Artigo de investigação

Cápsula Yangjing Alivia a Disfunção Espermatogênica em Camundongos ao Inibir a Via QKI-5/p38 MAPK por meio da Regulação Positiva do incRNA NONMMUT031883.2

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DOI:

10.3791/73166

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28 de agosto de 2026

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1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este estudo avalia os efeitos protetores da Cápsula Yangjing sobre a disfunção espermatogênica induzida por ciclofosfamida em camundongos e examina a participação da via de sinalização lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Resumo

A disfunção espermatogênica é uma causa importante de infertilidade masculina, e a ciclofosfamida (CP) pode prejudicar a espermatogênese ao induzir apoptose anormal dos espermatogônios. A Cápsula Yangjing (YC) tem sido utilizada para melhorar a função reprodutiva, mas seu mecanismo molecular subjacente permanece pouco claro. Este estudo investigou os efeitos protetores da YC em um modelo murino de disfunção espermatogênica induzida por CP e em células espermatogoniais GC-1. Foram avaliados a contagem e a motilidade espermáticas, a fertilidade masculina, os níveis séricos de hormônios sexuais e as alterações histopatológicas nos testículos e epidídimos. A viabilidade celular, a liberação de desidrogenase láctica, a apoptose e as proteínas relacionadas à apoptose foram analisadas nas células GC-1. A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa, ensaios de captura de RNA, imunofluorescência e Western blot foram utilizados para examinar o lncRNA NONMMUT031883.2, a Quaking-5 (QKI-5) e a sinalização da quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK). A YC melhorou de forma dependente da dose a qualidade espermática, os níveis séricos de hormônios sexuais, a morfologia dos órgãos reprodutivos, a histopatologia testicular e a fertilidade em camundongos tratados com CP. Nas células GC-1, a YC aumentou a viabilidade celular e reduziu os danos celulares e a apoptose. O lncRNA NONMMUT031883.2 interagiu fisicamente com a QKI-5, e o tratamento com YC aumentou a expressão do lncRNA NONMMUT031883.2, ao mesmo tempo que reduziu a expressão da QKI-5 e a fosforilação da p38. O tratamento com YC inibiu a apoptose induzida pela silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2 nas células GC-1, enquanto a superexpressão da QKI-5 reduziu os efeitos antiapoptóticos da YC. Esses achados sugerem que a YC alivia a disfunção espermatogênica induzida por CP e que seus efeitos protetores são mediados pela regulação da via lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Introdução

A disfunção espermatogênica refere-se ao comprometimento reprodutivo causado por anormalidades na produção, maturação ou função dos espermatozoides no sistema reprodutor masculino. Caracteriza-se por contagem espermática reduzida, baixa motilidade e aumento da taxa de deformidades espermáticas.1,2A patogênese da disfunção espermatogênica é complexa e está associada a fatores genéticos, distúrbios autoimunes, toxinas ambientais, lesões induzidas por quimioterapia e lesões nos órgãos reprodutivos³⁻⁵. Fármacos quimioterápicos como a ciclofosfamida (CP) podem danificar diretamente os túbulos seminíferos testiculares e induzir a apoptose de espermatogônias, contribuindo assim para a disfunção espermatogênica masculina.6,7A terapia de reposição hormonal, a suplementação com antioxidantes e as tecnologias de reprodução assistida são atualmente utilizadas como intervenções clínicas. No entanto, essas abordagens apresentam eficácia inconsistente e efeitos adversos significativos.8,9,10Portanto, identificar intervenções seguras e eficazes e esclarecer seus alvos moleculares é clinicamente importante para melhorar os resultados reprodutivos em pacientes com disfunção espermatogênica.

A medicina herbal chinesa tem demonstrado potencial na proteção da função reprodutiva masculina e no tratamento da disfunção espermatogênica devido às suas propriedades multialvo e baixa toxicidade relativamente11,12. A Cápsula Yangjing (YC) é um medicamento patentado tradicional chinês composto por Rehmannia glutinosa, Epimedium, placenta, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis e outras medicinas herbais chinesas. É utilizada para tonificar o rim e a essência, nutrir o sangue e a medula e regular a função reprodutiva13. Estudos anteriores mostraram que a YC pode regular os níveis de hormônios sexuais em animais machos, melhorar a qualidade espermática, reparar danos no tecido testicular e proteger contra lesões reprodutivas induzidas por agentes químicos14,15. As células espermatogoniais formam a base da espermatogênese, e a apoptose anormal das espermatogônias é um evento central no desenvolvimento da disfunção espermatogênica16. Relatou-se também que a YC melhora a viabilidade das espermatogônias, aumenta a proporção de células na fase S e inibe a apoptose17. No entanto, seus efeitos protetores e mecanismos moleculares específicos na disfunção espermatogênica induzida por CP permanecem pouco claros.

Os RNAs não codificantes longos (lncRNAs) são moléculas de RNA com mais de 200 nucleotídeos que não possuem capacidade de codificação proteica18. Os lncRNAs podem regular a expressão gênica por meio de mecanismos como silenciamento cromossômico, modificação da cromatina, impressão genômica e ativação transcricional19,20. A proteína ligadora de RNA Quaking-5 (QKI-5) participa de processos fisiológicos e patológicos, incluindo proliferação celular e apoptose, por meio da regulação do splicing alternativo de genes downstream21. A via da proteína quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK) está envolvida na regulação da apoptose e também desempenha um papel importante na fertilidade masculina e no desenvolvimento testicular22,23. Um estudo anterior mostrou que a superexpressão de QKI-5 ativa a via p38 MAPK em células de carcinoma hepatocelular24. Além disso, demonstrou-se que o lncRNA NONMMUT074098.2 se liga a QKI-5 em espermatogônias, enquanto o silenciamento de QKI-5 inibiu a via p38 MAPK e reduziu a apoptose de espermatogônias25. Este estudo utilizou um modelo murino induzido por CP de disfunção espermatogênica para investigar se YC regula a expressão do lncRNA NONMMUT031883.2 e o eixo de sinalização QKI-5/p38 MAPK, reduzindo assim a apoptose anormal de espermatogônias e atenuando a disfunção espermatogênica induzida por CP (Figura 1). O objetivo foi esclarecer o mecanismo molecular subjacente aos efeitos protetores de YC sobre a espermatogênese e ampliar o entendimento de seu papel farmacológico na proteção da função reprodutiva masculina.

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Figura 1: Diagrama esquemático do delineamento experimental. O painel superior resume os experimentos in vitro em células espermatogoniais GC-1. O silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2 foi utilizado para induzir apoptose e dano celular, seguido pelo silenciamento de QKI-5 para avaliar seus efeitos sobre apoptose e lesão celular. O painel inferior resume os experimentos in vivo em modelos murinos de disfunção espermatogênica induzida por ciclofosfamida (CP). Os camundongos receberam tratamento com a Cápsula Yangjing e/ou intervenção com lncRNA NONMMUT031883.2 ou QKI-5. Foram posteriormente avaliadas a fertilidade, os níveis séricos de hormônios, os tecidos testiculares e epididimários, a suspensão espermática, as reservas espermáticas, a qualidade espermática e os danos histopatológicos testiculares. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes ARRIVE e com o Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. Todos os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Sudeste (número de aprovação: 20230216022).

1. Preparação do soro contendo YC
Duas cápsulas Yangjing (YC; 0,5 g/cápsula) foram abertas e 0,8 g do conteúdo foi pesado. Adicionou-se solução salina normal até um volume final de 10 mL e a mistura foi agitada em vórtex completamente para preparar uma suspensão de 80 mg/mL. Camundongos machos BALB/c livres de patógenos específicos, pesando 22–25 g e com 8 semanas de idade, foram mantidos a 22 °C e umidade de 55%–60%, sob ciclo de 12 h claro/escuro, com alimentação e água fornecidas ad libitum. Após 1 semana de aclimatação, os camundongos receberam YC por gavagem oral na dose de 800 mg/kg de peso corporal, em um volume de 10 mL/kg, uma vez ao dia durante 5 dias consecutivos. Duas horas após a última administração, os animais foram anestesiados com pentobarbital de sódio 1% por via intraperitoneal e amostras de sangue foram coletadas para preparar o soro contendo YC. O soro foi inativado a 56 °C por 30 min, filtrado através de membrana de 0,22 µm e armazenado a −80 °C até o uso.

2. Cultura celular e transfeção
Células espermatogoniais GC-1 de camundongo foram mantidas em DMEM contendo 1% de penicilina-estreptomicina e 10% de soro bovino fetal. Todas as culturas foram mantidas a 37 °C em uma atmosfera contendo 5% de CO₂ (v/v).

RNA de interferência específico para lncRNA (sh-lncRNA), um plasmídeo de superexpressão de QKI-5 (OE-QKI-5), RNA interferente pequeno para QKI-5 (si-QKI-5) e seus controles negativos correspondentes (sh-NC, OE-NC e si-NC) foram sintetizados e construídos. As células GC-1 foram transfectadas com sh-lncRNA ou sh-NC, si-QKI-5 ou si-NC, ou OE-QKI-5 ou OE-NC, conforme as instruções do reagente de transfeção. Após 48 h de incubação, a eficiência de transfeção foi avaliada pela medição da expressão da lncRNA NONMMUT031883.2 ou de QKI-5.

Para o grupo sh-lncRNA + si-QKI-5 + etoposídeo, as células GC-1 foram transfectadas com sh-lncRNA e si-QKI-5 e posteriormente tratadas com 100 µM de etoposídeo por 12 h26. Para ensaios subsequentes de viabilidade celular, as células GC-1 foram cultivadas em meio suplementado com soro contendo 5%, 10% ou 20% de YC e designadas como os grupos de baixa dose de YC (L-YC), média dose de YC (M-YC) e alta dose de YC (H-YC), respectivamente. As concentrações de soro contendo YC (5%, 10% e 20% de YC) foram determinadas com base nos resultados de experimentos preliminares de gradiente de concentração. Para os grupos sh-lncRNA + H-YC + OE-NC e sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5, as células GC-1 foram transfectadas com sh-lncRNA mais OE-NC ou sh-lncRNA mais OE-QKI-5 por 48 h e, em seguida, expostas a soro contendo 20% de YC por 24 h.

3. Ensaio com o Kit-Cell Counting-8
Células GC-1 foram semeadas em placas de 96 poços a 5 × 103 células/poço e cultivadas por 24 h. Após a adesão celular, o meio original foi substituído por 100 µL de meio completo suplementado com soro contendo YC, e as células foram incubadas por 6, 12 ou 24 h. Após a incubação, adicionou-se 10 µL do reagente do Kit-Cell Counting-8 a cada poço, e as células foram incubadas a 37 °C no escuro por 2 h. A absorbância em 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas.

4. Ensaio de desidrogenase láctica
Após 48 h de transfeção com sh-NC ou sh-lncRNA, o meio de cultura das células GC-1 foi coletado e o sobrenatante foi obtido por centrifugação. De acordo com as instruções do kit de ensaio de desidrogenase láctica, o sobrenatante foi misturado suavemente com a solução de detecção e transferido para uma placa de 96 poços. A placa foi incubada a 25 °C, no escuro, por 30 min. A absorbância em 490 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas e a liberação de desidrogenase láctica foi calculada para avaliar o dano celular.

5. Coloração com Calceína AM/iodeto de propídio
Após 48 h de transfeção com sh-NC ou sh-lncRNA, a sobrevivência das células GC-1 foi avaliada por meio da coloração com calceína AM/iodeto de propídio (PI). As células foram semeadas em placas de 12 poços a 5 × 104 células/poço e cultivadas até atingirem 60%–70% de confluência. As células foram lavadas suavemente com solução salina tamponada com fosfato e adicionou-se 500 µL de solução de coloração com calceína AM/PI a cada poço. As células foram incubadas a 37 °C, no escuro, por 30 min e observadas em microscópio de fluorescência. As células vivas e mortas foram contadas utilizando um software de análise de imagens e a proporção de células viáveis foi calculada.

6. Citometria de fluxo
As células GC-1 foram coletadas por centrifugação e lavadas suavemente com solução salina tamponada com fosfato. O pellet celular foi ressuspenso em 500 µL de tampão de ligação, numa densidade de 5 × 105 células/mL. Em seguida, foram adicionados 5 µL de cada um de Annexina V-APC e PI, e a suspensão foi bem misturada e incubada a 25 °C, no escuro, por 10 minutos. A apoptose foi analisada por citometria de fluxo utilizando comprimentos de onda de excitação/emissão de 633/660 nm para APC e 488/630 nm para PI. A taxa de apoptose foi avaliada utilizando software de análise de citometria de fluxo.

7. Ensaio de atividade da caspase-3
Após os tratamentos indicados, aproximadamente 1 × 106 células GC-1 foram coletadas, lavadas e ressuspendidas em solução salina tamponada com fosfato. As células foram misturadas com 100 µL do reagente II do kit de ensaio de atividade da caspase-3 e lisadas em gelo por 15 min. Após a centrifugação, 50 µL do sobrenadante do lisado foi coletado e misturado com 40 µL do reagente I e 10 µL do reagente III. A mistura foi incubada a 37 °C por 2 h. A absorbância a 405 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas, e a atividade da caspase-3 foi avaliada de acordo com as instruções do kit.

8. Ensaio de precipitação de RNA
As fitas sentido e antissenso do lncRNA NONMMUT031883.2 foram sintetizadas de acordo com a sequência correspondente e marcadas com biotina. As células foram lisadas em tampão de lise celular para imunoprecipitação, em gelo, durante 30 minutos, e o sobrenadante contendo proteína foi coletado por centrifugação. As esferas magnéticas de estreptavidina foram lavadas três vezes com tampão de ligação de RNA e incubadas em tampão de ligação contendo 1% de albumina de soro bovino durante 30 minutos.

As esferas pré-tratadas foram combinadas com as sondas marcadas com biotina e incubadas a 25 °C por 30 min. As sondas não ligadas foram removidas por separação magnética. O sobrenadante do lisado celular foi então adicionado, e a mistura foi incubada a 4 °C por 4 h para formar complexos de esferas magnéticas-RNA-proteína. As esferas magnéticas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem para remover proteínas ligadas de forma não específica. O tampão de lavagem foi removido por separação magnética, e foi adicionado tampão de carregamento de SDS 2×. As amostras foram aquecidas a 95 °C por 10 min, e o sobrenadante foi coletado por separação magnética para análise subsequente por Western blot.

9. Construção de um modelo murino de disfunção espermatogênica
Após 5 dias de aclimatação, camundongos machos BALB/c livres de patógenos específicos, pesando 22–25 g e com 8 semanas de idade, receberam ciclofosfamida (CP) por via intraperitoneal a 50 mg/kg uma vez ao dia durante 7 dias para estabelecer um modelo de disfunção espermatogênica14,27. Os camundongos que foram adequadamente modelados foram aleatorizados, utilizando uma tabela de números aleatórios, nos grupos CP, YC 200 mg/kg, YC 400 mg/kg, YC 800 mg/kg, YC 800 mg/kg + sh-NC e YC 800 mg/kg + sh-lncRNA, com seis camundongos em cada grupo.

Os camundongos nos grupos tratados com YC receberam a dose correspondente de YC por gavagem oral uma vez ao dia durante 30 dias13. Para os grupos 800 mg/kg YC + sh-NC e 800 mg/kg YC + sh-lncRNA, após o estabelecimento bem-sucedido do modelo, os camundongos foram anestesiados por inalação de isoflurano a 2%. Após confirmar a ausência do reflexo de retirada do membro e que a frequência respiratória estava estável em cada camundongo, a área cirúrgica foi raspada e desinfetada com iodopovidona. Em condições assépticas, foi feita uma incisão mediana ventral através da pele e da parede corporal anterior aos genitais. O testículo foi exposto manipulando cuidadosamente a bolsa adiposa epididimal, tomando cuidado para evitar danos vasculares. Utilizando um micromanipulador, os túbulos seminíferos foram visualizados e 1 µL da suspensão adenoviral (1 × 1010 TU/mL) foi injetado lentamente com uma agulha de microinjeção28. A agulha permaneceu no local por 5 minutos após a injeção antes de ser retirada lentamente, e a hemostasia foi obtida com um cotonete estéril. O mesmo procedimento foi posteriormente realizado no testículo contralateral. A incisão foi então suturada e os camundongos foram mantidos em recuperação sobre uma plataforma aquecida no pós-operatório. Os camundongos controle receberam volume igual de solução salina por gavagem e injeção diariamente.

10. Avaliação da fertilidade
Após a conclusão da administração do fármaco, camundongos machos de cada grupo foram acasalados livremente com camundongas BALB/c numa proporção de 1:2 durante 7 dias. A formação do tampão vaginal nas camundongas foi monitorada e registrada diariamente. Após a confirmação do acasalamento bem-sucedido, os machos foram removidos e as fêmeas foram mantidas individualmente até o parto natural. Foram obtidas nove camundongas prenhes por grupo, as quais foram incluídas na análise. O tamanho médio da ninhada foi registrado para avaliar a fertilidade dos machos em cada grupo.

Ao final do período experimental, os camundongos foram eutanasiados por administração intraperitoneal de pentobarbital sódico a 100 mg/kg. Esse método de eutanásia foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Sudeste (número de aprovação: 20230216022). Os testículos e epidídimos foram cuidadosamente separados, fotografados e pesados. Os índices de testículo e epidídimo foram calculados como peso do órgão/peso corporal. Um epidídimo de cada camundongo foi coletado, cortado em pedaços, colocado em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato pré-aquecida (37 °C) e incubado por 20 min para permitir que os espermatozoides saíssem nadando29. A suspensão espermática foi suavemente misturada e 10 µL da suspensão espermática foram colocados em uma lâmina de contagem de células sanguíneas pré-aquecida. Os espermatozoides foram contados manualmente ao microscópio óptico com aumento de 200×, e os resultados foram expressos em 106/L. Além disso, a porcentagem de espermatozoides com motilidade progressiva em relação ao número total de espermatozoides foi calculada como motilidade espermática13.

11. Determinação dos níveis de hormônios sexuais
O sangue foi coletado da veia orbital de camundongos de cada grupo e deixado em repouso a 25 °C por 30 min. O soro foi obtido por centrifugação a 3.000 × g durante 10 min30. Os níveis séricos de testosterona, hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo-estimulante (FSH) foram medidos utilizando os respectivos kits de ensaio imunoenzimático (ELISA).

12. Ensaio de estabilidade do RNA
Células GC-1 foram semeadas em placas de cultura de 96 poços, transfectadas com si-QKI-5 ou si-NC e cultivadas por 48 h. Actinomicina D foi então adicionada a 5 µg/mL, e as células foram coletadas aos 0, 3, 6 e 9 h. O RNA total foi isolado, e o nível relativo de expressão do lncRNA NONMMUT031883.2 foi determinado por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa após transcrição reversa. O nível relativo de RNA em cada ponto temporal foi calculado utilizando o nível de expressão em 0 h como 100%.

13. Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa
As células GC-1 e tecidos testiculares de camundongo foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato e lisadas para o isolamento de RNA total. O DNA complementar foi gerado por meio da transcrição reversa utilizando a transcriptase reversa AMV. A amplificação por reação em cadeia da polimerase foi realizada em sistema de PCR em tempo real e com um kit de PCR quantitativo, utilizando o DNA complementar como molde de amplificação. O U6 foi utilizado como referência interna para o lncRNA NONMMUT031883.2, e o GAPDH foi utilizado como o referência interna para QKI-5. A expressão relativa do gene alvo foi calculada utilizando o 2−ΔΔCt método25. O RNA também foi isolado separadamente das frações citoplasmática e nuclear para determinar a localização subcelular do lncRNA NONMMUT031883.2. As sequências dos iniciadores estão fornecidas em Tabela 1.

GenePrimer direto (5' a 3')Primer reverso (5' a 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Tabela 1: Sequências de iniciadores utilizadas para a reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa quantitativa. As sequências dos iniciadores direto e reverso são listadas na direção 5′–3′ para o lncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 e GAPDH.

14. Coloração com hematoxilina e eosina
Tecidos testiculares e epididimários de camundongos foram imersos em paraformaldeído a 4% e fixados a 4 °C por 24 h. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato, os tecidos foram desidratados em uma série gradiente de etanol, emblocados em parafina e seccionados com espessura de 5 µm. Os cortes foram aquecidos a 60 °C por 60 min e desparafinizados em xilol por 30 min.

Após a hidratação em uma série de etanol graduado, as seções foram coradas com hematoxilina por 5 min, tratadas com solução diferenciadora de ácido clorídrico-etanol por 10 s, lavadas com água da torneira para realce do azulado e coradas com eosina 1% por 2 min. Em seguida, as seções foram desidratadas em etanol 95% e etanol absoluto e clareadas em xilol por 30 min. Após secagem ao ar, as seções foram montadas com goma neutra. Alterações morfológicas nos testículos e epidídimos foram observadas ao microscópio.

15. Imunofluorescência
Seções parafinadas de testículo de camundongo foram desparafinizadas e hidratadas em uma série graduada de etanol, seguida por recuperação de antígeno mediada por micro-ondas em tampão citrato com pH 6,0. Após resfriamento natural até a temperatura ambiente, as seções foram incubadas com Triton X-100 0,3% durante 10 min. As seções foram bloqueadas com albumina sérica bovina a 5% a 25 °C por 60 min, lavadas com solução salina tamponada com fosfato e incubadas durante a noite a 4 °C com um anticorpo primário contra Ki67. No dia seguinte, foi aplicado um anticorpo secundário de imunoglobulina G marcado com fluorocromo, e as seções foram incubadas a 37 °C no escuro por 60 min. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato, as seções foram contra-coloridas com DAPI por 10 min e observadas ao microscópio de fluorescência. A intensidade da fluorescência foi analisada utilizando software de análise de imagens.

Para a coloração por imunofluorescência de células GC-1, as células foram semeadas em placas de 12 poços a 1 × 105 células/poço e incubadas por 24 h. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 30 min, permeabilizadas com Triton X-100 a 0,3% por 10 min, bloqueadas com albumina sérica bovina a 5% e incubadas durante a noite a 4 °C com um anticorpo primário contra QKI-5. O procedimento restante foi realizado conforme descrito para as seções de tecido testicular.

16. Coloração TUNEL
Seções de parafina de testículo de camundongo foram desparafinizadas, hidratadas em uma série de etanol graduado e incubadas com Triton X-100 0,1% por 5 min para aumentar a permeabilidade da membrana celular. A solução de trabalho de proteinase K a 20 µg/mL, sem DNase, foi aplicada uniformemente sobre as seções, que foram então incubadas a 37 °C por 15 min. Foi adicionada a solução de detecção TUNEL, e as seções foram incubadas a 37 °C no escuro por 90 min. Após a incubação com DAPI por 10 min, foi aplicado meio de montagem com agente antidesvanecimento, e o tecido testicular foi observado em microscópio de fluorescência.

As células GC-1 foram semeadas em placas de 12 poços e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 30 min. Após a permeabilização com Triton X-100 a 0,1% por 5 min, foi aplicada a solução de detecção TUNEL às células, seguida de incubação no escuro por 60 min. As células foram então coradas com DAPI por 10 min e observadas ao microscópio de fluorescência.

17. Western blotting
Os tecidos testiculares de camundongo e as células GC-1 foram lisados no tampão de lise celular para imunoprecipitação em gelo durante 30 min e submetidos à ultrassonicação. Após a centrifugação, o sobrenadante contendo proteína foi coletado e a concentração proteica foi determinada utilizando um kit de ensaio com ácido bicinconínico. O sobrenadante proteico foi misturado com tampão de carga SDS e aquecido em água fervente por 10 min. Após a separação por eletroforese em gel, as proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno e bloqueadas com albumina sérica bovina a 5% durante 2 h31.

As membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra caspase-3 clivada (1:500), Bcl-2 (1:1000), caspase-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), p38 fosforilada (1:1000) ou p38 (1:500). No dia seguinte, as membranas foram lavadas com solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 e incubadas com imunoglobulina G de cabra anti-coelho na diluição de 1:10000 durante 2 h a 25 °C. A solução de trabalho de quimioluminescência aumentada foi aplicada à superfície das membranas e as bandas proteicas foram visualizadas com um sistema de imagem para géis. A intensidade das bandas foi analisada por meio de software de análise de imagens, e a expressão proteica relativa foi normalizada em relação a GAPDH (1:3000).

Cicloeximida a 50 µg/mL foi utilizada para inibir a síntese proteica. Para determinar a meia-vida da QKI-5, as células foram coletadas aos 0, 3, 6 e 9 h, e os níveis proteicos de QKI-5 foram posteriormente determinados por meio de Western blotting25.

18. Análise estatística
Todos os dados foram analisados estatisticamente e representados graficamente utilizando softwares estatísticos, de criação de gráficos e de análise de imagens. O teste de Shapiro-Wilk foi utilizado para avaliar a normalidade dos dados. Os dados experimentais são apresentados como média ± desvio padrão. A análise de variância de um fator foi utilizada para avaliar as diferenças entre os grupos. O teste t de LSD foi utilizado para comparações múltiplas post hoc quando as variâncias eram homogêneas, enquanto o teste T3 de Dunnett foi utilizado quando as variâncias eram heterogêneas. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A inibição do lncRNA NONMMUT031883.2 induz apoptose em espermatogônias
As células GC-1 foram transfectadas com sh-lncRNA para reduzir a expressão do lncRNA NONMMUT031883.2. Em comparação com as células transfectadas com sh-NC, o nível transcricional do lncRNA NONMMUT031883.2 foi marcadamente reduzido após a transfeção com sh-lncRNA, confirmando a inibição bem-sucedida (Figura 2A). Após a inibição do lncRNA NONMMUT031883.2, a viabilidade das células GC-1 foi significativamente reduzida (Figura 2B), enquanto a liberação de LDH foi significativamente aumentada, indicando maior dano celular (Figura 2C). A coloração com Calceína-AM/PI mostrou um aumento no número de células GC-1 positivas para PI e uma proporção reduzida de células viáveis no grupo sh-lncRNA (Figura 2D, E). A taxa de apoptose das células GC-1 foi marcadamente aumentada após a inibição do lncRNA NONMMUT031883.2 (Figura 2F, G). A taxa de células positivas para TUNEL também foi significativamente elevada no grupo sh-lncRNA, indicando ainda mais aumento da apoptose (Figura 2H, I). Além disso, a inibição do lncRNA NONMMUT031883.2 aumentou significativamente a atividade da caspase-3 nas células GC-1 (Figura 2J). No grupo sh-lncRNA, a expressão de Bax foi marcadamente aumentada, a expressão de Bcl-2 foi reduzida e a razão caspase-3 clivada/caspase-3 foi significativamente elevada (Figura 2K, L). Esses resultados indicam que a inibição do lncRNA NONMMUT031883.2 induz apoptose nas células GC-1. Todos os dados quantificados foram obtidos com n = 6.

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Figura 2: A redução do lncRNA NONMMUT031883.2 induz apoptose em espermatogônias. (A) Análise por reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) da expressão do lncRNA NONMMUT031883.2 em células GC-1. (B) Ensaio com o Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8) para avaliar a viabilidade das células GC-1 após a redução do lncRNA NONMMUT031883.2. (C) Liberação de lactato desidrogenase (LDH) pelas células GC-1 após a redução do lncRNA NONMMUT031883.2. (D, E) Coloração com Calceína-AM/iodeto de propídio (PI) para avaliar a sobrevivência das células GC-1 (20×; barra de escala, 100 µm). (F, G) Análise por citometria de fluxo da apoptose após a redução do lncRNA NONMMUT031883.2. (H, I) Análise por marcação de extremidades de quebra de DNA com transferase de desoxinucleotidil dUTP (TUNEL) em células GC-1 (40×; barra de escala, 50 µm). (J) Atividade da caspase-3 após a redução do lncRNA NONMMUT031883.2. (K, L) Análise por Western blot da expressão de Bcl-2, Bax, caspase-3 e caspase-3 clivada após a transfeção com sh-lncRNA. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão; n = 6. ***p < 0,001 em comparação com sh-NC. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

O lncRNA NONMMUT031883.2 interage com QKI-5
A interação entre o lncRNA NONMMUT031883.2 e QKI-5 foi examinada para elucidar o mecanismo molecular subjacente à apoptose de espermatogônias. Após a separação das frações nucleares e citoplasmáticas, a análise por qRT-PCR mostrou que o lncRNA NONMMUT031883.2 estava principalmente localizado nos núcleos das células GC-1 (Figura 3A). A análise por imunofluorescência mostrou que QKI-5 também estava concentrado no núcleo, fornecendo uma base espacial para a interação entre o lncRNA NONMMUT031883.2 e QKI-5 (Figura 3B). A meia-vida do lncRNA NONMMUT031883.2 foi medida após tratamento com actinomicina D para avaliar se QKI-5 regulava a estabilidade do lncRNA. O silenciamento de QKI-5 não teve efeito significativo sobre a meia-vida do transcrito do lncRNA (Figura 3C). Após a inibição da síntese proteica por cicloeximida, o silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2 não alterou a expressão proteica de QKI-5 (Figura 3D, E). A eficiência de captura da sonda antissenso marcada com biotina direcionada ao lncRNA NONMMUT031883.2 foi então avaliada por qRT-PCR. A sonda antissenso enriqueceu eficientemente o lncRNA-alvo e, portanto, foi utilizada no ensaio subsequente de precipitação de RNA (Figura 3F). A precipitação de RNA seguida de Western blotting revelou uma interação física específica entre o lncRNA NONMMUT031883.2 e QKI-5 (Figura 3G, H). Esses resultados indicam que o lncRNA NONMMUT031883.2 e QKI-5 colocalizam-se nos núcleos das células GC-1 e interagem especificamente. Os dados quantitativos da Figura 3C e da Figura 3D, F foram obtidos com n = 3, e os demais dados quantitativos foram obtidos com n = 6.

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Figura 3: O lncRNA NONMMUT031883.2 interage com QKI-5. (A) Análise por qRT-PCR da distribuição nuclear e citoplasmática do lncRNA NONMMUT031883.2 em células GC-1. (B) Análise por imunofluorescência da localização subcelular de QKI-5 em células GC-1 (40×; barra de escala, 50 µm). (C) Análise por qRT-PCR da meia-vida do lncRNA NONMMUT031883.2 após tratamento com actinomicina D e silenciamento de QKI-5 (n = 3). (D, E) Análise por Western blot da expressão proteica de QKI-5 após tratamento com cicloheximida e silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) Validação por qRT-PCR da eficiência de enriquecimento da sonda antissenso marcada com biotina direcionada ao lncRNA NONMMUT031883.2. (G, H) Análise de RNA pull-down e Western blot da interação entre o lncRNA NONMMUT031883.2 e QKI-5. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão; n = 6. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

A inibição do QKI-5 inibe a apoptose de espermatogônias por meio da supressão da via de sinalização p38 MAPK
Foi examinado o papel do QKI-5 e da via p38 MAPK downstream na apoptose de espermatogônias. Após transfeção com si-QKI-5, os níveis proteicos de QKI-5 foram significativamente reduzidos em células GC-1, confirmando a eficácia da inibição (Figura 4A, B). A inibição do lncRNA NONMMUT031883.2 aumentou significativamente a razão p-p38/p38, enquanto a inibição simultânea de QKI-5 reduziu essa razão, indicando inibição da ativação da via p38 MAPK (Figura 4C, D). A inibição de QKI-5 atenuou os danos nas células GC-1 provocados pela inibição do lncRNA NONMMUT031883.2, enquanto o tratamento com o indutor de apoptose etoposídeo reduziu significativamente a viabilidade celular (Figura 4E). A inibição de QKI-5 reduziu significativamente a taxa de apoptose nas células GC-1, enquanto o tratamento com etoposídeo aumentou acentuadamente a apoptose (Figura 4F, G). A transfeção com si-QKI-5 também reduziu significativamente a atividade da caspase-3, enquanto o tratamento com etoposídeo aumentou a atividade da caspase-3 (Figura 4H). A inibição de QKI-5 reduziu a expressão de Bax, aumentou a expressão de Bcl-2 e diminuiu significativamente a razão caspase-3 clivada/caspase-3, enquanto o tratamento com etoposídeo reverteu esses perfis de expressão (Figura 4I, J). Esses resultados indicam que a inibição de QKI-5 suprime a apoptose em espermatogônias GC-1 por meio da inibição da via p38 MAPK. Todos os dados quantificados foram obtidos com n = 6.

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Figura 4: A supressão de QKI-5 inibe a apoptose de espermatogônias por meio da inibição da via de sinalização p38 MAPK. (A, B) Análise por Western blot da expressão de QKI-5 em células GC-1 após transfeção com si-NC ou si-QKI-5. (C, D) Análise por Western blot da expressão de p38 fosforilada (p-p38) e p38 total. (E) Análise CCK-8 da viabilidade celular de células GC-1 nos diferentes grupos tratados. (F, G) Análise citométrica de fluxo da apoptose após tratamento com etoposídeo. (H) Atividade da caspase-3 nos diferentes grupos tratados. (I, J) Análise por Western blot da expressão de Bax, Bcl-2, caspase-3 e caspase-3 clivada em células GC-1. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão; n = 6. ***p < 0,001 versus si-NC ou sh-NC; ###p < 0,001 versus sh-lncRNA; &&&p < 0,001 versus sh-lncRNA + si-QKI-5. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

YC inibe a apoptose de espermatogônias por meio da via da lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
Após o tratamento de células GC-1 com soro contendo YC por 6, 12 e 24 h, a viabilidade celular aumentou progressivamente com o aumento das concentrações de YC e com o prolongamento do tempo de exposição. Portanto, essas concentrações foram selecionadas para experimentos subsequentes, com uma duração de tratamento de 24 h (Figura 5A). O tratamento com YC por 24 h aumentou significativamente o nível transcricional da lncRNA NONMMUT031883.2 em células GC-1 (Figura 5B) e potencializou sua capacidade de ligação ao QKI-5 (Figura 5C, D). Após o tratamento com YC, a expressão de QKI-5 e a razão p-p38/p38 foram notavelmente reduzidas nas células GC-1, sugerindo inibição da via p38 MAPK (Figura 5E, F). O tratamento com YC também reduziu acentuadamente a taxa de apoptose (Figura 5G, H), diminuiu a atividade da caspase-3 (Figura 5I), aumentou a expressão de Bcl-2 e reduziu a expressão de Bax e a razão caspase-3 clivada/caspase-3 (Figura 5J, K).

Para avaliar ainda mais a especificidade da via, células GC-1 foram transfectadas com OE-NC ou OE-QKI-5. A expressão da proteína QKI-5 aumentou significativamente nas células transfectadas com OE-QKI-5, confirmando a superexpressão bem-sucedida (Figura 5L, M). A supressão do lncRNA NONMMUT031883.2 reduziu significativamente a viabilidade celular, enquanto o tratamento com YC reverteu esse efeito. A superexpressão de QKI-5 atenuou o efeito citoprotetor do YC (Figura 5N). O tratamento com YC também reduziu a apoptose induzida pela supressão do lncRNA NONMMUT031883.2 (Figura 5O, P), diminuiu a atividade da caspase-3 (Figura 5Q), reduziu a expressão de Bax, aumentou a expressão de Bcl-2 e diminuiu a razão caspase-3 clivada/caspase-3 total (Figura 5R, S). Em contraste, a superexpressão de QKI-5 atenuou os efeitos antiapoptóticos do YC. Esses resultados indicam que o YC regula positivamente o lncRNA NONMMUT031883.2 e promove sua ligação ao QKI-5, inibindo, assim, a via p38 MAPK e suprimindo a apoptose em células GC-1. Todos os dados quantificados foram obtidos com n = 6.

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Figura 5: YC inibe a apoptose de espermatogônias via a via da lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Análise de viabilidade celular de GC-1 pelo CCK-8 após exposição ao soro contendo Cápsula Yangjing (YC) por 6, 12 e 24 h. (B) Análise de qRT-PCR da expressão da lncRNA NONMMUT031883.2 em células GC-1 após 24 h de tratamento com YC. (C, D) Análise de precipitação de RNA da ligação do lncRNA NONMMUT031883.2 à QKI-5 após tratamento com YC. (E, F) Análise por Western blot da expressão de QKI-5, p-p38 e p38 após tratamento com YC. (G, H) Análise citométrica de fluxo da apoptose em células GC-1 após tratamento com YC. (I) Atividade da caspase-3 após o tratamento com YC. (J, K) Análise por Western blot da expressão de Bcl-2, Bax, caspase-3 e caspase-3 clivada após o tratamento com YC. (L, M) Análise por Western blot da expressão de QKI-5 após transfeção com OE-NC ou OE-QKI-5. (N) Análise da viabilidade celular de GC-1 por CCK-8. (O, P) Análise citométrica de fluxo da apoptose em células GC-1 após superexpressão de QKI-5. (Q) Atividade da caspase-3 após superexpressão de QKI-5 (R, S) Análise por Western blot da expressão de Bax, Bcl-2, caspase-3 e caspase-3 clivada após superexpressão de QKI-5. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão; n = 6. ***p < 0,001 versus controle; ###p < 0,001 versus sh-lncRNA; &&&p < 0,001 versus sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

YC melhora a disfunção espermatogênica induzida por CP em camundongos
Os efeitos protetores do YC foram avaliados em camundongos com disfunção espermatogênica. Os testículos e as epidídimos dos camundongos do grupo CP apresentaram atrofia acentuada, volume reduzido e aparência opaca. Após o tratamento com diferentes doses de YC, a morfologia, a plenitude e a cor dos órgãos reprodutivos foram gradualmente melhoradas (Figura 6A). Os pesos relativos dos testículos e das epidídimos aumentaram significativamente, com o maior efeito observado no grupo tratado com YC de 800 mg/kg (Figura 6B, C).

A taxa de deformidade espermática foi significativamente aumentada no grupo CP, com anormalidades frequentes incluindo distorção da cabeça, encurvamento da cauda e danos estruturais. O número e a motilidade espermáticos também foram acentuadamente reduzidos. Após o tratamento com YC, a morfologia espermática melhorou (Figura 6D), o número espermático aumentou (Figura 6E) e a motilidade espermática foi significativamente aprimorada (Figura 6F). Experimentos de acasalamento mostraram que a fertilidade e o tamanho da ninhada foram acentuadamente reduzidos no grupo CP, enquanto o tratamento com YC melhorou a fertilidade (Figura 6G). Os níveis séricos de testosterona, hormônio folículo-estimulante e hormônio luteinizante também foram acentuadamente reduzidos no grupo CP e aumentaram após o tratamento com YC (Figura 6H-J). Esses achados indicam que o YC melhora a atrofia dos órgãos reprodutores, a qualidade espermática, a fertilidade e a secreção de hormônios sexuais em camundongos com disfunção espermatogênica. Os dados quantitativos da Figura 6G foram obtidos com n = 9, e o restante dos dados quantitativos foi obtido com n = 6.

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Figura 6: O YC melhora a disfunção espermatogênica induzida pelo CP em camundongos. (A-C) Morfologia dos órgãos reprodutivos nos grupos controle, ciclofosfamida (CP) e tratamento com YC (A), índice testicular (B) e índice do epidídimo (C). (D-F) Morfologia espermática (D) (40×; barra de escala, 50 µm), densidade espermática (E) e motilidade espermática (F). (G) Fertilidade masculina avaliada por experimentos de acasalamento (n = 9). (H-J) Níveis séricos de hormônio folículo-estimulante (FSH), testosterona e hormônio luteinizante (LH) medidos por meio de kits de ensaio imunoenzimático. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão; n = 6. ***p < 0,001 versus controle; #p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 versus CP. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

YC melhora os danos histopatológicos testiculares em camundongos com disfunção espermatogênica
O efeito reparador do YC sobre os danos no tecido testicular foi avaliado por meio de coloração histológica. A coloração com hematoxilina e eosina mostrou estrutura tecidual íntegra, camadas celulares distintas e número adequado de células no grupo controle. Em contraste, o grupo CP apresentou acentuada atrofia dos túbulos seminíferos e desorganização estrutural, redução no número de células e colapso da luz do epidídimo. Após o tratamento com YC, os danos testiculares e epididimários foram reduzidos, a estrutura dos túbulos seminíferos foi progressivamente restaurada e as células tornaram-se mais ordenadas e aumentaram em número (Figura 7A, B).

A proporção de células positivas para TUNEL no tecido testicular foi significativamente aumentada no grupo CP e significativamente reduzida após o tratamento com YC (Figura 7C, D). A expressão de Bax e a razão caspase-3 clivada/caspase-3 foram notavelmente aumentadas no grupo CP, enquanto a expressão de Bcl-2 foi reduzida. O tratamento com YC reverteu esses padrões de expressão (Figura 7E, F). A análise por imunofluorescência mostrou que a intensidade de fluorescência de Ki67 foi acentuadamente reduzida no grupo CP e significativamente aumentada após o tratamento com YC, sugerindo a restauração da proliferação das células espermatogênicas (Figura 7G, H). Esses achados sugerem que o YC reduz os danos histopatológicos induzidos pelo CP nos testículos e epidídimos, inibe a apoptose excessiva e promove a proliferação das células espermatogênicas. Todos os dados quantificados foram obtidos com n = 6.

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Figura 7: O YC melhora os danos histopatológicos induzidos pelo CP no tecido testicular de camundongos. (A, B) Coloração com hematoxilina e eosina (HE) dos testículos (A) e epidídimos (B) após tratamento com YC (20×; barra de escala, 100 µm). (C, D) Análise TUNEL da apoptose no tecido testicular de camundongos (40×; barra de escala, 50 µm). (E, F) Análise por Western blot da expressão de Bax, Bcl-2, caspase-3 e caspase-3 clivada no tecido testicular após tratamento com YC. (G, H) Análise por imunofluorescência da expressão de Ki67 no tecido testicular de camundongos (40×; barra de escala, 50 µm). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão; n = 6. ***p < 0,001 versus controle; p < 0,001 versus CP. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

YC melhora a disfunção espermatogênica e os danos patológicos testiculares em camundongos por meio de a via lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
A participação da via lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK nos efeitos do YC foi avaliada mais aprofundadamente. A expressão do lncRNA NONMMUT031883.2 foi significativamente reduzida no tecido testicular de camundongos do grupo CP, enquanto a expressão de QKI-5 e a razão p-p38/p38 foram acentuadamente aumentadas (Figura 8A-D). Após o tratamento com YC, a expressão da lncRNA NONMMUT031883.2 aumentou, enquanto a expressão de QKI-5 e a razão p-p38/p38 diminuíram.

Para avaliar ainda mais a especificidade da via, o lncRNA NONMMUT031883.2 foi silenciado em camundongos utilizando sh-lncRNA. O nível de expressão do lncRNA NONMMUT031883.2 foi significativamente reduzido, confirmando o silenciamento eficaz (Figura 8E). Após o silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2, o nível de QKI-5 no tecido testicular não apresentou alteração significativa, mas o nível de p-p38/p38 foi significativamente aumentado (Figura 8F, G). O tratamento com sh-lncRNA atenuou os efeitos do YC em 800 mg/kg, resultando na redução da expressão do lncRNA NONMMUT031883.2 no tecido testicular (Figura 8H) e no aumento dos níveis de p-p38/p38 (Figura 8I, J). O tratamento com YC aumentou significativamente a contagem e a motilidade dos espermatozoides após a indução com CP, enquanto o silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2 atenuou esses efeitos (Figura 8K, L). O tratamento com YC também aumentou os níveis de testosterona, hormônio folículo-estimulante e hormônio luteinizante no grupo CP, enquanto o silenciamento do lncRNA atenuou esses efeitos (Figura 8M-O).

A coloração com hematoxilina e eosina mostrou que YC melhorou os danos testiculares induzidos por CP, incluindo atrofia dos túbulos seminíferos e desorganização do arranjo das células espermatogênicas. O silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2 atenuou esses efeitos protetores (Figura 8P). Após o tratamento com YC, a expressão de Bax e a razão entre caspase-3 clivada e caspase-3 foram reduzidas, enquanto a expressão de Bcl-2 foi aumentada. O silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2 reverteu esses efeitos sobre as proteínas relacionadas à apoptose (Figura 8Q, R). Esses achados indicam que YC melhora a qualidade espermática e reduz os danos no tecido testicular após a indução por CP por meio da upregulação do lncRNA NONMMUT031883.2, da downregulação de QKI-5 e da inibição da via p38 MAPK. Todos os dados quantificados foram obtidos com n = 6.

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Figura 8: YC melhora a espermatogênese e reduz os danos histopatológicos testiculares por meio da via da lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Análise por qRT-PCR da expressão da lncRNA NONMMUT031883.2 em tecido testicular de camundongo. (B-D) Análise por Western blot da expressão de QKI-5, p-p38 e p38 em tecido testicular de camundongo após tratamento com YC. (E) Validação por qRT-PCR da silenciamento da lncRNA NONMMUT031883.2 em tecido testicular de camundongo após administração de sh-lncRNA. (F, G) Análise por Western blot dos níveis de QKI-5 e p-p38/p38 no tecido testicular dos camundongos após o silenciamento da lncRNA NONMMUT031883.2. (H) Análise por qRT-PCR da expressão da lncRNA NONMMUT031883.2 em tecido testicular de camundongo após tratamento com YC e administração de sh-lncRNA. (I, J) Análise por Western blot da expressão de p-p38 e p38 em tecido testicular de camundongo. (K, L) Contagem de espermatozoides (K) e motilidade espermática (L) nos diferentes grupos de tratamento. (M-O) Os níveis séricos de FSH, testosterona e LH foram medidos utilizando kits de ensaio imunoenzimático (ELISA). (P) Coloração com HE de tecido testicular de camundongos tratados com CP (20×; barra de escala, 100 µm). (Q, R) Análise por Western blot da expressão de Bcl-2, Bax, caspase-3 clivada e caspase-3 em tecido testicular de camundongo. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão; n = 6. ***p < 0,001 em comparação com o controle; p < 0,001 em comparação com CP; p < 0,001 em comparação com YC 800 mg/kg + sh-NC. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Disponibilidade de Dados:
Os dados brutos que apoiam os achados deste estudo são fornecidos como Arquivo Suplementar 1.

Arquivo Suplementar 1: Dados originais. Este arquivo Excel contém os dados numéricos brutos que fundamentam as análises quantitativas apresentadas nas Figuras 2–8. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A disfunção espermatogênica adquirida induzida por quimioterapia é uma causa importante de infertilidade masculina32,33,34. No entanto, os mecanismos moleculares específicos ainda não são completamente compreendidos. Os achados deste estudo demonstram que a Cápsula Yangjing (YC) melhora de maneira dependente da dose as anormalidades hormonais sexuais induzidas pelo ciclofosfamida (CP), os danos histopatológicos testiculares e a redução da fertilidade em camundongos machos. Essas melhorias estiveram associadas à superexpressão da lncRNA NONMMUT031883.2 e à inibição da via QKI-5/p38 MAPK, sugerindo que a YC pode atuar por meio desse eixo para reduzir a apoptose anormal de espermatogônias.

A toxicidade reprodutiva do CP tem sido amplamente documentada. Seu metabólito acroleína pode se acumular no tecido testicular e induzir apoptose de células germinativas por meio de estresse oxidativo, danos ao DNA e outras vias. As espermatogônias, como células iniciais da espermatogênese, são particularmente sensíveis aos efeitos citotóxicos do CP35,36. Cao et al. descobriram que a sinalização do ponto de verificação de danos ao DNA estava significativamente enriquecida no tecido testicular de pacientes com azoospermia após quimioterapia com CP, enquanto genes associados ao desenvolvimento espermático foram significativamente subregulados e a integridade estrutural dos túbulos seminíferos foi comprometida37. A Bcl-2 é uma proteína antiapoptótica que atua pela manutenção da integridade da membrana mitocondrial38. A Bax é uma proteína pró-apoptótica, e sua superexpressão pode promover a liberação de citocromo c das mitocôndrias para o citoplasma, ativar a cascata de caspases e induzir apoptose39,40. Saleh et al. demonstraram que a exposição ao CP causou atrofia dos túbulos seminíferos e edema intersticial em camundongos, acompanhada de subregulação da Bcl-2 e superexpressão da Bax, resultando, por fim, na redução da contagem e da motilidade espermáticas41. Portanto, a inibição da apoptose excessiva de espermatogônias induzida pelo CP pode representar um alvo importante para a proteção da função reprodutiva após a quimioterapia. No presente estudo, a intervenção com YC reduziu de maneira dependente da dose as anormalidades na secreção sérica de hormônios sexuais induzidas pelo CP, reparou os danos aos túbulos seminíferos e melhorou a motilidade espermática e a fertilidade masculina. O YC também aumentou a expressão de Bcl-2 e reduziu a expressão de Bax, a razão clivada caspase-3/caspase-3 e o número de células positivas para TUNEL no tecido testicular. In vitro, o soro contendo YC reduziu acentuadamente a apoptose de células GC-1 e aumentou a viabilidade celular, reforçando ainda mais um efeito inibitório sobre a apoptose de espermatogônias.

Os RNAs não codificantes longos (lncRNAs) desempenham importantes papéis regulatórios em processos fisiológicos e patológicos, incluindo a espermatogênese e a apoptose de células germinativas42,43. A expressão anormal de lncRNAs pode prejudicar a função espermatogênica testicular por meio da regulação do estresse oxidativo e das vias apoptóticas, representando um importante mecanismo molecular da infertilidade masculina44. Wang et al. descobriram que o lncRNA DNM3OS regula o eixo miR-214-5p/E2F2, resultando na redução da atividade das células espermatogoniais e no aumento da apoptose e senescência, contribuindo, por fim, para a azoospermia não obstrutiva45. Pesquisas anteriores também demonstraram que o silenciamento do lncRNA NONMMUT074098.2 em espermatogônias induz a apoptose25. Esses estudos indicam que os lncRNAs são reguladores importantes da apoptose espermatogonial e da espermatogênese. No presente estudo, o silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2 induziu a apoptose espermatogonial. Sua expressão foi significativamente reduzida no tecido testicular de camundongos após a indução com CP, enquanto a intervenção com YC restaurou parcialmente sua expressão. Além disso, a intervenção com YC atenuou a apoptose espermatogonial anormal induzida pelo silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2, sugerindo que o efeito protetor do YC pode estar associado à regulação desse lncRNA.

A QKI-5 é uma proteína ligadora de RNA pertencente à família STAR e participa de diversos processos fisiológicos e patológicos ao regular o splicing, a estabilidade e a eficiência traducional do mRNA alvo46,47. Pesquisas anteriores estabeleceram que a QKI-5 é um regulador importante no sistema reprodutivo e que sua expressão anormal pode promover a apoptose de células germinativas e prejudicar a função espermática por meio da ativação da via p38 MAPK a jusante25. Li et al. descobriram que a inibição da ativação da via p38 MAPK reduziu os danos ao tecido testicular induzidos pelo CP e restaurou a função da barreira hemato-testicular em ratos48. Esses achados sugerem que o eixo QKI-5/p38 MAPK pode ser uma via importante no controle da apoptose de espermatogônias e um alvo potencial para o tratamento da disfunção espermatogênica. No presente estudo, a expressão de QKI-5 e a fosforilação de p38 foram significativamente aumentadas no tecido testicular de camundongos após a indução pelo CP, enquanto a intervenção com YC reduziu a expressão de QKI-5 e a ativação da via p38 MAPK. O lncRNA NONMMUT031883.2 ligou-se diretamente à QKI-5, enquanto a expressão de QKI-5 não afetou a estabilidade do lncRNA, sugerindo que o lncRNA NONMMUT031883.2 pode regular a função da QKI-5 por interação direta. O silenciamento de QKI-5 atenuou os danos às células GC-1 causados pelo silenciamento do lncRNA NONMMUT031883.2, enquanto a superexpressão de QKI-5 reduziu os efeitos protetores do YC sobre as células GC-1. Li et al. relataram que o lncRNA NONMMUT074098.2 regula a apoptose de células germinativas ao se ligar à QKI-525. Os achados atuais mostram que o lncRNA NONMMUT031883.2 também se liga à QKI-5 e está envolvido na regulação da apoptose de espermatogônias. Em conjunto, esses dados sugerem que o YC pode aumentar a expressão do lncRNA NONMMUT031883.2, inibir a via QKI-5/p38 MAPK, reduzir a apoptose anormal de espermatogônias e aliviar a disfunção espermatogênica induzida pelo CP. Contudo, deve-se observar que o YC é uma formulação herbácea multicomponente que provavelmente atua sobre múltiplos alvos. Outros mecanismos, como efeitos antioxidantes diretos dos componentes do YC, modulação de outras vias de sinalização ou regulação epigenética independente do eixo lncRNA-QKI-5, não podem ser descartados e podem contribuir para os efeitos protetores observados.

Várias limitações devem ser reconhecidas. O estudo foi conduzido apenas em um modelo murino e na linhagem celular GC-1, e não incluiu validação com amostras clínicas de pacientes com infertilidade. A espermatogênese é um processo complexo, e o ciclo completo de espermatogênese em camundongos dura aproximadamente 35 dias49,50. O regime de 30 dias de YC utilizado neste estudo não cobriu um ciclo completo de espermatogênese. Portanto, estudos futuros que empreguem protocolos de intervenção de ≥35 dias são necessários para avaliar sistematicamente os efeitos terapêuticos do YC ao longo de todo o ciclo espermatogênico. Além disso, os eventos moleculares precisos após a ligação do lncRNA NONMMUT031883.2 à QKI-5, como alterações na atividade de splicing da QKI-5 e sua localização subcelular, bem como o reconhecimento e regulação de alvos de splicing downstream, permanecem por ser explorados. Ademais, embora o tratamento com YC tenha aumentado a expressão do lncRNA NONMMUT031883.2, os fatores de transcrição upstream e os mecanismos epigenéticos permanecem por ser elucidados. Estudos futuros que incorporem análise de promotor e ensaios de imunoprecipitação da cromatina são necessários para esclarecer a base molecular da expressão induzida por YC do lncRNA NONMMUT031883.2. Além disso, estudos futuros devem avaliar os efeitos do YC em pacientes com infertilidade masculina associada à quimioterapia e analisar a expressão do lncRNA NONMMUT031883.2 no tecido testicular ou no sêmen, a fim de determinar seu valor clínico potencial como marcador diagnóstico ou terapêutico.

Em conclusão, o YC regula positivamente o lncRNA NONMMUT031883.2 e inibe a ativação da via QKI-5/p38 MAPK, reduzindo assim a apoptose de espermatogônias e os danos testiculares e aliviando a disfunção espermatogênica em camundongos. Esses achados esclarecem o mecanismo molecular subjacente aos efeitos protetores do YC contra a disfunção espermatogênica e ampliam o entendimento atual sobre os papéis do lncRNA NONMMUT031883.2 e da via QKI-5/p38 MAPK na regulação da espermatogênese. O lncRNA NONMMUT031883.2 e o QKI-5 podem representar alvos terapêuticos potenciais para a disfunção espermatogênica masculina.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesses financeiros ou não financeiros.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº do convênio 82374257), pelo Quarto Lote do Programa de Formação de Talentos Acadêmicos de Excelência do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Jiangsu (nº do convênio k2026yrc74) e pelos Projetos de Pesquisa Científica em Medicina Chinesa Tradicional e em Medicina Integrada Chinesa e Ocidental da Província de Jiangsu (nº do convênio CYTF2026019).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Actinomicina DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUAHY-17559Inibidor da transcrição utilizado em ensaios de estabilidade de RNA
Transcriptase reversa AMVTakara, Tóquio, Japão2621Enzima para síntese de DNA complementar
Kit de detecção de Anexina V-APC/PIBioLab Technology, Pequim, ChinaKFS191Kit para análise citométrica de apoptose
Meio de montagem antifadenteMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUAHY-K1042Meio de montagem para preservação de fluorescência
Anticorpo primário BaxAffinity Biosciences, OH, EUAAF0120Anticorpo primário para detecção de Bax
Kit BCAMacklin, Xangai, ChinaB917925Kit para determinação de concentração proteica
Anticorpo primário Bcl-2Affinity Biosciences, OH, EUAAF0769Anticorpo primário para detecção de Bcl-2
Albumina sérica bovinaBioLab Technology, Pequim, ChinaBTN131070Reagente bloqueador
Kit de detecção Calceína/PIBeyotime, Xangai, ChinaC2015MKit para coloração de células vivas/mortas
Kit de ensaio de atividade da caspase-3BioLab Technology, Pequim, ChinaQN2866Kit para medição da atividade da caspase-3
Anticorpo primário caspase-3Abcam, MA, EUAab184787Anticorpo primário para detecção de caspase-3
Reagente CCK-8MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUAHY-K0301Reagente para avaliação da viabilidade celular
Anticorpo primário caspase-3 clivadaAbcam, MA, EUAab32042Anticorpo primário para detecção de caspase-3 clivada
CicloeximidaMacklin, Xangai, ChinaH823111Inibidor da síntese proteica utilizado em ensaios de estabilidade proteica
CiclofosfamidaMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUAHY-17420Utilizada para induzir disfunção espermatogênica
Reagente DAPIBeyotime, Xangai, ChinaC1006Contracoloração nuclear
Meio DMEMWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNLM-302Meio de cultura celular para células GC-1
Solução de trabalho ECLSolarbio, Pequim, ChinaSW2030Substrato quimioluminescente para detecção de bandas proteicas
EtoposídeoMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUAHY-13629Agente indutor de apoptose
Citômetro de fluxoBD Biosciences, CA, EUABD FACSCaliburInstrumento para análise de apoptose
Software FlowJoBD Biosciences, CA, EUAv10.8Software para análise de dados de citometria de fluxo
Microscópio de fluorescênciaLeica, Heidelberg, AlemanhaDM3000Instrumento para imagem de fluorescência
Anticorpo secundário marcado com fluorescência IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB22303Anticorpo secundário para detecção por imunofluorescência
Kit ELISA para hormônio folículo-estimulanteHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E06871mKit para medição do hormônio folículo-estimulante sérico
Anticorpo primário GAPDHAffinity Biosciences, OH, EUAT0004Anticorpo de controle de carga para Western blotting
Células GC-1Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNL-302Linhagem celular de espermatogônias murinas
Sistema de imagem de géisJinpeng Analysis Instrument, Xangai, ChinaJP-2880Sistema de imagem para visualização de géis e blots
Sistema de imagem de géisInvitrogen, Carlsbad, CA, EUAiBright CL1500Sistema de imagem quimioluminescente para Western blots
Anticorpo secundário caprino anti-coelho IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB23303Anticorpo secundário para Western blotting
Solução de hematoxilinaBioLab Technology, Pequim, ChinaYT165Coloração nuclear para análise histológica
Solução de diferenciação com etanol e ácido clorídricoBeyotime, Xangai, ChinaC0163SReagente de diferenciação para coloração com hematoxilina
Software ImageJNational Institutes of Health, EUA1.54hSoftware para quantificação de imagens
Tampão de lise celular para IPBeyotime, Xangai, ChinaP0013Tampão de lise para imunoprecipitação e extração proteica
Anticorpo primário Ki67Affinity Biosciences, OH, EUAAF0198Anticorpo primário para detecção de Ki67
Kit de Citotoxicidade LDHBeyotime, Xangai, ChinaC0016Kit para medição da liberação de lactato desidrogenase e dano celular
Microscópio ópticoOlympus, Tóquio, JapãoCKX53Utilizado para contagem de espermatozoides e observação morfológica
Lipofectamina 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, EUAL3000001Reagente de transfeção
Leitor de microplacasMolecular Devices, CA, EUASpectraMax MiniInstrumento para medições de absorbância
Kit ELISA para hormônio luteinizante murinoHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E12770mKit para medição do hormônio luteinizante sérico
Kit ELISA para testosterona murinaHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E05101mKit para medição da testosterona sérica
Bálsamo neutroBioLab Technology, Pequim, ChinaQN1253Meio de montagem para seções histológicas
Anticorpo primário p38Affinity Biosciences, OH, EUAAF6456Anticorpo primário para detecção de p38 total
ParaformaldeídoMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUAHY-Y0333Fixador para células e tecidos
Kit PARISInvitrogen, Carlsbad, CA, EUAAM1921Kit para fracionamento de RNA nuclear e citoplasmático
Sistema de PCRABI, CA, EUAABI PRISM 7300Instrumento de PCR em tempo real
Anticorpo primário p-p38Affinity Biosciences, OH, EUAAF3455Anticorpo primário para detecção de p38 fosforilada
Solução de proteinase KBeyotime, Xangai, ChinaST532Reagente para permeabilização tecidual antes da coloração TUNEL
Membranas PVDFMillipore, MA, EUAISEQ00010Membranas para transferência proteica em Western blotting
Anticorpo primário QKI-5Abcam, MA, EUAab126742Anticorpo primário para detecção de QKI-5
Tampão de ligação de RNAInvitrogen, Carlsbad, CA, EUA65040DTampão para reações de ligação RNA-proteína
Tampão de carga SDSBeyotime, Xangai, ChinaP0286Tampão de carga de amostra para SDS-PAGE
Esferas magnéticas de estreptavidinaMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUAHY-K0208Esferas magnéticas para captura de sondas de RNA marcadas com biotina
Kit TB Green FAST qPCRTakara, Tóquio, JapãoCN830SKit de reagentes para PCR quantitativa
Triton X-100Macklin, Xangai, ChinaT824275Reagente de permeabilização
Reagente TRIzolInvitrogen, Carlsbad, CA, EUA15596018CNReagente para extração de RNA total
Solução de detecção TUNELBeyotime, Xangai, ChinaC1086Reagente para detecção de fragmentação de DNA
XilolMacklin, Xangai, ChinaX821391Reagente para remoção de parafina e clareamento tecidual

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