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Artigo de método

Incubação in vitro com Fluido Ruminal e Coloração Histológica de Componentes Seletivos da Parede Celular em Caules de Alfafa (Medicago sativa L.)

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DOI:

10.3791/73286

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18 de setembro de 2026

 , 
1Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota - Twin Cities, 2United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service

Neste artigo

Resumo

Este protocolo visualiza a deposição de lignina e componentes da parede celular de pectina em seções transversais de hastes de alfafa (Medicago sativa L.). O objetivo é identificar tecidos específicos da haste que poderiam ser alvo para o desenvolvimento de novas linhagens de alfafa com características desejáveis de digestibilidade da haste.

Resumo

O acúmulo de componentes da parede celular conforme as plantas crescem limita a nutrição forrageira para ruminantes. Em particular, a deposição de lignina nos tecidos vegetais dificulta a degradação dos carboidratos da parede celular, celulose e hemicelulose, reduzindo assim a quantidade de energia disponível a partir da forragem. O componente altamente digestível da parede celular, a pectina, entretanto, está prontamente disponível para degradação. Informações sobre a deposição de lignina e pectina em diferentes tipos celulares do caule podem fornecer subsídios mecanicistas sobre os fatores subjacentes à variação na digestibilidade do caule entre linhagens de alfafa. A incubação in vitro de secções transversais do caule em fluido ruminal simula os processos que os tecidos do caule sofrem no rúmen. Combinado com coloração histológica e microscopia, este método permite a visualização das alterações na degradação tecidual ao longo do tempo e a localização de lignina e pectina no caule. A coloração de Wiesner reage com unidades aldeído guaiacila (G) da lignina, corando-as de fúcsia. Da mesma forma, o vermelho de rutênio interage com os grupos carboxílicos da pectina, corando a pectina no caule em tons que variam do rosa ao laranja e marrom. Este protocolo descreve a digestão de secções transversais do caule de alfafa após exposição a microrganismos ruminais, seguida por coloração para visualizar os padrões de lignina e pectina nas paredes celulares. O método pode ser utilizado para identificar tecidos do caule nos quais a lignina e a pectina estão presentes ou ausentes, facilitando comparações entre linhagens de alfafa.

Introdução

Uma parede celular envolve todas as células vegetais. Celulose, hemicelulose, lignina e pectina são componentes da parede celular e contribuem para a fibra vegetal, parte necessária na dieta de ruminantes. Enquanto as pectinas são polissacarídeos altamente digeríveis (solúveis)1, a lignina é um polímero indigerível que limita a degradação da fibra2. Assim, a lignina reduz a digestibilidade da planta e, em última instância, diminui a energia disponível para o ruminante a partir da forragem. Contudo, a lignina sustenta funções fisiológicas importantes para a planta, como a condução de água por toda a planta ao reforçar os elementos traqueídios3. Trabalhos anteriores demonstraram que alterações na fibra do caule que reduzem a lignina ou aumentam a pectina poderiam melhorar a digestibilidade do caule e o valor nutricional da forragem4. Assim, este protocolo concentra-se nestes dois componentes da parede celular. As concentrações totais de lignina e pectina na parede celular do caule fornecem informações insuficientes para explicar os mecanismos subjacentes à digestibilidade da fibra do caule5. A incubação in vitro com fluido ruminal e a coloração histológica podem fornecer insights no nível celular, ao visualizar diferenças nos componentes da parede celular entre plantas com digestibilidade variável da fibra do caule4,6. No presente protocolo, a alfafa (Medicago sativa L.), uma leguminosa forrageira perene comum, serve como espécie modelo para ilustrar os padrões de lignina e pectina nos tecidos do caule, que contêm mais lignina, mas menos pectina do que as folhas.

A incubação in vitro com fluido ruminal simula a digestão de forragens no estômago de ruminantes, permitindo a observação dos efeitos da anatomia da forragem sobre a digestibilidade. Ao criar em tubo de ensaio condições semelhantes às encontradas no rúmen, secções transversais de colmos aderidas a lâminas de vidro podem ser removidas em diferentes momentos para avaliar o grau de degradação tecidual após exposição ao fluido ruminal6. Este método fornece uma abordagem relativamente simples, rápida e econômica para visualizar as estruturas anatômicas dos colmos de alfafa7 e examinar como os tipos celulares contendo diferentes componentes da parede celular mudam à medida que o colmo é digerido.

A coloração histológica de seções transversais de caules permite a visualização dos componentes da parede celular. O floglucinol e o ácido clorídrico (HCl) combinam-se para formar a coloração de Wiesner, que destaca os tecidos do caule contendo unidades de lignina ricas em guaiacila8 ao reagir com monômeros de aldeído G C6C3 (coniferaldeído)9. A lignina é composta por múltiplas subunidades monoméricas; no entanto, ao longo deste artigo, o termo “lignina” refere-se exclusivamente ao monômero da unidade G, pois é o monômero que reage com a coloração de Wiesner10 e, portanto, é visualizado por meio deste protocolo. Alguns tecidos, como os vasos do xilema, são sempre lignificados6. Caso contrário, a deposição de lignina nos tecidos do caule da alfafa começa quando o crescimento secundário (cambial) inicia e coincide com a cessação do alongamento dos entrenós do caule6. O vermelho de rutênio liga-se às substâncias pécticas, que contêm grupos carboxila que às vezes são esterificados e compartilham algumas cadeias laterais11. Os grupos carboxílicos das pectinas presentes na lâmina média e nas paredes celulares primárias interagem com o vermelho de rutênio11. A pectina está envolvida no alongamento celular e, portanto, está presente nas células durante o crescimento primário. Ao longo do manuscrito, o termo “pectina” refere-se genericamente ao conjunto de pectinas que podem estar presentes. O acoplamento da coloração histológica com a incubação in vitro ruminal facilita a observação da localização dos componentes da parede celular no caule e destaca como diferentes tipos celulares mudam durante a digestão ruminal. Em última análise, este protocolo pode ser usado para identificar células do caule que contêm lignina e pectina e para caracterizar os padrões entre linhagens de alfafa e tempos de incubação.

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Protocolo

Esta pesquisa foi conduzida em conformidade com as diretrizes institucionais para o uso de animais (IACUC 2301-40689B).

1. Rotulagem dos tubos de amostra

  1. Preparação e rotulagem de tubos de amostra para incubação, armazenamento e coloração
    1. Rotule previamente cinco conjuntos separados de tubos cónicos descartáveis de 50 mL com tampa de rosca para cada amostra. Adicione o identificador da amostra e o tempo de incubação a cada tubo, conforme os usos descritos abaixo.
    2. Rotule os tubos de espera para pré-incubação e adicione 35 mL de água ultrapura.
    3. Rotule os tubos de incubação para uso nas Seções 3 e 4. Organize os tubos em racks separados de acordo com o tempo de incubação (0, 4, 8, 24, 48 ou 96 h).
      NOTA: Utilize uma caneta permanente de grau industrial para evitar que os rótulos sejam removidos durante a imersão no banho-maria.
    4. Rotule os tubos de armazenamento pós-incubação e adicione 35 mL de uma mistura 50:50 de glicerol a 100% e água ultrapura. Utilize esses tubos para armazenar as seções transversais digeridas em lâminas até a coloração.
    5. Rotule os tubos de pré-coloração e adicione 35 mL de uma mistura 50:50 de etanol a 200 graus e água ultrapura. Utilize esses tubos para extrair o glicerol das seções transversais antes da coloração.
    6. Rotule os tubos de hidratação e adicione 35 mL de água ultrapura.

2. Seccionamento transversal do caule e montagem em lâminas

  1. Usando pinças, selecione um segmento de caule por vez a partir dos caules da amostra e excise o centro do segmento.
    NOTA: Utilize quatro caules por amostra como réplicas técnicas para cada réplica biológica. Selecione aleatoriamente os quatro caules entre todos os caules possíveis por amostra. Utilize um conjunto adicional de caules padrão como controle em todas as corridas de incubação.
  2. Corte dois retângulos de espuma rígida de poliestireno extrudido, cada um com aproximadamente 2,5 cm de comprimento e 0,6 cm de espessura. Corte uma pequena cunha ao longo do comprimento de cada peça, de modo que um entrenó do caule se encaixe firmemente entre as duas peças de espuma.
  3. Monte o "sanduíche" de caule na platina de um micrótomo deslizante capaz de produzir seções com espessura de 100 μm. Usando um pincel de ponta fina, coloque uma gota de água sobre o caule e a lâmina do micrótomo para facilitar o corte limpo.
  4. Corte as seções transversais do caule com espessura de 100 μm. Use o pincel para transferir cada seção transversal para uma placa de Petri previamente rotulada contendo água ultrapura para armazenamento temporário, e remova qualquer espuma do recipiente.
    NOTA: Substitua a lâmina do micrótomo se a espuma rasgar, pois o rasgo pode indicar uma lâmina desgastada.
  5. Rotule manualmente duas lâminas de vidro padrão de 25 mm × 75 mm para cada amostra em cada tempo de incubação (2 colorações × 6 pontos de tempo = 12 lâminas por amostra para cada uma das réplicas biológicas). Inclua o identificador da amostra, o tempo de incubação e a coloração em cada rótulo.
  6. Corte um pedaço de fita dupla face de 2 mm de largura e 2,5 cm de comprimento. Posicione o lado curto da fita a 0,5 cm da base da lâmina, com o lado adesivo voltado para baixo, e pressione firmemente o lado de papel encerado da fita usando luvas para garantir aderência.
    NOTA: Realize este passo sobre uma superfície plana para evitar quebrar as lâminas de vidro.
  7. Use um microscópio estereoscópico para orientar todas as seções transversais na mesma direção. Remova o papel encerado da fita dupla face e, mantendo a orientação das seções transversais, transfira-as para a fita na lâmina de vidro previamente rotulada usando um pincel de ponta fina umedecido. Mantenha as seções transversais levemente úmidas.
  8. Coloque o papel encerado sobre as seções transversais e role levemente o pincel sobre ele para fixar firmemente as seções transversais à fita dupla face. Remova o papel encerado e coloque a lâmina montada contendo quatro seções transversais no tubo de armazenamento previamente rotulado descrito na etapa 1.1.2, garantindo que a água ultrapura cubra as seções transversais montadas.
  9. Para coloração com vermelho de rutênio e com a coloração de Wiesner, coloque duas lâminas frente a frente em cada tubo de armazenamento, com a fita dupla face voltada para fora.
    NOTA: Após montar todas as lâminas e colocá-las em tubos contendo água ultrapura, armazene as lâminas durante a noite à temperatura ambiente, se necessário.

3. Preparação para a incubação in vitro de seções transversais de caules

  1. Utilize os tubos descartáveis de centrífuga de 50 mL com tampa de rosca preparados para incubação (ver 1.1.3). Agrupe todos os tubos de amostra para cada intervalo de incubação em um único suporte de plástico.
  2. Use uma balança analítica de quatro casas decimais para pesar 0,2 g de padrão de colmo de milho moído a 1 mm sobre papel de pesagem e transfira cuidadosamente o material para cada tubo de incubação, exceto para os tubos de 0 h, que servem como controle não incubado. Tampe os tubos e reserve-os até o uso.
    NOTA: O padrão de colmo de milho fornece energia para sustentar os microrganismos do rúmen durante a incubação, pois a biomassa das seções transversais do caule é insuficiente para manter a atividade microbiana.
  3. Encha um banho de água com circulação com quantidade suficiente de água e equilibre-a a 39 °C antes de iniciar a incubação. Ajuste a profundidade da água para cobrir a marca de 35 mL nos tubos de 50 mL e use um aerador, se necessário, para manter a circulação e temperatura da água uniformes.
  4. Preparação do tampão de McDougall para a solução de inoculação
    1. Prepare o tampão de McDougall no máximo 2 dias antes de iniciar as incubações.
      NOTA: Misture o tampão de McDougall com fluido ruminal na proporção de 4:1 para preparar a solução de inoculação. Ajuste o volume do tampão conforme o número de amostras e prepare quantidade suficiente de solução de inoculação para fornecer 30 mL por tubo.
    2. Meça 1.600 mL de água ultrapura. Transfira 1 L para um frasco Erlenmeyer plano de 3 L e reserve 600 mL para transferência e lavagem dos reagentes.
    3. Coloque um bastão magnético no frasco Erlenmeyer e posicione o frasco sobre uma placa de agitação.
    4. Coloque um funil de plástico no frasco Erlenmeyer. Adicione 15,7 g de bicarbonato de sódio (NaHCO₃), 5,9 g de fosfato dibásico de sódio anidro (Na₂HPO₄), 0,91 g de cloreto de potássio (KCl), 0,75 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,19 g de sulfato de magnésio heptaidratado (MgSO₄·7H₂O) e 0,06 g de cloreto de cálcio diidratado (CaCl₂), adicionando um reagente por vez e permitindo que cada reagente se dissolva antes de adicionar o próximo. Utilize partes dos 600 mL reservados de água ultrapura para lavar o funil após cada adição.
    5. Após a adição do cloreto de cálcio diidratado, insira um difusor de CO₂ para facilitar a dissolução e borbulhe a solução. Quando a solução ficar límpida, continue a borbulhar por mais 10–15 min.
    6. Tampe o frasco firmemente e fixe a tampa com fita crepe, pois o aquecimento do tampão pode pressurizar o recipiente.
    7. Armazene a solução a 20 °C por até 2 dias. Coloque a solução em um banho de água a 39 °C no dia anterior ao uso, ou coloque-a diretamente no banho de água a 39 °C se for utilizada no dia seguinte.

4. Incubação in vitro de seções transversais de caule

  1. No dia da incubação, coloque 47 mL de água e 4 mL de NaOH 1 N em um béquer de 100 mL em uma capela, e adicione 0,625 g de cisteína-HCl. Em um segundo béquer de 100 mL, adicione 0,625 g de sulfeto de sódio a 47 mL de água, mantendo as duas soluções separadas até que a solução de inóculo seja preparada.
  2. Encha uma garrafa térmica isolada com água quente para criar um ambiente aquecido para o transporte de microrganismos ruminais da vaca até o laboratório. Leve um balde de cinco galões para transferir a água quente da garrafa térmica.
  3. Dirija-se ao estábulo para coletar fluido ruminal da vaca canulada designada para o experimento pela equipe do estábulo.
    NOTA: Colete o fluido ruminal aproximadamente no mesmo horário do dia e da mesma vaca durante todo o experimento para minimizar variações. Coordene com a equipe do estábulo para fornecer aviso prévio sobre o momento em que você estará no local para coletar o fluido ruminal.
  4. Identifique a vaca experimental e use os equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo jaleco de laboratório, proteção ocular, capas para botas e luvas de comprimento até os ombros.
    NOTA: Restrinja os procedimentos nas etapas 4.4–4.8 ao pessoal autorizado sob o protocolo IACUC aplicável.
  5. Transfira a água quente da garrafa térmica para o balde de cinco galões. Prepare duas camadas de gaze grau 50 (pano de musselina) para filtrar o material ruminal.
  6. Coleta de fluido ruminal da vaca canulada
    1. Abra cuidadosamente a cânula e coloque a tampa no balde de cinco galões com água quente para evitar contaminar a tampa. Usando a mão com luva, remova material suficiente do rúmen para acessar a interface sólido-líquido do rúmen.
    2. Uma vez na interface sólido-líquido, colete várias mãos-cheias de material e esprema-o através de duas camadas de gaze grau 50, cada uma com aproximadamente 45 cm de lado, para dentro de uma garrafa térmica com tampa de rosca pré-aquecida. Descarte o material usado após espremer o fluido ruminal através da gaze.
    3. Repita a etapa 4.6.2 até que haja 1 L de fluido ruminal na garrafa térmica para cada conjunto de 60 tubos de inóculo, ajustando o volume conforme necessário com base no número de amostras a serem incubadas.
      NOTA: Vacas canuladas têm limites específicos quanto à quantidade de fluido ruminal que pode ser extraída em uma determinada semana. Comunique-se com o gerente do estábulo para garantir que a quantidade de fluido ruminal retirada não exceda o limite estabelecido para a vaca.
  7. Após coletar quantidade suficiente de fluido ruminal, feche bem a garrafa térmica para manter sua temperatura. Recoloque a cânula e use a água quente no balde de cinco galões para a limpeza.
  8. Descarte as capas para botas, luvas e gaze sujas no recipiente apropriado ao sair do estábulo. Retorne ao laboratório o mais rápido possível para manter a temperatura do fluido ruminal e as condições anóxicas.
  9. Ao retornar ao laboratório, combine as duas soluções de agente redutor (ver 4.1) na capela e misture-as para preparar a solução redutora.
  10. Coloque um béquer de vidro com capacidade mínima de 2 L contendo um bastão de agitação em uma placa de aquecimento com agitação ajustada para <30 °C, e posicione um difusor de CO₂ acima do líquido. Adicione 1.600 mL do tampão de McDougall e agite lentamente, sem permitir que o difusor de CO₂ entre em contato com o líquido.
    NOTA: Pode-se usar um béquer de polipropileno nesta baixa temperatura. Use CO₂ para deslocar o O₂ e ajudar a manter as condições anóxicas.
  11. Forre um funil grande com duas camadas de musselina grau 50 e coloque-o sobre um cilindro graduado de 2 L. Filtre 400 mL de fluido ruminal e adicione-o ao tampão de McDougall (ver 3.4.7) para preparar a solução de inóculo.
  12. Adicione 80 mL da solução redutora (ver 4.9) à solução de inóculo e misture lentamente. Mantenha o difusor de CO₂ sem contato com o líquido.
  13. Na capela, remova as tampas dos tubos de incubação e organize-os em suportes separados de acordo com o tempo de incubação. Remova as tampas dos tubos de espera pré-incubação em preparação para a transferência das lâminas (ver 1.1.2).
  14. Selecione aleatoriamente um tubo de espera pré-incubação de cada vez e use pinças para transferir as lâminas montadas para o tubo de incubação correspondente (ver 1.1.3). Coloque cada tubo de incubação contendo as lâminas montadas em um suporte pequeno e coloque o tubo de espera pré-incubação de lado.
    NOTA: Use duas pessoas para realizar as etapas 4.14–4.15. Sempre que possível, minimize o resfriamento da mistura de fluido ruminal com tampão.
  15. Aspire 30 mL da solução de inóculo em uma seringa de 60 mL equipada com agulha romba de grande calibre. Dispense lentamente a solução pela parede interna do tubo de incubação, purgue o tubo com CO₂ por aproximadamente 20 s, tampe o tubo e devolva-o ao suporte.
  16. Coloque os suportes contendo os tubos inoculados em um banho-maria a 39 °C. Agite suavemente os tubos pelo menos uma vez por dia e altere as posições dos suportes diariamente para minimizar o aquecimento desigual.
    NOTA: A formação de bolhas de gás nos tubos indica fermentação ativa.
  17. No final de cada período de incubação, remova o suporte correspondente do banho-maria. Abra um tubo por vez, retire cada lâmina e enxágue suavemente os sólidos e a solução de inóculo residual com água ultrapura.
  18. Coloque as lâminas enxaguadas nos tubos de armazenamento pós-incubação contendo a mistura de glicerol-água descrita na etapa 1.1.4.

5. Coloração de seções transversais para lignina

  1. Se as lâminas tiverem sido armazenadas em uma mistura 50:50 de glicerol-água, transfira ambas as lâminas contendo as seções transversais montadas para tubos de pré-coloração contendo a solução de etanol-água ultrapura (ver 1.1.5). Armazene os tubos durante a noite em geladeira para remover o glicerol antes da coloração.
  2. Prepare uma solução de floroglucinol (PG) a 3% dissolvendo 0,3 g de PG em 10 mL de etanol absoluto em um erlenmeyer de 25 mL envolto em papel alumínio para proteger o reagente fotossensível da luz. Tampe o frasco e rotule-o com o nome da solução, data de preparação e nome do preparador, e armazene-o a 20 °C.
  3. Remova as lâminas dos tubos refrigerados e transfira-as temporariamente para os tubos de hidratação descritos na etapa 1.1.6, contendo água ultrapura a 100%.
    NOTA: Mantenha as seções transversais hidratadas durante o manuseio para minimizar a oxidação, que pode danificar as seções e afetar a imagem subsequente.
  4. Prepare a coloração de Wiesner na capela com auxílio de uma pipeta, misturando 50 μL de PG a 3% em etanol (ver 5.2) com 25 μL de ácido clorídrico (HCl) em um béquer de 50 mL.
    NOTA: Ajuste as quantidades conforme o número de lâminas, mantendo a proporção de PG para HCl de 2:1.
    ATENÇÃO: Manipule o ácido clorídrico na capela, pois é corrosivo para metais, causa queimaduras graves na pele e danos oculares, e pode provocar irritação respiratória. Evite inalar vapores ou aerossóis, use luvas, roupas, proteção ocular e facial apropriadas e lave bem a pele exposta após o manuseio.
  5. Remova uma lâmina do tubo e seque suavemente o vidro ao redor da fita dupla face com um papel sem fiapos para evitar que a coloração escorra da fita. Coloque a lâmina em uma bandeja plástica pequena e use uma pipeta para aplicar várias gotas da coloração de Wiesner sobre as seções transversais. 
  6. Acerte um cronômetro para 12 min e cubra as lâminas com papel alumínio para protegê-las da luz. Verifique as seções transversais durante a coloração e reaplique a coloração conforme necessário para evitar secagem.
    NOTA: Evite que as seções transversais sequem, pois a oxidação pode danificar o tecido e afetar a imagem subsequente.
  7. Após 12 min, remova cuidadosamente o excesso de coloração de Wiesner com um papel sem fiapos. Lave o tecido antes do montagem para minimizar a exposição da objetiva do microscópio aos vapores corrosivos do HCl.
  8. Aplicar 1–2 gotas de glicerol-água ultrapura a 50% sobre cada seção transversal e cubra com uma lamínula de 24 mm × 30 mm (espessura No. 1.5). Prossiga imediatamente para análise microscópica e obtenção de imagens.
    NOTA: Adquira as imagens dentro de 6–8 h, pois a coloração de Wiesner é sensível ao tempo e pode ficar amarela e difundir-se a partir da seção transversal com o passar do tempo.

6. Coloração de cortes transversais para pectina

  1. Siga o passo 5.1 para remover a mistura de glicerol e água ultrapura de lâminas armazenadas antes da coloração.
  2. Prepare uma solução de vermelho de rutênio a 0,02% dissolvendo 0,02 g de vermelho de rutênio em 100 mL de água ultrapura em um erlenmeyer de 125 mL envolto em papel alumínio para proteger o reagente fotossensível da luz. Tampe o frasco e identifique-o com o nome da solução, data de preparação e nome do preparador, e armazene-o a 20 °C.
  3. Remova as lâminas dos tubos refrigerados contendo etanol e água ultrapura e transfira as lâminas corretamente identificadas, contendo seções montadas, para tubos contendo água ultrapura a 100% (veja 1.1.6) para armazenamento temporário.
    NOTA: Siga as precauções de hidratação descritas no passo 5.3.
  4. Remova uma lâmina da água ultrapura com pinça e seque a água ao redor da fita com um tecido de baixa geração de fiapos para evitar que o corante escorra para o vidro. Coloque a lâmina em uma pequena bandeja de plástico.
  5. Aplique várias gotas da solução de vermelho de rutênio (veja 6.2) para cobrir uniformemente as seções transversais. Cubra as lâminas com papel alumínio por 10 min para protegê-las da luz, depois enxágue suavemente o corante da lâmina com água ultrapura por 2 min.
  6. Seque o excesso de água da lâmina e aplique 1–2 gotas de glicerol a 50% em água ultrapura sobre cada seção transversal. Cubra as seções transversais com uma lamínula de 24 mm × 30 mm (espessura No. 1.5) e prossiga para a análise microscópica e obtenção de imagens.
    NOTA: Realize a análise microscópica no mesmo dia para obter resultados ideais.

7. Imagem em campo claro

  1. Observe as seções transversais em iluminação de campo claro usando um microscópio com aumentos de 10×, 20× e 40×. Consulte a Tabela 1 para obter os parâmetros e configurações de aquisição de imagens.

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Resultados

O uso de tubos de centrífuga para simular condições do rúmen permitiu a digestão in vitro relativamente rápida e econômica de seções transversais de caule de Medicago sativa. Utilizando um micrótomo deslizante, foram preparadas seções transversais de 100 μm de espessura dos caules de M. sativa (Figura 1A). As seções transversais dos caules foram aderidas a lâminas de vidro com fita adesiva dupla face (Figura 1B) e imersas em solução de...

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Discussão

O material de alfafa utilizado no presente estudo consistiu em clones de cinco linhagens de alfafa. Duas linhagens experimentais foram selecionadas após dois ciclos de seleção divergente para digestibilidade in vitro da fibra detergente neutro (IVNDFD) a partir de plantas matrizes com baixa IVNDFD em 16 h e baixa IVNDFD em 96 h ou alta IVNDFD em 16 h e alta IVNDFD em 96 h12. Três linhagens comerciais com origens genéticas desconhecidas também foram incluídas no estudo, e as plantas m...

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Divulgações

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida sem quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um possível conflito de interesses. A menção a nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação tem como único objetivo fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. O USDA é um fornecedor e empregador que preza a igualdade de oportunidades. Todos os experimentos estiveram em conformidade com as leis vigentes dos Estados Unidos, o país onde foram realizados.

Agradecimentos

Os autores agradecem a R. Ted Jeo por suas contribuições sobre trabalhos anteriores relacionados. Agradecemos ao University Imaging Center da Universidade de Minnesota - Twin Cities pelo acesso ao software de aquisição e análise de imagens microscópicas para preparar as imagens para publicação. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos – Serviço de Pesquisa Agrícola [062-21500-001-000D] e pelo acordo cooperativo de não-assistência (nº 58-5062-2-016).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Folha de alumínioBoardwalk7106BW18 in × 1.000 ft; usada para proteger soluções de coloração sensíveis à luz da exposição à luz
Cloreto de cálcio di-hidratado, mínimo 99%Sigma Life ScienceC7902-500GNº CAS 10035-04-8; reagente para o tampão de McDougall’s
Software da câmeraNikonNIS-Elements AR 5.42.04Software de imagem de 64 bits usado para aquisição e análise de imagens
Gás dióxido de carbonoMathesonUN1013Qualidade técnica; usado para manter condições anóxicas durante a preparação e incubação
Banho-maria com circulação de águaPrecision—Banho-maria com circulação de água com controle de temperatura, usado para manter as amostras a 39 °C
Padrão de colmo de milhoUniversidade de MinnesotaNAColetado no outono de 2023 em St. Paul, Minnesota, EUA; moído a 1 mm e usado como substrato microbiano
Lâmina de coberturaThermo Scientific341924 mm × 30 mm, espessura No. 1,5, 1 oz
Câmera microscópica colorida Digital Sight 10 com sensor de imagem CMOS de grande formato FXNikonMQA20000Câmera digital colorida usada para adquirir imagens microscópicas em campo claro
Microscópio estereoscópicoNikonSMZ18Microscópio estereoscópico usado para orientar e posicionar seções transversais de caule
Fita adesiva dupla faceSelloTape Office Vinyl Double Sided Tape42702 mm × 53 m; usada para fixar seções transversais de caule em lâminas de vidro
Balança eletrônicaANDGH-202Balança analítica com leitura de quatro casas decimais
Frasco Erlenmeyer (125 mL)Kimax25600Frasco de 125 mL; compatível com rolha No. 5
Frascos Erlenmeyer (25 mL)Pyrex4980Frasco de 25 mL; compatível com rolha No. 0
Etanol (200 provas)Fisher Scientific04-355-720Etanol absoluto usado na preparação de soluções de coloração e enxágues pré-coloração
Isolamento rígido de espuma de poliestireno expandidoOwens Corning14077881 in × 2 ft × 2 ft, R-5, espuma de 15 PSI; usada para suportar entrenós de caule durante o corte em seções
PincetaFisher Scientific10-316APinceta de laboratório usada para manipular segmentos de caule, lâminas e seções montadas
Lâminas de vidroFisherBrand12550325 mm × 75 mm × 1 mm; usadas para montar seções transversais de caule
Frascos globo (6 L)PyrexCLS43205L-4EAFrascos de vidro de 6 L usados para preparação ou manipulação de volumes maiores de solução
Glicerina, líquido grau laboratorialFisher Science Education525342CNº CAS 56-81-5; glicerol usado em soluções de montagem e armazenamento
Tecido de algodão cru duplo (malha 50)JINIOHEE ShopB0FL27KXRN100% algodão, branqueado; usado para filtrar material e fluido ruminal
Proveta graduada (10 mL)Pyrex700024Proveta graduada de 10 mL usada para medir volumes líquidos
Ácido clorídricoFisherA1445-500Nº CAS 7647-01-0; usado com floroglucinol para preparar a coloração de Wiesner
Marcador industrial superpermanenteSharpie13601Ponta fina; usado para rotular tubos de incubação com marcações resistentes à água
Cloridrato de L-cisteína hidratadoSigma-AldrichC121800-10GNº CAS 345909-32-2; agente redutor usado na preparação da solução de incubação
Tecido sem fiaposKimberly-Clark341554,5 in × 8,5 in; usado para remover o excesso de líquido das lâminas sem deixar fibras
Lâmina de microtomo de perfil baixoLeica 81963065-LPLâmina de reposição de perfil baixo usada para preparar seções transversais uniformes de caule
Sulfato de magnésio hepta-hidratadoFisher ChemicalM80-500Nº CAS 10034-99-8; reagente para o tampão de McDougall’s
Barra de agitação magnéticaFisher Scientific03-411-78376 mm × 12 mm; usada para misturar tampões e soluções de inoculação
Rótulos para endereços postaisAvery51671/2 in × 1 3/4 in; usados para identificação de amostras e lâminas
PincelLoew-Cornell—Série 7000, redondo No. 3; pincel fino usado para transferir e manipular seções transversais de caule
Placas de Petri com tampaBecton Dickinson Labware8173111960 mm × 15 mm; usadas para armazenamento temporário de seções transversais de caule em água ultrapura
Floroglucinol, 1,3,5-tri-hidroxibenzenoSigma-AldrichP3502-25GNº CAS 108-73-6; reagente usado para preparar a coloração de Wiesner
Pipeta (100 μL)GilsonP 1000; 767547MPipeta de volume ajustável usada para dispensar soluções de coloração
Funil plástico de uso geralNalgene10-437-23E150 mm; usado para transferência e filtração de reagentes
Béquer de polipropileno (4 L)Nalgene1201-4000Béquer resistente a produtos químicos de 4 L usado para preparação e mistura de soluções de inoculação
Cloreto de potássioFisher ChemicalP217-500Nº CAS 7447-40-7; reagente para o tampão de McDougall’s
Lâminas de barbearPersonna66-00890,009 in de espessura; usadas para corte manual de material de caule
Vermelho de rutênio, oxicloreto de rutênio amonizadoSigmaR-2751Nº CAS 11103-72-3; corante histológico usado para visualizar substâncias pécticas
TesouraFiskars1063071Tesoura de uso geral usada para cortar fitas, espuma e outros consumíveis
Tubos cónicos de centrífuga com tampa rosqueável (50 mL)Corning430828Polipropileno, não pirógeno; usados para retenção, incubação, enxágue e armazenamento de amostras
Microtomo de deslizamentoLeica2000RMicrotomo de deslizamento usado para preparar seções transversais de caule com espessura de 100 μm
Bicarbonato de sódio, grau ACSFisher ChemicalS233-3Nº CAS 144-55-8; reagente para o tampão de McDougall’s
Cloreto de sódioFisher Chemical—Nº CAS 7647-14-5; reagente para o tampão de McDougall’s
Hidróxido de sódioFisher ChemicalS318-500Nº CAS 1310-73-2; usado na preparação da solução redutora
fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4)Sigma AldrichS-9763CAS 7558-79-4
Sulfeto de sódio anidro, ACS, mínimo 98,0%Oakwood Chemicals245960Nº CAS 1313-84-4; agente redutor usado na preparação da solução de incubação
Colher de laboratório (espátula)Fisher Scientific14-375-10Espátula de laboratório usada para transferir reagentes em pó
Placa de agitaçãoThermolyne by Sybron7200Placa de agitação magnética usada para misturar tampões e soluções de inoculação
Seringa (60 mL) com agulha largaMonoject935401028Seringa de 60 mL com agulha de grande calibre usada para dispensar a solução de inoculação
Porta-tubos de ensaioThermo Scientific14-809-44Porta-tubos usados para organizar e suportar tubos de incubação de 50 mL
TermômetroFisherBrand13201663Termômetro de laboratório usado para verificar a temperatura da solução e do banho-maria
Microscópio eretoNikonEclipse NiMicroscópio ereto de campo claro usado para visualização e obtenção de imagens de seções transversais de caule coradas
Bomba de uso geralLittle Giant Pump Co.502203Modelo 2E-38N; 115 VCA, 60 Hz, 1,7 A; usada para circular água e manter a temperatura uniforme do banho
Papel para pesagemVWR Scientific Products12578-165Papel descartável para pesagem usado para pesar e transferir reagentes sólidos e substrato de colmo de milho

Referências

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