Efeitos Nefroprotetores do Etanol e do Fomepizol em um Modelo de Ratos Pré-tratados com Metotrexato de Intoxicação por Metanol

Resumo

Este estudo compara os efeitos nefroprotetores do etanol e da fomepizol em um modelo de ratos pré-tratados com metotrexato de intoxicação por metanol, projetado para reduzir a eliminação de formiato dependente de folato. Os desfechos renais foram avaliados por meio de medidas da função renal, biomarcadores de lesão renal, marcadores inflamatórios, biomarcadores relacionados ao estado redox e achados histopatológicos.

Resumo

A intoxicação por metanol causa acidose metabólica, lesão orgânica e morte; a lesão renal prediz desfechos adversos. O etanol e a fomepizol foram comparados em um modelo de ratos pré-tratados com metotrexato para intoxicação por metanol. Trinta ratos Wistar machos foram alocados em cinco grupos: Controle, metotrexato (MTX), MTX + Metanol, MTX + Metanol + Fomepizol e MTX + Metanol + Etanol (n = 6 por grupo). O MTX foi administrado por gavagem oral na dose de 0,3 mg/kg/dia nos dias 1–7. Os três grupos expostos ao metanol receberam 3 g/kg de metanol por gavagem oral no dia 8. A fomepizol foi administrada por via intraperitoneal na dose de 15 mg/kg 4 h após a administração do metanol, seguida por 10 mg/kg às 12, 24 e 36 h. O etanol foi administrado uma única vez por gavagem oral na dose de 0,5 g/kg 4 h após a administração do metanol. As amostras foram coletadas no dia 10. Nenhum desfecho primário foi definido prospectivamente. Foram avaliadas a função renal, lesão no homogenato renal, biomarcadores inflamatórios, biomarcadores relacionados ao estado redox derivados do sangue e achados histopatológicos. A análise de variância (ANOVA) revelou diferenças significativas entre os grupos nos níveis de cistatina C no homogenato renal (p = 0,003), interleucina-6 (IL-6; p = 0,013), molécula de lesão renal-1 (KIM-1; p = 0,017), ureia sérica (p = 0,017) e creatinina sérica (p < 0,001). O teste post hoc de Duncan mostrou valores menores para esses parâmetros em ambos os grupos com antídotos em comparação com o grupo MTX + Metanol. Não foram identificadas diferenças bioquímicas significativas entre os dois grupos com antídotos. Os escores histopatológicos foram menores nos grupos com antídotos. Embora a fomepizol tenha apresentado um padrão descritivo mais favorável, os achados não estabelecem sua superioridade em relação ao etanol. A heterogeneidade da variância, os testes múltiplos, os regimes de antídotos desiguais, a ausência de medidas toxicocinéticas e do equilíbrio ácido-base e o curto período de acompanhamento limitam a interpretação. Estudos futuros devem incluir medidas diretas de metanol e formiato, atividade da álcool desidrogenase citosólica renal, correlações com desfechos bioquímicos renais, períodos de acompanhamento mais longos e regimes de antídotos comparáveis.

Introdução

A intoxicação por álcool metílico (metanol) é uma emergência toxicológica importante associada a morbidade e mortalidade significativas em todo o mundo, particularmente após a ingestão de bebidas alcoólicas ilegais ou produzidas ilegalmente. Embora o metanol em si tenha toxicidade relativamente baixa, ele é predominantemente metabolizado no fígado pela desidrogenase do álcool (ADH) em formaldeído e, subsequentemente, em ácido fórmico; o acúmulo resultante de formiato pode causar acidose metabólica com lacuna aniónica elevada, neuropatia óptica e lesão multissistêmica.^1,2O formaldeído é um intermediário de curta duração, enquanto o acúmulo de formiato é considerado o principal fator contribuinte para a toxicidade por meio da inibição da citocromo oxidase mitocondrial, hipóxia celular e estresse oxidativo³. O diagnóstico precoce, a correção da acidose metabólica, a terapia antidótica e a hemodiálise são as principais abordagens terapêuticas para reduzir a mortalidade.².

Na intoxicação por metanol, as manifestações clínicas geralmente tornam-se evidentes após um período latente. Náusea, vômito, dor abdominal e leve depressão do sistema nervoso central podem ser seguidas por acidose metabólica com lacuna aniônica elevada, dispneia, alteração do estado mental e sintomas visuais^1,2. Desfoque visual, fotofobia, midríase, edema de disco óptico e, em casos graves, cegueira permanente estão entre os efeitos tóxicos mais característicos associados à inibição mediada por ácido fórmico da citocromo oxidase mitocondrial^1,2. As estratégias terapêuticas atuais incluem cuidados de suporte; correção da acidose metabólica com bicarbonato de sódio; suplementação com ácido folínico ou ácido fólico; inibição da desidrogenase do álcool com etanol ou fomepizol; e, em casos graves selecionados, hemodiálise para acelerar a eliminação de metanol e formiato^3,4. O fomepizol é cada vez mais considerado um antídoto de primeira linha devido à sua farmacocinética mais previsível, dosagem mais simples e menor risco de efeitos adversos; no entanto, o etanol permanece uma alternativa importante devido à sua disponibilidade e menor custo^4,5,6,7.

Embora a lesão do nervo óptico e do sistema nervoso central tenha tradicionalmente sido considerada a principal manifestação da toxicidade do metanol, o rim tem sido cada vez mais reconhecido como um órgão-alvo clinicamente relevante^8,9,10. Em coortes específicas de metanol, a lesão renal aguda (LRA) tem sido associada a acidose metabólica mais grave, insuficiência respiratória, falência múltipla de órgãos, ventilação mecânica, tratamento extracorpóreo, internação hospitalar prolongada e maior mortalidade intra-hospitalar; a depleção volêmica, sepse, rabdomiólise e pancreatite aguda também foram identificadas como fatores associados ao desenvolvimento de LRA^8,10. Na coorte relatada por Chang et al., a LRA manteve-se independentemente associada à mortalidade intra-hospitalar em uma análise multivariável; no entanto, o delineamento observacional retrospectivo não estabelece que a própria LRA tenha causado a mortalidade⁸. Assim, a LRA deve ser interpretada como um marcador de maior gravidade da doença e de pior prognóstico na intoxicação por metanol. Por outro lado, a revisão sistemática de Wang et al. avaliou os desfechos renais após envenenamento por álcoois tóxicos de forma mais ampla, principalmente metanol e etilenoglicol; portanto, suas conclusões não são exclusivamente específicas ao metanol⁹. Essa revisão identificou mortalidade substancial em curto prazo e lacunas importantes de evidência quanto à recuperação renal a longo prazo, diálise contínua e relato padronizado de desfechos renais⁹.

A relação entre a toxicidade do metanol e a LRA provavelmente é multifatorial. O acúmulo de metabólitos tóxicos pode contribuir por meio da inibição mitocondrial, hipóxia celular, acidose metabólica grave e desequilíbrio redox, enquanto fatores sistêmicos documentados em coortes clínicas — incluindo depleção volêmica, comprometimento hemodinâmico, rabdomiólise, sepse, insuficiência respiratória e disfunção de múltiplos órgãos — podem causar lesões renais adicionais^1,2,3,8,10. Essas vias fornecem conexões biológica e clinicamente plausíveis entre a intoxicação por metanol e a lesão renal. Distúrbios metabólicos renais podem resultar da exposição ao formato circulante, inibição mitocondrial, acidose metabólica e estresse hemodinâmico sistêmico. No entanto, a contribuição específica do metabolismo do álcool e do aldeído nos tecidos renais permanece incerta, pois as concentrações de metanol, formaldeído e formato, a atividade da ADH renal e a função mitocondrial não foram diretamente avaliadas no presente estudo.

Um grande desafio metodológico em estudos experimentais da toxicidade do metanol é que os ratos metabolizam o ácido fórmico mais rapidamente do que os humanos. Embora o acúmulo de ácido fórmico seja um determinante principal da toxicidade do metanol em humanos, alcançar acúmulo comparável e lesão orgânica consequente em ratos é mais difícil devido ao seu metabolismo de formato altamente eficiente e dependente de folato. Portanto, agentes que suprimem o metabolismo de folato são frequentemente utilizados em modelos experimentais de toxicidade do metanol^11,12. O pré-tratamento com metotrexato (MTX) foi utilizado para reduzir a depuração de formato dependente de folato em ratos, aumentando assim a suscetibilidade à toxicidade do metanol^11,12. O metotrexato por si só não induz toxicidade do metanol, e o modelo resultante não reproduz todos os aspectos do envenenamento humano por metanol. Como o metotrexato pode influenciar independentemente os desfechos renais, oxidativos e inflamatórios, um grupo somente com MTX foi incluído para caracterizar as alterações associadas ao pré-tratamento. Dentro dessas limitações, o modelo fornece uma plataforma pré-clínica controlada para comparar padrões de desfechos renais entre grupos experimentais que recebem o mesmo protocolo de pré-tratamento com metotrexato e exposição ao metanol, e para avaliar esses desfechos em níveis bioquímicos, inflamatórios, oxidativos e histopatológicos.

A inibição da álcool desidrogenase constitui a pedra angular do tratamento antídoto para a intoxicação por metanol. Os dois agentes mais comumente utilizados para esse fim na prática clínica são o etanol e a fomepizol (4-metilpirazol). O etanol suprime competitivamente a formação de metabólitos tóxicos devido à sua maior afinidade pela ADH em comparação com o metanol, enquanto o fomepizol, um inibidor potente e seletivo da ADH, impede diretamente a conversão do metanol em formaldeído e ácido fórmico^5,6. No entanto, não existe um consenso completo quanto à eficácia clínica comparativa, segurança, facilidade de administração e efeitos protetores sobre órgãos desses dois antídotos. O fomepizol é considerado vantajoso em muitos centros devido ao seu regime de dosagem padronizado, ausência da necessidade de monitoramento dos níveis séricos, inexistência de depressão do sistema nervoso central e propriedades farmacocinéticas mais previsíveis, enquanto a terapia com etanol está associada a potenciais desvantagens, incluindo hipoglicemia, hepatotoxicidade, alteração do estado mental e a necessidade de monitoramento intensivo^6,7. Por outro lado, comparações clínicas em larga escala sugeriram que os efeitos dos dois antídotos sobre mortalidade e desfechos clínicos podem ser semelhantes. No estudo de Zakharov et al., que avaliou casos de intoxicação em massa, nenhuma diferença significativa na sobrevida foi observada entre fomepizol e etanol⁵.

Apesar da importância prognóstica da lesão renal aguda (AKI) na intoxicação por metanol^8,9,10, a lesão renal recebeu consideravelmente menos atenção do que a toxicidade ocular e neurológica, e os efeitos renais comparativos do etanol e da fomepizol permanecem insuficientemente caracterizados. Uma avaliação focada nos rins, incorporando testes convencionais de função renal, biomarcadores precoces de lesão tubular, citocinas inflamatórias, parâmetros relacionados ao estado redox e histopatologia, é portanto justificada para determinar se as duas estratégias antidóticas estão associadas a padrões diferentes de desfechos renais. Além disso, este modelo controlado de ratos pré-tratados com metotrexato pode facilitar a avaliação pré-clínica de intervenções antidóticas candidatas, direcionadas aos rins e de suporte, sob condições experimentais definidas. O valor científico deste modelo reside na avaliação comparativa dentro de um contexto experimental agudo, e não na réplica direta da complexidade clínica e metabólica da intoxicação humana por metanol.

As diferenças no metabolismo do metanol entre roedores e humanos, juntamente com o uso de pré-tratamento farmacológico para reduzir a eliminação do formiato dependente de folato, continuam sendo limitações metodológicas importantes. Além disso, a toxicidade aguda induzida em condições experimentais pode não refletir plenamente as diferentes durações de exposição e condições clínicas associadas encontradas na prática clínica. Assim, os achados desse modelo animal devem ser considerados como evidências pré-clínicas preliminares e não devem ser usados diretamente para embasar decisões terapêuticas em humanos. É necessária a confirmação em estudos clínicos adequadamente delineados antes que conclusões clínicas possam ser estabelecidas. Nesse contexto, a principal lacuna de conhecimento é se o etanol e a fomepizol estão associados a diferentes padrões de desfechos renais nas medidas convencionais de função renal, biomarcadores de lesão tubular, citocinas inflamatórias, parâmetros relacionados ao estado redox e histopatologia em um modelo de rato pré-tratado com metotrexato. A hipótese do estudo foi que a inibição da desidrogenase alcoólica com etanol ou fomepizol estaria associada à atenuação da lesão renal, com possíveis diferenças entre os tratamentos nos domínios de desfecho avaliados. A nefroproteção foi definida operacionalmente como um padrão mais favorável de desfechos renais em comparação ao grupo MTX + Metanol. Esse padrão incluiu concentrações mais baixas de ureia e creatinina séricas; níveis renais mais baixos da molécula de lesão renal-1 (KIM-1), cistatina C, fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-1 beta (IL-1β); concentrações séricas mais baixas de malondialdeído (MDA); atividade sérica mais elevada de superóxido dismutase (SOD), níveis sanguíneos mais altos de glutationa reduzida (GSH) e atividade sanguínea mais elevada de catalase (CAT); e escores histopatológicos mais baixos para degeneração tubular, necrose tubular, lesão glomerular, congestão vascular, inflamação intersticial e fibrose. A nefroproteção não foi calculada como um único escore composto; ao invés disso, os desfechos individuais foram avaliados coletivamente ao longo desses domínios complementares. Assim, o estudo teve como objetivo comparar os efeitos do etanol e da fomepizol sobre a função renal, lesão tubular, inflamação, estado redox e histopatologia renal nesse modelo.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Local em Experimentos com Animais da Universidade Ahi Evran de Kırşehir (número da decisão de aprovação: 1, número da reunião: 12, data da aprovação: 12 de junho de 2025) e foram conduzidos de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Foram adotadas medidas ao longo do estudo para minimizar a dor e o sofrimento e para utilizar o menor número possível de animais.

Preparação dos reagentes
A metotrexato foi utilizada como agente de pré-tratamento para facilitar o estabelecimento do modelo experimental de toxicidade por metanol. Como a oxidação do formiato dependente de folato é mais eficiente em ratos do que em humanos, o pré-tratamento com metotrexato foi empregado para reduzir a depuração do formiato e aumentar a suscetibilidade à toxicidade por metanol; foi usado como uma intervenção para sensibilização do modelo, e não como substituto da exposição ao metanol^11,12. A metotrexato foi fornecida na forma de uma formulação de 500 mg/5 mL, correspondendo a uma concentração estoque de 100 mg/mL. A formulação foi diluída com solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% para obter uma concentração de trabalho final de 0,06 mg/mL. A solução de trabalho foi administrada por gavagem oral na dose de 5 mL/kg, correspondendo a uma dose de MTX de 0,3 mg/kg. Para ratos com peso corporal entre 200–220 g no início do estudo, o volume diário administrado variou de 1,00 a 1,10 mL por animal e foi calculado individualmente com base no peso corporal registrado no início do estudo. O peso corporal não foi reavaliado durante o período de pré-tratamento com MTX de 7 dias. A metotrexato foi administrada uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos (dias do estudo 1–7), e o metanol foi administrado no dia 8 do estudo, após a conclusão do protocolo de pré-tratamento com MTX. Esse regime foi consistente com modelos de pré-tratamento oral por gavagem com MTX previamente publicados¹³.

O metanol (pureza ≥99,8%) foi preparado recentemente no dia da administração como uma solução aquosa de trabalho a 20% (v/v) por diluição com água destilada estéril. A solução de trabalho foi preparada misturando 1 volume de metanol com 4 volumes de água destilada estéril. De acordo com modelos prévios de ratos tratados com metotrexato para intoxicação por metanol, uma dose única de metanol foi administrada aos Grupos 3–5 no dia 8 do estudo, na dose de 3 g/kg por gavagem oral. Nenhuma restrição de alimento ou água foi imposta antes da administração do metanol. O volume necessário para administração foi calculado individualmente com base no peso corporal de cada animal e foi de aproximadamente 18,9 mL/kg para a solução de metanol a 20%. Para um rato com peso aproximado de 220 g, essa dose correspondeu a 0,66 g de metanol e a um volume final de gavagem de aproximadamente 4,2 mL. Esse regime de exposição ao metanol foi escolhido para manter a comparabilidade com modelos publicados anteriormente de ratos tratados com metotrexato para toxicidade aguda por metanol^13,14,15.

A solução de trabalho de fomepizol foi preparada em solução estéril de cloreto de sódio a 0,9%, com concentração final de 10 mg/mL. Uma dose de ataque intraperitoneal de 15 mg/kg foi administrada 4 h após a administração de metanol, seguida por doses de manutenção intraperitoneais de 10 mg/kg às 12, 24 e 36 h. Na concentração de trabalho de 10 mg/mL, os volumes administrados foram de 1,5 mL/kg para a dose de ataque e 1,0 mL/kg para cada dose de manutenção. Para uma rata com peso corporal no início do estudo de aproximadamente 220 g, essas doses corresponderam a aproximadamente 0,33 mL para a dose de ataque e 0,22 mL para cada dose de manutenção. Todos os volumes administrados foram calculados com base no peso corporal registrado no início do estudo. As doses de ataque e de manutenção de fomepizol foram selecionadas com base em recomendações estabelecidas para o tratamento da intoxicação por metanol^1,6.

O etanol foi utilizado como tratamento comparador antidótico. O etanol absoluto (pureza ≥99,8%) foi diluído com água destilada estéril, misturando 1 volume de etanol absoluto com 4 volumes de água destilada estéril, para obter uma solução aquosa de trabalho final a 20% (v/v). Uma única dose de etanol foi administrada por gavagem oral na dose de 0,5 g/kg, 4 h após a administração de metanol; nenhuma dose de manutenção de etanol foi administrada. O volume de administração foi de aproximadamente 3,2 mL/kg. Para uma rata com peso corporal no início do estudo de aproximadamente 220 g, isso correspondeu a um volume final de gavagem de aproximadamente 0,70 mL. O volume de administração foi calculado utilizando o peso corporal registrado no início do estudo. A concentração de etanol, dose, via e momento da administração foram escolhidos com base em modelos prévios publicados de ratos pré-tratados com metotrexato, utilizando etanol como comparador antidótico^13,14.

Todas as soluções foram preparadas recentemente no dia da administração e foram inspecionadas quanto à aparência homogênea e ausência de material particulado visível. As administrações orais foram realizadas utilizando uma cânula de gavagem de aço inoxidável. Durante a gavagem, a cânula foi cuidadosamente avançada desde a cavidade oral até o esôfago, evitando-se regurgitação, vazamento oral, aspiração e dificuldade respiratória. As injeções intraperitoneais foram realizadas em condições assépticas, utilizando seringas e agulhas descartáveis estéreis. Todos os procedimentos relacionados ao preparo e à administração de produtos químicos foram conduzidos de acordo com as regulamentações institucionais de segurança em laboratório.

Animais experimentais, condições de alojamento e randomização
Um total de 30 ratos albinos machos da linhagem Wistar, com idade entre 8 e 12 semanas e peso de 220 ± 20 g, foram obtidos do Laboratório de Pesquisa com Animais Experimentais da Universidade Ahi Evran, em Kırşehir, Türkiye. Os ratos Wistar foram selecionados porque já foram amplamente utilizados em estudos experimentais de toxicidade e nefroproteção, permitindo comparação com estudos previamente publicados. Os animais foram mantidos a 24 ± 2 °C, sob ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Ração em pellets padrão e água da torneira foram fornecidas ad libitum durante todo o período experimental de 10 dias. Antes dos procedimentos experimentais, todos os animais passaram por um período de aclimatação de 7 dias.

Trinta ratos foram alocados em cinco grupos experimentais utilizando um procedimento computadorizado de alocação aleatória, com um objetivo de seis animais por grupo. Para cada rato, um número inteiro aleatório entre 1 e 5 foi gerado, e o animal foi atribuído ao grupo experimental correspondente. Assim que um grupo atingia seis animais, qualquer sorteio subsequente que identificasse esse grupo era descartado, e um novo número aleatório era gerado até que um grupo com vaga disponível fosse selecionado. Esse procedimento foi mantido até que os 30 ratos tivessem sido alocados, resultando em seis animais por grupo. O mesmo pesquisador gerou as atribuições aleatórias e implementou a alocação; não foi utilizado um operador de alocação separado. O grupo 1 (Controle) não recebeu tratamento com fármaco experimental, e os animais passaram pela mesma coleta programada de pontos terminais que os demais grupos. O grupo 2 (MTX) recebeu metotrexato por gavagem oral na dose de 0,3 mg/kg durante 7 dias. O grupo 3 (MTX + Metanol) recebeu metotrexato durante 7 dias, seguido de metanol na dose de 3 g/kg no oitavo dia do estudo. O grupo 4 (MTX + Metanol + Fomepizole) recebeu pré-tratamento com metotrexato seguido de metanol, com o início do tratamento com 4-metilpirazol 4 horas depois. O grupo 5 (MTX + Metanol + Etanol) recebeu pré-tratamento com metotrexato seguido de metanol, com administração de etanol 4 horas depois.

Os três grupos expostos ao metanol receberam o mesmo pré-tratamento com MTX e protocolo de administração de metanol, diferindo apenas quanto ao tratamento antidótico pós-exposição. A alocação dos grupos experimentais, o protocolo de administração, o momento do tratamento antidótico e o processo de coleta de amostras foram resumidos na Figura 1. Uma análise de poder a priori foi realizada para uma ANOVA de efeitos fixos com um fator e cinco grupos independentes. Assumindo um tamanho de efeito padronizado grande (f de Cohen = 0,70), um nível de significância de 0,05 e poder estatístico de 80%, o tamanho mínimo total da amostra necessário foi calculado como 30 animais, correspondendo a seis animais por grupo. O poder calculado para um tamanho total da amostra de 30 foi aproximadamente 80,9%. O tamanho de efeito assumido (f de Cohen = 0,70) foi especificado antes do experimento com base na expectativa dos pesquisadores de um grande efeito global entre grupos neste modelo de toxicidade aguda. Essa suposição baseou-se no julgamento dos pesquisadores, e não em uma estimativa derivada de dados piloto ou de um estudo prévio específico. Nenhum único desfecho primário foi designado prospectivamente para este estudo; o cálculo do tamanho da amostra baseou-se em um efeito global grande assumido em uma comparação abrangente entre os cinco grupos experimentais. Um desfecho primário não pode ser designado retrospectivamente como um ponto final especificado prospectivamente. Assim, o cálculo do tamanho da amostra não fornece poder adequado para cada desfecho individual ou para comparações pareadas.

Protocolo de intoxicação por metanol e tratamento antidótico
Após o período de aclimatação, os animais dos Grupos 2–5 receberam metotrexato uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos (dias do estudo 1–7). No dia do estudo 8, os animais dos Grupos 3–5 receberam uma dose única de solução de metanol a 20% na dose de 3 g/kg por gavagem oral. Nenhuma restrição de jejum ou de alimento e água foi imposta antes da administração do metanol.

No grupo MTX + Metanol + Fomepizol, uma dose de carga intraperitoneal de 15 mg/kg foi administrada 4 h após a administração de metanol, seguida por doses de manutenção intraperitoneais de 10 mg/kg às 12, 24 e 36 h após a administração de metanol. No grupo MTX + Metanol + Etanol, uma dose única de etanol foi administrada por gavagem oral na dose de 0,5 g/kg, 4 h após a administração de metanol; nenhuma dose de manutenção de etanol foi administrada. Os dois regimes antidóticos foram escolhidos para refletir as recomendações estabelecidas de dosagem de fomepizol e protocolos comparadores de etanol previamente publicados^1,6,13,14. Os regimes não foram projetados para fornecer tratamento com doses, vias ou exposições equivalentes. Portanto, o regime repetido de fomepizol por via intraperitoneal e a dose única de etanol por via oral constituíram uma comparação farmacológica desigual. A administração bem-sucedida por gavagem foi confirmada pela ausência de regurgitação, vazamento oral ou desconforto respiratório durante o procedimento. A administração intraperitoneal bem-sucedida foi confirmada pela ausência de vazamento, sangramento ou inchaço acentuado no local da injeção.

Após a administração, os animais foram monitorados regularmente quanto ao estado geral de saúde, mobilidade, ingestão de alimento, postura, aparência da pelagem e sinais de toxicidade. O esquema de tratamento foi planejado para permitir o início da formação de metabólitos tóxicos a partir do metanol, ao mesmo tempo que possibilita a avaliação dos efeitos protetores e terapêuticos dos agentes antidóticos.

Eutanásia, critérios éticos de interrupção e coleta de amostras
Durante todo o experimento, todos os animais foram avaliados diariamente quanto ao estado geral de saúde, ingestão de alimento e água, mobilidade e alterações comportamentais. Os critérios para pontos finais éticos foram previamente definidos como letargia acentuada, incapacidade de ingerir alimento ou água, perda severa de peso, mobilidade restrita, postura anormal, piloereção persistente ou sinais evidentes de sofrimento. Os animais que atendessem a qualquer um desses critérios deveriam ser submetidos à eutanásia humanitária. No entanto, nenhum animal atingiu os critérios pré-definidos de ponto final ético durante o estudo.

Todos os animais nos cinco grupos experimentais foram eutanasiados no dia 10 do estudo. Para os grupos MTX + Metanol, MTX + Metanol + Fomepizol e MTX + Metanol + Etanol, este ponto final correspondeu a 48 h após a administração única de metanol no dia 8 do estudo. O grupo Controle permaneceu sem tratamento até o dia 10 do estudo, enquanto o grupo apenas com MTX foi monitorado até o dia 10 após a conclusão do protocolo de administração de MTX por 7 dias. Assim, os cinco grupos tiveram a mesma duração total do estudo e passaram pela eutanásia e coleta de amostras no mesmo dia do estudo.

A cetamina e a xilazina foram usadas para induzir anestesia profunda. A profundidade da anestesia foi confirmada pela ausência do reflexo de retirada do pé. Após a obtenção da anestesia profunda, amostras de sangue foram coletadas por punção intracardíaca. Aproximadamente 3–5 mL de sangue foram obtidos utilizando uma seringa e agulha apropriadas. O sangue coletado para medição das concentrações séricas de ureia e creatinina, atividade sérica de SOD e concentração sérica de MDA foi transferido para tubos sem anticoagulante e deixado coagular completamente. O sangue destinado à medição do nível de GSH e atividade de CAT foi coletado separadamente em tubos contendo ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) e processado sem etapa de coagulação. Após a formação completa do coágulo, as amostras de soro foram centrifugadas a 3.000 × g durante 10–15 min a 4 °C. O soro separado foi armazenado a −80 °C até a análise. A separação bem-sucedida do soro foi confirmada pela aparência clara e não hemolisada. Após a coleta de sangue, a eutanásia foi concluída por exsanguinação sob anestesia profunda. Em seguida, foi realizada uma laparotomia mediana e ambos os rins foram cuidadosamente removidos. Após a remoção da gordura e dos tecidos conjuntivos ao redor, os rins foram lavados com solução salina fisiológica fria. As amostras de tecido foram divididas para análises histopatológicas e bioquímicas. As amostras destinadas ao exame histopatológico foram colocadas em formaldeído a 10% tamponado e neutro. As amostras destinadas às análises bioquímicas foram devidamente identificadas e armazenadas a −80 °C.

A coleta de amostras, as análises bioquímicas e as avaliações de desfecho foram realizadas por pesquisadores cegos em relação aos grupos experimentais. Nenhum animal foi excluído das análises.

Análises bioquímicas
A concentração sérica de ureia foi medida por meio de um ensaio cinético enzimático urease–desidrogenase do glutamato em um analisador bioquímico automatizado. A ureia foi hidrolisada pela urease para produzir amônia, que posteriormente reagiu com o 2-oxoglutarato e o nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (NADH) na presença da desidrogenase do glutamato. A diminuição da absorbância resultante do consumo de NADH foi medida cineticamente. A concentração sérica de creatinina foi medida colorimetricamente utilizando o mesmo analisador bioquímico automatizado.

A atividade da superóxido dismutase (SOD) sérica foi determinada utilizando um ensaio colorimétrico baseado na geração de radicais superóxido pelo sistema xantina–xantina oxidase e sua reação com cloreto de 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazólio para formar um produto colorido de formazano. A absorbância final foi medida a 505 nm. A concentração de malondialdeído (MDA) sérico foi determinada utilizando a reação com ácido tiobarbitúrico. As amostras séricas foram misturadas com ácido tricloroacético frio para precipitar as proteínas e centrifugadas a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C. O sobrenadante resultante foi misturado com volume igual de ácido tiobarbitúrico e incubado a 90 °C por 60 min. Os tubos de reação foram então resfriados em banho de água fria por 10 min, e a absorbância foi medida a 532 nm. As concentrações de MDA foram calculadas a partir da curva de calibração correspondente. O glutationa reduzido (GSH) foi medido em sangue anticoagulado com EDTA utilizando um método de Ellman modificado. Após a precipitação proteica com ácido tricloroacético, as amostras desproteinizadas foram reagidas com 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoico) em tampão Tris 500 mM a pH 8,2, e a absorbância foi medida a 412 nm. A atividade da catalase (CAT) foi medida em sangue anticoagulado com EDTA utilizando um ensaio colorimétrico de dois passos. As amostras foram incubadas com uma quantidade conhecida de peróxido de hidrogênio, e após a terminação da reação enzimática, o peróxido de hidrogênio residual foi medido utilizando um reagente cromogênico a 405 nm.

Como a atividade da SOD e a concentração de MDA foram medidas no soro, e o nível de GSH e a atividade da CAT foram medidos no sangue anticoagulado com EDTA em vez de homogenatos de tecido renal, a normalização desses parâmetros relacionados ao estado redox em relação à concentração total de proteína tecidual não foi aplicável. Para a interpretação do perfil de biomarcadores relacionados ao estado redox, concentrações mais elevadas de MDA no soro foram consideradas compatíveis com maior peroxidação lipídica, enquanto atividade sérica mais baixa da SOD, níveis sanguíneos reduzidos de GSH e atividade sanguínea diminuída da CAT foram considerados indicativos de capacidade antioxidante reduzida; alterações na direção oposta foram interpretadas como um perfil mais favorável relacionado ao estado redox.

Para medições de ensaio imunoenzimático (ELISA) em tecido renal, aproximadamente 50 mg de tecido renal armazenado a −80 °C foram homogeneizados em gelo em 500 µL de tampão de homogeneização contendo um coquetel de inibidores de protease, correspondendo a uma proporção fixa de tecido para tampão de 1:10 (p/v). Um homogeneado de tecido renal específico para cada animal foi preparado para cada rato. Amostras de animais diferentes foram processadas independentemente e não foram agrupadas em nenhuma etapa. Os homogeneados foram centrifugados a 14.000 × g durante 10 min a 4 °C, e o sobrenadante obtido de cada animal foi coletado separadamente e dividido em alíquotas para as análises planejadas de tecido renal. A concentração total de proteína não foi medida separadamente; portanto, os resultados do ELISA em tecido não foram normalizados em relação a ela. As concentrações finais calculadas a partir das curvas-padrão específicas para cada ensaio foram expressas em ng/L para TNF-α e IL-6 e em ng/mL para IL-1β, KIM-1 e cystatina C.

A molécula de lesão renal-1 (KIM-1) e a cistatina C foram avaliadas como biomarcadores de lesão renal, enquanto o fator de necrose tumoral-α (TNF-α), a interleucina-6 (IL-6) e a interleucina-1β (IL-1β) foram avaliados como marcadores inflamatórios renais. Os cinco analitos foram medidos em homogeneizados de tecido renal utilizando kits ELISA específicos para rato, conforme os protocolos dos fabricantes. Para os respectivos ensaios, as sensibilidades analíticas e as faixas de medição foram 2,51 ng/L e 5–1.000 ng/L para TNF-α, 0,052 ng/L e 0,1–40 ng/L para IL-6, 0,08 ng/mL e 0,2–60 ng/mL para IL-1β, 0,01 ng/mL e 0,05–10 ng/mL para KIM-1, e 0,25 ng/mL e 0,5–100 ng/mL para cistatina C, respectivamente. Antes da análise, todos os reagentes, padrões e sobrenadantes de tecido renal foram levados à temperatura ambiente. Curvas-padrão foram geradas separadamente para cada execução do ensaio, conforme as recomendações do fabricante. Padrões e sobrenadantes de tecido renal foram adicionados a poços pré-revestidos com anticorpos, seguidos pelo anticorpo de detecção biotinilado correspondente e conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano. As amostras e os reagentes do ELISA foram incubados por 1 h a 37 °C. Após cinco ciclos de lavagem utilizando um lavador automático de microplacas, as soluções de substrato A e B foram adicionadas e incubadas por 10 min a 37 °C. A reação colorimétrica foi interrompida com uma solução ácida de parada, e a absorbância foi medida a 450 nm. Para cada analito, os valores de absorbância corrigidos para branco foram convertidos em concentrações utilizando a curva-padrão específica do respectivo ensaio.

Todas as análises bioquímicas foram realizadas em condições padronizadas, e todas as amostras foram processadas utilizando os mesmos procedimentos. As medições de ELISA em tecido renal foram realizadas em duplicata. Para cada analito, a média das duas poças de réplica técnica foi calculada para obter um único valor por animal. As poças de réplica técnica e as alíquotas separadas obtidas do mesmo homogenato específico de animal não foram consideradas observações independentes. O animal individual foi considerado a unidade experimental, e um resultado por animal para cada parâmetro foi incluído na análise estatística.

Processamento histopatológico e pontuação de lesão renal
As amostras de tecido foram processadas para avaliação microscópica utilizando procedimentos histopatológicos padrão. Os tecidos renais foram fixados em formaldeído a 10% tamponado e neutro, à temperatura ambiente, por 72 h. Após a fixação, os tecidos foram desidratados em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 80%, 96% e 100%), mantendo-se cada concentração por 1 h. Posteriormente, os tecidos foram clareados utilizando um procedimento em duas etapas com xilol e emblocados em parafina. Secções com espessura de 5 µm foram obtidas dos blocos de parafina utilizando um micrótomo rotativo.

Para a coloração com hematoxilina e eosina, os cortes foram desparafinizados e reidratados, corados com hematoxilina por 5 min e lavados sob água corrente por 5 min. A diferenciação foi realizada usando álcool ácido, após a qual os cortes foram mantidos em água amoniacal por 1 min. Em seguida, os cortes foram contracorados com eosina por 2 min. Posteriormente, os cortes foram desidratados por meio de uma série ascendente de álcoois, clarificados em xilol e montados com um meio de montagem apropriado.

Para a coloração de Masson, as seções foram desparafinizadas e reidratadas, em seguida incubadas em uma solução mordente a 56 °C por 60 min e lavadas sob água corrente por 10 min. As seções foram então tratadas sequencialmente com hematoxilina férrica de Weigert por 10 min, escarlate Biebrich-fucsina ácida por 15 min, ácido fosfotúngstico por 10 min e azul de anilina por 10 min. Por fim, as seções foram mantidas em ácido acético 1% por 5 min, desidratadas, clareadas em xilol e montadas.

A coloração bem-sucedida foi confirmada pela coloração nuclear nítida, contraste citoplasmático preservado, manutenção da arquitetura renal e visualização distinta das estruturas do tecido conjuntivo. Todos os cortes corados foram avaliados em condições padronizadas utilizando um microscópio óptico equipado com um sistema de imagem digital.

As avaliações histopatológicas foram realizadas por um único patologista experiente, cegado em relação aos grupos experimentais. A pontuação histopatológica foi realizada com aumento de 200×. Para cada animal e cada parâmetro histopatológico, foram examinados 10 campos microscópicos selecionados aleatoriamente. O campo que apresentava a alteração mais grave para o parâmetro em avaliação foi utilizado para atribuir ao animal uma pontuação única inteira na escala de 0 a 4. A lesão tubular foi avaliada com base na dilatação tubular, acúmulo de material proteico na luz tubular, degeneração do epitélio tubular e necrose tubular. A lesão glomerular foi avaliada com base na degeneração ou atrofia glomerular, aumento do espaço de Bowman e congestão vascular. A lesão intersticial foi avaliada com base na inflamação e fibrose intersticial. Secções renais coradas com hematoxilina e eosina e tricrômio de Masson, com cinco micrômetros de espessura, provenientes de cada animal, foram utilizadas para a avaliação histopatológica. Fotomicrografias representativas foram obtidas com aumento de 200×, com barras de escala representando 100 µm. O número de secções histológicas separadas examinadas por animal não pôde ser recuperado dos registros do estudo e, portanto, não pode ser informado.

Os achados da tricrômio de Masson foram interpretados histomorfologicamente, considerando a localização e o padrão morfológico do depósito de colágeno, e não apenas a intensidade da coloração azul. A pontuação semiquantitativa da fibrose intersticial foi baseada nesta avaliação histomorfológica, e a porcentagem da área positiva para colágeno não foi quantificada. A pontuação histopatológica foi realizada de forma semiquantitativa utilizando critérios de avaliação de lesão renal previamente descritos^16,17. A cada animal foi atribuída uma pontuação inteira para cada parâmetro histopatológico numa escala de 0 a 4, em que 0 = ausente, 1 = mínima, 2 = leve, 3 = moderada e 4 = grave. As categorias de graduação representavam a avaliação global do patologista, realizado de forma cega, sobre a gravidade morfológica de cada lesão, e não uma medida morfométrica contínua.

Precauções de segurança e gerenciamento de resíduos
Equipamento de proteção individual apropriado foi utilizado ao manipular metanol, formaldeído, xilol, amostras biológicas e tecidos animais. Jalecos laboratoriais, luvas e proteção ocular foram usados. Devido à toxicidade sistêmica e volatilidade do metanol, todos os procedimentos foram realizados com cautela. Procedimentos envolvendo formaldeído e xilol foram conduzidos sob capela de exaustão química sempre que possível. Materiais perfurocortantes foram coletados em recipientes apropriados para descarte de objetos perfurocortantes. Resíduos químicos e materiais biológicos foram descartados de acordo com os procedimentos institucionais de biossegurança e gerenciamento de resíduos perigosos.

Análise estatística
As variáveis contínuas bioquímicas, biomarcadores de lesão renal, inflamatórias, de função renal e relacionadas ao estado redox foram expressas como média ± desvio padrão (média ± DP). A normalidade da distribuição dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro–Wilk, e a homogeneidade das variâncias foi verificada pelo teste de Levene. As comparações entre grupos para os resultados bioquímicos foram realizadas por meio de análise de variância unidirecional (ANOVA). A verificação dos pressupostos identificou desvios da normalidade em um grupo para a creatinina sérica e heterogeneidade de variância para diversos resultados bioquímicos. A abordagem original de ANOVA foi mantida; no entanto, esses desvios podem ter afetado a confiabilidade dos valores de p obtidos, e, portanto, os resultados foram interpretados com cautela.

Quando uma diferença estatisticamente significativa foi detectada pela ANOVA, comparações aos pares entre os grupos foram realizadas utilizando o teste de comparação múltipla post hoc de Duncan. Valores que compartilham a mesma letra sobrescrita dentro de cada linha não diferiram significativamente de acordo com o teste post hoc de Duncan. Nenhum ajuste adicional de multiplicidade foi aplicado nos resultados bioquímicos. O procedimento de Duncan não forneceu um controle rigoroso da taxa de erro tipo I por família, e a análise de múltiplos resultados aumentou ainda mais o risco de achados falsos positivos. Portanto, as comparações significativas individuais foram interpretadas com cautela.

Os tamanhos de efeito globais para os resultados bioquímicos foram estimados utilizando a eta-ao-quadrado (η²), calculada como (F × df_entre)/(F × df_entre + df_erro), em que df_entre = 4 e df_erro = 25. Os intervalos de confiança bilaterais de 95% foram calculados invertendo a distribuição F não central e transformando os limites de não centralidade (λ) usando λ/(λ + N), onde N = 30. Esses cálculos complementares foram realizados utilizando um ambiente de computação científica. As estimativas foram derivadas das estatísticas F arredondadas obtidas a partir da análise estatística primária e, portanto, são aproximadas. Os intervalos de confiança basearam-se nas suposições de normalidade e de variâncias iguais do modelo ANOVA e não foram ajustados para múltiplos desfechos.

As pontuações histopatológicas foram observações ordinais e semiquantitativas, resumidas descritivamente como média ± DP para mostrar a carga média de lesões no grupo e a variabilidade entre os animais. Nenhum teste inferencial de hipóteses ou comparações pareadas pós-hoc foram realizados para as pontuações histopatológicas. Portanto, a ANOVA, o teste post hoc de Duncan e a apresentação do valor p foram aplicados apenas aos resultados bioquímicos, de biomarcadores de lesão renal, inflamatórios, de função renal e relacionados ao estado redox. Um valor p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

All 30 animals were included in the analyses, with six animals in each of the five experimental groups. All animals in the five groups were euthanized and sampled on study day 10. For the three methanol-exposed groups, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Therefore, the total study duration and sample collection time were consistent across all experimental groups. Renal injury and inflammatory biomarkers, renal function and redox-related parameters, and histopathological findings were evaluated as described below.

Biochemical findings: renal injury and inflammatory biomarkers
The findings for renal injury and inflammatory biomarkers measured in kidney tissue homogenates are presented in Table 1. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in cystatin C [F(4,25) = 5.329, p = 0.003], IL-6 [F(4,25) = 3.907, p = 0.013], KIM-1 [F(4,25) = 3.673, p = 0.017], TNF-α [F(4,25) = 7.660, p < 0.001], and IL-1β [F(4,25) = 11.584, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 1. Kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, and KIM-1 were highest in the MTX + Methanol group, whereas no significant differences were observed among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups for these variables. Kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β were also highest in the MTX + Methanol group. The MTX-only group showed higher levels of TNF-α and IL-1β in kidney tissue homogenates than the Control group, whereas the antidote-treated groups showed intermediate values (Table 1).

Renal function and redox-related parameters
Serum renal function indices and blood-derived redox-related parameters were presented in Table 2. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in serum urea [F(4,25) = 3.694, p = 0.017], serum creatinine [F(4,25) = 12.988, p < 0.001], serum SOD activity [F(4,25) = 11.621, p < 0.001], blood GSH level [F(4,25) = 10.164, p < 0.001], blood CAT activity [F(4,25) = 10.631, p < 0.001], and serum MDA concentration [F(4,25) = 8.814, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 2.

Serum urea, serum creatinine, and serum MDA concentrations were highest in the MTX + Methanol group. Serum urea and serum MDA concentrations did not differ significantly among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups, whereas serum creatinine was lowest in the Control group (Table 2).

The MTX + Methanol group also showed the lowest serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity. Compared with the MTX + Methanol group, the fomepizole-treated group showed significantly higher serum SOD and blood CAT activities, whereas the corresponding increases in the ethanol-treated group were not statistically significant. Blood GSH levels did not differ significantly among the MTX-only, MTX + Methanol, and two antidote-treated groups (Table 2).

Compared with the Control group, the MTX-only group showed higher kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β and lower serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity but did not differ significantly in kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, or KIM-1 or in serum urea, serum creatinine, or serum MDA concentration.

Histopathological findings and renal injury scores
The results of the histopathological evaluation of renal tissues were presented in Table 3. Descriptive variation among the groups was observed in tubular dilatation, accumulation of proteinaceous material, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

In the Control group, renal tissue preserved normal histological architecture, with no evident pathological alterations in the glomerular or tubular structures. In the MTX group, mild tubular degeneration, vascular congestion, and interstitial inflammation were observed.

The MTX + Methanol group showed the highest observed injury scores across the evaluated tubular, glomerular, vascular, and interstitial parameters. Both antidote-treated groups showed descriptively lower observed scores than the MTX + Methanol group. In descriptive comparisons, the fomepizole-treated group showed lower observed scores than the ethanol-treated group for most parameters, particularly tubular dilatation, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, and interstitial fibrosis (Table 3). These comparisons were descriptive, and no inferential statistical tests were performed on the histopathological scores. Representative renal histopathological images obtained using hematoxylin and eosin and Masson’s trichrome staining are shown in Figure 2.

Overall, the MTX + Methanol group showed the highest renal injury and inflammatory biomarker values, the least favorable renal function and redox profiles, and the highest histopathological injury scores. Both antidote-treated groups showed more favorable renal outcome patterns than the MTX + Methanol group, with the fomepizole-treated group showing a more consistently favorable pattern across the evaluated domains. The MTX-only group also showed changes in selected inflammatory and redox-related parameters relative to the Control group.

DATA AVAILABILITY:
The animal-level raw data supporting the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, renal function, and redox-related analyses are provided in Supplementary File 1.

Figure 1: Experimental design and treatment timeline. Schematic representation of the experimental rat model of methanol intoxication. Adult male Wistar albino rats were assigned to five groups: Control, methotrexate (MTX) only, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol (n = 6/group). Standard pellet chow and tap water were available ad libitum throughout the 10-day study, and no fasting or other food or water restrictions were imposed before or after methanol administration. The Control group received no experimental treatment. Animals in Groups 2–5 received MTX by oral gavage at 0.3 mg/kg once daily for seven consecutive days (study days 1–7). Animals in Groups 3–5 received a single dose of methanol at 3 g/kg by oral gavage on study day 8. In the MTX + Methanol + Fomepizole group, an intraperitoneal loading dose of fomepizole at 15 mg/kg was administered 4 h after methanol administration, followed by maintenance doses of 10 mg/kg at 12, 24, and 36 h. In the MTX + Methanol + Ethanol group, ethanol was administered as a single dose of 0.5 g/kg by oral gavage 4 h after methanol administration. All animals were euthanized on study day 10. For Groups 3–5, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Blood and kidney samples were collected for analyses of renal function, renal injury biomarkers, inflammatory cytokines, redox-related biomarkers, and renal histopathology. Abbreviations: MTX = methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Representative histopathological findings in renal tissue from experimental groups. Representative kidney sections from the Control, MTX, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups are shown. The upper row presents hematoxylin and eosin (H&E) staining, whereas the lower row presents Masson’s trichrome staining. The Control group exhibited preserved renal architecture with normal glomerular and tubular morphology. The blue-stained collagen observed in the glomerular and tubular basement membranes, vascular walls, and interstitial connective tissue of the Control group was considered physiological collagen rather than evidence of pathological fibrosis. The MTX group showed mild tubular degeneration, vascular congestion, and inflammatory changes. The MTX + Methanol group exhibited more pronounced renal injury, characterized by tubular degeneration (*), vascular congestion (+), widening of Bowman’s space (x), tubular necrosis (↑), interstitial inflammation (↕), and periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change (‡), as observed in the Masson’s trichrome-stained section. The Fomepizole-treated group showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group, with relatively preserved tubular and glomerular structures and less extensive necrosis, inflammation, vascular congestion, and collagen-associated changes. The Ethanol-treated group also showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group; however, residual tubular, glomerular, and vascular alterations were more apparent than in the Fomepizole-treated group. Photomicrographs were obtained at 200× magnification, and scale bars represent 100 µm. Masson’s trichrome staining was evaluated as supportive histomorphological evidence; differences in the intensity of blue staining among the panels were not used as a quantitative measure for intergroup comparison of fibrosis. Symbols: * tubular degeneration; + vascular congestion; x widening of Bowman’s space; ↑ tubular necrosis; ↕ interstitial inflammation; ‡ periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change. MTX, methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Variable	Control (n = 6)	MTX (n = 6)	MTX + Methanol (n = 6)	MTX + Methanol + Fomepizole (n = 6)	MTX + Methanol + Ethanol (n = 6)	p	η² (95% CI)
Cystatin C (ng/mL)	26.07 ± 12.05a	32.01 ± 1.86a	45.23 ± 10.51b	32.49 ± 1.60a	31.27 ± 4.60a	0.003	0.460 (0.084 – 0.597)
IL-6 (ng/L)	7.66 ± 1.38a	8.72 ± 2.45a	11.02 ± 0.83b	7.96 ± 1.54a	8.12 ± 1.77a	0.013	0.385 (0.023 – 0.535)
KIM-1 (ng/mL)	2.21 ± 1.00a	2.47 ± 0.24a	3.45 ± 0.81b	2.28 ± 0.58a	2.32 ± 0.37a	0.017	0.370 (0.013 – 0.522)
TNF-α (ng/L)	118.66 ± 22.95a	190.51 ± 5.84b	238.29 ± 34.68c	147.10 ± 24.31ab	168.41 ± 75.41ab	<0.001	0.551 (0.181 – 0.668)
IL-1β (ng/mL)	8.43 ± 0.59a	12.53 ± 1.05c	15.26 ± 1.46d	10.05 ± 2.86ab	11.17 ± 2.37bc	<0.001	0.650 (0.316 – 0.743)

Table 1: Renal injury and inflammatory biomarkers in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. All biomarkers were measured in kidney tissue homogenates. Cystatin C, KIM-1, and IL-1β concentrations are expressed in ng/mL; IL-6 and TNF-α concentrations are expressed in ng/L. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified among some biomarkers; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted with caution. Abbreviations: MTX = methotrexate; KIM-1 = kidney injury molecule-1; IL-6 = interleukin-6; TNF-α = tumor necrosis factor-alpha; IL-1β = interleukin-1 beta; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol	p	η² (95% CI)
Serum urea (mg/dL)	39.64 ± 13.69a	46.88 ± 9.49a	98.75 ± 59.24b	48.03 ± 19.64a	60.44 ± 18.53a	0.017	0.371 (0.014–0.523)
Serum creatinine (mg/dL)	0.50 ± 0.10a	0.54 ± 0.05ab	0.72 ± 0.03c	0.54 ± 0.03ab	0.60 ± 0.05b	<0.001	0.675 (0.356–0.762)
Serum SOD activity (U/mL)	470.40 ± 40.49d	371.16 ± 17.64c	219.29 ± 85.06a	319.38 ± 107.20bc	256.22 ± 67.89ab	<0.001	0.650 (0.317–0.743)
Blood GSH (mmol/L)	58.74 ± 31.90b	26.36 ± 5.92a	11.10 ± 3.73a	19.56 ± 1.66a	13.66 ± 5.32a	<0.001	0.619 (0.272–0.720)
Blood CAT activity (U/mL)	220.82 ± 74.08c	160.88 ± 55.18b	68.90 ± 13.41a	129.45 ± 7.49b	110.14 ± 20.18ab	<0.001	0.630 (0.287–0.728)
Serum MDA (nmol/mL)	13.17 ± 2.03a	17.29 ± 6.36a	31.83 ± 9.94b	17.93 ± 2.04a	19.34 ± 4.65a	<0.001	0.585 (0.225–0.694)

Table 2: Renal function and redox-related parameters in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Serum urea, serum creatinine, superoxide dismutase (SOD) activity, and malondialdehyde (MDA) concentration were measured in serum, whereas reduced glutathione (GSH) level and catalase (CAT) activity were measured in blood anticoagulated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Serum urea and creatinine concentrations are expressed in mg/dL, SOD and CAT activities in U/mL, GSH levels in mmol/L, and MDA concentrations in nmol/mL. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified for some outcomes; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted cautiously. The redox-related biomarkers are indirect indicators and do not constitute direct measurements of mitochondrial function or molecular mechanisms of injury. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated. Abbreviations: MTX = methotrexate; SOD = superoxide dismutase; GSH = reduced glutathione; CAT = catalase; MDA = malondialdehyde; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol  + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol
Tubular dilatation	0.16 ± 0.40	1.50 ± 0.54	3.50 ± 0.54	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Proteinaceous material accumulation	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.33 ± 0.51
Tubular epithelial degeneration	0.16 ± 0.40	1.83 ± 0.40	3.83 ± 0.40	1.00 ± 0.00	2.00 ± 0.00
Tubular necrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.33 ± 0.51	0.83 ± 0.40	1.33 ± 0.51
Glomerular degeneration	0.16 ± 0.40	1.33 ± 0.51	3.33 ± 0.51	1.00 ± 0.00	1.66 ± 0.51
Bowman's space enlargement	0.00 ± 0.00	1.16 ± 0.40	3.00 ± 0.00	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Vascular congestion	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Interstitial inflammation	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.00 ± 0.63	0.83 ± 0.40	1.16 ± 0.40
Interstitial fibrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	2.83 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.16 ± 0.40

Table 3: Descriptive histopathological scores in experimental groups. Data are presented descriptively as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Histopathological scores were obtained from kidney sections stained with hematoxylin and eosin (H&E) and Masson’s trichrome; the scores are dimensionless. Each animal was assigned one integer score for each histopathological parameter on a scale of 0–4, where 0 = absent, 1 = minimal, 2 = mild, 3 = moderate, and 4 = severe. The decimal values presented in the table represent the arithmetic means of the individual integer scores obtained from the six animals in each experimental group and do not represent scores assigned to individual animals or a continuous scoring system. The standard deviations represent between-animal variability within each group. No inferential statistical testing or post hoc pairwise comparisons were performed on the histopathological scores; therefore, the observed between-group patterns should be interpreted descriptively rather than as statistically significant differences. Histopathological evaluation included tubular dilatation, proteinaceous material accumulation, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

Supplementary File 1: Raw data supporting the biochemical analyses. This spreadsheet contains the animal-level raw values used for the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, and redox-related analyses reported in the manuscript. Please click here to download this file.

Discussão

A principal descoberta deste estudo foi que o grupo MTX + Metanol apresentou o perfil mais adverso de lesão renal em desfechos funcionais, inflamatórios, relacionados ao estado redox e histopatológicos. Esse grupo apresentou os níveis mais elevados de ureia sérica, creatinina sérica, cistatina C renal, KIM-1, TNF-α, IL-6, IL-1β e MDA, bem como as menores atividades de SOD, níveis de GSH e atividade de CAT, juntamente com as pontuações histopatológicas de lesão mais altas observadas. Ambos os grupos tratados com antídotos apresentaram padrões renais mais favoráveis do que o grupo MTX + Metanol, sendo que o grupo tratado com fomepizol mostrou um padrão mais consistentemente favorável nos domínios avaliados. No entanto, esses achados foram obtidos em um modelo agudo de ratos pré-tratados com MTX, utilizando regimes de antídotos desiguais: administração intraperitoneal repetida de fomepizol versus uma única dose oral de etanol. Essas diferenças na via e na frequência de administração limitam a comparação direta da eficácia nefroprotetora, e os padrões de desfecho observados não estabelecem a superioridade do fomepizol em relação ao etanol. O grupo somente com MTX apresentou níveis mais elevados de TNF-α e IL-1β e menor atividade de SOD, níveis de GSH e atividade de CAT do que o grupo Controle, enquanto a cistatina C renal, IL-6, KIM-1, ureia sérica, creatinina sérica e níveis de MDA permaneceram estatisticamente comparáveis entre os grupos. Esse padrão indicou que o pré-tratamento com MTX contribuiu para o perfil inflamatório e relacionado ao estado redox de base. Assim, as alterações adicionais observadas no grupo MTX + Metanol ocorreram sobre um fundo de pré-tratamento com MTX e não puderam ser atribuídas exclusivamente ao metanol. Como nenhum grupo somente com metanol foi incluído, a contribuição independente do metanol e as possíveis interações entre MTX e metanol não puderam ser totalmente separadas.

Com base na toxicologia estabelecida do metanol, o acúmulo de metabólitos tóxicos representava um fator plausível contribuinte para a lesão renal. O metanol é metabolizado predominantemente no fígado pela ADH em formaldeído e, subsequentemente, em ácido fórmico^1,3,18,19,20. Assim, o rim poderia ter sido afetado principalmente pelo formiato circulante e pelas perturbações metabólicas sistêmicas resultantes, em vez de por um metabolismo local extensivo do metanol. No entanto, não se pôde excluir uma contribuição do metabolismo do álcool ou aldeído no tecido renal, já que as concentrações de metanol, formaldeído e formiato, bem como a atividade da ADH renal, não foram medidas. O ácido fórmico inibe a citocromo c oxidase mitocondrial, prejudicando, assim, a fosforilação oxidativa, reduzindo a produção de ATP e induzindo hipóxia histotóxica; esse processo pode culminar em acidose láctica, aumento da geração de espécies reativas de oxigênio e dano à membrana^1,2,3,19,20. Em comparação com o fígado, que é o principal local do metabolismo do metanol, o rim pode ser particularmente suscetível aos efeitos tardios do formiato e das perturbações metabólicas sistêmicas. As células epiteliais dos túbulos proximais possuem altas demandas energéticas e são particularmente vulneráveis à disfunção mitocondrial, ao estresse oxidativo e ao comprometimento da microcirculação. Consequentemente, a hipóxia mediada por formiato, a acidose metabólica e a inflamação podem contribuir para a lesão renal^{2,8,9,21,22,23}. Estudos clínicos que mostram associações entre lesão renal aguda e acidose metabólica, insuficiência respiratória, rabdomiólise, sepse e disfunção de múltiplos órgãos sugeriram que a lesão renal pode refletir a carga tóxica sistêmica^8,9,10,21. A oxidação dependente de folato do formiato em ratos ser mais rápida do que em humanos representou uma limitação importante dos modelos experimentais^1,11,12. Assim, o pré-tratamento com metotrexato foi utilizado para reduzir a depuração do formiato e aumentar a suscetibilidade à toxicidade do metanol, em vez de reproduzir as características clínicas e metabólicas completas do envenenamento humano por metanol.

A disfunção renal foi demonstrada por meio da avaliação combinada de parâmetros bioquímicos convencionais e biomarcadores de lesão renal. As concentrações elevadas de ureia e creatinina séricas no grupo MTX + Metanol apoiaram a presença de filtração renal prejudicada e capacidade excretora reduzida. O aumento dos níveis renais de cistatina C e KIM-1 sugeriu que a lesão tubular acompanhou a disfunção funcional. Dada a associação do KIM-1 com lesão tubular proximal, esse aumento foi compatível com degeneração epitelial tubular, dilatação e necrose^24,25. Níveis aumentados de cistatina C também corroboraram a presença de função renal prejudicada^26,27. Os níveis mais baixos desses biomarcadores nos grupos tratados com fomepizol e etanol sugeriram atenuação da lesão renal, com um padrão mais consistente observado no grupo tratado com fomepizol. O padrão dos biomarcadores relacionados ao estado redox foi compatível com estresse oxidativo como um possível contribuinte para a lesão renal, e não como evidência de um mecanismo confirmado. O MDA é comumente utilizado como índice de peroxidação lipídica, enquanto o GSH contribui para a manutenção da homeostase redox celular^28,29. Em modelos experimentais de intoxicação por metanol e neuropatia óptica associada ao metanol, estresse oxidativo, peroxidação lipídica e capacidade antioxidante reduzida também foram associados à lesão tecidual^10,15,20. A atividade sérica reduzida de SOD, concentrações séricas mais elevadas de MDA e níveis sanguíneos mais baixos de GSH e atividade de CAT no grupo MTX + Metanol foram compatíveis com capacidade antioxidante reduzida e aumento da peroxidação lipídica; entretanto, essas medições não estabeleceram um mecanismo molecular ou mitocondrial subjacente. Concentrações séricas mais baixas de MDA e recuperação parcial das atividades séricas de SOD e sanguínea de CAT nos grupos tratados com antídotos foram compatíveis com um perfil mais favorável de biomarcadores relacionados ao estado redox, com um padrão mais consistentemente favorável observado no grupo tratado com fomepizol.

Valores mais elevados de TNF-α, IL-6 e IL-1β no grupo MTX + Metanol foram consistentes com um perfil renal pró-inflamatório. Como essas citocinas não eram específicas de via e o próprio MTX estava associado a alterações em marcadores inflamatórios selecionados, os achados sustentaram a inflamação como um possível contribuinte, e não um mecanismo confirmado, de lesão renal. A disfunção mitocondrial mediada por ácido fórmico, hipóxia celular e estresse oxidativo podem fornecer uma base para a ativação de vias inflamatórias; portanto, o estresse oxidativo e a inflamação podem progredir como processos mutuamente reforçadores na toxicidade do metanol^1,2,3,15. Modelos experimentais de intoxicação por metanol relataram associações da exposição ao metanol com infiltração de células inflamatórias, dano histopatológico e níveis aumentados de marcadores pró-inflamatórios, como IL-1β e TNF-α^13,15. Esses achados foram consistentes com os níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias e escores elevados para inflamação intersticial, degeneração tubular e necrose tubular observados no grupo MTX + Metanol. Coletivamente, os achados foram compatíveis com um processo multifatorial envolvendo efeitos de metabólitos tóxicos, estresse oxidativo, inflamação, comprometimento da microcirculação e carga tóxica sistêmica; no entanto, essas vias não foram diretamente avaliadas. Níveis mais baixos de TNF-α, IL-6 e IL-1β nos grupos tratados com antídoto sugeriram que a inibição da formação de metabólitos tóxicos também pode ter limitado a resposta inflamatória. Os achados histopatológicos forneceram correlatos em nível tecidual da lesão renal, com o grupo MTX + Metanol apresentando os escores de lesão mais elevados observados nos parâmetros tubulares, glomerulares, vasculares e intersticiais. Ambos os grupos tratados com antídoto apresentaram, descritivamente, escores histopatológicos de lesão mais baixos, e o grupo tratado com fomepizol apresentou, descritivamente, escores mais baixos do que o grupo tratado com etanol na maioria dos parâmetros. No entanto, como nenhum teste estatístico inferencial foi realizado nos escores histopatológicos, essas observações não estabeleceram proteção histopatológica estatisticamente significativa nem superioridade de qualquer antídoto^16,17.

Os efeitos antidóticos do etanol e da fomepizola na intoxicação por metanol baseiam-se na supressão do metabolismo mediado pela álcool desidrogenase, reduzindo assim a formação de formaldeído e ácido fórmico. O etanol atua como substrato competitivo, enquanto a fomepizola funciona como inibidor direto e potente da álcool desidrogenase^{1,3,4,6,7,30,31,32}. Os padrões de desfecho renal mais favoráveis observados em ambos os grupos tratados com antídotos foram compatíveis com os efeitos esperados da inibição da álcool desidrogenase. No entanto, a literatura atual não demonstra superioridade clínica definitiva da fomepizola em relação ao etanol. Embora a fomepizola seja frequentemente preferida devido à facilidade de dosagem, farmacocinética previsível e perfil de efeitos adversos mais baixo, o etanol continua sendo uma alternativa eficaz^{1,3,4,6,7,30,32}. Nos dados de intoxicação massiva por metanol relatados por Zakharov et al., nenhuma diferença clara foi observada entre os dois antídotos em relação à mortalidade, duração da terapia intensiva ou necessidade de diálise; portanto, interpretações sobre superioridade clínica devem ser feitas com cautela⁵. Nenhuma diferença direta estatisticamente significativa entre os grupos tratados com fomepizola e etanol foi identificada para os desfechos bioquímicos utilizando o teste post hoc de Duncan. Além disso, a fomepizola foi administrada em doses repetidas, enquanto o etanol foi administrado em dose única. Os regimes não foram equiparados quanto à via, frequência de dosagem ou exposição sistêmica. Consequentemente, o padrão descritivamente mais favorável associado à fomepizola poderia refletir diferenças no esquema de dosagem, via de administração ou exposição ao fármaco, além das diferenças entre os agentes antidóticos, e não estabeleceu maior eficácia bioquímica, superioridade clínica ou preferência terapêutica clínica^5,6,30,32. Uma grande vantagem do estudo foi a avaliação integrada da ureia e creatinina séricas, cistatina C, KIM-1, citocinas pró-inflamatórias, biomarcadores relacionados ao estado redox e escores histopatológicos em domínios funcionais, tubulares, inflamatórios, relacionados ao estado redox e estruturais complementares. Esse modelo focado na lesão renal pode fornecer uma estrutura pré-clínica útil para avaliar regimes antidóticos, intervenções renoprotetoras adjuvantes e biomarcadores de lesão renal em condições de redução da depuração de formato dependente de folato^8,9,10,21.

Várias limitações afetaram a interpretação. A generalização direta para a intoxicação clínica por metanol foi limitada pelo modelo animal experimental e pelas diferenças metabólicas entre espécies. O metotrexato pode influenciar independentemente os desfechos renais, inflamatórios e oxidativos.³³, e a ausência de um grupo controle com apenas metanol impediu a separação completa dos efeitos do metanol das possíveis interações entre MTX e metanol. As concentrações séricas ou teciduais de metanol, formaldeído, formiato, etanol e fomepizol não foram medidas, e a atividade da ADH na fração citosólica renal bruta não foi avaliada; portanto, a sensibilização metabólica, a formação de metabólitos tóxicos, a exposição ao antídoto e a inibição do metabolismo do metanol não puderam ser verificadas diretamente, e análises de correlação com os desfechos bioquímicos renais não puderam ser realizadas. As variáveis ácido-base, incluindo pH, bicarbonato, excesso de base e lacuna aniônica, não foram medidas. O acompanhamento de 48 horas permitiu a avaliação apenas de desfechos renais agudos e não estabeleceu a recuperação, persistência ou reversibilidade da lesão, nem alterações estruturais crônicas. A coloração de tricrômio de Masson foi avaliada histomorfologicamente sem medida quantitativa da área positiva para colágeno, e marcadores moleculares ou bioquímicos de fibrose, incluindo α-a expressão da actina do músculo liso, o conteúdo de colágeno e a concentração de 4-hidroxiprolina não foram avaliados. A avaliação histopatológica realizada por um único patologista cego impediu a análise da concordância entre observadores, e a classificação semiquantitativa das lesões permaneceu potencialmente sujeita à classificação dependente do observador. Os regimes antidóticos eram farmacologicamente desiguais; as concentrações renais de ELISA não foram normalizadas pela concentração total de proteína; análises moleculares da função mitocondrial e das vias de morte celular não foram realizadas; o tamanho da amostra foi limitado; e somente ratos machos foram incluídos. Estudos futuros deveriam incorporar grupos controle com apenas metanol e apenas metotrexato, regimes antidóticos comparáveis, medidas seriadas das concentrações de metanol, formiato e antidotos, atividade renal de desidrogenase do álcool (ADH), medidas de equilíbrio ácido-base, avaliação quantitativa de fibrose, seguimento prolongado e validação clínica adequadamente delineada. Em conclusão, a exposição ao metanol neste modelo de rato pré-tratado com metotrexato esteve associada a disfunção renal, aumento de biomarcadores de lesão renal e inflamação, perfil desfavorável relacionado ao estado redox e lesão histopatológica. Ambos os grupos tratados com antidotos apresentaram padrões renais mais favoráveis do que o grupo MTX + Metanol. O fomepizole mostrou um padrão descritivo mais consistentemente favorável em todos os domínios avaliados; entretanto, a ausência de diferenças bioquímicas diretas significativas entre os grupos antidóticos, a natureza descritiva das comparações histopatológicas, os regimes antidóticos desiguais e a ausência de medidas toxicocinéticas impediram conclusões sobre sua superioridade em relação ao etanol. Esses achados restringem-se ao modelo de rato pré-tratado com metotrexato e não estabelecem os efeitos renais de qualquer um dos antidotos após exposição ao metanol sem pré-tratamento com metotrexato ou na intoxicação humana por metanol. São necessários estudos adicionais que incluam medidas toxicocinéticas diretas, avaliações mecanicistas, regimes de dosagem antidótica comparáveis e seguimento prolongado para avaliar a reprodutibilidade e a aplicabilidade mais ampla desses achados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Formol tamponado neutro a 10%	Merck	Não registrado	Fixação de tecidos para processamento histopatológico.
Etanol absoluto (≥99,8%)	Sigma-Aldrich, USA	Não registrado	Diluído com água destilada estéril para obter uma solução final de 20% (v/v); administrado em dose única por gavagem oral de 0,5 g/kg, 4 h após a administração de metanol.
Centrífuga de bancada	Nüve	NF048	Preparação de amostras e centrifugação.
Anticorpo conjugado com biotina	Componentes do Kit ELISA BT Lab	Incluído no kit	Anticorpo de detecção
Kit CAT (Catalase)	Otto Scientific	Otto3051	Medição colorimétrica da atividade de catalase (CAT) em sangue anticoagulado com EDTA.
Coquetel de inibidores de protease cOmplete Mini sem EDTA	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	Adicionado ao tampão de homogeneização durante a preparação de homogeneizados de tecido renal para análises por ELISA.
Kit de Creatinina	Otto Scientific	OttoBC139	Avaliação dos níveis séricos de creatinina.
Homogeneizador digital	Daihan Scientific	HG-15D	Homogeneização de tecidos
Lavador automático de fitas ELx50	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	Lavagem em ELISA
Leitor de microplacas ELx800	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	Medição de absorbância para ELISA e ensaios colorimétricos; a absorbância em ELISA foi lida a 450 nm.
Eosina Y (amarelada)	Merck	1.15935.0025	Coloração histopatológica
Fomepizol (4-Metilpirazol)	Hüsnü Arsan A.., Ankara, Türquia	Não registrado	Preparado em solução estéril de cloreto de sódio a 0,9%, com concentração final de 10 mg/mL; administrado por via intraperitoneal como dose de carga de 15 mg/kg, 4 h após a administração de metanol, seguido por doses de manutenção de 10 mg/kg às 12, 24 e 36 h após a administração de metanol.
Kit GSH (Glutationa)	Otto Scientific	Otto3053	Medição colorimétrica dos níveis de glutationa reduzida (GSH) em sangue anticoagulado com EDTA.
Solução de hematoxilina de Harris	BSLAB	BS-002	Coloração histopatológica
Ácido clorídrico (HCl)	Merck	7647-01-0	Ajuste de pH
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	IBM SPSS Statistics Versão 29.0	Análise estatística; RRID:SCR_016479.
Cloridrato de cetamina (Ketalar)	Pfizer, EUA	Não registrado	Anestesia geral antes da coleta de sangue e tecido renal.
Microscópio óptico	Nikon Eclipse	Ni-U	Exame histopatológico
Kit de coloração com Tricrômio de Masson	MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Türquia)	BKMTO001	Coloração histopatológica
Kit MDA (Malondialdeído)	Otto Scientific	Otto1001	Medição colorimétrica dos níveis de malondialdeído (MDA) em soro como índice de peroxidação lipídica.
Metanol (≥99,8%)	Sigma-Aldrich, EUA	322415	Administrado por via oral (3 g/kg) para induzir intoxicação experimental por metanol.
Metotrexato (Emthexate 500 mg/5 mL)	Teva Pharma Belgium	Não registrado	Formulação comercial de 100 mg/mL diluída com solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% para obter uma concentração final de trabalho de 0,06 mg/mL; administrado por gavagem oral em 5 mL/kg, correspondente a 0,3 mg/kg, uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos.
Analisador de química Mindray	Mindray	BS-400	Medição de ureia e creatinina séricas.
Parafina, grau histológico	Não registrado	Não registrado	Inclusão de tecidos.
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Merck	P4417	Enxágue/lavagem de tecidos
Kit ELISA de Cistatina-C de rato	BT Lab, China	E0145Ra	Quantificação dos níveis de cistatina C em homogeneizados de tecido renal; sensibilidade analítica, 0,25 ng/mL; faixa de detecção, 0,5–100 ng/mL.
Kit ELISA de IL-1β de rato	BT Lab, China	E0119Ra	Quantificação dos níveis de IL-1β em homogeneizados de tecido renal; sensibilidade analítica, 0,08 ng/mL; faixa de detecção, 0,2–60 ng/mL.
Kit ELISA de IL-6 de rato	BT Lab, China	E0135Ra	Quantificação dos níveis de IL-6 em homogeneizados de tecido renal; sensibilidade analítica, 0,052 ng/L; faixa de detecção, 0,1–40 ng/L.
Kit ELISA de KIM-1 de rato	BT Lab, China	E0549Ra	Quantificação dos níveis de KIM-1 em homogeneizados de tecido renal; sensibilidade analítica, 0,01 ng/mL; faixa de detecção, 0,05–10 ng/mL.
Kit ELISA de TNF-α de rato	BT Lab, China	E0764Ra	Quantificação dos níveis de TNF-α em homogeneizados de tecido renal; sensibilidade analítica, 2,51 ng/L; faixa de detecção, 5–1.000 ng/L.
Tampão de lise e extração RIPA	Thermo Scientific	89900	Homogeneização e lise de tecido renal para análises por ELISA.
Kit SOD (Superóxido Dismutase)	Otto Scientific	Otto3047	Medição colorimétrica da atividade de superóxido dismutase (SOD) em soro.
Citrato de sódio	Merck	03-04-6132	Preparação de tampão
Hidróxido de sódio (NaOH)	Merck	1310-73-2	Ajuste de pH
Agulha de alimentação em aço inoxidável (cânula de gavagem oral 22 G)	Instech Laboratories, EUA	Não registrado	Cânula reutilizável de aço inoxidável utilizada para administração por gavagem oral em ratos.
Solução de parada	Componentes do Kit ELISA BT Lab	Incluído no kit	Encerramento da reação em ELISA
Peroxidase de estreptavidina	Thermo Scientific	SHRP248-B	Sistema de detecção em ELISA
Solução de substrato TMB	Componentes do Kit ELISA BT Lab	Incluído no kit	Substrato cromogênico
Tris-HCl	Thermo Scientific	1185-53-1	Preparação de tampão
Kit de Ureia	Otto Scientific	OttoBC157	Medição dos níveis séricos de ureia.
Concentrado de tampão de lavagem	Componentes do Kit ELISA BT Lab	Incluído no kit	Lavagem de placas
Ratos albinos Wistar	Laboratório de Pesquisa com Animais Experimentais da Universidade Ahi Evran, , Türquia	Número da licença de criação/produção: 184	Machos; 8–12 semanas de idade; peso corporal, 220 ± 20 g
Cloridrato de xilazina (Rompun)	Bayer, Alemanha	Não registrado	Anestesia geral antes da coleta de sangue e tecido renal.
Xilol, grau histológico	Não registrado	Não registrado	Processamento e desparafinização de tecidos histológicos.