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Isolamento e Cultura de Células Primárias de Músculo Liso Aórtico Murino para Estudos in vitro Relevantes para o Remodelamento Vascular e a Biologia de Aneurismas Aórticos

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DOI:

10.3791/73380

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9 de outubro de 2026

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1Department of Pediatrics, Division of Research, College of Medicine, University of Kentucky, 2Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, College of Medicine, University of Kentucky

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método reprodutível para o isolamento e cultivo de células musculares lisas aórticas primárias de origem murina, provenientes das regiões torácica e abdominal. O método produz células viáveis adequadas para estudos in vitro de remodelação vascular e biologia relacionada a aneurismas.

Resumo

O isolamento e cultivo de células musculares lisas aórticas primárias (CMLs) oferece uma abordagem valiosa para investigar os mecanismos celulares subjacentes às doenças vasculares, incluindo aneurismas da aorta. O presente artigo descreve um protocolo detalhado e otimizado para o isolamento e cultivo de CMLs aórticas murinas provenientes de segmentos torácicos e abdominais da aorta. O procedimento atual inclui a dissecação cuidadosa da aorta, remoção do tecido circundante e uma digestão enzimática em dois passos utilizando colagenase, elastase e inibidor da tripsina de soja, seguida por dissociação mecânica e expansão celular sob condições de cultivo definidas. Ênfase especial é dada aos passos que melhoram o rendimento, pureza e reprodutibilidade das células, incluindo a remoção da adventícia e o controle do tempo de digestão. Utilizando esta abordagem, as CMLs primárias podem ser isoladas e expandidas com sucesso, exibindo morfologia e padrões de crescimento característicos. Este protocolo fornece uma abordagem reprodutível e adaptável para a obtenção de CMLs aórticas primárias e serve como uma plataforma para estudos in vitro relevantes à remodelação vascular e à biologia do aneurisma da aorta.

Introdução

As células musculares lisas aórticas (SMCs) são componentes essenciais da parede vascular, contribuindo tanto para a integridade estrutural quanto para a regulação funcional da aorta. Em vasos saudáveis, as SMCs mantêm um fenótipo contrátil caracterizado pela expressão de proteínas contráteis, como a actina da musculatura lisa α (α-SMA) e a cadeia pesada da miosina da musculatura lisa (MYH11)1,2,3. Esse fenótipo sustenta o tônus vascular e preserva a organização da matriz extracelular. No entanto, em condições patológicas, como aneurisma da aorta abdominal (AAA), as SMCs sofrem modulação fenotípica rumo a um estado sintético e pró-inflamatório1,2,3. Essa transição está associada ao aumento da proliferação, secreção de citocinas e produção de enzimas degradadoras da matriz, contribuindo, por fim, para o enfraquecimento da parede aórtica4,5.

Modelos animais, incluindo a formação de aneurisma aórtico induzida por angiotensina II (Ang II), avançaram significativamente o entendimento da patogênese da AAA1,6,7,8,9,10,11. No entanto, esses modelos não permitem manipulação precisa de vias celulares nem observação direta de mecanismos específicos aos MLCs. Sistemas in vitro utilizando MLCs primários oferecem uma abordagem complementar, permitindo investigação detalhada de vias de sinalização, regulação gênica e respostas celulares em condições controladas12.

Apesar de sua utilidade, o isolamento de CMLs aórticas murinas primárias é tecnicamente desafiador. O pequeno tamanho da aorta murina, a presença de tecido adiposo e conjuntivo ao redor e o risco de contaminação por fibroblastos adventiciais podem comprometer a pureza celular. Além disso, a digestão enzimática deve ser cuidadosamente controlada para equilibrar a dissociação tecidual com a preservação da viabilidade celular. A variabilidade nessas etapas frequentemente leva a resultados inconsistentes entre experimentos e laboratórios.

Vários protocolos que descrevem o isolamento e o cultivo de células musculares lisas aórticas primárias de camundongos já foram publicados, a maioria dos quais baseia-se na remoção completa da adventícia por métodos mecânicos antes da digestão enzimática e foca principalmente em aortas inteiras ou segmentos aórticos torácicos13,14. O presente protocolo aprimora esses métodos incorporando várias refinamentos técnicos, incluindo um breve passo de pré-digestão enzimática para facilitar a separação das camadas adventícia e média antes da dissociação completa do tecido, condições padronizadas de digestão com dissociação mecânica suave intermitente e um fluxo de trabalho para o isolamento e cultivo separados de células musculares lisas da aorta torácica (THX) e abdominal (ABD). Juntos, esses aprimoramentos têm como objetivo melhorar a consistência e a reprodutibilidade do processamento do tecido, ao mesmo tempo que facilitam estudos regionais específicos sobre remodelação vascular e biologia de aneurismas. Os cultivos resultantes de CMLs são adequados para uma ampla gama de aplicações posteriores, incluindo silenciamento gênico, estudos farmacológicos e investigações mecanicistas relevantes para a remodelação vascular e a biologia de aneurismas. Embora CMLs primárias isoladas de aortas não doentes não repliquem inerentemente fenótipos aneurismáticos, elas fornecem um sistema controlado in vitro para investigar vias celulares implicadas no desenvolvimento de aneurismas após manipulação experimental direcionada.

Protocolo

Utilizaram-se camundongos fêmeas adultos C57BL/6J com 8 a 10 semanas de idade e peso de 18–20 g para o procedimento descrito abaixo. Dois camundongos foram utilizados por isolamento. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as orientações do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Kentucky e foram aprovados sob o protocolo nº 2022-4153. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais. Uma visão esquemática do fluxo de trabalho completo de isolamento e cultivo é mostrada em  Figura 1.

ATENÇÃO: A cetamina e a xilazina são substâncias controladas e devem ser manipuladas, armazenadas e descartadas de acordo com as políticas institucionais e as regulamentações aplicáveis. A colagenase tipo II e a elastase são enzimas proteolíticas que podem causar irritação na pele, nos olhos e no sistema respiratório. O azul de tripano é um corante perigoso e deve ser manipulado com equipamento de proteção individual apropriado, evitando-se o contato com a pele e os olhos. Todos os reagentes perigosos devem ser manipulados e descartados de acordo com as diretrizes de segurança institucionais e as instruções dos fabricantes.

1. Preparação dos reagentes e meios de cultura

  1. Prepare 10 mL de solução de digestão enzimática fresca no dia do isolamento em um tubo cônico estéril de 15 mL:
    1. Adicione 10 mg de colagenase tipo II (concentração final de 1 mg/mL) (ver Tabela de Materiais).
    2. Adicione 10 mg de inibidor de tripsina de soja (concentração final de 1 mg/mL) (ver Tabela de Materiais).
    3. Adicione 71 µL de suspensão de elastase (concentração final de 0,744 U/mL) (ver Tabela de Materiais).
    4. Prepare a solução em HBSS contendo cálcio e magnésio sem vermelho de fenol (ver Tabela de Materiais).
    5. Adicione 100 µL de penicilina/estreptomicina (1% do volume final) (ver Tabela de Materiais).
  2. Misture bem a solução e filtre esterilizando com um filtro de seringa de náilon de 0,2 µm (ver Tabela de Materiais).
  3. Prepare o meio de cultura completo para CML (500 mL)
    1. Adicione 385 mL de meio nutriente modificado de Eagle de Dulbecco/mistura nutritiva F-12 (DMEM/F12) sem vermelho de fenol (ver Tabela de Materiais) como meio base.
    2. Complete com 100 mL de soro bovino fetal tratado com carvão ativado/dextrana (20% do volume final) (ver Tabela de Materiais).
    3. Adicione 10 mL de penicilina/estreptomicina (2% do volume final) (ver Tabela de Materiais).
    4. Adicione 5 mL de anfotericina B (1% do volume final) (ver Tabela de Materiais)
  4. Filtre esterilize os meios e armazene a 4 °C.
  5. Pré-aqueça todos os reagentes a 37 °C antes do uso.

2. Preparação para o processamento de tecidos

  1. Aliquotar previamente a solução de digestão enzimática igualmente em 4 poços (2,5 mL cada) de uma placa de cultura de 6 poços e pré-aquecer na estufa a 37 °C com 5% de CO₂ antes do processamento do tecido. Dois poços devem ser designados como 'THX' e dois como 'ABD' para os segmentos aórticos. Vários segmentos da mesma região anatômica podem ser processados em um único poço.
  2. Preparar 2 placas de cultura separadas (ver Tabela de Materiais) contendo meio de cultura completo para CML e rotulá-las como THX e ABD.
  3. Pré-aquecer as placas de cultura contendo o meio em uma estufa umidificada.
  4. Preparar previamente 20 mL de HBSS estéril para perfusão vascular e manipulação do tecido.
  5. Montar 2 placas de cultura adicionais contendo 3 mL de HBSS cada para a limpeza sequencial das aortas isoladas.
  6. Preparar tubos cónicos de 15 mL rotulados (ver Tabela de Materiais) contendo 5 mL de HBSS cada para armazenamento temporário e separação dos segmentos aórticos THX e ABD.
  7. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos entre os animais aplicando detergente, enxaguando com água destilada, desinfetando com etanol 70% e esterilizando usando um esterilizador de contas (ver Tabela de Materiais).

3. Preparação do animal e dissecação da aorta

  1. Anestesiar camundongos por injeção intraperitoneal (IP) de quetamina (300 mg/kg) e xilazina (30 mg/kg) (consulte a Tabela de Materiais), conforme aprovado sob o protocolo IACUC da Universidade de Kentucky 2022-4153 para procedimentos terminais.
  2. Confirmar profundidade adequada da anestesia pela ausência de resposta reflexa ao aperto nos dedos dos pés.
  3. Estérilizar o campo cirúrgico utilizando etanol a 70%.
  4. Enquanto estiverem sob anestesia cirúrgica profunda, eutanasiar os camundongos por exsanguinação mediante punção cardíaca seguida de perfusão transcardial com HBSS, de acordo com as diretrizes institucionais e da AVMA.
  5. Abrir a cavidade torácica e realizar punção cardíaca para coletar o sangue.
  6. Perfusar a vasculatura através do ventrículo esquerdo utilizando uma seringa de 10 mL acoplada a uma agulha de 25 graus para injetar lentamente 10 mL de HBSS estéril. Recomenda-se uma taxa de perfusão de aproximadamente 0,5 mL/s para garantir a remoção eficiente do sangue residual.
  7. Remover cuidadosamente os órgãos adjacentes (fígado, pulmões, baço, trato gastrointestinal, rins). Deixar um pedaço do diafragma conectado à aorta.
  8. Isolar a aorta desde a raiz aórtica até a bifurcação ilíaca, mantendo o diafragma intacto. O diafragma serve como limite anatômico entre as regiões torácica (THX) e abdominal (ABD) (Figura 2B).
  9. Transferir imediatamente a aorta para HBSS estéril (Figura 2A).

4. Limpeza e segmentação da aorta

  1. Coloque a placa de cultura estéril contendo a aorta sob um microscópio estereoscópico (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Remova cuidadosamente o tecido adiposo e o tecido conjuntivo utilizando pinças finas (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Divida a aorta em segmentos THX e ABD.
    NOTA: O segmento THX estende-se da região da aorta logo acima do diafragma até a raiz aórtica, enquanto o segmento ABD estende-se da região da aorta logo abaixo do diafragma até a bifurcação ilíaca (Figura 2B).
  4. Transfira os segmentos limpos para tubos cónicos separados de 15 mL com HBSS fresco para processamento adicional.

5. Digestão enzimática e isolamento celular

  1. Incubar segmentos aórticos em solução enzimática a 37 °C por 8–10 min.
  2. Remover os segmentos aórticos da solução enzimática.
  3. Transferir os segmentos para placas de cultura separadas contendo meio completo para CML designado para amostras THX e ABD.
  4. Remover a camada adventícia da aorta utilizando pinças grossas e finas. A remoção completa da adventícia é confirmada quando a superfície externa da aorta apresenta aparência lisa e translúcida, sem tecido conjuntivo ou tecido adiposo residual visível (Figura 2C).
  5. Transferir os segmentos aórticos para nova solução enzimática e picar a camada média em fragmentos pequenos diretamente dentro da solução (Figura 3A).
  6. Incubar os fragmentos teciduais a 37 °C em incubadora umidificada com 5% CO₂ por 1 h.
  7. Realizar dissociação mecânica suave por pipetagem para cima e para baixo aproximadamente 10–15 vezes para facilitar a liberação celular (Figura 3B).
  8. Repetir a etapa de dissociação mecânica em intervalos de 30–60 min durante a incubação contínua, por um tempo total de digestão de 2–3 h ou até que seja obtida uma suspensão celular homogênea.

6. Coleta, lavagem, semeadura e cultivo inicial de células

  1. Transfira a solução de digestão enzimática contendo as células dissociadas para tubos cônicos separados de 15 mL (consulte a Tabela de Materiais), designados para as amostras de THX e ABD.
  2. Lave cada poço de digestão com 5 mL de meio de cultura e combine com os tubos correspondentes.
  3. Centrifugue a suspensão celular a 400 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Repita a centrifugação se a formação do pellet for insuficiente.
  5. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet celular (Figura 3C).
  6. Resuspenda as células com 5 mL de meio de cultura fresco e realize uma etapa adicional de lavagem seguida por centrifugação nas mesmas condições.
  7. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet celular final em um volume apropriado (geralmente 6 mL) de meio completo de cultura de CML.
  8. Plaque toda a suspensão celular obtida do segmento aórtico torácico ou abdominal em dois poços de uma placa de cultura de 6 poços (3 mL de meio suspenso por poço) e incube a 37 °C com 5,0% de CO₂. As células são semeadas imediatamente após o isolamento, sem contagem prévia; portanto, nenhuma densidade de semeadura alvo é utilizada nesta etapa.
  9. Mantenha as culturas sem perturbação por 5–7 dias para permitir a adesão celular e a expansão inicial.
    PONTO DE PAUSA: Após o plaqueamento, as culturas podem ser mantidas na incubadora por 5–7 dias antes de prosseguir para as etapas de manutenção e expansão celular da Seção 7.

7. Manutenção e expansão celulares

  1. Substitua o meio de cultura a cada 3–4 dias.
  2. Monitore regularmente a morfologia e a confluência celular.
  3. Subcultive as células quando atingirem aproximadamente 80–90% de confluência.
  4. Aspire o meio de cultura e lave as células com solução salina tamponada com fosfato aquecida previamente (PBS) (veja Tabela de Materiais).
  5. Adicione tripsina-EDTA 0,05% e incube a 37 °C por 5–10 min.
  6. Prossiga quando 80%–90% das células estiverem destacadas.
  7. Bata suavemente no frasco de cultura para facilitar o destacamento.
  8. Adicione volume igual de meio de cultura completo para neutralizar a tripsina.
  9. Pipete suavemente para destacar as células remanescentes.
  10. Transfira a suspensão celular para tubos cônicos e centrifugue a 400 × g por 5 min.
  11. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em meio de cultura fresco.
  12. Plaque as células em uma razão de divisão de 1:2 (ou na densidade experimental desejada) e incube a 37 °C com 5% de CO₂. Deixe as células aderirem sem perturbação por 24–48 h.
    NOTA: Para experimentos subsequentes, utilize células entre as passagens 3 e 7 (P3–P7) para minimizar a deriva fenotípica induzida pelo cultivo. Células além da passagem 7 são mais propensas à deriva fenotípica e podem exibir alterações na morfologia e função.

8. Validação por coloração de imunofluorescência para α-SMA

  1. Cultive células em material adequado para microscopia fluorescente.
    1. Plaque células em uma placa de fundo óptico de 96 poços a 15.000 células por poço. Deixe as células crescerem até a confluência desejada.
  2. Prepare as células para fixação
    1. Aspire o meio de cultura das células aderentes. Lave 3 vezes com 200 µL por poço de solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween 20 (TBS-T) por 5 min a cada lavagem, depois aspire com vácuo de cabine biológica.
  3. Fixe as células
    1. Adicione 200 µL por poço de paraformaldeído a 4% em PBS 1x. Incube por 10–20 min à temperatura ambiente, depois aspire.
  4. Permeabilização
    1. Adicione 200 µL por poço de Triton X-100 a 0,1% em PBS 1x. Incube por 10–15 min à temperatura ambiente, depois aspire.
  5. Bloqueio da ligação inespecífica
    1. Lave as células 3 vezes com 200 µL por poço de TBS-T por 5 min a cada lavagem. Adicione 200 µL por poço de albumina sérica bovina a 5% (BSA) em TBS-T.
    2. Coloque a placa em agitador orbital a aproximadamente 200 rpm por 1 h à temperatura ambiente.
  6. Coloração com anticorpo primário
    1. Prepare o anticorpo primário α-SMA em diluição 1:1.000 em BSA a 5% em TBS-T.
    2. Retire a placa do agitador orbital e aspire a solução de bloqueio dos poços destinados à coloração com α-SMA. Para o controle apenas com anticorpo secundário, omita o anticorpo primário e mantenha o poço controle em BSA a 5% em TBS-T.
    3. Adicione 200 µL por poço do anticorpo primário α-SMA diluído aos poços experimentais. Incube os poços experimentais e o controle apenas com anticorpo secundário durante a noite a 4 °C em agitador orbital suave.
  7. Coloração com anticorpo secundário
    1. Prepare o anticorpo secundário fluorescente em diluição 1:2.500 em TBS-T contendo 0,1% de Tween 20.
    2. Retire a placa do agitador orbital e aspire todos os poços.
    3. Lave todos os poços 3 vezes com 200 µL por poço de TBS-T por 5 min a cada lavagem, depois aspire.
    4. Adicione 200 µL por poço do anticorpo secundário fluorescente diluído a todos os poços, incluindo o controle apenas com anticorpo secundário.
    5. Proteja a placa da luz e incube em agitador orbital a aproximadamente 200 rpm por 1 h à temperatura ambiente.
  8. Coloração nuclear e imagem de fluorescência
    1. Prepare uma solução de Hoechst 33342 a 2 µg/mL.
    2. Lave as células 3 vezes com 200 µL por poço de TBS-T por 5 min a cada lavagem. Adicione quantidade suficiente da solução de coloração com Hoechst 33342 para cobrir as células e incube por 10 min à temperatura ambiente, protegido da luz.
    3. Adquira imagens de fluorescência usando um microscópio invertido com aumento de 20x para culturas de THX e ABD coradas para α-SMA e aumento de 10x para os controles apenas com anticorpo secundário, utilizando excitação de 385 nm para Hoechst 33342 e excitação de 475 nm para o anticorpo secundário conjugado a fluoróforo. Os controles apenas com anticorpo secundário foram imagiados em 10x para incluir um número suficiente de núcleos no campo de visão.
  9. Quantificação de células positivas para α-SMA.
    1. Avalie a positividade para α-SMA contando núcleos positivos para Hoechst associados a células que exibem coloração citoplasmática clara, em formato fusiforme e positiva para α-SMA. Classifique conservadoramente como negativas para α-SMA as células com sinal fluorescente ambíguo ou não definido.
    2. Calcule a positividade para α-SMA como o número de células positivas para α-SMA dividido pelo número total de núcleos positivos para Hoechst contados nos campos microscópicos avaliados, multiplicado por 100.

Resultados

Entre 24 e 48 h após o isolamento, um subconjunto de células começa a aderir à superfície do cultivo e a se espalhar, exibindo inicialmente uma morfologia arredondada. A adesão celular pode ser variável nos primeiros momentos, e os cultivos podem parecer esparsos devido ao número limitado de células viáveis recuperadas durante o isolamento inicial. Entre os dias 3 e 5, as células aderentes adotam progressivamente uma morfologia alongada e fusiforme, característica das células musculares lisas vasculares (SMCs), e começam a proliferar, formando pequenos agregados. Uma visão esquemática do fluxo experimental, incluindo o isolamento da aorta, segmentação, digestão enzimática, dissociação mecânica e semeadura celular, é apresentada na Figura 1.

Imagens representativas do isolamento da aorta, da segmentação anatômica nas regiões TOR (THX) e ABD e da remoção da camada adventícia são mostradas na Figura 2. As regiões aórticas TOR (THX) e ABD foram diferenciadas com base na localização anatômica relativa ao diafragma, conforme indicado na Figura 2B. Imagens representativas da digestão enzimática, da dissociação mecânica e da formação de um pellet celular visível após a centrifugação são mostradas na Figura 3.

A contagem celular e a viabilidade foram avaliadas na passagem 3 utilizando exclusão com azul de tripano (1:1) e um contador automático de células Countess. Os dados foram obtidos a partir de 3 isolamentos independentes utilizando um total de 6 camundongos (2 camundongos por isolamento). As culturas de THX apresentaram uma contagem média de células de 5,10 × 105 ± 7,81 × 104 células (intervalo, 4,20 × 105–5,60 × 105) e viabilidade média de 66,33 ± 18,18% (intervalo, 46–81%). As culturas de ABD apresentaram uma contagem média de células de 4,63 × 105 ± 2,31 × 104 células (intervalo, 4,50 × 105–4,90 × 105) e viabilidade de 61,66 ± 12,01% (intervalo, 50–74%) (Tabela 1).

Entre os dias 5 e 7, os cultivos geralmente atingem cerca de 70%–90% de confluência, formando uma monocamada densa e relativamente uniforme. As células comumente se alinham em orientações paralelas, refletindo sua linhagem contrátil. Podem ser observadas diferenças na taxa de proliferação e na densidade celular entre as CMLs de THX e ABD, consistentes com a heterogeneidade regional conhecida da aorta. Imagens representativas de contraste de fase da morfologia de CMLs primárias de segmentos aórticos de THX e ABD em ampliações baixa (10x) e maior (20x) são mostradas na Figura 4.

As CML exibiram a morfologia alongada e em forma de fuso característica, alinhamento organizado em paralelo na confluência e padrão de crescimento uniforme, enquanto as células semelhantes a fibroblastos tipicamente apresentam uma morfologia mais achatada e irregular, com orientação menos organizada e espalhamento heterogêneo. Essas características morfológicas e de crescimento fornecem uma abordagem prática e reprodutível para identificar populações de CML em cultura primária na ausência de validação molecular. O sucesso do isolamento é indicado pela adesão precoce das células nas primeiras 24–48 h, aquisição progressiva da morfologia em forma de fuso e formação de uma monocamada confluente entre os dias 5 e 7. As células normalmente se alinham em arranjos paralelos em maior confluência, compatível com o fenótipo de músculo liso. Resultados subótimos podem incluir pouca adesão celular, baixo rendimento celular ou a presença de células achatadas e com formatos irregulares, o que pode indicar digestão incompleta, exposição excessiva à enzima ou contaminação com populações de células não pertencentes ao músculo liso.

A viabilidade celular consistente e a contaminação mínima por células semelhantes a fibroblastos apoiam ainda mais o sucesso do isolamento. Para validar adicionalmente a identidade das células musculares lisas (SMCs), culturas primárias representativas foram imunomarcadas para α-actina muscular lisa (α-SMA) (Figura 5) utilizando o procedimento descrito na Seção 8. As culturas de THX e ABD demonstraram o padrão de marcação filamentoso característico da α-SMA esperado em SMCs vasculares. A quantificação em quatro campos microscópicos identificou 69 células positivas para α-SMA entre 72 células positivas para Hoechst analisadas, correspondendo a uma positividade geral para α-SMA de 95,8% (IC 95%, 88,5%–98,9%). Especificamente, 20/20 células de THX e 49/52 células de ABD foram positivas para α-SMA. Figura 5 mostra campos representativos dos analisados.

Durante as primeiras passagens, as células mantêm uma morfologia estável e capacidade proliferativa. No entanto, com cultivo prolongado, as células podem gradualmente exibir características de modulação fenotípica, incluindo aumento da aposição, redução do alinhamento e padrões de crescimento alterados.

Sob essas condições, os cultivos primários de CML são adequados para aplicações posteriores, incluindo silenciamento gênico, tratamentos farmacológicos e estudos mecanicistas de vias envolvidas na remodelação vascular e no desenvolvimento de aneurisma aórtico.

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Figura 1: Visão esquemática do fluxo de trabalho. Uma representação esquemática do protocolo principal de isolamento de células musculares lisas aórticas murinas. Painel 1 mostra a eutanásia e o isolamento da aorta. Painel 2 mostra a separação dos segmentos aórticos torácicos (THX) e abdominais (ABD) em solução enzimática de digestão. Painel 3 mostra a remoção da adventícia e o isolamento da camada média. Painel 4 mostra a devolução dos segmentos teciduais à solução enzimática fresca e sua trituração. Painel 5 mostra a dissociação mecânica por pipetagem a cada 30 min durante 2–3 h. Painel 6 mostra a recuperação e semeadura das células, incluindo 6a centrifugação, 6b remoção do sobrenadante e 6c ressuspensão do sedimento e semeadura. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Isolamento e preparação de segmentos de aorta de camundongo. (A) Aorta inteira isolada e colocada em uma placa de cultura. (B) Aorta limpa com marcos anatômicos indicando as regiões torácica (THX) e abdominal (ABD), incluindo o diafragma e a bifurcação ilíaca. (C) Imagens representativas da remoção da adventícia de segmentos torácicos (THX, superior) e abdominais (ABD, inferior) utilizando pinças finas e grossas, revelando a camada média subjacente, essencial para o isolamento de células musculares lisas. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Digestão enzimática e dissociação mecânica de tecido aórtico. (A) Após a remoção da camada adventícia, a camada média é transferida para uma solução enzimática fresca e picada com pequenas tesouras. (B) Exemplo de dissociação mecânica de fragmentos aórticos por pipetagem suave. (C) Após a digestão enzimática e a centrifugação, observa-se um pellet celular visível. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Morfologia representativa de células musculares lisas aórticas murinas primárias (SMCs). SMCs primárias isoladas de segmentos aórticos torácicos e abdominais foram cultivadas em condições padrão e analisadas no quarto subcultivo. São apresentadas imagens representativas em contraste de fase com aumento baixo (10x) e maior (20x). As células exibem morfologia característica em forma de fuso, alongada, e alinhamento compatível com fenótipo contrátil de SMCs. Podem ser observadas diferenças na densidade celular e na organização entre SMCs derivadas de THX e ABD, refletindo heterogeneidade regional. Barras de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Validação por imunofluorescência de CMLs aórticas murinas primárias. (A) Imagens representativas de imunofluorescência de CMLs primárias isoladas da aorta THX (esquerda) e ABD (direita) e coradas para α-actina muscular lisa (α-SMA) (verde). Os núcleos foram contra-coloridos com Hoechst 33342 (azul). As imagens foram obtidas com aumento de 20x. (B) Imagens representativas de controles com apenas anticorpo secundário de CMLs primárias THX (esquerda) e ABD (direita), processadas sem o anticorpo primário anti-α-SMA e contra-coloridas com Hoechst 33342 (azul). As imagens foram obtidas com aumento de 10x. A quantificação em quatro campos microscópicos identificou 69/72 células como positivas para α-SMA (95,8%). Barras de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Contagem Celular e Viabilidade de Culturas Primárias de Células Musculares Lisas Aórticas de Camundongo
Segmento aórticoIsolamentos independentes, nContagem Celular (Média ± DP)*Viabilidade celular (Média ± DP)†
THX35,10 x 105 ± 7,81 x 104 células66,33 ± 18,18 %
ABD34,63 x 105 ± 2,31 x 104 células61,66 ± 12,01 %
*A contagem celular foi obtida na passagem 3 a partir de 3 isolamentos independentes.
†A contagem celular e a viabilidade foram determinadas pelo método de exclusão de azul de tripano 1:1 utilizando um contador automático de células Countess.

Tabela 1: Contagem celular e viabilidade de culturas primárias de células musculares lisas aórticas murinas

EtapaProblemaCausa provávelSolução recomendada
Dissecção aórticaBaixo rendimento celularRecuperação incompleta da aorta ou dano tecidual durante a dissecçãoAssegure o isolamento completo desde a raiz aórtica até a bifurcação ilíaca; manipule o tecido com cuidado para evitar danos
Limpeza da aortaContaminação por fibroblastosRemoção incompleta do tecido adventicialRemova cuidadosamente a adventícia após a digestão inicial; isso é essencial para a pureza das CML
Digestão inicialDificuldade para remover a adventíciaAlívio enzimático insuficienteAssegure uma incubação adequada (8-10 min) antes de tentar a remoção mecânica
Digestão enzimáticaBaixo rendimento celularDigestão insuficiente do tecidoAlongue ligeiramente o tempo de digestão ou aumente a frequência da dissociação mecânica
Digestão enzimáticaBaixa viabilidade celularSuperdigestão ou exposição excessiva à enzimaReduza o tempo de digestão e evite incubações prolongadas
Dissociação mecânicaPouca liberação celularPipetagem inadequadaRealize pipetagem suave, mas repetida, a cada 30-60 min
Aderência celularMá aderência à placaDano celular ou meio frioUtilize meio pré-aquecido e minimize o estresse da manipulação
Cultura inicialSem crescimento celularBaixa viabilidade ou contaminaçãoConfirme as condições de digestão e a esterilidade; repita o isolamento, se necessário
Morfologia celularForma não fusiforme (células arredondadas/achatadas persistem)Contaminação ou deriva fenotípicaVerifique a remoção da adventícia; evite supercrescimento e cultura prolongada
Crescimento celularProliferação lentaConcentração subótima de soroUtilize 20% de soro bovino fetal (FBS) durante a fase inicial de expansão
ConfluênciaCélulas superconfluentes difíceis de repicarRepique atrasadoRepique as células a 80-90% de confluência
RepiqueMá dissociaçãoCélulas excessivamente confluentes ou tripsinização insuficienteAumente ligeiramente a exposição à tripsina e auxilie a dissociação mecanicamente
Cultura de longo prazoPerda do fenótipo de CMLNúmero elevado de passagens ou cultura prolongadaUtilize células entre as passagens 3 e 7
ReprodutibilidadeVariação entre isolamentosDiferenças na técnica ou variabilidade biológicaPadronize a preparação da enzima, os tempos e a manipulação entre experimentos

Tabela 2: Guia de solução de problemas para o isolamento e cultivo de células musculares lisas aórticas murinas primárias. Resumo dos problemas técnicos comuns encontrados durante o isolamento, digestão e cultivo de células musculares lisas aórticas murinas primárias, incluindo causas potenciais e soluções recomendadas para melhorar a reprodutibilidade.

Discussão

Este protocolo fornece um método robusto e reprodutível para o isolamento e cultivo de células musculares lisas aórticas primárias de camundongos (SMCs) para estudos in vitro. Além de sua utilidade técnica, esta abordagem é altamente relevante para investigar os mecanismos subjacentes ao remodelamento vascular e ao desenvolvimento de aneurismas aórticos. Considerando o papel bem estabelecido do sistema renina-angiotensina (RAS) e da Ang II na inflamação vascular e na formação de aneurismas15,16, o isolamento de SMCs aórticas primárias oferece uma abordagem valiosa para investigar essas vias em nível celular.

Um fator determinante para o sucesso é a remoção completa do tecido adventicial. A adventícia contém fibroblastos e outras populações não musculares lisas (SMCs) que podem supercrescer em cultura se não forem adequadamente removidos. O breve passo inicial de digestão enzimática facilita a separação mecânica da adventícia da camada média, permitindo uma dissecação mais precisa. A falha em realizar este passo de forma eficaz é uma das causas mais comuns de contaminação e variabilidade nos protocolos de isolamento de células musculares lisas.

As condições de digestão enzimática também devem ser cuidadosamente otimizadas. A combinação de colagenase tipo II, elastase e inibidor de tripsina de soja permite a degradação eficiente dos componentes da matriz extracelular, preservando a viabilidade celular. No entanto, a digestão deve ser rigorosamente monitorada. Uma digestão insuficiente resulta em dissociação incompleta do tecido e redução no rendimento celular, enquanto uma digestão excessiva pode danificar as células, comprometer sua adesão e diminuir a viabilidade. A dissociação mecânica por meio de pipetagem suave e repetida é, portanto, uma etapa complementar essencial, promovendo a liberação celular enquanto minimiza a superexposição enzimática. Juntas, essas etapas destacam a importância de equilibrar o processamento enzimático e mecânico para otimizar tanto o rendimento quanto a viabilidade celular. Manter tempos de digestão, manipulação do tecido e dissociação mecânica consistentes ao longo do procedimento é igualmente importante para melhorar a reprodutibilidade entre os isolamentos.

As condições de cultivo desempenham um papel central na manutenção do fenótipo e da função das células musculares lisas (SMC). Meios com alto teor de soro (20% de soro bovino fetal) favorecem a adesão inicial e a expansão das células primárias após o isolamento. Utilizou-se soro tratado com carvão ativado/dextrana para reduzir a variabilidade provocada por hormônios e componentes lipídicos presentes nas preparações padrão de soro. No entanto, a exposição prolongada a soro rico ou a períodos extensos de cultivo pode induzir uma deriva fenotípica rumo a um estado sintético ou semelhante ao de fibroblastos. Para minimizar esses efeitos, recomenda-se utilizar as células em passagens iniciais a intermediárias (P3–P7) e evitar condições de superconfluência, as quais podem alterar a morfologia e reduzir a capacidade proliferativa.

A morfologia de células isoladas fornece um indicador inicial importante da qualidade do cultivo. Células musculares lisas saudáveis apresentam uma morfologia característica em forma de fuso, alongada, e se alinham em arranjos paralelos em maior confluência. Desvios em relação a essa morfologia, incluindo células achatadas ou com formatos irregulares, podem indicar contaminação, condições de cultivo subótimas ou deriva fenotípica. Características morfológicas sugestivas de uma transição fenotípica de um estado contrátil para um estado sintético incluem aumento na espalhamento celular, redução da morfologia em forma de fuso, perda do alinhamento paralelo e padrões de crescimento mais heterogêneos.

Embora a avaliação morfológica seja informativa, ela é insuficiente para determinar definitivamente o fenótipo das células musculares lisas (SMC) e deve ser complementada por validação molecular utilizando marcadores como α-SMA e MYH11, dependendo da aplicação. No presente estudo, α- A imunofluorescência para SMA confirmou a identidade das células isoladas e demonstrou uma alta proporção de α-Células positivas para SMA em culturas de THX e ABD (Figura 5). Uma vantagem fundamental deste protocolo é a capacidade de isolar células musculares lisas (SMCs) de regiões distintas da aorta, incluindo os segmentos torácico (THX) e abdominal (ABD). Essas regiões apresentam diferenças biológicas intrínsecas, incluindo variações na composição da matriz extracelular, origem embriológica e suscetibilidade a doenças. O isolamento de SMCs específicas de cada região permite investigar a heterogeneidade espacial na biologia vascular e pode fornecer subsídios para compreender a vulnerabilidade regional específica à formação de aneurismas.16,17,18. Métodos existentes de isolamento de VSMCs aórticas murinas utilizam digestão com colagenase durante a noite13 ou 4–6 h de digestão enzimática, sendo relatado que 5–6 h proporcionam melhor recuperação14, em comparação com a digestão de 2–3 h após uma pré-digestão de 8–10 min utilizada no presente protocolo, com um tempo total de processamento de aproximadamente 4 h, desde a eutanásia até o plaqueamento celular. Adhikari et al. relataram 25–35 × 103 células viáveis/mL após 5 dias de cultivo e positividade de 97%–99% para sm22α e Acta2, enquanto o presente protocolo produziu contagens de células do passagem-3 de 5,10 × 105 ± 7.81 × 104 células para THX e 4,63 × 105 ± 2.31 × 104 células para ABD, com um geral α-Positividade para SMA de 95,8%. Hubert et al. utilizaram digestão durante a noite, mas não relataram um rendimento celular quantitativo ou porcentagem de pureza13,14. Em contraste, o método baseado em explantes de McMurray et al. exigiu um período médio de latência de aproximadamente 7,6 dias antes do crescimento de células musculares lisas (SMC) a partir de explantes aórticos normais, com >90% dos explantes apresentando crescimento externo no dia 10 e >95% no dia 12, enquanto o presente método enzimático permite o plaqueamento direto das células isoladas no dia do isolamento18. O presente protocolo combina uma etapa breve de pré-digestão que facilita a remoção da adventícia com condições padronizadas de digestão e dissociação mecânica para promover um processamento tecidual consistente e a recuperação celular. Juntamente com o isolamento específico por região de CMLs de THX e ABD, o tempo reduzido de processamento e a caracterização quantitativa da recuperação celular e α- A positividade para SMA oferece vantagens práticas para a reprodutibilidade in vitro estudos.

Este método é muito adequado para estudos mecanicistas que envolvem manipulação genética e farmacológica. Culturas primárias de CML podem ser utilizadas em abordagens de silenciamento gênico, incluindo a redução mediada por siRNA, bem como em estudos de superexpressão e tratamentos com fármacos. Essas abordagens permitem a investigação direta de vias de sinalização envolvidas na transição fenotípica de CML, inflamação e remodelação da matriz extracelular, processos centrais no desenvolvimento e progressão da aneurisma aórtica1,5.

É importante considerar as limitações deste protocolo no contexto da modelagem de doenças. As células musculares lisas neste protocolo são isoladas de aortas murinas não doentes e, portanto, não exibem inerentemente fenótipos associados a aneurismas. Assim, abordagens experimentais adicionais, incluindo estimulação farmacológica, manipulação genética ou integração com modelos in vivo, são necessárias para recapitular processos relevantes à doença, como ativação inflamatória, remodelamento da matriz extracelular e transição fenotípica. Além das considerações descritas acima, este protocolo apresenta várias limitações. Pode ocorrer variabilidade no rendimento celular e na cinética de crescimento entre isolamentos devido a diferenças biológicas entre os animais ou pequenas variações na técnica. Além disso, o isolamento baseado em digestão enzimática pode influenciar a expressão de receptores na superfície celular ou vias de sinalização, o que deve ser levado em conta ao interpretar estudos funcionais subsequentes. As CMLs primárias também perdem gradualmente seu fenótipo contrátil com o aumento do número de passagens, o que pode afetar os resultados experimentais. A padronização cuidadosa dos procedimentos e o uso de células em passagens iniciais podem ajudar a mitigar essas limitações. Os desafios técnicos comuns e as soluções recomendadas para este protocolo são resumidos na Tabela 2.

Em resumo, este protocolo fornece uma estrutura confiável e adaptável para o isolamento e cultivo de CMLs aórticas murinas primárias. Quando combinado com modelos in vivo, esta abordagem permite a investigação abrangente dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao remodelamento vascular e à patogênese de aneurismas aórticos.

Divulgações

Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes. O Grammarly foi utilizado para edição de linguagem e correção gramatical; todo o conteúdo científico e sua interpretação foram produzidos pelos autores.

Agradecimentos

O apoio financeiro foi fornecido, em parte, pelo College of Medicine da Universidade de Kentucky. O resumo gráfico (Figura 1) foi criado usando o BioRender.com sob uma Licença de Publicação Acadêmica, com o número de acordo de publicação GI2A3W9TY8.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtros de seringa de náilon 0,2 μmVWR76439-080Filtração estéril
Tubos cónicos de 15 mLVWR—Para transferência da aorta após limpeza e para coleta de células
Placas de cultivo de 6 poços / 12 poços (não tratadas)Corning—Cultura celular
Tubos cónicos de 50 mLVWR—Coleta de células
Placa de microplaca de fundo óptico de 96 poçosThermo Fisher Scientific165305Para validação de CML
Anticorpo α-actina de músculo liso (Monoclonal)Cell Signaling Technology19245SPara validação de CML; diluição de trabalho 1:1000
Anticorpo secundário IgG Alexa Fluor 488 (Policlonal)InvitrogenA-11008Para validação de CML; diluição de trabalho 1:2500
Anfotericina BThermo Fisher Scientific15290018Antifúngico
Albumina Sérica BovinaSigma-AldrichA7906Para validação de CML
Incubadora de CO2 (37 °C)Vários—Condições de cultura celular
Colagenase Tipo IIWorthington BiochemicalLS004174Para digestão enzimática; usado 260 U/mg
Contador Automatizado de Células CountessInvitrogenC10281 Para contagem de células
Microscópio de dissecaçãoVários—Limpeza de tecido
Meio DMEM/F12Thermo Fisher Scientific21041-025Meio de cultura base
ElastaseWorthington BiochemicalLS002279Para degradação da matriz; usado 4,17 U/mg de proteína
Soro Fetal Bovino (tratado com Carvão Ativado/Dextrano)Cytiva (Hyclone)SH30068.03Usado a 20% na cultura
HBSS com Ca2+ e Mg2+Thermo Fisher Scientific14025-092Usado como tampão de digestão
Solução Hoechst 33342BD Pharmingen561908Para validação de CML
Esterilizador por conta quenteFine Science Tools18000-45Para extração da aorta
Ketamina Dechra—Para anestesia de camundongos
Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122Antibiótico
Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific20012-027Tampão de lavagem
Cloreto de SódioFisher ScientificBDH9286Para validação de CML; concentração de trabalho 150 mM (8,8 g para 1 L)
Inibidor de Tripsina de SojaWorthington BiochemicalLS003570Evita superdigestão
Base de TrisFisher Scientific BP152Para validação de CML; concentração de trabalho 20 mM (2,4 g para 1 L)
Triton X-100Fisher Scientific BP151Para validação de CML; concentração de trabalho 0,1%
Corante Azul de TripanoThermo Fisher ScientificT10282Para contagem de células
Tripsina-EDTA (0,05%)Thermo Fisher Scientific15400054Para passagem
Tween 20Fisher Scientific BP337Para validação de CML; concentração de trabalho 0,1%
XilazinaCovetrus61035Para anestesia de camundongos
Materiais Opcionais (se utilizados)
Frascos de cultura (T25/T75)Corning—Expansão celular

Referências

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