Este protocolo visualiza a deposição de lignina e componentes da parede celular de pectina em seções transversais de hastes de alfafa (Medicago sativa L.). O objetivo é identificar tecidos específicos da haste que poderiam ser alvo para o desenvolvimento de novas linhagens de alfafa com características desejáveis de digestibilidade da haste.
Artigo de método
Incubação in vitro com Fluido Ruminal e Coloração Histológica de Componentes Seletivos da Parede Celular em Caules de Alfafa (Medicago sativa L.)
Neste artigo
Resumo
Resumo
O acúmulo de componentes da parede celular conforme as plantas crescem limita a nutrição forrageira para ruminantes. Em particular, a deposição de lignina nos tecidos vegetais dificulta a degradação dos carboidratos da parede celular, celulose e hemicelulose, reduzindo assim a quantidade de energia disponível a partir da forragem. O componente altamente digestível da parede celular, a pectina, entretanto, está prontamente disponível para degradação. Informações sobre a deposição de lignina e pectina em diferentes tipos celulares do caule podem fornecer subsídios mecanicistas sobre os fatores subjacentes à variação na digestibilidade do caule entre linhagens de alfafa. A incubação in vitro de secções transversais do caule em fluido ruminal simula os processos que os tecidos do caule sofrem no rúmen. Combinado com coloração histológica e microscopia, este método permite a visualização das alterações na degradação tecidual ao longo do tempo e a localização de lignina e pectina no caule. A coloração de Wiesner reage com unidades aldeído guaiacila (G) da lignina, corando-as de fúcsia. Da mesma forma, o vermelho de rutênio interage com os grupos carboxílicos da pectina, corando a pectina no caule em tons que variam do rosa ao laranja e marrom. Este protocolo descreve a digestão de secções transversais do caule de alfafa após exposição a microrganismos ruminais, seguida por coloração para visualizar os padrões de lignina e pectina nas paredes celulares. O método pode ser utilizado para identificar tecidos do caule nos quais a lignina e a pectina estão presentes ou ausentes, facilitando comparações entre linhagens de alfafa.
Introdução
Uma parede celular envolve todas as células vegetais. Celulose, hemicelulose, lignina e pectina são componentes da parede celular e contribuem para a fibra vegetal, parte necessária na dieta de ruminantes. Enquanto as pectinas são polissacarídeos altamente digeríveis (solúveis)1, a lignina é um polímero indigerível que limita a degradação da fibra2. Assim, a lignina reduz a digestibilidade da planta e, em última instância, diminui a energia disponível para o ruminante a partir da forragem. Contudo, a lignina sustenta funções fisiológicas importantes para a planta, como a condução de água por toda a planta ao reforçar os elementos traqueídios3. Trabalhos anteriores demonstraram que alterações na fibra do caule que reduzem a lignina ou aumentam a pectina poderiam melhorar a digestibilidade do caule e o valor nutricional da forragem4. Assim, este protocolo concentra-se nestes dois componentes da parede celular. As concentrações totais de lignina e pectina na parede celular do caule fornecem informações insuficientes para explicar os mecanismos subjacentes à digestibilidade da fibra do caule5. A incubação in vitro com fluido ruminal e a coloração histológica podem fornecer insights no nível celular, ao visualizar diferenças nos componentes da parede celular entre plantas com digestibilidade variável da fibra do caule4,6. No presente protocolo, a alfafa (Medicago sativa L.), uma leguminosa forrageira perene comum, serve como espécie modelo para ilustrar os padrões de lignina e pectina nos tecidos do caule, que contêm mais lignina, mas menos pectina do que as folhas.
A incubação in vitro com fluido ruminal simula a digestão de forragens no estômago de ruminantes, permitindo a observação dos efeitos da anatomia da forragem sobre a digestibilidade. Ao criar em tubo de ensaio condições semelhantes às encontradas no rúmen, secções transversais de colmos aderidas a lâminas de vidro podem ser removidas em diferentes momentos para avaliar o grau de degradação tecidual após exposição ao fluido ruminal6. Este método fornece uma abordagem relativamente simples, rápida e econômica para visualizar as estruturas anatômicas dos colmos de alfafa7 e examinar como os tipos celulares contendo diferentes componentes da parede celular mudam à medida que o colmo é digerido.
A coloração histológica de seções transversais de caules permite a visualização dos componentes da parede celular. O floglucinol e o ácido clorídrico (HCl) combinam-se para formar a coloração de Wiesner, que destaca os tecidos do caule contendo unidades de lignina ricas em guaiacila8 ao reagir com monômeros de aldeído G C6C3 (coniferaldeído)9. A lignina é composta por múltiplas subunidades monoméricas; no entanto, ao longo deste artigo, o termo “lignina” refere-se exclusivamente ao monômero da unidade G, pois é o monômero que reage com a coloração de Wiesner10 e, portanto, é visualizado por meio deste protocolo. Alguns tecidos, como os vasos do xilema, são sempre lignificados6. Caso contrário, a deposição de lignina nos tecidos do caule da alfafa começa quando o crescimento secundário (cambial) inicia e coincide com a cessação do alongamento dos entrenós do caule6. O vermelho de rutênio liga-se às substâncias pécticas, que contêm grupos carboxila que às vezes são esterificados e compartilham algumas cadeias laterais11. Os grupos carboxílicos das pectinas presentes na lâmina média e nas paredes celulares primárias interagem com o vermelho de rutênio11. A pectina está envolvida no alongamento celular e, portanto, está presente nas células durante o crescimento primário. Ao longo do manuscrito, o termo “pectina” refere-se genericamente ao conjunto de pectinas que podem estar presentes. O acoplamento da coloração histológica com a incubação in vitro ruminal facilita a observação da localização dos componentes da parede celular no caule e destaca como diferentes tipos celulares mudam durante a digestão ruminal. Em última análise, este protocolo pode ser usado para identificar células do caule que contêm lignina e pectina e para caracterizar os padrões entre linhagens de alfafa e tempos de incubação.
Protocolo
Esta pesquisa foi conduzida em conformidade com as diretrizes institucionais para o uso de animais (IACUC 2301-40689B).
1. Rotulagem dos tubos de amostra
- Preparação e rotulagem de tubos de amostra para incubação, armazenamento e coloração
- Rotule previamente cinco conjuntos separados de tubos cónicos descartáveis de 50 mL com tampa de rosca para cada amostra. Adicione o identificador da amostra e o tempo de incubação a cada tubo, conforme os usos descritos abaixo.
- Rotule os tubos de espera para pré-incubação e adicione 35 mL de água ultrapura.
- Rotule os tubos de incubação para uso nas Seções 3 e 4. Organize os tubos em racks separados de acordo com o tempo de incubação (0, 4, 8, 24, 48 ou 96 h).
NOTA: Utilize uma caneta permanente de grau industrial para evitar que os rótulos sejam removidos durante a imersão no banho-maria. - Rotule os tubos de armazenamento pós-incubação e adicione 35 mL de uma mistura 50:50 de glicerol a 100% e água ultrapura. Utilize esses tubos para armazenar as seções transversais digeridas em lâminas até a coloração.
- Rotule os tubos de pré-coloração e adicione 35 mL de uma mistura 50:50 de etanol a 200 graus e água ultrapura. Utilize esses tubos para extrair o glicerol das seções transversais antes da coloração.
- Rotule os tubos de hidratação e adicione 35 mL de água ultrapura.
2. Seccionamento transversal do caule e montagem em lâminas
- Usando pinças, selecione um segmento de caule por vez a partir dos caules da amostra e excise o centro do segmento.
NOTA: Utilize quatro caules por amostra como réplicas técnicas para cada réplica biológica. Selecione aleatoriamente os quatro caules entre todos os caules possíveis por amostra. Utilize um conjunto adicional de caules padrão como controle em todas as corridas de incubação. - Corte dois retângulos de espuma rígida de poliestireno extrudido, cada um com aproximadamente 2,5 cm de comprimento e 0,6 cm de espessura. Corte uma pequena cunha ao longo do comprimento de cada peça, de modo que um entrenó do caule se encaixe firmemente entre as duas peças de espuma.
- Monte o "sanduíche" de caule na platina de um micrótomo deslizante capaz de produzir seções com espessura de 100 μm. Usando um pincel de ponta fina, coloque uma gota de água sobre o caule e a lâmina do micrótomo para facilitar o corte limpo.
- Corte as seções transversais do caule com espessura de 100 μm. Use o pincel para transferir cada seção transversal para uma placa de Petri previamente rotulada contendo água ultrapura para armazenamento temporário, e remova qualquer espuma do recipiente.
NOTA: Substitua a lâmina do micrótomo se a espuma rasgar, pois o rasgo pode indicar uma lâmina desgastada. - Rotule manualmente duas lâminas de vidro padrão de 25 mm × 75 mm para cada amostra em cada tempo de incubação (2 colorações × 6 pontos de tempo = 12 lâminas por amostra para cada uma das réplicas biológicas). Inclua o identificador da amostra, o tempo de incubação e a coloração em cada rótulo.
- Corte um pedaço de fita dupla face de 2 mm de largura e 2,5 cm de comprimento. Posicione o lado curto da fita a 0,5 cm da base da lâmina, com o lado adesivo voltado para baixo, e pressione firmemente o lado de papel encerado da fita usando luvas para garantir aderência.
NOTA: Realize este passo sobre uma superfície plana para evitar quebrar as lâminas de vidro. - Use um microscópio estereoscópico para orientar todas as seções transversais na mesma direção. Remova o papel encerado da fita dupla face e, mantendo a orientação das seções transversais, transfira-as para a fita na lâmina de vidro previamente rotulada usando um pincel de ponta fina umedecido. Mantenha as seções transversais levemente úmidas.
- Coloque o papel encerado sobre as seções transversais e role levemente o pincel sobre ele para fixar firmemente as seções transversais à fita dupla face. Remova o papel encerado e coloque a lâmina montada contendo quatro seções transversais no tubo de armazenamento previamente rotulado descrito na etapa 1.1.2, garantindo que a água ultrapura cubra as seções transversais montadas.
- Para coloração com vermelho de rutênio e com a coloração de Wiesner, coloque duas lâminas frente a frente em cada tubo de armazenamento, com a fita dupla face voltada para fora.
NOTA: Após montar todas as lâminas e colocá-las em tubos contendo água ultrapura, armazene as lâminas durante a noite à temperatura ambiente, se necessário.
3. Preparação para a incubação in vitro de seções transversais de caules
- Utilize os tubos descartáveis de centrífuga de 50 mL com tampa de rosca preparados para incubação (ver 1.1.3). Agrupe todos os tubos de amostra para cada intervalo de incubação em um único suporte de plástico.
- Use uma balança analítica de quatro casas decimais para pesar 0,2 g de padrão de colmo de milho moído a 1 mm sobre papel de pesagem e transfira cuidadosamente o material para cada tubo de incubação, exceto para os tubos de 0 h, que servem como controle não incubado. Tampe os tubos e reserve-os até o uso.
NOTA: O padrão de colmo de milho fornece energia para sustentar os microrganismos do rúmen durante a incubação, pois a biomassa das seções transversais do caule é insuficiente para manter a atividade microbiana. - Encha um banho de água com circulação com quantidade suficiente de água e equilibre-a a 39 °C antes de iniciar a incubação. Ajuste a profundidade da água para cobrir a marca de 35 mL nos tubos de 50 mL e use um aerador, se necessário, para manter a circulação e temperatura da água uniformes.
- Preparação do tampão de McDougall para a solução de inoculação
- Prepare o tampão de McDougall no máximo 2 dias antes de iniciar as incubações.
NOTA: Misture o tampão de McDougall com fluido ruminal na proporção de 4:1 para preparar a solução de inoculação. Ajuste o volume do tampão conforme o número de amostras e prepare quantidade suficiente de solução de inoculação para fornecer 30 mL por tubo. - Meça 1.600 mL de água ultrapura. Transfira 1 L para um frasco Erlenmeyer plano de 3 L e reserve 600 mL para transferência e lavagem dos reagentes.
- Coloque um bastão magnético no frasco Erlenmeyer e posicione o frasco sobre uma placa de agitação.
- Coloque um funil de plástico no frasco Erlenmeyer. Adicione 15,7 g de bicarbonato de sódio (NaHCO₃), 5,9 g de fosfato dibásico de sódio anidro (Na₂HPO₄), 0,91 g de cloreto de potássio (KCl), 0,75 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,19 g de sulfato de magnésio heptaidratado (MgSO₄·7H₂O) e 0,06 g de cloreto de cálcio diidratado (CaCl₂), adicionando um reagente por vez e permitindo que cada reagente se dissolva antes de adicionar o próximo. Utilize partes dos 600 mL reservados de água ultrapura para lavar o funil após cada adição.
- Após a adição do cloreto de cálcio diidratado, insira um difusor de CO₂ para facilitar a dissolução e borbulhe a solução. Quando a solução ficar límpida, continue a borbulhar por mais 10–15 min.
- Tampe o frasco firmemente e fixe a tampa com fita crepe, pois o aquecimento do tampão pode pressurizar o recipiente.
- Armazene a solução a 20 °C por até 2 dias. Coloque a solução em um banho de água a 39 °C no dia anterior ao uso, ou coloque-a diretamente no banho de água a 39 °C se for utilizada no dia seguinte.
- Prepare o tampão de McDougall no máximo 2 dias antes de iniciar as incubações.
4. Incubação in vitro de seções transversais de caule
- No dia da incubação, coloque 47 mL de água e 4 mL de NaOH 1 N em um béquer de 100 mL em uma capela, e adicione 0,625 g de cisteína-HCl. Em um segundo béquer de 100 mL, adicione 0,625 g de sulfeto de sódio a 47 mL de água, mantendo as duas soluções separadas até que a solução de inóculo seja preparada.
- Encha uma garrafa térmica isolada com água quente para criar um ambiente aquecido para o transporte de microrganismos ruminais da vaca até o laboratório. Leve um balde de cinco galões para transferir a água quente da garrafa térmica.
- Dirija-se ao estábulo para coletar fluido ruminal da vaca canulada designada para o experimento pela equipe do estábulo.
NOTA: Colete o fluido ruminal aproximadamente no mesmo horário do dia e da mesma vaca durante todo o experimento para minimizar variações. Coordene com a equipe do estábulo para fornecer aviso prévio sobre o momento em que você estará no local para coletar o fluido ruminal. - Identifique a vaca experimental e use os equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo jaleco de laboratório, proteção ocular, capas para botas e luvas de comprimento até os ombros.
NOTA: Restrinja os procedimentos nas etapas 4.4–4.8 ao pessoal autorizado sob o protocolo IACUC aplicável. - Transfira a água quente da garrafa térmica para o balde de cinco galões. Prepare duas camadas de gaze grau 50 (pano de musselina) para filtrar o material ruminal.
- Coleta de fluido ruminal da vaca canulada
- Abra cuidadosamente a cânula e coloque a tampa no balde de cinco galões com água quente para evitar contaminar a tampa. Usando a mão com luva, remova material suficiente do rúmen para acessar a interface sólido-líquido do rúmen.
- Uma vez na interface sólido-líquido, colete várias mãos-cheias de material e esprema-o através de duas camadas de gaze grau 50, cada uma com aproximadamente 45 cm de lado, para dentro de uma garrafa térmica com tampa de rosca pré-aquecida. Descarte o material usado após espremer o fluido ruminal através da gaze.
- Repita a etapa 4.6.2 até que haja 1 L de fluido ruminal na garrafa térmica para cada conjunto de 60 tubos de inóculo, ajustando o volume conforme necessário com base no número de amostras a serem incubadas.
NOTA: Vacas canuladas têm limites específicos quanto à quantidade de fluido ruminal que pode ser extraída em uma determinada semana. Comunique-se com o gerente do estábulo para garantir que a quantidade de fluido ruminal retirada não exceda o limite estabelecido para a vaca.
- Após coletar quantidade suficiente de fluido ruminal, feche bem a garrafa térmica para manter sua temperatura. Recoloque a cânula e use a água quente no balde de cinco galões para a limpeza.
- Descarte as capas para botas, luvas e gaze sujas no recipiente apropriado ao sair do estábulo. Retorne ao laboratório o mais rápido possível para manter a temperatura do fluido ruminal e as condições anóxicas.
- Ao retornar ao laboratório, combine as duas soluções de agente redutor (ver 4.1) na capela e misture-as para preparar a solução redutora.
- Coloque um béquer de vidro com capacidade mínima de 2 L contendo um bastão de agitação em uma placa de aquecimento com agitação ajustada para <30 °C, e posicione um difusor de CO₂ acima do líquido. Adicione 1.600 mL do tampão de McDougall e agite lentamente, sem permitir que o difusor de CO₂ entre em contato com o líquido.
NOTA: Pode-se usar um béquer de polipropileno nesta baixa temperatura. Use CO₂ para deslocar o O₂ e ajudar a manter as condições anóxicas. - Forre um funil grande com duas camadas de musselina grau 50 e coloque-o sobre um cilindro graduado de 2 L. Filtre 400 mL de fluido ruminal e adicione-o ao tampão de McDougall (ver 3.4.7) para preparar a solução de inóculo.
- Adicione 80 mL da solução redutora (ver 4.9) à solução de inóculo e misture lentamente. Mantenha o difusor de CO₂ sem contato com o líquido.
- Na capela, remova as tampas dos tubos de incubação e organize-os em suportes separados de acordo com o tempo de incubação. Remova as tampas dos tubos de espera pré-incubação em preparação para a transferência das lâminas (ver 1.1.2).
- Selecione aleatoriamente um tubo de espera pré-incubação de cada vez e use pinças para transferir as lâminas montadas para o tubo de incubação correspondente (ver 1.1.3). Coloque cada tubo de incubação contendo as lâminas montadas em um suporte pequeno e coloque o tubo de espera pré-incubação de lado.
NOTA: Use duas pessoas para realizar as etapas 4.14–4.15. Sempre que possível, minimize o resfriamento da mistura de fluido ruminal com tampão. - Aspire 30 mL da solução de inóculo em uma seringa de 60 mL equipada com agulha romba de grande calibre. Dispense lentamente a solução pela parede interna do tubo de incubação, purgue o tubo com CO₂ por aproximadamente 20 s, tampe o tubo e devolva-o ao suporte.
- Coloque os suportes contendo os tubos inoculados em um banho-maria a 39 °C. Agite suavemente os tubos pelo menos uma vez por dia e altere as posições dos suportes diariamente para minimizar o aquecimento desigual.
NOTA: A formação de bolhas de gás nos tubos indica fermentação ativa. - No final de cada período de incubação, remova o suporte correspondente do banho-maria. Abra um tubo por vez, retire cada lâmina e enxágue suavemente os sólidos e a solução de inóculo residual com água ultrapura.
- Coloque as lâminas enxaguadas nos tubos de armazenamento pós-incubação contendo a mistura de glicerol-água descrita na etapa 1.1.4.
5. Coloração de seções transversais para lignina
- Se as lâminas tiverem sido armazenadas em uma mistura 50:50 de glicerol-água, transfira ambas as lâminas contendo as seções transversais montadas para tubos de pré-coloração contendo a solução de etanol-água ultrapura (ver 1.1.5). Armazene os tubos durante a noite em geladeira para remover o glicerol antes da coloração.
- Prepare uma solução de floroglucinol (PG) a 3% dissolvendo 0,3 g de PG em 10 mL de etanol absoluto em um erlenmeyer de 25 mL envolto em papel alumínio para proteger o reagente fotossensível da luz. Tampe o frasco e rotule-o com o nome da solução, data de preparação e nome do preparador, e armazene-o a 20 °C.
- Remova as lâminas dos tubos refrigerados e transfira-as temporariamente para os tubos de hidratação descritos na etapa 1.1.6, contendo água ultrapura a 100%.
NOTA: Mantenha as seções transversais hidratadas durante o manuseio para minimizar a oxidação, que pode danificar as seções e afetar a imagem subsequente. - Prepare a coloração de Wiesner na capela com auxílio de uma pipeta, misturando 50 μL de PG a 3% em etanol (ver 5.2) com 25 μL de ácido clorídrico (HCl) em um béquer de 50 mL.
NOTA: Ajuste as quantidades conforme o número de lâminas, mantendo a proporção de PG para HCl de 2:1.
ATENÇÃO: Manipule o ácido clorídrico na capela, pois é corrosivo para metais, causa queimaduras graves na pele e danos oculares, e pode provocar irritação respiratória. Evite inalar vapores ou aerossóis, use luvas, roupas, proteção ocular e facial apropriadas e lave bem a pele exposta após o manuseio. - Remova uma lâmina do tubo e seque suavemente o vidro ao redor da fita dupla face com um papel sem fiapos para evitar que a coloração escorra da fita. Coloque a lâmina em uma bandeja plástica pequena e use uma pipeta para aplicar várias gotas da coloração de Wiesner sobre as seções transversais.
- Acerte um cronômetro para 12 min e cubra as lâminas com papel alumínio para protegê-las da luz. Verifique as seções transversais durante a coloração e reaplique a coloração conforme necessário para evitar secagem.
NOTA: Evite que as seções transversais sequem, pois a oxidação pode danificar o tecido e afetar a imagem subsequente. - Após 12 min, remova cuidadosamente o excesso de coloração de Wiesner com um papel sem fiapos. Lave o tecido antes do montagem para minimizar a exposição da objetiva do microscópio aos vapores corrosivos do HCl.
- Aplicar 1–2 gotas de glicerol-água ultrapura a 50% sobre cada seção transversal e cubra com uma lamínula de 24 mm × 30 mm (espessura No. 1.5). Prossiga imediatamente para análise microscópica e obtenção de imagens.
NOTA: Adquira as imagens dentro de 6–8 h, pois a coloração de Wiesner é sensível ao tempo e pode ficar amarela e difundir-se a partir da seção transversal com o passar do tempo.
6. Coloração de cortes transversais para pectina
- Siga o passo 5.1 para remover a mistura de glicerol e água ultrapura de lâminas armazenadas antes da coloração.
- Prepare uma solução de vermelho de rutênio a 0,02% dissolvendo 0,02 g de vermelho de rutênio em 100 mL de água ultrapura em um erlenmeyer de 125 mL envolto em papel alumínio para proteger o reagente fotossensível da luz. Tampe o frasco e identifique-o com o nome da solução, data de preparação e nome do preparador, e armazene-o a 20 °C.
- Remova as lâminas dos tubos refrigerados contendo etanol e água ultrapura e transfira as lâminas corretamente identificadas, contendo seções montadas, para tubos contendo água ultrapura a 100% (veja 1.1.6) para armazenamento temporário.
NOTA: Siga as precauções de hidratação descritas no passo 5.3. - Remova uma lâmina da água ultrapura com pinça e seque a água ao redor da fita com um tecido de baixa geração de fiapos para evitar que o corante escorra para o vidro. Coloque a lâmina em uma pequena bandeja de plástico.
- Aplique várias gotas da solução de vermelho de rutênio (veja 6.2) para cobrir uniformemente as seções transversais. Cubra as lâminas com papel alumínio por 10 min para protegê-las da luz, depois enxágue suavemente o corante da lâmina com água ultrapura por 2 min.
- Seque o excesso de água da lâmina e aplique 1–2 gotas de glicerol a 50% em água ultrapura sobre cada seção transversal. Cubra as seções transversais com uma lamínula de 24 mm × 30 mm (espessura No. 1.5) e prossiga para a análise microscópica e obtenção de imagens.
NOTA: Realize a análise microscópica no mesmo dia para obter resultados ideais.
7. Imagem em campo claro
- Observe as seções transversais em iluminação de campo claro usando um microscópio com aumentos de 10×, 20× e 40×. Consulte a Tabela 1 para obter os parâmetros e configurações de aquisição de imagens.
Resultados
O uso de tubos de centrífuga para simular condições do rúmen permitiu a digestão in vitro relativamente rápida e econômica de seções transversais de caule de Medicago sativa. Utilizando um micrótomo deslizante, foram preparadas seções transversais de 100 μm de espessura dos caules de M. sativa (Figura 1A). As seções transversais dos caules foram aderidas a lâminas de vidro com fita adesiva dupla face (Figura 1B) e imersas em solução de inóculo de fluido ruminal para períodos de incubação variando de 4 h a 96 h (Figura 1C). Para a incubação in vitro, tubos descartáveis de centrífuga de 50 mL com tampa foram usados como recipientes de incubação e suplementados com 0,2 g de substrato de colmo de milho moído a 1 mm para manter os microrganismos ruminais durante toda a incubação. Os tubos foram incubados em banho-maria mantido a 39 °C (Figura 1D). A fermentação ativa pelos microrganismos ruminais foi confirmada visualmente pela formação de bolhas de gás na solução de inóculo. Os materiais necessários para este protocolo estão comumente disponíveis em laboratórios de química úmida. A fita adesiva dupla face não impediu a degradação do tecido durante a exposição ao fluido ruminal, mas manteve as porções do caule que restaram após a digestão, permitindo coloração subsequente e visualização microscópica.
Seções transversais de caule que não foram submetidas à incubação in vitro (0 h) permitiram a visualização dos componentes iniciais da parede celular em diferentes tecidos do caule. Seções transversais coradas com o corante de Wiesner identificaram tecidos que exibiam coloração associada à lignina (Figura 2A–E), enquanto seções transversais coradas com vermelho de rutênio destacaram tecidos que exibiam coloração associada a pectinas (Figura 3A–E). Nas seções coradas com Wiesner, as fibras do floema primário maduras exibiram coloração fúcsia (Figura 2B–E). Vasos do xilema e xilema interfascicular também exibiram coloração fúcsia (Figura 2B–D). A coloração com vermelho de rutênio foi observada na epiderme, colênquima, clorênquima, floema secundário (Figura 3B–E) e medula (Figura 3B–D). Algumas regiões de xilema interfascicular e fibras do floema primário também foram coradas com vermelho de rutênio (Figura 3B–E). Seções transversais completas do caule foram visualizadas pela montagem de uma grade de imagens 5 × 5 obtidas com aumento de 10× (Figura 2A e Figura 3A). Imagens adicionais de uma região da seção transversal do caule foram obtidas com aumento de 10× (Figura 2B e Figura 3B), 20× (Figura 2C e Figura 3C) e 40× acima (Figura 2D e Figura 3D) e abaixo (Figura 2E e Figura 3E) do câmbio vascular.
Tecidos corados com Wiesner de secções transversais de caule de M. sativa foram evidentes em todas as incubações in vitro de 0 h a 96 h (Figura 4A–F). Em 0 h, todas as células apresentavam bordas nítidas (Figura 4A). Após 8 h, evidências de degradação tecidual tornaram-se aparentes pelo borrar das bordas das células com paredes celulares finas e não lignificadas (isto é, não coradas) (por exemplo, colênquima) e pelo desaparecimento de células (por exemplo, floema secundário). Após 24 h, a estrutura tridimensional espiral dos vasos do xilema tornou-se mais evidente à medida que os tecidos circundantes se degradaram (Figura 4D). Após 24 h, as células não coradas degradaram-se e desapareceram progressivamente (Figura 4D–F). Conforme esses tecidos se degradaram, a perda de suporte anatômico provocou o colapso lateral da epiderme não corada, produzindo a aparência de uma fita de células finas e transparentes em 24, 48 e 96 h (Figura 4D–F).
A incubação in vitro de secções transversais do caule de M. sativa, seguida pela coloração com vermelho de rutênio, permitiu a visualização da coloração associada a pectinas nos tecidos do caule após 0–96 h de exposição ao fluido ruminal (Figura 5A–F). Entre 0 e 4 h, as bordas bem definidas ao redor de todas as células indicam que elas estavam intactas (Figura 5A,B). À medida que o tempo de incubação avançou para 8 h, os tecidos com paredes celulares finas e não lignificadas no córtex, incluindo o colênquima, o clorênquima e o floema secundário, perderam progressivamente a integridade estrutural, resultando no desfoque das bordas celulares (Figura 5C). Em 24, 48 e 96 h, grande parte do tecido cortical circundante havia desaparecido, enquanto porções da epiderme, do xilema interfascicular, da medula e dos tecidos vasculares permaneceram visíveis (Figura 5D–F). A perda da estrutura anatômica circundante foi acompanhada por colapso lateral da região epidérmica. Após 96 h, restava substancialmente menos tecido corado com vermelho de rutênio do que nos tempos iniciais de incubação (Figura 5F). De modo geral, a perda progressiva do tecido do caule durante a incubação foi acompanhada por uma redução nas células que apresentavam coloração positiva para vermelho de rutênio. A degradação e o desaparecimento de células finas, não lignificadas e associadas a pectinas eram esperados, pois a pectina degrada-se facilmente ao longo do tempo.
Figura 1: in vitro incubação de cortes transversais de caule de alfafa (ASegmentos de caule de alfafa foram fixados entre dois pedaços de espuma rígida de poliestireno expandido e montados em uma platina de micrótomo deslizante para seccionamento transversal.B) Quatro seções transversais, cada uma 100 μm grossos, foram fixados em uma lâmina de vidro com fita adesiva dupla face para in vitro incubação e coloração histológica. (CDuas lâminas de vidro foram colocadas uma contra a outra, com a fita adesiva dupla face voltada para fora, em um tubo de 50 mL contendo 30 mL de solução tampão com fluido ruminal como inóculo e 0,2 g de colmo de milho moído a 1 mm. O tubo foi purgado com CO₂ e fechado para incubação. Bolhas de gás ao longo da parede do tubo indicaram fermentação ativa por microrganismos ruminais durante a incubação.D) As grades contendo os tubos de 50 mL foram mantidas em um 39 °C banho-maria durante toda a incubação. O nível da água cobriu a solução de inoculação, mas permaneceu abaixo das aberturas dos tubos, impedindo que a água entrasse nos tubos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: A coloração de Wiesner em tecidos do caule de alfafa indica a distribuição dos componentes da parede celular lignificada. (A–E) Cortes transversais do caule de alfafa não digeridos (tempo de incubação = 0 h) serviram como referência inicial para identificar os tecidos do caule que exibem coloração de Wiesner. Vasos do xilema (XV), xilema interfascicular (ifX) e fibras do floema primário maduras (PP) coraram-se de fúcsia. Aumentos e barras de escala: (A) grade 5 × 5 de imagens emendadas adquiridas com aumento de 10×, barra de escala = 500 μm; (B) 10×, barra de escala = 500 μm; (C) 20×, barra de escala = 250 μm; (D, E) 40×, barras de escala = 150 μm. Abreviações: Xy = xilema; Ct = córtex; Pi = medula; Ep = epiderme; Co = colênquima; Ch = clorênquima; SP = floema secundário; XV = vasos do xilema; ifX = xilema interfascicular; PP = fibras do floema primário maduras. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: A coloração com vermelho de rutênio em tecidos de caule de alfafa indica a distribuição de polissacarídeos pécticos nas paredes celulares. (A–E) Seções transversais de caule de alfafa não digeridas (tempo de incubação = 0 h) serviram como referência inicial para identificar os tecidos do caule que exibem coloração com vermelho de rutênio. Epiderme (Ep), colênquima (Co), clorênquima (Ch), floema secundário (SP) e medula (Pi) exibiram coloração vermelha. Xilema secundário (SX) e floema primário maduro (PP) também apresentaram coloração, enquanto os vasos de xilema (XV) permaneceram comparativamente não corados. Aumentos e barras de escala: (A) grade 5 × 5 de imagens emendadas adquiridas com aumento de 10×, barra de escala = 500 μm; (B) 10×, barra de escala = 500 μm; (C) 20×, barra de escala = 250 μm; (D, E) 40×, barras de escala = 150 μm. Abreviações: Xy = xilema; Ct = córtex; Pi = medula; Ep = epiderme; Co = colênquima; Ch = clorênquima; SP = floema secundário; XV = vasos de xilema; SX = xilema secundário; PP = floema primário maduro. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Alterações nos tecidos do caule de alfafa após incubação in vitro e coloração de Wiesner. Seções transversais de caules de alfafa provenientes dos mesmos entrenós foram submetidas à incubação in vitro com fluido ruminal por (A) 0 h, (B) 4 h, (C) 8 h, (D) 24 h, (E) 48 h e (F) 96 h. Vasos do xilema (XV), xilema interfascicular (ifX) e fibras do floema primário maduras (PP) mantiveram a coloração de Wiesner ao longo dos períodos de incubação. Observou-se coloração tênue do ifX em tecido de caule imaturo. Com o aumento do tempo de incubação, os tecidos circundantes perderam progressivamente a integridade estrutural, tornando as estruturas vasculares coradas remanescentes cada vez mais aparentes. Barras de escala = 250 μm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: Alterações nos tecidos do caule de alfafa após incubação in vitro e coloração com vermelho de rutênio. Seções transversais de caules de alfafa provenientes dos mesmos entrenós foram submetidas à incubação in vitro com fluido ruminal por (A) 0 h, (B) 4 h, (C) 8 h, (D) 24 h, (E) 48 h e (F) 96 h. A coloração com vermelho de rutênio foi observada em múltiplos tecidos do caule, enquanto os vasos do xilema (XV) permaneceram relativamente não corados. Com o aumento do tempo de incubação, observou-se perda progressiva da estrutura tecidual e da coloração com vermelho de rutênio. Partes dos vasos do xilema, xilema interfascicular (ifX) e região epidérmica (Ep) permaneceram visíveis em tempos mais avançados de incubação. Barras de escala = 250 μm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Parâmetro | Configuração |
| Rápido (Foco) | 2000 × 1328 |
| Qualidade (Captura) | 2000 × 1328 |
| Modo de Cor | Cor RGB |
| Profundidade de Bits | 8 bits por canal |
| Profundidade Eficaz de Cor | RGB de 24 bits (8 bits R + 8 bits G + 8 bits B) |
| Ganho | 2 |
| Tempo de exposição com aumento de 10x (ms) | 30 |
| Tempo de exposição com aumento de 20x (ms) | 50 |
| Tempo de exposição com aumento de 150x (ms) | 150 |
Tabela 1: Configurações do microscópio e da câmera para aquisição de imagens. Configurações do microscópio, câmera e aquisição de imagens utilizadas para imagens em campo claro com um microscópio invertido equipado com câmera digital colorida e software de aquisição de imagens.
Discussão
O material de alfafa utilizado no presente estudo consistiu em clones de cinco linhagens de alfafa. Duas linhagens experimentais foram selecionadas após dois ciclos de seleção divergente para digestibilidade in vitro da fibra detergente neutro (IVNDFD) a partir de plantas matrizes com baixa IVNDFD em 16 h e baixa IVNDFD em 96 h ou alta IVNDFD em 16 h e alta IVNDFD em 96 h12. Três linhagens comerciais com origens genéticas desconhecidas também foram incluídas no estudo, e as plantas matrizes foram selecionadas com base na análise por espectroscopia no infravermelho próximo para identificar indivíduos com (a) maior teor de lignina, (b) menor teor de lignina e (c) menor teor de fibra detergente neutro e fibra detergente ácido. As cinco linhagens de alfafa foram transplantadas de um viveiro em maio de 2021 para ensaios de campo replicados em dois locais em Minnesota, EUA. Para as colheitas de primeiro e segundo corte de cada estação de crescimento, 10 hastes de cada linhagem de alfafa foram colhidas nos estádios vegetativo, pré-brotamento, início da floração, floração e vagem verde de maturidade da planta. O sétimo entrenó do ápice de cada haste foi seccionado e colocado em um tubo de 50 mL contendo uma mistura 50:50 de etanol a 200 graus e água ultrapura para armazenamento até a incubação das seções transversais. Esse método foi desenvolvido com base em trabalhos previamente realizados pelo grupo de laboratório na década de 1990, nos quais o sétimo entrenó foi selecionado como unidade de estudo4,6.
In vitro, a incubação com fluido ruminal e a coloração histológica de caules de alfafa foram utilizadas para compreender os padrões de deposição de componentes da parede celular nos tecidos do caule degradados. As incubações in vitro simularam o grau de degradação que um caule de alfafa sofre no rúmen, e a coloração histológica subsequente destacou a lignina e a pectina em células onde esses componentes da parede celular permaneceram detectáveis após a digestão microbiana controlada no tempo. O uso de um micrótomo deslizante garantiu uma espessura padronizada das secções transversais, minimizando artefatos de corte que poderiam interferir nos resultados13. Embora apenas a lignina e a pectina tenham sido examinadas no presente protocolo, corantes alternativos, como azul de toluidina, azul de Astra e Direct Red 23, também podem ser utilizados para a coloração histológica desses e de outros componentes da parede celular14,15,16. Além disso, a luz polarizada pode ser usada para detectar celulose nas paredes celulares, e reagentes fluorescentes, como safranina O, podem visualizar a lignina17 e os polissacarídeos da parede celular. Além disso, anticorpos podem ser utilizados para marcar pectinas específicas18. Além da alfafa, este protocolo poderia ser aplicado a outras espécies. No entanto, as respostas à coloração podem variar entre espécies, genótipos, estágios de desenvolvimento e condições ambientais19.
O uso de fita adesiva de baixo custo, dupla face, para fixar seções transversais de caules em lâminas de vidro já foi descrito anteriormente6,20. Antes de iniciar este protocolo de incubação in vitro, foi necessário identificar uma fita dupla face capaz de resistir à imersão em líquido por vários dias e que fosse facilmente obtida. Vários tipos de fita, diferindo quanto ao uso industrial pretendido e à espessura, foram avaliados. Resumidamente, pedaços de fita dupla face com 2,5 cm de comprimento e seções transversais de caules foram fixados em lâminas de vidro e imersos em água por períodos variados ao longo de uma semana, para determinar se permaneciam aderidos às lâminas. Algumas fitas duplas face se soltaram das lâminas de vidro, enquanto outras ficaram opacas após exposição prolongada ao líquido. A perda de transparência da fita interferiu na microscopia e impediu a obtenção de imagens de alta qualidade das seções transversais de caule. Uma fita dupla face de vinil apresentou o melhor desempenho entre os adesivos testados. A fita utilizada nos experimentos originais havia sido adquirida na década de 1990 e continuava eficaz; no entanto, o mesmo produto não pôde ser obtido para experimentos posteriores. Portanto, a fita selecionada deve ser testada antes do uso, para garantir que tanto a fita quanto as seções transversais permaneçam aderidas durante todo o período de incubação. A fita também deve permanecer transparente, permitindo a obtenção de imagens de alta qualidade.
A etapa de incubação in vitro do protocolo envolveu múltiplas etapas dependentes do tempo, que exigiram planejamento e coordenação cuidadosos. O tempo total necessário para o procedimento de incubação in vitro pode variar conforme o tamanho do experimento. Por exemplo, para gerar um conjunto de dados robusto de seções transversais de caules, quatro caules únicos de alfafa foram montados em cada lâmina para cada amostra × intervalo de incubação in vitro × combinação de corantes. Com 16 amostras, seis intervalos de incubação e dois corantes, um total de 768 seções transversais de caules foi necessário para cada execução de incubação in vitro. Aproximadamente 8 h foram necessárias para preparar as 768 seções transversais, que então puderam ser armazenadas durante a noite em placas de Petri contendo água ultrapura e montadas no dia seguinte. Antes do montagem, 192 lâminas de vidro e 96 tubos de centrífuga (50 mL) precisavam ser rotulados. O montagem das seções transversais exigiu mais 8 h, pois as seções foram orientadas de forma consistente entre os intervalos de incubação e os corantes, facilitando comparações entre os tecidos dos caules. Essa abordagem exigiu mais tempo do que o montagem aleatório das seções transversais. As lâminas montadas foram armazenadas durante a noite em água ultrapura antes do início da incubação in vitro no dia seguinte. Enquanto as seções transversais de caules de alfafa estavam sendo preparadas e montadas, o tampão de McDougall também precisava ser preparado. O tampão podia ser preparado com até dois dias de antecedência do início da incubação in vitro e precisava ser aquecido a 39 °C antes da inoculação das seções transversais montadas. Assim, planejamento e preparação cuidadosos foram necessários para a conclusão bem-sucedida do protocolo.
A coloração de Wiesner é comumente utilizada para visualizar estruturas associadas à lignina em tecidos vegetais. Embora este método de coloração seja relativamente simples21 e razoavelmente específico22, ele cora os grupos terminais de cinamaldeído associados às unidades de lignina guaiaçila (G)13. Em angiospermas dicotiledôneas, como a alfafa, as unidades G e siríngila (S) são os principais constituintes do polímero de lignina, embora subunidades com anel H também estejam presentes. Portanto, a coloração de Wiesner pode subestimar a lignina total no caule, pois não reage com a lignina S. Ambas as unidades G e S podem estar presentes no xilema interfascicular e nas fibras do floema primário (ou seja, tecidos esclerenquimatosos); assim, embora as unidades S possam não reagir com a coloração de Wiesner, a coloração das unidades G pode indicar a presença de estruturas associadas à lignina nesses tecidos. A coloração de Mäule poderia ser utilizada para visualizar as unidades S e fornecer uma representação mais completa das unidades de lignina no caule13. Também pode ocorrer variação na intensidade da coloração do pectato com vermelho de rutênio, dependendo do estado de esterificação ou desesterificação do ácido pectínico23. A coloração pode variar de um tom amarelo-alaranjado a um vermelho brilhante. Como o vermelho de rutênio pode interagir com diversos carboidratos, o uso deste corante pode resultar em superestimação do pectato nos tecidos11. Como a proporção de lignina aumenta com o amadurecimento do caule da alfafa, a lignina também pode interferir na coloração do pectato em caules mais velhos. As diferenças entre tons de uma mesma coloração podem ser difíceis de distinguir visualmente; no entanto, tecnologias de análise de imagem podem ajudar a superar essa limitação.
Após a incubação in vitro com fluido ruminal e coloração histológica, seções transversais de caules podem ser visualizadas ao microscópio, e imagens podem ser obtidas para análise subsequente. Como a coloração de Wiesner desaparece em até 24 h9, a análise microscópica em campo claro de caules corados para lignina deve ser concluída no mesmo dia da coloração, idealmente dentro de 6–8 h, para garantir coloração consistente entre as imagens. A coloração com vermelho de rutênio mantém sua intensidade ao longo do tempo; portanto, a aquisição das imagens no mesmo dia é menos crítica. Contudo, as imagens coradas com vermelho de rutênio também foram obtidas dentro de 6–8 h para manter a consistência. As imagens foram adquiridas usando uma câmera digital colorida de microscópio de alta definição e alta resolução, equipada com sensor de imagem CMOS de grande formato. Os mesmos parâmetros de exposição, ganho analógico, profundidade de bits, qualidade da imagem e foco foram utilizados para garantir comparabilidade entre as imagens e minimizar variações introduzidas por diferenças nos ajustes de aquisição. O tempo de exposição foi ajustado conforme a magnificação (10×, 20× e 40×) para evitar superexposição ou subexposição e produzir imagens de alta qualidade. Portanto, as comparações devem ser feitas entre imagens adquiridas na mesma magnificação para minimizar variações associadas a diferentes configurações de exposição. Os parâmetros de aquisição de imagens podem exigir ajustes dependendo do microscópio e da câmera utilizados (Tabela 1). Outras técnicas de microscopia, incluindo microscopia eletrônica de varredura 6,20 e microscopia de fluorescência14,15,17, também foram utilizadas para visualizar componentes da parede celular, embora a microscopia em campo claro tenha sido usada no presente protocolo.
Este protocolo gerou um grande conjunto de dados de imagens de seções transversais de caules (>15.000), que pode ser aproveitado para ampliar as informações qualitativas geradas neste protocolo com coloração histológica em direção à análise quantitativa utilizando tecnologias de aprendizado de máquina. Pipelines eficientes de análise de imagem podem automatizar e acelerar a extração de dados quantitativos a partir de imagens. A colaboração com cientistas da computação pode facilitar o desenvolvimento de ferramentas para pré-processar imagens, remover ruídos irrelevantes e extrair características de interesse para testar múltiplas hipóteses. Abordagens de aprendizado de máquina exigem conjuntos de dados de treinamento e teste adequados e de tamanho suficiente para garantir um desempenho robusto do modelo. Conjuntos de dados menores podem ser analisados usando abordagens mais simples de análise de imagem, como a medição manual de características de interesse com softwares de análise de imagem, tais como ImageJ24 ou com softwares de análise de imagem associados ao microscópio25. Portanto, considerar o uso pretendido dos dados de imagem pode melhorar a eficiência na determinação do tipo e número de imagens a serem adquiridas, bem como na abordagem analítica subsequente.
Divulgações
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida sem quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um possível conflito de interesses. A menção a nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação tem como único objetivo fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. O USDA é um fornecedor e empregador que preza a igualdade de oportunidades. Todos os experimentos estiveram em conformidade com as leis vigentes dos Estados Unidos, o país onde foram realizados.
Agradecimentos
Os autores agradecem a R. Ted Jeo por suas contribuições sobre trabalhos anteriores relacionados. Agradecemos ao University Imaging Center da Universidade de Minnesota - Twin Cities pelo acesso ao software de aquisição e análise de imagens microscópicas para preparar as imagens para publicação. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos – Serviço de Pesquisa Agrícola [062-21500-001-000D] e pelo acordo cooperativo de não-assistência (nº 58-5062-2-016).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Folha de alumínio | Boardwalk | 7106BW | 18 in × 1.000 ft; usada para proteger soluções de coloração sensíveis à luz da exposição à luz |
| Cloreto de cálcio di-hidratado, mínimo 99% | Sigma Life Science | C7902-500G | Nº CAS 10035-04-8; reagente para o tampão de McDougall’s |
| Software da câmera | Nikon | NIS-Elements AR 5.42.04 | Software de imagem de 64 bits usado para aquisição e análise de imagens |
| Gás dióxido de carbono | Matheson | UN1013 | Qualidade técnica; usado para manter condições anóxicas durante a preparação e incubação |
| Banho-maria com circulação de água | Precision | — | Banho-maria com circulação de água com controle de temperatura, usado para manter as amostras a 39 °C |
| Padrão de colmo de milho | Universidade de Minnesota | NA | Coletado no outono de 2023 em St. Paul, Minnesota, EUA; moído a 1 mm e usado como substrato microbiano |
| Lâmina de cobertura | Thermo Scientific | 3419 | 24 mm × 30 mm, espessura No. 1,5, 1 oz |
| Câmera microscópica colorida Digital Sight 10 com sensor de imagem CMOS de grande formato FX | Nikon | MQA20000 | Câmera digital colorida usada para adquirir imagens microscópicas em campo claro |
| Microscópio estereoscópico | Nikon | SMZ18 | Microscópio estereoscópico usado para orientar e posicionar seções transversais de caule |
| Fita adesiva dupla face | SelloTape Office Vinyl Double Sided Tape | 4270 | 2 mm × 53 m; usada para fixar seções transversais de caule em lâminas de vidro |
| Balança eletrônica | AND | GH-202 | Balança analítica com leitura de quatro casas decimais |
| Frasco Erlenmeyer (125 mL) | Kimax | 25600 | Frasco de 125 mL; compatível com rolha No. 5 |
| Frascos Erlenmeyer (25 mL) | Pyrex | 4980 | Frasco de 25 mL; compatível com rolha No. 0 |
| Etanol (200 provas) | Fisher Scientific | 04-355-720 | Etanol absoluto usado na preparação de soluções de coloração e enxágues pré-coloração |
| Isolamento rígido de espuma de poliestireno expandido | Owens Corning | 1407788 | 1 in × 2 ft × 2 ft, R-5, espuma de 15 PSI; usada para suportar entrenós de caule durante o corte em seções |
| Pinceta | Fisher Scientific | 10-316A | Pinceta de laboratório usada para manipular segmentos de caule, lâminas e seções montadas |
| Lâminas de vidro | FisherBrand | 125503 | 25 mm × 75 mm × 1 mm; usadas para montar seções transversais de caule |
| Frascos globo (6 L) | Pyrex | CLS43205L-4EA | Frascos de vidro de 6 L usados para preparação ou manipulação de volumes maiores de solução |
| Glicerina, líquido grau laboratorial | Fisher Science Education | 525342C | Nº CAS 56-81-5; glicerol usado em soluções de montagem e armazenamento |
| Tecido de algodão cru duplo (malha 50) | JINIOHEE Shop | B0FL27KXRN | 100% algodão, branqueado; usado para filtrar material e fluido ruminal |
| Proveta graduada (10 mL) | Pyrex | 700024 | Proveta graduada de 10 mL usada para medir volumes líquidos |
| Ácido clorídrico | Fisher | A1445-500 | Nº CAS 7647-01-0; usado com floroglucinol para preparar a coloração de Wiesner |
| Marcador industrial superpermanente | Sharpie | 13601 | Ponta fina; usado para rotular tubos de incubação com marcações resistentes à água |
| Cloridrato de L-cisteína hidratado | Sigma-Aldrich | C121800-10G | Nº CAS 345909-32-2; agente redutor usado na preparação da solução de incubação |
| Tecido sem fiapos | Kimberly-Clark | 34155 | 4,5 in × 8,5 in; usado para remover o excesso de líquido das lâminas sem deixar fibras |
| Lâmina de microtomo de perfil baixo | Leica 819 | 63065-LP | Lâmina de reposição de perfil baixo usada para preparar seções transversais uniformes de caule |
| Sulfato de magnésio hepta-hidratado | Fisher Chemical | M80-500 | Nº CAS 10034-99-8; reagente para o tampão de McDougall’s |
| Barra de agitação magnética | Fisher Scientific | 03-411-783 | 76 mm × 12 mm; usada para misturar tampões e soluções de inoculação |
| Rótulos para endereços postais | Avery | 5167 | 1/2 in × 1 3/4 in; usados para identificação de amostras e lâminas |
| Pincel | Loew-Cornell | — | Série 7000, redondo No. 3; pincel fino usado para transferir e manipular seções transversais de caule |
| Placas de Petri com tampa | Becton Dickinson Labware | 81731119 | 60 mm × 15 mm; usadas para armazenamento temporário de seções transversais de caule em água ultrapura |
| Floroglucinol, 1,3,5-tri-hidroxibenzeno | Sigma-Aldrich | P3502-25G | Nº CAS 108-73-6; reagente usado para preparar a coloração de Wiesner |
| Pipeta (100 μL) | Gilson | P 1000; 767547M | Pipeta de volume ajustável usada para dispensar soluções de coloração |
| Funil plástico de uso geral | Nalgene | 10-437-23E | 150 mm; usado para transferência e filtração de reagentes |
| Béquer de polipropileno (4 L) | Nalgene | 1201-4000 | Béquer resistente a produtos químicos de 4 L usado para preparação e mistura de soluções de inoculação |
| Cloreto de potássio | Fisher Chemical | P217-500 | Nº CAS 7447-40-7; reagente para o tampão de McDougall’s |
| Lâminas de barbear | Personna | 66-0089 | 0,009 in de espessura; usadas para corte manual de material de caule |
| Vermelho de rutênio, oxicloreto de rutênio amonizado | Sigma | R-2751 | Nº CAS 11103-72-3; corante histológico usado para visualizar substâncias pécticas |
| Tesoura | Fiskars | 1063071 | Tesoura de uso geral usada para cortar fitas, espuma e outros consumíveis |
| Tubos cónicos de centrífuga com tampa rosqueável (50 mL) | Corning | 430828 | Polipropileno, não pirógeno; usados para retenção, incubação, enxágue e armazenamento de amostras |
| Microtomo de deslizamento | Leica | 2000R | Microtomo de deslizamento usado para preparar seções transversais de caule com espessura de 100 μm |
| Bicarbonato de sódio, grau ACS | Fisher Chemical | S233-3 | Nº CAS 144-55-8; reagente para o tampão de McDougall’s |
| Cloreto de sódio | Fisher Chemical | — | Nº CAS 7647-14-5; reagente para o tampão de McDougall’s |
| Hidróxido de sódio | Fisher Chemical | S318-500 | Nº CAS 1310-73-2; usado na preparação da solução redutora |
| fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S-9763 | CAS 7558-79-4 |
| Sulfeto de sódio anidro, ACS, mínimo 98,0% | Oakwood Chemicals | 245960 | Nº CAS 1313-84-4; agente redutor usado na preparação da solução de incubação |
| Colher de laboratório (espátula) | Fisher Scientific | 14-375-10 | Espátula de laboratório usada para transferir reagentes em pó |
| Placa de agitação | Thermolyne by Sybron | 7200 | Placa de agitação magnética usada para misturar tampões e soluções de inoculação |
| Seringa (60 mL) com agulha larga | Monoject | 935401028 | Seringa de 60 mL com agulha de grande calibre usada para dispensar a solução de inoculação |
| Porta-tubos de ensaio | Thermo Scientific | 14-809-44 | Porta-tubos usados para organizar e suportar tubos de incubação de 50 mL |
| Termômetro | FisherBrand | 13201663 | Termômetro de laboratório usado para verificar a temperatura da solução e do banho-maria |
| Microscópio ereto | Nikon | Eclipse Ni | Microscópio ereto de campo claro usado para visualização e obtenção de imagens de seções transversais de caule coradas |
| Bomba de uso geral | Little Giant Pump Co. | 502203 | Modelo 2E-38N; 115 VCA, 60 Hz, 1,7 A; usada para circular água e manter a temperatura uniforme do banho |
| Papel para pesagem | VWR Scientific Products | 12578-165 | Papel descartável para pesagem usado para pesar e transferir reagentes sólidos e substrato de colmo de milho |
Referências
- Cosgrove DJ. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005;6(11):850-861.
- Moore KJ, Jung H-JG. Lignin and fiber digestion. Journal of Range Management. 2001;54(4):420-430.
- Barros J, Serk H, Granlund I, Pesquet E. The cell biology of lignification in higher plants. Annals of Botany. 2015;115(7):1053-1074.
- Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: cell wall deposition, composition, and degradability. Crop Science. 2002;42(2):524-534.
- Jung HG, Lamb JFS. Stem morphological and cell wall traits associated with divergent in vitro neutral detergent fiber digestibility in alfalfa clones. Crop Science. 2006;46(5):2054-2061.
- Engels FM, Jung HG. Alfalfa stem tissues: cell-wall development and lignification. Annals of Botany. 1998;82(5):561-568.
- Akin DE. Section to slide technique for study of forage anatomy and digestion. Crop Science. 1982;22(2):444-446.
- Jung HG, Deetz DA. Cell wall lignification and degradability. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:315-346.
- Blaschek L, et al. Cellular and genetic regulation of coniferaldehyde incorporation in lignin of herbaceous and woody plants by quantitative Wiesner staining. Frontiers in Plant Science. 2020;11:109.
- Blaschek L, et al. Different combinations of laccase paralogs nonredundantly control the amount and composition of lignin in specific cell types and cell wall layers in Arabidopsis. The Plant Cell. 2023;35(2):889-909.
- Nevins DJ. Analysis of forage cell wall polysaccharides. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:105-132.
- Xu Z, Heuschele DJ, Lamb JFS, Jung H-JG, Samac DA. Improved forage quality in alfalfa (Medicago sativa L.) via selection for increased stem fiber digestibility. Agronomy. 2023;13(3):770.
- Pradhan Mitra P, Loqué D. Histochemical staining of Arabidopsis thaliana secondary cell wall elements. Journal of Visualized Experiments. 2014;(87):51381.
- De Micco V, Aronne G. Combined histochemistry and autofluorescence for identifying lignin distribution in cell walls. Biotechnic & Histochemistry. 2007;82(4–5):209-216.
- Kraus JE, et al. Astra Blue and Basic Fuchsin double staining of plant materials. Biotechnic & Histochemistry. 1998;73(5):235-243.
- Ursache R, Andersen TG, Marhavý P, Geldner N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 2018;93(2):399-412.
- Baldacci-Cresp F, et al. A rapid and quantitative safranin-based fluorescent microscopy method to evaluate cell wall lignification. The Plant Journal. 2020;102(5):1074-1089.
- Casero PJ, Knox JP. The monoclonal antibody JIM5 indicates patterns of pectin deposition in relation to pit fields at the plasma-membrane-face of tomato pericarp cell walls. Protoplasma. 1995;188(1-2):133-137.
- Pesquet E, Cesarino I, Kajita S, Pawlowski K. Physiological roles of lignins – tuning cell wall hygroscopy and biomechanics. New Phytologist. 2025;248(6):2674-2706.
- Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: rate and extent of cell-wall thinning during ruminal degradation. NJAS: Wageningen Journal of Life Sciences. 2001;49(1):3-13.
- Yeung EC. A beginner’s guide to the study of plant structure. Tested Studies for Laboratory Teaching. 1998;19:125-142.
- Jensen, W.A. Botanical Histochemistry: Principles and Practice. Freeman W.H. & Co. San Francisco, CA. (1962).
- Ruzin, SE. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press; New York, NY; 1999.
- Gronwald JW, Bucciarelli B. Comparison of stem morphology and anatomy of two alfalfa clonal lines exhibiting divergent cell wall composition. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2013;93(11):2858-2863.
- Dai R, et al. Overexpression MsJAR1 gene increased lateral branches and plant height in alfalfa (Medicago sativa L.). Scientific Reports. 2025;15(1):16956.
Reimpressões e permissões
Este artigo foi publicado
Vídeo em breve