os aumentos acentuados na ureia sérica, NUS e creatinina após a administração do contraste confirmam a indução bem-sucedida de disfunção renal neste modelo experimental de LRA-CM. A exposição ao contraste pode comprometer a função renal por meio de processos interativos que incluem vasoconstrição intrarrenal, hipóxia medular, lesão oxidativa e dano celular tubular. A redução resultante na perfusão renal e na filtração glomerular pode limitar a eliminação de produtos residuais nitrogenados, aumentando assim suas concentrações circulantes. As alterações na função renal observadas no grupo de LRA-CM não tratado são consistentes com as descritas em estudos experimentais anteriores^1,30,31,32.

Foi observada uma considerável variabilidade intragrupo para ureia sérica e nitrogênio ureico no sangue (BUN) no grupo de CI-AKI não tratado, conforme refletido pelos desvios-padrão relativamente grandes. Essa dispersão pode refletir diferenças biológicas interindividuais na suscetibilidade ao protocolo de indução de CI-AKI sensibilizado, incluindo a variabilidade na resposta renal à privação de água, inibição das vias de óxido nítrico e prostaglandinas e exposição ao contraste. Pequenas diferenças na reserva funcional renal e nas respostas fisiológicas entre os animais também podem ter contribuído para a gravidade heterogênea da lesão renal. Portanto, os grandes desvios-padrão devem ser interpretados como evidência de substancial variabilidade biológica dentro deste modelo experimental, e não como erro de medição. Contudo, dada a pequena quantidade de animais em cada grupo, as características da distribuição e a magnitude das diferenças relacionadas ao tratamento devem ser interpretadas com cautela.

No presente estudo, a ureia sérica, a UBN e a creatinina foram numericamente menores no grupo tratado com NAC em comparação com o grupo de IA-AC não tratado, um padrão consistente com uma possível atenuação da disfunção renal. O NAC tem sido amplamente estudado na IA-AC, mas seus efeitos relatados sobre a função renal têm variado entre os estudos^14,15,16,17. Os mecanismos propostos incluem a eliminação de espécies reativas, o apoio à síntese de glutationa e a limitação da lesão oxidativa no tecido renal¹. Assim, o perfil da função renal observado após o tratamento com NAC pode estar relacionado às suas propriedades antioxidantes, embora esse mecanismo não tenha sido diretamente examinado no presente estudo.

No presente estudo, a ureia sérica, a ureia no sangue (BUN) e a creatinina foram numericamente menores no grupo tratado com montelucaste do que no grupo com CI-AKI não tratado, sugerindo uma possível atenuação da disfunção renal. Estudos experimentais anteriores, incluindo investigações sobre CI-AKI, também relataram níveis mais baixos de creatinina e ureia séricas após a administração de montelucaste^9,18,19. O grupo de combinação também apresentou marcadores de função renal numericamente menores do que o grupo com CI-AKI não tratado. No entanto, ureia, BUN e creatinina foram numericamente menores com a monoterapia de montelucaste do que com o tratamento combinado, e as comparações pós-hoc de Duncan não mostraram diferenças estatisticamente significativas entre esses dois grupos (p > 0,05). Assim, a terapia combinada não demonstrou superioridade em relação à monoterapia com montelucaste para esses marcadores de função renal.

A lesão oxidativa é considerada um importante fator contribuinte para a fisiopatologia da LCA-AQI. A hipóxia medular induzida pela exposição ao contraste promove a geração excessiva de ERO, o que pode danificar lipídios celulares e mitocôndrias, lesar células epiteliais tubulares e intensificar a sinalização inflamatória^1,12,30.

O grupo de LRA-IC não tratado exibiu a maior concentração de MDA, juntamente com as menores atividades de SOD e CAT e o menor nível de GSH, indicando um desequilíbrio entre a carga oxidativa e as defesas antioxidantes após a exposição ao contraste. Perfis comparáveis, caracterizados pelo aumento do MDA juntamente com a redução da capacidade antioxidante, foram relatados em outros modelos experimentais de LRA-IC^18,19. Esses achados são consistentes com o estresse oxidativo contribuindo para o desenvolvimento e a progressão da lesão renal, em vez de ocorrer unicamente como uma consequência secundária^1,30.

Em comparação com o grupo de CI-AKI não tratado, os grupos tratados com NAC e montelukast geralmente apresentaram valores mais baixos de MDA juntamente com valores mais altos de SOD, GSH e CAT, um padrão compatível com atenuação da lesão oxidativa. As ações antioxidantes propostas do NAC incluem a neutralização de espécies reativas e a manutenção da disponibilidade de glutationa intracelular^1,14. O montelukast também pode limitar a lesão oxidativa renal por mecanismos que vão além do bloqueio do receptor de leucotrienos cisteínicos, incluindo a supressão das respostas oxidativas no tecido renal^18,33. Estudos prévios sobre lesão renal, incluindo modelos de CI-AKI, relataram igualmente redução da peroxidação lipídica e melhora das defesas antioxidantes após o tratamento com montelukast^9,19,27. Embora parâmetros favoráveis de estresse oxidativo também tenham sido observados no grupo de combinação, o tratamento combinado não superou consistentemente qualquer um dos tratamentos com monoterapia. Assim, esses achados não estabelecem um efeito antioxidante aditivo ou sinérgico do NAC e do montelukast administrados em conjunto.

Os achados de KIM-1 e cistatina C forneceram evidências complementares de lesão renal após exposição ao contraste. O KIM-1 está associado principalmente a danos no epitélio tubular, enquanto a cistatina C é utilizada como indicador de alterações relacionadas à filtração e lesão renal; ambas foram avaliadas como biomarcadores precoces em modelos experimentais de CI-AKI^1,10. No grupo de CI-AKI não tratado, os níveis mais elevados de ambos os biomarcadores acompanharam a acentuada deterioração dos parâmetros convencionais de função renal. Esse padrão é consistente com estudos experimentais anteriores que relataram aumentos na KIM-1 e na cistatina C após lesão renal induzida por contraste^1,10.

Em comparação com o grupo de CI-AKI sem tratamento, os grupos tratados apresentaram valores mais baixos de KIM-1 e cistatina C, um padrão compatível com atenuação da lesão renal. Esse perfil de biomarcadores acompanhou as concentrações numericamente menores de ureia e creatinina séricas observadas após o tratamento. Estudos experimentais anteriores associaram a administração de montelucaste à redução da expressão de KIM-1, lesão tubular menos grave e preservação da função renal em modelos de CI-AKI e outras lesões renais^9,18,19. O NAC também tem sido associado a perfis mais favoráveis de biomarcadores na lesão renal aguda, possivelmente por limitar danos celulares relacionados ao estresse oxidativo^14,15,16,17. No entanto, nenhuma diferença estatisticamente significativa em KIM-1 ou cistatina C foi detectada entre os grupos com tratamento combinado e com monoterapia de montelucaste (p > 0,05). Assim, os achados atuais não demonstram um benefício adicional em biomarcadores com o tratamento combinado.

As respostas oxidativas e inflamatórias podem reforçar-se mutuamente durante a LCA-AKI. O excesso de ERO pode estimular a sinalização pró-inflamatória, com aumentos subsequentes de TNF-α, IL-1β e IL-6, potencialmente amplificando a lesão do tecido renal^1,12,13,30.

O grupo de CI-AKI não tratado exibiu as concentrações mais altas de TNF-α, IL-1β e IL-6, o que apoia a presença de uma resposta inflamatória após a exposição ao contraste. Em modelos experimentais de CI-AKI, o aumento dessas citocinas tem sido associado a lesão tubular, infiltração de células inflamatórias e disfunção renal^10,12,13. O perfil de citocinas inflamatórias observado no presente estudo é consistente com achados experimentais anteriores relatados após a administração de contraste¹.

Os grupos tratados com NAC e montelukast apresentaram valores mais baixos de TNF-α, IL-1β e IL-6 do que o grupo com CI-AIQ não tratado, um padrão compatível com atenuação da resposta inflamatória. A atividade anti-inflamatória proposta para o NAC pode surgir em parte da redução da carga oxidativa e da consequente limitação da produção de citocinas pró-inflamatórias^{1,14,15,16,17}. O montelukast pode influenciar a expressão de citocinas por meio do bloqueio do receptor de cisteinil leucotrienos, bem como pela modulação de outros processos de sinalização inflamatória^18,33. Estudos experimentais sobre lesão renal também associaram o tratamento com montelukast à redução da sinalização relacionada ao NF-κB e à atividade pró-inflamatória^9,19,27. Assim, o perfil de citocinas observado neste estudo é compatível com a modulação de processos inflamatórios que envolvem vias como o NF-κB e o inflamassoma da família de receptores tipo NOD com domínio pirina contendo 3 (NLRP3). No entanto, o NF-κB, o NLRP3 e a NOX4 não foram medidos diretamente; portanto, os achados dos biomarcadores fornecem apenas evidências indiretas de suporte e não podem comprovar ativação ou inibição específica de vias.

Os valores das citocinas inflamatórias foram menores no grupo com tratamento combinado do que no grupo de CI-IRA não tratado, mas o tratamento combinado não produziu consistentemente valores mais baixos do que o montelucaste isolado. Não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos CI-IRA + Montelucaste e CI-IRA + Montelucaste + NAC para TNF-α, IL-1β ou IL-6 (p > 0,05). Assim, os resultados atuais não fornecem evidência de que a adição de NAC ao montelucaste confira um benefício anti-inflamatório adicional.

Avaliações histopatológicas demonstraram ainda que a administração de meios de contraste resultou em lesão renal estrutural substancial. As alterações de necrose tubular, dilatação tubular, degeneração celular e congestão vascular observadas no grupo com CI-AKI representam características histopatológicas típicas dessa condição e estão associadas à perfusão renal prejudicada, estresse oxidativo e lesão das células tubulares^1,12,18,19. Juntamente com os achados bioquímicos, essas alterações histopatológicas confirmam que a administração de meios de contraste provocou lesão significativa no tecido renal. O menor grau de lesão histopatológica observado nos grupos tratados com montelucaste e NAC sugere que esses agentes possam exercer efeitos protetores sobre o tecido renal. Notavelmente, o grupo com terapia combinada exibiu os escores numericamente mais baixos de lesão histopatológica entre os grupos de tratamento. Além disso, a avaliação qualitativa de cortes corados com tricrômio de Masson mostrou deposição intersticial de colágeno menos acentuada e melhor preservação da arquitetura tubulointersticial nos grupos de tratamento em comparação com o grupo com CI-AKI não tratado. Considerando o período agudo de observação e a natureza qualitativa da avaliação com tricrômio de Masson, esses achados devem ser interpretados como evidência de melhor preservação estrutural no momento analisado, e não como evidência de alterações no remodelamento da matriz extracelular a longo prazo.

A avaliação histopatológica semi-quantitativa foi consistente com as observações qualitativas, mostrando escores de lesão menores em todos os grupos tratados em comparação com o grupo de CI-AKI não tratado. Embora o grupo de combinação tenha apresentado numericamente os menores escores de lesão histopatológica, essa constatação não foi acompanhada por superioridade consistente nos desfechos bioquímicos. Portanto, os achados histopatológicos favoráveis observados com o tratamento combinado não devem ser interpretados como evidência de um efeito aditivo ou sinérgico com base no desenho atual do estudo. Da mesma forma, estudos anteriores em modelos experimentais de CI-AKI e outras formas de lesão renal aguda relataram que a supressão do estresse oxidativo e da inflamação reduz o dano histopatológico e contribui para a preservação da integridade tubular^9,18,19,27.

Uma divergência aparente foi observada entre os achados bioquímicos e histopatológicos. Embora várias variáveis bioquímicas tenham sido numericamente mais favoráveis no grupo com monoterapia de montelucaste do que no grupo com terapia combinada, essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Em contraste, o grupo com terapia combinada apresentou os escores numericamente mais baixos de lesão histopatológica. Essa dissociação parcial pode refletir diferenças nos processos biológicos e perfis temporais capturados pelas duas abordagens de avaliação. O exame histopatológico avalia diretamente a lesão celular e estrutural local no tecido renal e, portanto, pode revelar preservação em nível tecidual no momento analisado, mesmo quando os marcadores séricos de função renal e outras medidas bioquímicas não melhoram na mesma magnitude. Em contraste, os desfechos bioquímicos fornecem leituras funcionais ou moleculares indiretas e podem ser influenciados pela reserva funcional renal, mecanismos compensatórios, variabilidade biológica entre animais e pelo momento da coleta das amostras. Como todos os desfechos foram avaliados em um único momento terminal, a preservação estrutural e a recuperação bioquímica podem não ter estado sincronizadas. Assim, a aparência histopatológica mais favorável no grupo com terapia combinada deve ser interpretada como uma diferença entre as modalidades de avaliação, e não como evidência de eficácia geral superior. Apesar disso, embora as avaliações histopatológicas tenham sido realizadas sob condições cegas para minimizar o viés do observador, todas as seções de tecido foram analisadas por um único patologista, o que impossibilitou a avaliação da variabilidade interobservador. Estudos futuros que incluam múltiplos avaliadores independentes podem aumentar ainda mais a confiabilidade e a reprodutibilidade dos achados histopatológicos.

A aplicação reprodutível deste modelo depende do desempenho consistente de várias etapas do procedimento. A duração da privação de água, os intervalos predeterminados entre a administração de L-NAME, indometacina e iohexol, e a administração intravenosa lenta do iohexol devem ser padronizados entre os animais. A extravasação na veia da cauda pode reduzir a dose efetiva de contraste e aumentar a variabilidade na gravidade da lesão renal; portanto, o local da injeção deve ser monitorado cuidadosamente durante toda a administração. Quando ocorrer vazamento, extravasação ou resistência substancial durante a injeção, deve-se considerar a possibilidade de administração incompleta do contraste ao interpretar os achados correspondentes. A consistência da dose também pode ser afetada por regurgitação durante a gavagem oral ou por ressuspendimento inadequado da preparação de montelucaste. Aplicar os mesmos procedimentos padronizados a todos os animais e atribuir as administrações ao mesmo pesquisador sempre que viável pode reduzir a variabilidade procedural evitável.

Este protocolo permite que a LIA-IC seja estabelecida em um período experimental relativamente curto, ao mesmo tempo que permite a análise de desfechos bioquímicos e histopatológicos no mesmo modelo animal^1,2,9.

Uma vantagem do presente estudo é que a lesão renal foi caracterizada utilizando desfechos funcionais, bioquímicos, inflamatórios e histopatológicos complementares. A avaliação dos índices de função renal juntamente com parâmetros de estresse oxidativo, citocinas inflamatórias, KIM-1, cistatina C e morfologia do tecido renal permitiu examinar diversos componentes da CI-AKI dentro do mesmo experimento. A inclusão do KIM-1 e da cistatina C também ampliou a avaliação para além das medidas convencionais de creatinina sérica. O teste do montelukast e do NAC tanto separadamente quanto em conjunto permitiu a comparação direta das estratégias de tratamento; no entanto, os resultados não demonstraram superioridade consistente da combinação em relação à monoterapia nos desfechos avaliados. Além disso, diferentemente das abordagens de indução baseadas apenas na exposição ao contraste, o presente modelo incorpora vasoconstrição renal e hipóxia medular, criando assim um cenário acentuado de lesão renal no qual podem ser avaliadas alterações biológicas associadas ao tratamento.

O intervalo de 1 h entre a exposição ao contraste e o início do tratamento representa apenas o ponto temporal analisado neste protocolo experimental e não deve ser interpretado como uma janela terapêutica clinicamente validada. Embora o tratamento logo após uma exposição conhecida ao contraste possa ser relevante para pesquisas translacionais futuras, o presente estudo em animais não pode determinar sua viabilidade ou eficácia em contextos clínicos. Em particular, o momento ideal para o início do tratamento, a dose, a via de administração, a duração do tratamento e a população de pacientes permanecem desconhecidos. Esses fatores devem ser investigados em estudos translacionais e clínicos específicos antes que a administração de NAC ou montelucaste após contraste possa ser considerada para uso clínico.

Várias limitações do presente estudo devem ser reconhecidas. Os achados foram obtidos a partir de um modelo animal pré-clínico e, portanto, não podem ser diretamente generalizados para a prática clínica. Como o protocolo combinou privação hídrica com inibição das vias do óxido nítrico e das prostaglandinas, o insulto renal resultante pode ter sido mais grave do que a lesão tipicamente observada após exposição ao contraste em pacientes. Os resultados devem, consequentemente, ser interpretados no contexto dessa configuração experimental sensibilizada. Embora o modelo permita a avaliação controlada das respostas biológicas a tratamentos renoprotetores em estudo, ele não reproduz toda a heterogeneidade ou a amplitude de gravidade da LCA-I clínica. As alterações associadas ao tratamento observadas neste estudo podem, portanto, diferir em pacientes com perfis de risco mais leves ou mais variados. É necessário realizar replicações em modelos menos intensivos que se aproximem mais das condições clínicas comuns, seguidas de estudos clínicos adequadamente delineados, antes que a magnitude ou a relevância clínica desses efeitos possa ser determinada. Uma limitação adicional é que apenas ratos machos foram incluídos no estudo. Portanto, possíveis diferenças relacionadas ao sexo na suscetibilidade à LCA-I e nas respostas à NAC e ao montelucaste não foram avaliadas, e os achados atuais não devem ser assumidos como generalizáveis para animais fêmeas. Estudos futuros que incluam ambos os sexos são necessários para determinar se o sexo influencia a gravidade da lesão renal ou a resposta ao tratamento.

Outra limitação é a ausência de um grupo controle procedimental emparelhado aos grupos experimentais em relação ao manuseio relacionado ao protocolo, contenção, privação de água, injeções, gavagem oral e administração de veículo. Como o grupo Controle não passou por esses procedimentos, não é possível excluir completamente que diferenças decorrentes de estresse procedimental desigual e efeitos inespecíficos relacionados à contenção, manuseio repetido, injeções, gavagem oral e exposição ao veículo tenham contribuído para algumas das diferenças observadas entre os grupos Controle e experimentais. A inclusão, em estudos futuros, de grupos controle procedimental e controle de veículo adequadamente emparelhados ajudaria a distinguir esses efeitos inespecíficos relacionados a procedimentos daqueles especificamente atribuíveis à indução e tratamento de CI-AKI.

Embora o tamanho da amostra pré-especificado tenha sido calculado para fornecer 80% de poder para detectar um efeito geral assumido como grande entre os cinco grupos experimentais, o estudo não foi especificamente dimensionado para detectar diferenças pareadas menores entre os grupos de monoterapia e tratamento combinado. Portanto, o estudo pode ter tido poder limitado para detectar tais diferenças entre tratamentos, e tendências numéricas não significativas não devem ser interpretadas como evidência de equivalência. Estudos com tamanhos maiores de amostra serão necessários para determinar se essas tendências representam diferenças reprodutíveis entre tratamentos.

Como foi avaliada apenas uma única dose de cada agente, o presente estudo não pode determinar uma combinação ótima de dose de NAC–montelucaste, caracterizar interações sinérgicas ou antagônicas dependentes da dose ou quantificar a contribuição relativa de cada agente aos efeitos observados com o tratamento combinado. Assim, um dos agentes pode ter contribuído de forma mais acentuada para determinados desfechos, mas isso não pode ser estabelecido com base no delineamento atual do estudo. Estudos futuros que incluam múltiplos níveis de dose e análises formais de interação medicamentosa serão necessários para caracterizar as relações dose-resposta e identificar um regime de combinação ideal.

O estudo avaliou indicadores bioquímicos de estresse oxidativo e inflamação, mas não examinou diretamente as vias de sinalização intracelular associadas. Portanto, os perfis de biomarcadores observados não podem demonstrar se as vias de sinalização relacionadas a NF-κB, NLRP3 ou NOX4 foram ativadas ou inibidas pelo tratamento. Investigações futuras utilizando abordagens moleculares, incluindo Western blot e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), são necessárias para determinar como essas vias contribuem para os efeitos renais do montelucaste e da NAC.

Como as avaliações foram limitadas à fase aguda, o presente estudo não fornece informações sobre a recuperação renal subsequente ou a remodelação tecidual de longo prazo. O depósito relativamente limitado de colágeno observado nos grupos tratados no ponto final examinado deve, portanto, ser considerado uma alteração estrutural precoce, e não como evidência de que a fibrose renal crônica foi prevenida. Esse achado pode, em vez disso, refletir a atenuação do dano renal inicial. Estudos longitudinais que incluam pontos de avaliação posteriores são necessários para determinar se essas alterações precoces persistem e se influenciam a função renal de longo prazo ou a remodelação tecidual.

De modo geral, a administração pós-contraste de montelucaste e NAC, isoladamente ou em combinação, foi associada à atenuação da disfunção renal, estresse oxidativo, respostas inflamatórias e lesão histopatológica neste modelo experimental de LIA-AC. No entanto, o tratamento combinado não demonstrou superioridade consistente em relação à monoterapia nos desfechos avaliados. Esses achados estão limitados ao presente modelo pré-clínico e apoiam investigações experimentais adicionais, em vez de extrapolação direta para a prática clínica.

Em conclusão, o tratamento pós-contraste com montelucaste, NAC ou sua combinação foi associado a achados bioquímicos e histopatológicos mais favoráveis neste modelo experimental de CI-AKI. No entanto, o regime combinado não superou de forma consistente a monoterapia em todos os desfechos avaliados. Como essas observações foram obtidas em um estudo pré-clínico com animais, devem ser consideradas como base para validação experimental adicional, e não como evidência de eficácia clínica ou aplicabilidade. Pesquisas adicionais são necessárias para determinar a relevância potencial dessas abordagens terapêuticas pós-contraste na CI-AKI clínica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Auto Strip Washer	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	Limpeza automatizada de placas para ELISA.
Microplate Reader	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	Medições de absorbância em ELISA. RRID:SCR_028651
Formol tamponado neutro a 10%	Merck	Não registrado	Fixação de tecidos para histopatologia.
Centrífuga de bancada	Nüve	NF048	Preparação de amostras e centrifugação.
Carboximetilcelulose (CMC)	Sigma-Aldrich, USA	C5678	Veículo utilizado para suspensão de montelucaste.
Kit CAT Universal	Otto Scientific	Otto3051	Medição colorimétrica da atividade de CAT no soro utilizando um analisador químico Mindray BS-400.
Homogeneizador digital	Daihan Scientific	HG-15D	Homogeneização de tecidos.
Eosina Y (amarelada)	Merck	1.15935.0025	Coloração HE.
Solução de Hematoxilina de Harris	BSLAB	BS-002	Coloração HE.
Indometacina	Sigma-Aldrich, USA	I7378	Utilizada para indução de CI-AKI.
Iohexol (Omnipaque 300)	GE HealthCare	Não registrado	Agente de contraste utilizado para induzir CI-AKI.
Cloretato de cetamina (Ketalar)	Pfizer, USA	Não registrado	Anestesia geral antes da coleta de amostras.
Microscópio óptico (Nikon Eclipse)	Nikon	Ni-U	Exame e imagem histopatológicos. RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-nitro-L-arginina metil éster)	Sigma-Aldrich, USA	N5751	Utilizado para indução de CI-AKI.
Kit de Coloração Tricrômio de Masson	MOSLAB, Türquia	BKMTO001	Coloração tricrômio de Masson.
Analisador Químico Mindray	Mindray	BS-400	Análises bioquímicas.
Montelucaste sódico	Sigma-Aldrich, USA	SML0101	Administrado por gavagem oral como tratamento.
N-acetilcisteína (ASIST 300 mg/2 mL)	MAC laç, Türquia	Não registrado	Administrado por via intraperitoneal como tratamento.
Kit ELISA de Cistatina C de Rato	BT Lab, China	E0145Ra	Medição por ELISA da cistatina C em sobrenadantes de tecido renal.
Kit ELISA de IL-1β de Rato	BT Lab, China	E0119Ra	Medição por ELISA da IL-1β em sobrenadantes de tecido renal.
Kit ELISA de IL-6 de Rato	BT Lab, China	E0135Ra	Medição por ELISA da IL-6 em sobrenadantes de tecido renal.
Kit ELISA de KIM-1 de Rato	BT Lab, China	E0549Ra	Medição por ELISA do KIM-1 em sobrenadantes de tecido renal.
Kit ELISA de TNF-α de Rato	BT Lab, China	E0764Ra	Medição por ELISA do TNF-α em sobrenadantes de tecido renal.
Agulha de alimentação em aço inoxidável (cânula de gavagem oral 22 G)	Instech Laboratories, USA	Não registrado	Administração por gavagem oral.
Ração peletizada padrão para roedores (Optima)	Optima, Türquia	Não registrado	Lote no. 58931. Composição nutricional: 24% proteína bruta, 3,94% celulose bruta, 5,08% gordura bruta, 8,8% cinza bruta, 1,44% lisina, 0,61% metionina, 1,14% cálcio, 0,89% fósforo e 0,28% sódio.
Kit Universal de Creatinina	Otto Scientific	OttoBC139	Medição colorimétrica de creatinina no soro.
Kit Universal de GSH	Otto Scientific	Otto3053	Medição colorimétrica de GSH em sangue anticoagulado com EDTA utilizando um método de Ellman modificado.
Kit Universal de MDA	Otto Scientific	Otto1001	Medição colorimétrica de MDA no soro utilizando um leitor de microplacas ELx800.
Kit Universal de SOD	Otto Scientific	Otto3047	Medição colorimétrica da atividade de SOD no soro utilizando um analisador químico Mindray BS-400.
Kit Universal de Uréia	Otto Scientific	OttoBC157	Medição colorimétrica de uréia e BUN no soro.
Cloretato de xilazina (Rompun)	Bayer, Alemanha	Não registrado	Anestesia geral antes da coleta de amostras.