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Fluxo de Trabalho Padronizado para Coleta de Amostras Fecais Humanas e Extração Automatizada de Ácido Desoxirribonucleico Utilizando um Processador de Partículas Magnéticas

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11 de setembro de 2026

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1Gut Microbiome Division, SKAN Research Trust, 2Stem Cells Division, SKAN Research Trust

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é padronizar a coleta de amostras fecais humanas e a extração automatizada de ácido desoxirribonucleico utilizando um processador de partículas magnéticas.

Resumo

O sequenciamento do microbioma intestinal tornou-se uma abordagem importante para investigar a dinâmica das comunidades microbianas em estados saudáveis e patológicos. Alterações na composição microbiana têm sido associadas a diversas doenças relacionadas ao estilo de vida e ao envelhecimento, incluindo diabetes, leucemia e doenças neurodegenerativas. Como diferentes microrganismos apresentam características fisiológicas e exigências ambientais distintas, a coleta, o transporte e o processamento padronizados de amostras fecais são essenciais para preservar a integridade das amostras e minimizar a variabilidade técnica. As variações introduzidas durante o manuseio pré-analítico e a extração do ácido desoxirribonucleico (DNA) podem influenciar as análises downstream do microbioma e afetar a interpretação dos dados. O objetivo deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho padronizado para coleta de amostras fecais humanas e extração automatizada de DNA utilizando o MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (kit de extração de ácidos nucleicos) e o KingFisher Flex System (processador automatizado de partículas magnéticas). O fluxo de trabalho integra o manuseio controlado das amostras com a extração automatizada de ácidos nucleicos, reduzindo a variabilidade manual e melhorando a consistência do procedimento. O protocolo inclui coleta, armazenamento, preparação, extração automatizada e recuperação de ácidos nucleicos a partir de matrizes fecais complexas, seguindo padrões rigorosos. Resultados representativos demonstram a recuperação bem-sucedida de DNA adequado para aplicações downstream, incluindo o sequenciamento do gene do ácido ribonucleico ribossômico 16S (rRNA) e o sequenciamento metagenômico em shotgun. O fluxo de trabalho padronizado permite o processamento reprodutível das amostras, facilita a escalabilidade em estudos de microbioma e promove maior consistência entre experimentos. A demonstração visual oferece orientações práticas para a implementação do processamento padronizado de amostras fecais e da extração automatizada de ácidos nucleicos na pesquisa do microbioma intestinal.

Introdução

O microbioma intestinal é um ecossistema microbiano complexo que influencia o metabolismo do hospedeiro, a imunidade e a função neurológica, e está cada vez mais associado a diversas doenças, incluindo distúrbios metabólicos, doença de Parkinson, câncer e neurodegeneração1,2. Ele desempenha um papel importante na manutenção da fisiologia do hospedeiro ao influenciar o metabolismo, a função imunológica, a absorção de nutrientes e a resistência a microrganismos patogênicos3,4. Medições robustas e reprodutíveis do microbioma são essenciais para traduzir essas associações em compreensões mecanicistas e aplicações clínicas. Os avanços nas tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS) revolucionaram nossa compreensão das comunidades microbianas complexas que residem no trato gastrointestinal. No entanto, variáveis pré-analíticas, como os procedimentos de coleta de amostras fecais, condições de armazenamento, manipulação, transporte e métodos de extração de ácido desoxirribonucleico (DNA), podem alterar seletivamente a estrutura da comunidade microbiana, o rendimento de DNA e os resultados do sequenciamento5,6. Tais inconsistências metodológicas frequentemente dificultam comparações entre estudos.

Entre as etapas pré-analíticas críticas, a extração de DNA representa um dos determinantes mais influentes na qualidade dos dados do microbioma7,8. Um protocolo ideal de extração deve produzir de forma consistente DNA de alta qualidade e alto peso molecular, com contaminação mínima, em grande número de amostras. Plataformas automatizadas de extração de ácidos nucleicos podem melhorar a reprodutibilidade, reduzir erros de manipulação manual, diminuir o risco de contaminação e aumentar a produtividade. O desempenho dessas plataformas automatizadas de extração depende substancialmente dos parâmetros do protocolo, incluindo homogeneização da amostra, condições de agitação com esferas, química de lise, condições de incubação e manipulação de esferas magnéticas9,10. Portanto, estabelecer um fluxo de trabalho padronizado que integre coleta uniforme de amostras fecais com extração automatizada de DNA é essencial para gerar conjuntos de dados de microbioma confiáveis e reprodutíveis.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho padronizado para coleta, manipulação e extração automatizada de DNA de amostras fecais humanas, utilizando o kit de extração de ácidos nucleicos e o processador automático de partículas magnéticas descritos acima. O protocolo enfatiza a manipulação controlada das amostras, lise mecânica e química eficaz, remoção de inibidores e medidas de controle de qualidade apropriadas para aplicações posteriores, incluindo sequenciamento de amplicons do gene do ácido ribonucleico ribossômico 16S (rRNA), sequenciamento de genoma inteiro, reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCR) e sequenciamento metagenômico em tiro ao alvo. A demonstração visual fornece orientações práticas para o processamento padronizado de amostras fecais e extração automatizada de ácidos nucleicos, a fim de apoiar pesquisas reprodutíveis e escaláveis sobre o microbioma intestinal.

Protocolo

O estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Institucional da SKAN Research Trust e foi aprovado pelo comitê (Número de Aprovação: SKAN/IEC/2025/04). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da coleta das amostras.

OBSERVAÇÃO: Todos os reagentes, consumíveis e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Montar o kit de coleta de amostra fecal

  1. Monte um kit de coleta de amostra fecal contendo um coletor fecal estéril, um tubo de coleta com tampa de rosca (capacidade de 30–50 mL) com espátula acoplada, um tubo de coleta pré-cheio com tampão de estabilização, luvas descartáveis, material absorvente, um saco de transporte selável com rótulo de risco biológico e uma folha de instruções (Figura 1).
  2. Rotule cada tubo de coleta com um identificador único da amostra, a data e o horário da coleta, utilizando uma caneta permanente ou etiqueta pré-impressa.
  3. Inclua uma folha de instruções descrevendo o procedimento de coleta da amostra, precauções de manuseio, condições de armazenamento e requisitos de transporte.
    ​OBSERVAÇÃO: O tampão de estabilização é fornecido pré-carregado no tubo de coleta fecal como parte do kit de coleta fecal. O fabricante não divulga a composição nem o volume do tampão de estabilização. Colete aproximadamente 2–5 g de material fecal diretamente no tubo de coleta pré-cheio, conforme instruções do fabricante.

Kit de coleta de amostra fecal com luvas, tubo, saco de biohazard, coletor e folheto para análise.
Figura 1. Componentes do kit de coleta de amostra fecal. 
O kit de coleta de amostra fecal inclui luvas descartáveis, um coletor fecal estéril, um tubo de coleta fecal com tampa rosqueável e espátula acoplada, um saco de transporte selável com rótulo de biohazard e um folheto instrutivo fornecido aos participantes para coleta, manipulação, armazenamento e transporte da amostra fecal. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

2. Prepare o participante para a coleta de amostra

  1. Instrua o participante a lavar as mãos antes da coleta da amostra.
  2. Instrua o participante a esvaziar a bexiga antes da evacuação para evitar a contaminação da amostra fecal com urina.

3. Coletar a amostra fecal utilizando um coletor fecal

  1. Coloque um coletor fecal estéril sobre a borda do vaso sanitário para evitar o contato entre a amostra fecal e a água do vaso.
  2. Para coletores fecais adesivos, desdobre cuidadosamente o dispositivo ao longo das bordas indicadas, sem rasgá-lo. Siga as instruções do fabricante fornecidas com o coletor fecal e fixe o dispositivo firmemente na parte traseira do assento do vaso sanitário para criar uma superfície estável para coleta.
  3. Para coletores fecais não adesivos, posicione o dispositivo sobre a bacia do vaso sanitário conforme as instruções do fabricante, garantindo suporte estável.
  4. Assegure-se de que o coletor fecal não entre em contato com a água do vaso durante a coleta da amostra.
  5. Instrua o participante a realizar a evacuação diretamente sobre o coletor fecal.
  6. Coloque as luvas descartáveis fornecidas no kit de coleta antes de manipular a amostra.
  7. Abra o tubo de coleta estéril e use a espátula acoplada para coletar material fecal de pelo menos quatro a cinco regiões distintas das fezes, incluindo a superfície externa e o núcleo interno. Esse procedimento geralmente fornece cerca de 2–5 g de material fecal, quantidade suficiente para extração de DNA.
  8. Evite coletar material fecal que tenha entrado em contato com as bordas do coletor fecal ou com quaisquer superfícies externas.
  9. Feche firmemente o tubo de coleta imediatamente após a coleta da amostra.
  10. Misture completamente a amostra fecal com o tampão de estabilização agitando vigorosamente o tubo fechado manualmente até que a amostra fique uniformemente suspensa e não restem grandes grumos.
  11. Coloque o tubo de coleta fechado dentro do saco de transporte à prova de vazamentos e identificado como material biológico perigoso, contendo material absorvente.
  12. Descarte cuidadosamente o coletor fecal no vaso sanitário junto com as fezes, certificando-se de que o conteúdo não derrame. Acione a descarga para eliminar o coletor fecal e as fezes juntos.

4. Armazenar e transportar amostras fecais

  1. Armazene as amostras de acordo com as especificações do tampão de estabilização utilizado.
  2. Armazene as amostras à temperatura ambiente se o tampão de estabilização permitir a preservação em condições ambientes. Alternativamente, armazene as amostras a 4 °C para armazenamento de curto prazo (≤24–48 h) ou a −20 °C a −80 °C para armazenamento de longo prazo.
  3. Armazene as amostras conforme as recomendações do fabricante. As amostras coletadas com o tampão de estabilização empregado neste estudo são estáveis por até 2 anos à temperatura ambiente.
  4. Transporte as amostras em sacos herméticos de risco biológico contendo material absorvente para evitar vazamentos e contaminação.
  5. Mantenha as amostras nas condições de temperatura recomendadas durante o transporte. Utilize recipientes isolados e elementos de refrigeração quando necessário.
  6. Garanta a conformidade com as diretrizes institucionais de biossegurança e com as regulamentações locais aplicáveis ao transporte de espécimes biológicos.

5. Receber e registrar amostras

  1. Inspecione cada amostra ao recebê-la no laboratório quanto à rotulagem adequada, integridade do tubo e sinais de vazamento.
  2. Atribua um identificador específico do laboratório, se necessário, e registre a data e hora da coleta, condições de armazenamento e duração do transporte.
  3. Descarte amostras que apresentem vazamento, rotulagem inadequada ou integridade comprometida.

6. Prepare os placas

OBSERVAÇÃO: Prepare todas as placas antes de iniciar o fluxo de trabalho de extração. Realize todas as etapas que envolvem reagentes e amostras biológicas em um ambiente limpo, utilizando equipamento de proteção individual apropriado, incluindo jaleco de laboratório, luvas e proteção ocular. Figura 2 mostra o processador automático de partículas magnéticas (Figura 2A), posições de carregamento de placas (Figura 2B), adaptador para placa de poços profundos (Figura 2C), centrífuga compatível com placas (Figura 2D), instrumento de agitação por esferas (Figura 2E), suporte amortecedor (Figura 2F), suporte para placa (Figura 2G), placa de esferas de 96 poços (Figura 2H), placa de poços profundos (Figura 2I) e Placa de Eluição (Figura 2J).

Configuração de equipamentos de laboratório para preparação e análise de amostras, incluindo centrífuga e lisador de tecidos.
Figura 2. Equipamentos e consumíveis utilizados para extração automatizada de ácido desoxirribonucleico (DNA) fecal. 
(A) Processador automatizado de partículas magnéticas. (B) Posição de carregamento de placas no processador automatizado de partículas magnéticas. (C) Adaptador de placa de poços profundos para centrifugação. (D) Centrífuga compatível com placas. (E) Homogeneizador por esferas. (F) Suporte amortecedor utilizado durante a agitação por esferas. (G) Suporte para placa de poços profundos (adaptador) para agitação por esferas. (H) Placa de 96 poços com esferas fornecida com o kit de extração de ácidos nucleicos. (I) Placa de poços profundos de 96 poços. (J) Placa de Eluição de 96 poços. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

  1. Retire a placa de pontas do seu invólucro e mantenha-a pronta para carregamento no instrumento.
  2. Prepare a Placa de Eluição (Figura 2J) adicionando 200 µL do tampão de eluição fornecido com o kit de extração de ácidos nucleicos a cada poço de uma placa de 96 poços. Sobreponha a placa com filme adesivo transparente para evitar contaminação. Mantenha a placa selada até o momento de carregá-la no processador automático de partículas magnéticas. Identifique a placa como Placa de Eluição.
  3. Prepare a Placa de Lavagem 4 adicionando 1 mL de etanol a 80% em cada poço de uma placa de poços profundos. Sobreponha a placa com filme adesivo para evitar evaporação e contaminação.
  4. Prepare a Placa de Lavagem 3 adicionando 1 mL de etanol a 80% recém-preparado em cada poço de uma placa de poços profundos separada. Sobreponha a placa com filme adesivo.
  5. Prepare a Placa de Lavagem 2 adicionando 1 mL de tampão de lavagem em cada poço de uma placa de poços profundos. Sobreponha a placa com filme adesivo.
  6. Prepare a Placa de Lavagem 1 adicionando 1 mL de tampão de lavagem em cada poço de uma placa de poços profundos. Sobreponha a placa com filme adesivo.

7. Configurar o processador automático de partículas magnéticas

  1. Ligue o processador automático de partículas magnéticas. Verifique se a cabeça magnética 96-poços profundos correta e o bloco de aquecimento 96-poços profundos estão instalados.
  2. Execute o protocolo apropriado de verificação do instrumento (por exemplo, o protocolo Check_96dw_tip) utilizando um pente de ponteiras limpo e uma placa de poços compatível vazia antes de processar as amostras.
  3. Confirme que o programa de extração necessário está disponível no processador automático de partículas magnéticas.
    NOTA: O uso de uma cabeça magnética ou bloco de aquecimento incorretos pode reduzir o rendimento de ácidos nucleicos e danificar o instrumento.

8. Realize a lise da amostra

  1. Prepare um mapa de placa para registrar a posição de cada amostra na placa de 96 poços.
  2. Centrifugue a placa de 96 poços com esferas (Figura 2H) a 2.750 × g durante 10 s utilizando uma centrífuga compatível com placas (Figura 2D) e adaptador (Figura 2C) para recolher as esferas no fundo de cada poço.
    NOTA: Este passo evita perda de esferas durante a remoção do selo da placa.
  3. Remova cuidadosamente o selo da placa sem perturbar as esferas.
  4. Adicione 800 µL de tampão de lise a cada poço da placa com esferas.
  5. Evite aspirar as esferas durante a pipetagem.
  6. Deixe as amostras fecais congeladas descongelarem à temperatura ambiente até completa fusão. Misture suavemente as amostras para homogeneizá-las e prossiga imediatamente para a extração de DNA. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento, pois podem reduzir a qualidade e o rendimento do DNA.
    NOTA: Para amostras frescas, vortexe cada tubo com amostra fecal contendo a solução de estabilização por 5–10 s para garantir a homogeneização da amostra.
  7. Transfira 200 µL de cada amostra homogeneizada para o poço correspondente na placa com esferas.
  8. Utilize uma pipeta de canal único equipada com ponteiras estéreis de grande diâmetro (cortadas) para transferir as amostras. Evite pipetagem repetida para minimizar a perda de esferas e a consequente redução no rendimento de DNA.
  9. Selle a placa firmemente com filme adesivo, garantindo que todos os poços e bordas da placa estejam completamente selados.

9. Realize a lise mecânica (bombeamento com esferas)

  1. Fixe a placa selada no instrumento de lise por esferas (Figura 2E) utilizando o suporte adequado para placa (Figura 2G) e o suporte amortecedor (Figura 2F).
  2. Equilibre o instrumento colocando uma placa de peso igual oposta à placa da amostra.
  3. Configure o instrumento para 30 Hz durante 2 min e inicie a corrida.
  4. Permita que a corrida prossiga sem interrupção.
  5. Remova cuidadosamente a placa após a conclusão da corrida sem perturbar o selo.
    NOTA: Utilize o suporte amortecedor para evitar danos à placa durante a lise por esferas.

10. Realizar o processamento pós-lise

  1. Centrifugue a placa a 2.750 × g durante 5 min à temperatura ambiente usando uma configuração balanceada.
  2. Transfira cuidadosamente 400 µL do sobrenadante de cada poço para uma nova placa de poços profundos designada como Placa de Amostras.
  3. Evite transferir quaisquer perlas durante este passo.
    NOTA: A Placa de Amostras não contém perlas e não requer pré-centrifugação.
  4. Sobreponha a Placa de Amostras, se não for prosseguir imediatamente.
    NOTA: Armazene a placa de lisados sobreposta a 4°C durante a noite, se necessário. Alternativamente, armazene a Placa de Amostras sobreposta a −20°C por até 3 meses. Deixe as amostras descongelarem à temperatura ambiente antes de qualquer processamento adicional.

11. Prepare a mistura de microesferas de ligação

  1. Prepare a mistura de microesferas de ligação imediatamente antes do uso, combinando 500 µL de tampão de ligação de ácidos nucleicos com 20 µL de microesferas magnéticas por amostra. Misture bem para obter uma suspensão homogênea.
  2. Calcule o volume total da mistura de microesferas de ligação necessário com base no número de amostras.
  3. Para uma placa de 96 poços completa, prepare a mistura de microesferas de ligação adicionando 48,00 mL de tampão de ligação de ácidos nucleicos e 1,92 mL de microesferas magnéticas a um tubo cônico estéril. Misture bem para obter um volume final de 49,92 mL (520 µL por poço).
    NOTA: Prepare um volume suficiente para um ou dois poços adicionais para compensar a variabilidade na pipetagem.
  4. Misture suavemente a suspensão de microesferas de ligação por inversão até ficar homogênea.
  5. Transfira a mistura de microesferas de ligação para um reservatório de reagentes limpo.
  6. Imediatamente antes da distribuição, re suspenda as microesferas magnéticas pipetando a suspensão para cima e para baixo três a quatro vezes para evitar sedimentação das microesferas.
  7. Distribua 520 µL da mistura de microesferas de ligação em cada poço da Placa de Amostras preparada, utilizando uma pipeta multicanal.
  8. Pipete lentamente devido à viscosidade da solução e evite a formação de bolhas. Re suspenda suavemente a mistura de microesferas no reservatório de reagentes antes de cada etapa de distribuição para manter uma distribuição uniforme das microesferas em todos os poços.

12. Modifique o programa do instrumento MagMAX_Microbiome_Stool_Flex (programa de extração modificado)

  1. Baixe e instale o software BindIt (software para edição de protocolos) de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Baixe o programa do instrumento do site do fabricante.
  3. Inicie o software de edição de protocolos e aguarde a inicialização.
  4. Clique em Abrir e selecione o programa do instrumento baixado.
  5. Modifique os parâmetros do protocolo conforme descrito na Tabela 1.
  6. Salve o protocolo modificado e feche o software.
  7. Conecte o computador ao processador automático de partículas magnéticas usando um cabo USB ou serial RS-232C.
    NOTA: Certifique-se de que o processador automático de partículas magnéticas esteja desligado antes de conectar o computador.
  8. Ligue o processador automático de partículas magnéticas e aguarde a conclusão da inicialização.
  9. Inicie o software de edição de protocolos e confirme se ele detecta o processador automático de partículas magnéticas.
  10. Transfira o programa de extração modificado para o processador automático de partículas magnéticas.
  11. Confirme a transferência bem-sucedida do programa de extração modificado, então desligue o processador automático de partículas magnéticas.
EtapaAçãoParâmetros
1AssociaçãoAgitar; 5 ciclos de coleta; 37°C
2Coletar esferas5 ciclos magnéticos de coleta
3Lavagem 1Agitar por 20 s × 3 ciclos; 37°C
4Lavagem 2Agitar por 20 s × 3 ciclos; 37°C
5Lavagem 3Agitar por 20 s × 2 ciclos; 37°C
6Lavagem 4Agitar; 1 ciclo; 37°C
7SecagemSecar ao ar por 2 min
8Eluição75°C; 6 ciclos de agitação; pré-aquecimento ativado
9Coletar esferas3 ciclos magnéticos de coleta
10Transferir eluatoTransferir o ácido nucleico purificado para a Placa de Eluição

Tabela 1: Programa automatizado de extração para o processador de partículas magnéticas.
Resumo do programa automatizado de extração executado pelo processador automatizado de partículas magnéticas durante a extração de ácido desoxirribonucleico (DNA). O programa inclui ligação de ácidos nucleicos, coleta de microesferas magnéticas, etapas sequenciais de lavagem, secagem ao ar, eluição e transferência do DNA purificado para a Placa de Eluição. Os parâmetros operacionais para cada etapa automatizada são listados.

13. Realize a extração automatizada de ácidos nucleicos

  1. Ligue o processador automático de partículas magnéticas (Figura 2A) ativando primeiro a fonte de alimentação principal e depois o botão de energia do instrumento. Aguarde a conclusão da inicialização do sistema.
  2. Utilizando o painel de controle do instrumento, selecione o programa de extração modificado e inicie a execução.
  3. Quando solicitado, coloque a placa de ponteiras na posição 7 e pressione Iniciar para prosseguir. Consulte a Tabela 2 para verificar as posições de carregamento das placas (Figura 2B).
  4. Remova o filme de vedação da Placa de Eluição e carregue-a na posição 6, garantindo a orientação correta (poço A1 alinhado com a posição designada). Pressione Iniciar para prosseguir.
  5. Remova o filme de vedação da Placa de Lavagem 4 contendo etanol a 80%, carregue a placa na posição 5 com a orientação correta e pressione Iniciar.
  6. Remova o filme de vedação da Placa de Lavagem 3 contendo etanol a 80%, carregue a placa na posição 4 e pressione Iniciar.
  7. Remova o filme de vedação da Placa de Lavagem 2, carregue a placa na posição 3 e pressione Iniciar.
  8. Remova o filme de vedação da Placa de Lavagem 1, carregue a placa na posição 2 e pressione Iniciar.
  9. Quando solicitado, carregue a Placa de Amostra na posição 1, garantindo a orientação correta.
  10. Feche a tampa do instrumento e pressione Iniciar para iniciar a execução automática da extração.
  11. Permita que o programa seja executado sem interrupções até sua conclusão (aproximadamente 35–40 min).
    NOTA: A Tabela 1 resume o programa de extração automática executado pelo instrumento.
PlacaPosiçãoTipo de placaReagenteVolume por poço
Placa de amostra1placa de 96 poços profundosmistura de lisado da amostra + esferas de ligação920 µL
Placa de lavagem 12placa de 96 poços profundostampão de lavagem1.000 µL
Placa de lavagem 23placa de 96 poços profundostampão de lavagem1.000 µL
Placa de lavagem 34placa de 96 poços profundosetanol 80%1.000 µL
Placa de lavagem 45placa de 96 poços profundosetanol 80%1.000 µL
Placa de eluição6placa de 96 poçostampão de eluição200 µL
Placa de pente de pontas7placa padrão de poços profundospente de pontas de 96 poços profundosN/A

Tabela 2: Configuração de carregamento da placa para extração automatizada de ácidos nucleicos.
Posições de carregamento das placas, tipos de placa, reagentes e volumes de reagentes utilizados para extração automatizada de DNA com o processador de partículas magnéticas. A Placa de Amostra contém a mistura de lisado da amostra e esferas de ligação. N/A indica que nenhum reagente líquido foi adicionado à Placa de Pente de Ponteiras.

​14. Eluir e armazenar ácidos nucleicos

  1. Abra o instrumento após a conclusão da corrida e remova a Placa de Eluição cuidadosamente para evitar derramar os eluatos.
    NOTA: Se houver arraste visível de microesferas magnéticas na Placa de Eluição, transfira os eluatos para uma placa padrão de 96 poços e coloque a placa em um suporte magnético por 5–10 min. Transfira o sobrenadante clarificado para uma nova placa de 96 poços ou tubos devidamente rotulados utilizando uma pipeta multicanal.
  2. Transfira o DNA eluído para tubos ou placas de armazenamento devidamente rotulados.
  3. Armazene o DNA eluído a 4°C para uso de curto prazo, a −20°C para armazenamento de até 6 meses, ou a −80°C para armazenamento de longo prazo.

15. Realize a limpeza pós-execução

  1. Remova todas as placas e escovas de ponteiras usadas do processador automático de partículas magnéticas.
  2. Descarte todos os materiais descartáveis conforme as diretrizes institucionais de segurança biológica e descarte de resíduos químicos.
  3. Limpe qualquer derramamento utilizando um desinfetante laboratorial apropriado.
  4. Desligue o processador automático de partículas magnéticas e, em seguida, a fonte principal de energia.

Resultados

Amostras fecais de sete participantes foram coletadas com sucesso utilizando o fluxo de trabalho de coleta descrito, resultando em espécimes com massa suficiente e consistência apropriada para processamento posterior. As amostras foram armazenadas à temperatura ambiente após a coleta. A maioria das amostras apresentou textura e coloração uniformes, compatíveis com condições adequadas de coleta e armazenamento, enquanto um pequeno subconjunto mostrou leve variabilidade na consistência, o que pode refletir variação biológica entre os participantes. Nenhuma contaminação visível ou vazamento foi observado durante o transporte, e todas as amostras foram processadas dentro da janela de estabilidade validada do kit de coleta (até 2 anos à temperatura ambiente), o que comprova a robustez e confiabilidade do fluxo de trabalho de coleta (Figura 1).

O fluxo de trabalho automatizado de extração de DNA foi realizado utilizando o processador automatizado de partículas magnéticas (Figura 2A), configuração de carregamento de placas (Figura 2B), adaptador para placa de poços profundos (Figura 2C), centrífuga compatível com placas (Figura 2D), instrumento de agitação com esferas (Figura 2E), suporte amortecedor (Figura 2F), suporte para placa (Figura 2G), placa com esferas (Figura 2H), placa de poços profundos (Figura 2I) e placa de eluição (Figura 2J), seguindo o programa automatizado de extração resumido na Tabela 1 e a configuração de carregamento de placas apresentada na Tabela 2. A concentração e pureza do DNA foram avaliadas em amostras fecais representativas, e os resultados estão resumidos na Tabela 3. A concentração de DNA foi medida utilizando o ensaio fluorométrico de DNA de fita dupla de alta sensibilidade Qubit (ensaio fluorométrico de quantificação de DNA) em um fluorímetro Qubit (instrumento fluorométrico de quantificação de DNA), conforme as instruções do fabricante. As amostras foram misturadas com a solução de trabalho, incubadas por 2 min à temperatura ambiente e medidas juntamente com os dois padrões do ensaio. As razões de absorbância A260/A280 e A260/A230 foram determinadas utilizando um espectrofotômetro NanoDrop (espectrofotômetro de microvolume). As concentrações de DNA variaram de 36 a 87 ng/µL, com todas as amostras eluídas em um volume constante de 200 µL, permitindo a comparação direta da recuperação total de DNA entre os preparos (Tabela 3).

AmostraConcentração de DNA
(ng/µL)		A260/A280A260/A230Volume de eluição
(µL)		Rendimento total de DNA
(ng)
Amostra A621.831.7120012.400
Amostra B361.891.512007.200
Amostra C871.921.8520017.400
Amostra D502.031.8720010.000
Amostra E551.971.8120011.000
Amostra F851.991.8820017.000
Amostra G442.011.512008.800
Branco de extração0——2000

Tabela 3: Recuperação e pureza representativas do DNA após extração automatizada de amostras fecais humanas.
Concentração representativa de DNA, pureza (razões de absorbância A260/A280 e A260/A230), volume de eluição e rendimento total de DNA medidos após extração automatizada de DNA de amostras fecais humanas. A concentração de DNA foi determinada por meio de um ensaio fluorométrico. A amostra em branco de extração serviu como controle negativo e não apresentou DNA detectável.

Os resultados representativos demonstraram variabilidade na recuperação de DNA entre as amostras. Foram obtidas concentrações mais altas de DNA para a Amostra A (62 ng/µL), Amostra F (85 ng/µL) e Amostra C (87 ng/µL), enquanto concentrações intermediárias foram observadas para a Amostra D (50 ng/µL) e Amostra E (55 ng/µL). As Amostras B e G apresentaram as concentrações mais baixas de DNA (36 ng/µL e 44 ng/µL, respectivamente). As razões de absorvância A260/A280 variaram de 1,83 a 2,03, enquanto as razões de absorvância A260/A230 variaram de 1,51 a 1,88 (Tabela 3). Essa variação é esperada em espécimes fecais e pode refletir diferenças na composição da amostra e na variabilidade biológica, além da variação técnica associada ao processamento dos espécimes. O branco de extração não apresentou DNA detectável, indicando ausência de contaminação detectável durante o procedimento de extração. A amplificação representativa do gene bacteriano 16S rRNA quase completo gerou o amplicon de PCR esperado de aproximadamente 1,5 kb em amostras de DNA fecal, enquanto o controle sem molde não mostrou amplificação (Figura 3).

Eletroforese em gel; resultados da PCR do rRNA 16S; escada de DNA; análise do processo de separação em faixas.
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose de amplicons do gene bacteriano de RNA ribossômico 16S (rRNA) obtidos por reação em cadeia da polimerase (PCR). 
Gel de agarose representativo mostrando a amplificação do gene bacteriano de rRNA 16S quase completo (~1,5 kb) utilizando os iniciadores universais 27F e 1525R após extração de DNA de amostras fecais humanas. Faixa M: escada de DNA de 100 pares de bases (pb); Faixa 1: controle sem molde (branco); Faixas 2–8: amostras representativas de DNA fecal mostrando o amplicon de PCR esperado de ~1,5 kb. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

A implementação bem-sucedida deste protocolo é demonstrada pela recuperação de DNA mensurável e adequado para aplicações moleculares subsequentes, incluindo ensaios baseados em PCR, sequenciamento do gene de RNA ribossômico 16S, sequenciamento metagenômico em shotgun e preparação de biblioteca. Em conjunto, esses resultados representativos demonstram que o protocolo recupera consistentemente DNA de amostras fecais humanas, ao mesmo tempo que ilustra a amplitude de variação que pode ser encontrada entre espécimes biológicos.

Discussão

O protocolo descrito aqui fornece um fluxo de trabalho padronizado para coleta de amostras fecais humanas e extração automatizada de DNA para estudos do microbioma. Etapas críticas incluem a amostragem fecal representativa de múltiplas regiões das fezes, homogeneização completa com o tampão de estabilização, armazenamento e transporte adequados sob condições recomendadas, lise mecânica eficiente e manuseio cuidadoso durante a extração automatizada. A adesão consistente a essas etapas minimiza a variabilidade técnica e favorece a recuperação reprodutível de DNA. Estudos anteriores igualmente identificaram a coleta de amostras, as condições de armazenamento, a homogeneização e a extração de DNA como fontes importantes de variabilidade nas análises do microbioma e enfatizaram a importância de fluxos de trabalho padronizados para resultados reprodutíveis5,6,7,8. Os resultados representativos demonstram coleta bem-sucedida das amostras, sem contaminação ou vazamento visível, e recuperação mensurável de DNA em todas as amostras testadas.

Vários fatores procedimentais podem influenciar a recuperação do DNA e devem ser considerados durante a implementação. A lise mecânica ou química inadequada, a homogeneização incompleta, a ligação ineficiente dos ácidos nucleicos ou a perda de amostra durante as etapas de transferência e lavagem podem reduzir o rendimento de DNA. A variação na composição fecal, na biomassa microbiana e na consistência da amostra também pode contribuir para diferenças na recuperação de DNA entre espécimes. Portanto, a execução cuidadosa do protocolo, especialmente durante a homogeneização da amostra, o batimento com perlas e a extração automatizada, é importante para obter resultados consistentes. A resolução de problemas deve focar na verificação da preparação dos reagentes, configuração do instrumento, carregamento da placa e execução do programa de extração automatizada antes do processamento das amostras. Recomendações semelhantes foram relatadas em estudos que avaliam fluxos analíticos do microbioma e metodologias de extração de DNA5,6,7,8,11.

A principal limitação deste método é a variabilidade observada no rendimento de DNA entre espécimes biológicos. Como demonstrado pelos resultados representativos, as diferenças na concentração de DNA podem refletir variações biológicas inerentes entre amostras fecais, bem como variações técnicas introduzidas durante o processamento das amostras. Consequentemente, a concentração de DNA isoladamente não deve ser considerada o único indicador do desempenho da extração. Podem ser necessárias medidas adicionais de qualidade e adequação do DNA, dependendo da aplicação molecular subsequente pretendida. Para avaliar mais detalhadamente a qualidade e adequação do DNA para análises moleculares subsequentes, o gene bacteriano 16S rRNA foi amplificado por PCR utilizando os primers universais 27F e 1525R. A amplificação bem-sucedida do fragmento esperado de aproximadamente 1,5 kb do gene 16S rRNA foi confirmada por eletroforese em gel de agarose (Figura 3), demonstrando que o DNA extraído apresentava qualidade suficiente para aplicações subsequentes, incluindo sequenciamento e outros ensaios moleculares. Estudos comparativos anteriores também mostraram que o rendimento de DNA nem sempre se correlaciona com o desempenho no sequenciamento subsequente ou com a precisão na caracterização do microbioma8,11.

Em comparação com os fluxos de trabalho de extração manual, os processadores automatizados de partículas magnéticas reduzem o tempo de manipulação, padronizam as condições de extração e permitem o processamento de alto rendimento de amostras, minimizando ao mesmo tempo a variabilidade dependente do operador9,10. No entanto, variações na consistência das fezes e na biomassa microbiana podem influenciar a eficiência da lise e o rendimento de DNA. Além disso, microrganismos com paredes celulares resistentes podem não ser lisados completamente, o que potencialmente afeta a representação de certos táxons. Apesar dessas limitações, a extração automatizada oferece uma abordagem robusta e eficiente para estudos em larga escala do microbioma intestinal5,6,7,8,9,10. O presente protocolo combina a coleta padronizada de amostras fecais com um fluxo de trabalho automatizado de extração de DNA, fornecendo uma abordagem prática e reprodutível para estudos do microbioma que exigem processamento consistente de grande número de amostras. Metodologias padronizadas como esta facilitam a reprodutibilidade entre estudos e são particularmente adequadas para aplicações moleculares posteriores, incluindo a caracterização do microbioma, sequenciamento metagenômico e outras análises baseadas em sequenciamento5,6,7,8,9,10.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros ou não financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente ao SKAN Research Trust (Índia) pelos recursos e pelo ambiente colaborativo que tornaram este trabalho possível. Também agradecemos à Dra. Anushree Kogje por sua assistência na verificação de fatos e pelo apoio editorial.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Etanol 80% (preparado a partir de etanol absoluto)MerckET00161000Preparar fresco a partir de etanol absoluto conforme descrito no protocolo.
Material absorventeKimtech34256Incluído no saco de transporte.
Filme adesivo para selagem de placasApplied Biosystems4306311Filme adesivo transparente MicroAmp.
Processador automático de partículas magnéticas (Sistema KingFisher Flex de Purificação com cabeçote de 96 poços profundos)Thermo Fisher Scientific5400630Sistema automatizado de extração de ácidos nucleicos.
Saco de transporte vedável com rótulo de risco biológicoZymo ResearchR1180Saco de transporte à prova de vazamentos para transporte de espécimes.
Software BindItThermo Fisher Scientific5189009Software utilizado para modificar e transferir o protocolo automatizado de extração.
Tubo de coleta com espátula acoplada (30–50 mL)Zymo ResearchR1180Tubo de coleta estéril com tampa rosqueável.
Suporte amortecedorQIAGEN69984Conjunto de adaptadores TissueLyser (utilizado como suporte amortecedor durante a quebra por esferas).
Placa de poços profundos (96 poços)Thermo Fisher Scientific95040460Placa KingFisher Deepwell 96.
Luvas descartáveisZymo ResearchR1180Recomendadas sem pó.
Tampão de eluiçãoApplied BiosystemsA42357Fornecido com o Kit de Isolamento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.
Coletor fecalZymo ResearchR1180Dispositivo estéril de coleta.
Bloco de aquecimento (96 poços profundos)Thermo Fisher ScientificFornecido com o equipamentoComponente do Sistema KingFisher Flex de Purificação.
Guarda-pó laboratorialFornecedor localN/AEquipamento de proteção individual.
Tampão de liseApplied BiosystemsA42357Fornecido com o Kit de Isolamento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.
Esferas magnéticasApplied BiosystemsA42357Fornecidas com o Kit de Isolamento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.
Cabeçote magnético (96 poços profundos)Thermo Fisher ScientificIncluído com 5400630Cabeçote magnético de 96 poços profundos fornecido com o sistema KingFisher Flex.
Gradil magnético (96 poços)Thermo Fisher Scientific12332DRequerido apenas se for observado arraste de esferas magnéticas.
Pipeta multicanalEppendorf3125000052Compatível com placas de 96 poços.
Espectrofotômetro NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-WUtilizado para determinar as razões A260/280 e A260/230.
Tampão de ligação de ácidos nucleicosApplied BiosystemsA42357Fornecido com o Kit de Isolamento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.
Marcador permanenteSharpie3002Alternativamente, usar rótulos pré-impressos.
Pontas de pipeta, filtradas e esterilizadas (10 µL)Tarsons528100Pontas filtradas graduadas e estéreis.
Pontas de pipeta, filtradas e esterilizadas (200 µL)Tarsons528104Pontas filtradas graduadas e estéreis.
Pontas de pipeta, filtradas e esterilizadas (1.000 µL)Tarsons529106Pontas filtradas estéreis; cortar para preparar pontas de grande diâmetro conforme indicado no protocolo.
Adaptador de placa para centrífugaEppendorf5820710004Adaptador de placa de poços profundos Rotor A-2-DWP-AT.
Centrífuga compatível com placasEppendorf5810Compatível com o adaptador Rotor A-2-DWP-AT.
Suporte de placa para quebra por esferasQIAGEN69984Conjunto de adaptadores TissueLyser 2 × 96.
Rótulos pré-impressos (opcional)BradyBBP12Alternativa ao marcador permanente.
Ensaio Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ33231Ensaio fluorométrico utilizado para quantificação de DNA.
Fluorímetro QubitThermo Fisher ScientificQ33327Equipamento utilizado para quantificação fluorométrica de DNA.
Reservatório de reagentesThermo Fisher Scientific8093Reservatório de Reagentes Matrix.
Tampão de estabilização de amostrasZymo ResearchR1180Kit de Coleta Fecal DNA/RNA Shield.
Tubo cônico estérilHiMediaTCP106HUtilizado para preparação da mistura de esferas de ligação.
Homogeneizador mecânico por esferas TissueLyser IIIQIAGEN9003240Equipamento de lise mecânica.
Placa de pente de pontasThermo Fisher Scientific97002534Pente de pontas KingFisher 96 para ímãs de poços profundos.
Tampão de lavagemApplied BiosystemsA42357Fornecido com o Kit de Isolamento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.

Referências

  1. Joshi D, et al. Roles of human gut microbiota in metabolic, neurodegenerative, cardiovascular and gastrointestinal diseases. Discov Biotechnol. 2026;3(1):8. doi:10.1007/s44340-026-00053-2.
  2. Jin X, et al. Gut microbiota and Parkinson’s disease: exploring pathogenesis and potential therapeutic strategies from a gut-brain axis perspective. iScience. 2026;29(2):114185. doi:10.1016/j.isci.2025.114185.
  3. Hou K, et al. Microbiota in health and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):135. doi:10.1038/s41392-022-00974-4.
  4. Valencia S, et al. Human gut microbiome: a connecting organ between nutrition, metabolism, and health. Int J Mol Sci. 2025;26(9):4112. doi:10.3390/ijms26094112.
  5. Panek M, et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota: effects of collection, storage, DNA extraction and next-generation sequencing technologies. Sci Rep. 2018;8(1):5143. doi:10.1038/s41598-018-23296-4.
  6. Ece G, et al. Basic microbiome analysis: analytical steps from sampling to sequencing. Microorganisms. 2026;14(2):387. doi:10.3390/microorganisms14020387.
  7. Bharti R, Grimm DG. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Brief Bioinform. 2021;22(1):178-193. doi:10.1093/bib/bbz155.
  8. Zoruk P, et al. Impact of DNA extraction techniques and sequencing approaches on microbial community profiling accuracy. Front Microbiomes. 2025;4:1688681. doi:10.3389/frmbi.2025.1688681.
  9. Wallinger C, et al. Evaluation of an automated protocol for efficient and reliable DNA extraction of dietary samples. Ecol Evol. 2017;7(16):6382-6389. doi:10.1002/ece3.3197.
  10. Kwa WT, Sim CK, Low A, Lee JWJ. A comparison of three automated nucleic acid extraction systems for human stool samples. Microorganisms. 2024;12(12):2417. doi:10.3390/microorganisms12122417.
  11. Demkina A, et al. Benchmarking DNA isolation methods for marine metagenomics. Sci Rep. 2023;13(1):22138. doi:10.1038/s41598-023-48804-z.

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